CN113588614B - 一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法。准确移取浓度为0.1×10‑5mol L‑1的牛血清蛋白溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，然后用微量注射器向比色皿中加入浓度为1×10‑2mol L‑1的营养补充剂溶液5μL，最后用微量注射器向比色皿中加入卡博替尼溶液5μL，混合均匀后，静置5min，得待测液，采用荧光光谱法测定，通过荧光光谱法研究营养补充剂对于卡博替尼安全用药的影响。本发明方法具有操作简单、结果准确并且具有说服力、用样量少、方法简单等优点，为研究营养补充剂对卡博替尼安全用药的影响奠定了基础。

Description

一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法
技术领域
本发明涉及分析方法技术领域，具体地提出了分析营养补充剂对于卡博替尼安全用药的影响的方法。
背景技术
卡博替尼是通过FDA批准且广泛应用于多种癌症治疗的药物，其治疗机理主要是抑制癌细胞的酪氨酸激酶的生理活性，防止肿瘤细胞生长、血管新生，从而发挥抗肿瘤、杀死肿瘤细胞的作用。牛血清蛋白是应用广泛的血清蛋白，它稳定的光谱性能使其成为研究小分子与血清蛋白相互作用的最佳选择。衡量一个药物是否能有效地用于临床，不但要看是否能直击中病灶，而且更要考虑这个药物能否被有效地转运到靶点，最后能不能被人体所代谢利用，这都与药物与蛋白质相互作用有很大的关系。
维生素在能量代谢过程中以及调节机体物质代谢过程中起着非常重要的角色，它能够维持机体正常新陈代谢和生理机能，它对维持身体健康有着重要的作用。卡博替尼是一种抗癌药，有报道，它的使用不当可能会引起出血、胃肠穿孔、高血压、血栓、腹泻、呕吐等不良反应。癌症患者身体都比较虚弱，因此经常需要补充维生素来强化提高身体免疫力。不同物质的存在会影响药物活性的发挥，因此研究在维生素等营养补充剂存在的情况下，营养补充剂对于卡博替尼安全用药的影响具有重要意义，有助于临床用药的研究。
发明内容
为解决上述存在的技术问题，本发明提供一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法。采取荧光光谱法检测营养补充剂对卡博替尼与牛血清蛋白相互作用的影响。
本发明采用的技术方案是：一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法，包括如下步骤：
1)准确移取浓度为0.1×10-5mol L-1的牛血清蛋白溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，然后用微量注射器向比色皿中加入浓度为1×10-2mol L-1的营养补充剂溶液5μL，最后用微量注射器向比色皿中加入卡博替尼溶液5μL，混合均匀后，静置5min，得待测液；
2)取待测液，在激发波长为278nm，荧光发射狭缝宽度5nm、激发狭缝宽度5nm，温度293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，取200～600nm的荧光发射光谱；
3)取待测液，在293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm和Δλ＝60nm，做光谱扫描；
4)取待测液，在293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，激发波长从200到360nm，发射波长从250到500nm，做光谱扫描。
优选的，上述的方法，步骤1)中，所述卡博替尼溶液的浓度为1.0×10-3mol L-1。
优选的，上述的方法，步骤1)中，所述营养补充剂是维生素。
优选的，上述的方法，步骤1)中，所述维生素是NAA，VB12和VC。
优选的，上述的方法，步骤3)中，设置激发波长为200～400nm。
本发明，根据加入营养补充剂后，卡博替尼-牛血清蛋白体系结合常数Ka值是否发生变化，来判断营养补充剂的加入，是否影响安全用药。如果发生变化，则是有影响的；反之，无影响。
本发明的有益效果是：本发明，通过荧光光光谱法研究维生素对卡博替尼与牛血清蛋白相互作用的影响，具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简单等优点，通过荧光光谱法能够准确地判断维生素等营养补充剂对于卡博替尼安全用药的影响。
附图说明
图1a为维生素NAA存在时体系随卡博替尼浓度变化的荧光光谱。
图1b为维生素VB12存在时体系随卡博替尼浓度变化的荧光光谱。
图1c为维生素VC存在时体系随卡博替尼浓度变化的荧光光谱。
图2为激发波长与发射波长的差值分别为Δλ＝15nm和Δλ＝60nm下，维生素NAA存在时牛血清蛋白的同步荧光光谱随卡博替尼浓度的变化。
