CN104434784B - 聚肌胞注射液药物组合物和制法 - Google Patents
聚肌胞注射液药物组合物和制法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及聚肌胞注射液药物组合物和制法。总体上讲,本发明涉及一种可用于治疗病毒性角膜炎、单纯疱疹、慢性病毒性肝炎的治疗或辅助治疗的药物,特别是涉及一种以聚肌胞为活性成分制成的药物组合物例如注射液。本发明还涉及该药物组合物的制备方法。具体地说,本发明涉及的聚肌胞注射液的药物组合物,其中包含聚肌胞、酸碱缓冲剂、渗透压调节剂、水。本发明提供的聚肌胞注射液具有如说明书所述的优异的药学性质。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种可用于治疗病毒性角膜炎、单纯疱疹、慢性病毒性肝炎的治疗或辅助治疗的药物,特别是涉及一种以聚肌胞为活性成分制成的药物组合物例如注射液。本发明还涉及该药物组合物的制备方法。
背景技术
聚肌胞(polyinosinic:polycytidylic acid copolymer,Polyinosinic-Polycytidylic Acid,Poly I:C,PIC等),又名聚肌胞苷酸,聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸,聚肌苷酸-聚胞苷酸等。于1958年由美国化学家David R.Davies和Alexander Rich首次发现与合成,为聚肌苷酸(polyinosinic acid,Poly I)和聚胞嘧啶酸(polycytidylic acid,PolyC)的共聚物。1967年,美国科学家Field和Tytell等人在研究各种高效干扰素(Interferon,IFN)诱导剂时,发现Poly I:C具有强大的IFN诱导功能。从此,在世界范围内掀起一股PolyI:C研究热潮Poly I:C目前已广泛应用于人类医学以治疗肝炎、疱疹病毒、腮腺炎病毒感染及一些肿瘤性疾病。
聚肌胞是由人工合成的PolyI和PolyC配对后的双链核糖核酸,是一种高效干扰素诱生剂,具有广谱抗病毒、刺激吞噬、调整机体免疫、抗肿瘤、抗某些细菌和原虫感染等功能。国产聚肌胞无明显毒副作用,已在临床用于治疗病毒感染性疾病。
已有大量文献报道,聚肌胞能够通过诱生干扰素和协调免疫细胞的功能来起到对肿瘤的抑制作用,对小鼠肉瘤S180,Lewis肺癌、小鼠肝癌和前列腺癌等都有明显的抑制作用。一般认为,聚肌胞抗肿瘤的机制主要有如下几点:
(1)蛋白激酶激活:蛋白激酶的活化依赖dsRNA的长度,一般蛋白激酶的完全激活大约需要80个核苷酸的dsRNA。长链dsRNA进入细胞后,细胞内IFN的产生增加,蛋白激酶被激活,活化的蛋白激酶进一步使翻译起始因子EIF2α磷酸化失活,造成翻译的停滞,最终通过凋亡和抑制蛋白合成破坏细胞。
(2)RNaseL的激活:2’5’-寡腺苷酸聚合酶是非特异性核糖核酸酶RNaseL的辅助因子,长链dsRNA可以激活2’5’-寡腺苷酸聚合酶,而2’5’-寡腺苷酸聚合酶又能活化细胞中处于潜伏状态的RNaseL,后者被活化后可非特异地切割mRNA。只要有长链dsRNA的存在它可以降解所有的RNA,抑制所有蛋白质的合成,最终导致细胞死亡。
(3)激活腺苷酸环化酶,提高环磷腺苷水平。
(4)增强NK细胞和巨噬细胞的活性。
(5)促进IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,协同发挥抗致瘤病毒引起的肿瘤作用。
双链聚肌胞在化妆品中应用可以消除痘痘、扁平疣等皮肤赘生物。
双链聚肌胞在兽药方面主要应用于预防和治疗家禽、家畜病毒性疾病,使用方便、广泛,可以与许多药物同时使用,具有协同或相加作用。本品无种属特异性,可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用,同时它还具有抗病毒谱广,毒性小、安全范围大的优点。
双链聚肌胞是一种动物免疫增强剂,可作为疾病治疗辅助用药,增强动物肌体免疫力、提高药物的疗效。同时,双链聚肌胞也是一种免疫佐剂,在用疫苗免疫的同时使用,可明显提高免疫效果,并且有预防免疫应激及其它病毒性疾病的发生。