图3为激发波长与发射波长的差值分别为Δλ＝15nm和Δλ＝60nm下，维生素VB12存在时牛血清蛋白的同步荧光光谱随卡博替尼浓度的变化。
图4为激发波长与发射波长的差值分别为Δλ＝15nm和Δλ＝60nm下，维生素VC存在时牛血清蛋白的同步荧光光谱随卡博替尼浓度的变化。
图5a为维生素NAA存在时卡博替尼-牛血清蛋白的三维荧光光谱图。
图5b为维生素VB12存在时卡博替尼-牛血清蛋白的三维荧光光谱图。
图5c为维生素VC存在时卡博替尼-牛血清蛋白的三维荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1维生素对卡博替尼安全用药的影响
方法如下：
一、溶液配制
Tris-HCl-NaCl(0.05mol L-1，pH＝7.40)缓冲溶液配制：Tris储备液：准确称取24.23gTris，用超纯水溶解后，定容于1000mL容量瓶。HCl溶液：准确量取12mol L-1盐酸溶液8.33mL，再用超纯水定容于1000mL容量瓶。准确量取Tris储备液250mL、HCl溶液400mL，再加入2.925g的NaCl，用蒸馏水定容于1000mL容量瓶。
牛血清蛋白溶液(0.1×10-5mol L-1)配制：准确称取牛血清蛋白0.067g，用Tris-HCl-NaCl缓冲溶液溶解后，定容于100mL容量瓶，得浓度为1.0×10-5mol L-1的牛血清蛋白储备液。准确移取牛血清蛋白储备液10mL，用Tris-HCl-NaCl缓冲溶液溶解后，定容于100mL容量瓶。
卡博替尼溶液(1.0×10-3mol L-1)配制：准确称取卡博替尼0.013g于25mL烧杯，用少量乙醇溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于25mL容量瓶。
NAA溶液(1×10-2mol L-1)配制：准确称量NAA 0.124g于25mL烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100mL容量瓶。
VB12溶液(1×10-3mol L-1)配制：准确称量VB12 0.136g于25mL烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100ml容量瓶。
VC溶液(1×10-2mol L-1)配制：准确称量VC 0.176g于25mL烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100mL容量瓶。
二、检测及结果
1、准确移取浓度为0.1×10-5mol L-1的牛血清蛋白溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，然后用微量注射器向比色皿中加入5μL浓度为1×10-2mol L-1的NAA溶液(或浓度为1×10-3mol L-1的VB12溶液或浓度为1×10-2mol L-1的VC溶液)，最后再用微量注射器逐次向比色皿中加入不同体积的浓度为1×10-3mol L-1的卡博替尼溶液，使卡博替尼浓度在0.0×10-5mol L-1到1.2×10-5mol L-1范围内，间隔浓度为0.2×10-5mol L-1，各溶液混匀后，再静置5min，得待测液。
2、取待测液，在激发波长为278nm，荧光发射狭缝宽度5nm、激发狭缝宽度5nm，温度293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，取200～600nm的荧光发射光谱。结果如图1a-图1c。
由图1a-图1c可见，固定浓度的NAA、VB12、VC存在时，分别随着卡博替尼浓度增加，三元体系的荧光强度逐步降低，说明NAA、VB12、VC的存在情况下，卡博替尼与牛血清蛋白存在相互作用。使之产生荧光猝灭。
3、取待测液，在293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm(激发波长从200到400nm，发射波长215nm)和Δλ＝60nm(激发波长从200到400nm，发射波长260nm)，做光谱扫描。结果如图2-图4。
由图2可以看出，NAA存在的情况下，卡博替尼对牛血清蛋白的Trp残基和Tyr残基的荧光强度呈现极其显著的猝灭，Trp残基的最大发射峰位置发生了轻微红移，Tyr残基最大发射峰位置未发生改变，NAA的存在未改变卡博替尼与牛血清蛋白的作用位置，可以认为在NAA存在时，卡博替尼依旧是作用在牛血清蛋白的Trp残基上。
由图3可以看出，VB12存在的情况下，卡博替尼对牛血清蛋白的酪氨酸残基和Trp残基的荧光强度呈现极其显著的猝灭，Trp残基的最大发射峰位置波长变长，既发生了红移，酪氨酸残基最大发射峰位置未发生改变，说明VB12的存在未改变卡博替尼与牛血清蛋白的作用位置卡博替尼依旧是作用在牛血清蛋白的Trp残基上。
由图4可以看出，VC存在的情况下，卡博替尼对牛血清蛋白的酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光强度呈现极其显著的猝灭，色氨酸残基和酪氨酸残基的最大发射峰位置波长未改变。所以说明在VC存在时，荧光猝灭可能主要以碰撞能量转移的存在。
4、取待测液，在293K条件下，以1200nm min-1速度扫描，激发波长从200到360nm，发射波长从250到500nm，做光谱扫描。结果如图5a-图5c。
图5a为NAA-卡博替尼-牛血清蛋白体系的三维荧光光谱图(A)和三维荧光等高线图(A')。从图5a中可以看出，两个像“山脊”的峰，分别是瑞利散射峰Peak 3、Peak 4，峰强度较大的Peak 1、Peak 2是BSA的指纹峰，位置分别位于228nm/346nm(λex/λem)、278nm/346nm(λex/λem)，Peak 1主要反映蛋白质二级结构(多肽骨架结构特征)的变化情况，Peak 2主要体现Trp、Tyr残基的光谱特征。
图5b为VB12-卡博替尼-牛血清蛋白体系的三维荧光光谱图(B)和三维荧光等高线图(B')。从图5b中可以看出，两个像“山脊”的峰，分别是瑞利散射峰Peak 3、Peak 4，峰强度较大的Peak 1、Peak 2是BSA的指纹峰，位置分别位于228nm/346nm(λex/λem)、278nm/346nm(λex/λem)，Peak 1主要反映蛋白质二级结构(多肽骨架结构特征)的变化情况，Peak 2主要体现Trp、Tyr残基的光谱特征。
图5c为VC-卡博替尼-牛血清蛋白体系的三维荧光光谱图(A、B、C)和三维荧光等高线图(C')。从图5c中可以看出，两个像“山脊”的峰，分别是瑞利散射峰Peak 3、Peak4，峰强度较大的Peak 1、Peak 2是BSA的指纹峰，位置分别位于228nm/346nm(λex/λem)、278nm/346nm(λex/λem)，Peak 1主要反映蛋白质二级结构(多肽骨架结构特征)的变化情况，Peak 2主要体现Trp、Tyr残基的光谱特征。
综合上述检测结果，NAA、VB12、VC的添加均未改变卡博替尼对牛血清蛋白的猝灭机理，但是，NAA、VB12的加入使卡博替尼-牛血清蛋白体系结合常数Ka值明显减小，说明NAA、VB12使卡博替尼-牛血清蛋白体系结合的稳定性差。VC使Ka减小不是很明显，说明VC对卡博替尼-牛血清蛋白体系结合的稳定性影响不大；NAA、VB12、VC对Tyr残基、Trp残基的荧光强度猝灭极其显著，NAA、VB12存在时，卡博替尼依旧作用在Trp残基上。NAA、VB12、VC存在时卡博替尼-牛血清蛋白体系三维荧光光谱特征峰强度和位置发生了明显改变，说明NAA、VB12、VC与卡博替尼-牛血清蛋白发生了相互作用。NAA、VB12存在时对卡博替尼的药效影响比较大，而VC对药效影响较小，所以在服用卡博替尼药物期间避免大量服用NAA和VB12。

Claims (5)

1.一种营养补充剂对卡博替尼安全用药影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）准确移取浓度为0.1×10-5 mol L-1的牛血清蛋白溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，然后用微量注射器向比色皿中加入浓度为1×10-2 mol L-1 的营养补充剂溶液5 μL，最后用微量注射器向比色皿中加入卡博替尼溶液5μL，混合均匀后，静置5 min，得待测液；
2）取待测液，在激发波长为278 nm，荧光发射狭缝宽度5nm、激发狭缝宽度5 nm，温度293K条件下，以1200 nm min-1速度扫描，取200～600 nm的荧光发射光谱；
3）取待测液，在293 K条件下，以1200 nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，做光谱扫描；
4）取待测液，在293K条件下，以1200 nm min-1速度扫描，激发波长从200到360nm，发射波长从250到500 nm，做光谱扫描；
5）根据加入营养补充剂后，卡博替尼-牛血清蛋白体系结合常数Ka值是否发生变化，来判断营养补充剂的加入，是否影响安全用药；如果发生变化，则有影响；反之，无影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述卡博替尼溶液的浓度为1.0×10-3 mol L-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述营养补充剂是维生素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述维生素是NAA、VB12或VC。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，设置激发波长为200～400nm。
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