已有诸多关于聚肌胞及其制剂的制备的研究报道。例如,CN102488707A(CN201110420066.2,济命生)公开了一种聚肌胞复合物的制备方法及其新用途;该方法是在聚肌胞的基础上加入卡那霉素和钙离子,增强了聚肌胞双链RNA的稳定性;据信,经动物实验结果表明,该发明的聚肌胞复合物具有抑制肿瘤生长的作用。CN102512440A(CN201110420067.7,济命生)公开了一种葡萄糖酸钙在制备药物中的用途;该方法在制备聚肌胞时,加入少量葡萄糖酸钙,据信能够增强聚肌胞双链结构的紧密性,从而增加了聚肌胞的稳定性,抵抗核酸酶对聚肌胞的降解。CN102488704A(CN201110420069.6,济命生)公开了一种精制聚肌胞的制备方法及用途,其特征是:通过化学方法纯化聚肌苷酸和聚肌胞酸,分别经过精制之后,合并成聚肌胞溶液,再经过超滤浓缩,加入辅料制成一种精制聚肌胞,据信这种精制聚肌胞可有效提高抗癌效果。CN103599071A(CN201310552020.5)公开了一种双链聚肌胞干粉的制备方法,所述方法包括:(1)将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用磷酸盐缓冲液溶解,混合后加入稳定剂,混合均匀,在40~100℃下保温;(2)步骤(1)反应液自然冷却后与有机溶剂混合,静置沉淀,沉淀物干燥,即得所述双链聚肌胞干粉;据信该发明的有益效果主要体现在:该发明提供了一种双链聚肌胞干粉的制备方法,制成的聚肌胞干粉具有完整的双螺旋结构特征和生理活性,质量和稳定性要比溶液状态下的聚肌胞要好很多,进入生物体内较裸露的聚肌胞有更强的抗酶解性能,从而增强了疗效;而且在双链聚肌胞溶液制成干粉的过程中对其进行了纯化,去除了很多小分子物质和杂质,降低了毒副作用,提高了双链聚肌胞的质量。CN102488703A(CN201110420068.1,济命生)公开了一种聚肌胞制剂的制备方法和抗肿瘤的用途。该发明进一步提供了包含聚肌苷酸、聚胞苷酸的双链RNA药物。据信该发明的聚肌胞制剂含有以磷脂为必需构成组分的载体和聚肌苷酸、聚胞苷酸、卡那霉素的复合体。
目前粉末状聚肌胞是制剂形式(是预混剂,不是原料形式),一般多采用聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液经聚合后,直接添加辅料制得,该干粉中聚肌胞的含量偏低。另外,现已报道的文献中,聚肌胞制剂的制备一般是以聚肌苷酸、聚胞苷酸为原料经过一步反应后得到中间体聚肌胞溶液,再进行制剂工序的操作。其不足之处在于,首先制剂生产线中增加聚合反应步骤,不仅增加操作的复杂性,还增加了监控的难度。其次,聚肌胞中间体是以溶液形式存在,贮藏条件及期限更加严格。
目前,聚肌胞诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长的研究越来越受到重视。然而,聚肌胞易受体内RNA酶的降解而失去作用。因此,研究聚肌胞新的制剂处方,增加聚肌胞的稳定性,使聚肌胞免受RNA酶的降解对本领域而言显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种具有双链结构的聚肌胞药物组合物例如药物制剂特别是其注射液,期待这种药物组合物具有至少如本发明所述的优良性质。本发明人出人意料地发现,具有本发明特征的组合物具有优异的药学性质。本发明基于此发现而得以完成。
为此,本发明第一方面提供了一种聚肌胞注射液的药物组合物,其中包含聚肌胞、酸碱缓冲剂、渗透压调节剂、水。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其每1ml中包含聚肌胞的量为0.5~5mg,例如0.5~2.5mg,例如约1mg,例如约2mg。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂使得所述药物组合物的pH值在6.5~8.0范围内。在一个实施方案中,酸碱缓冲剂在所述药物组合物中的浓度是1~20mmol/L,例如2~15mmol/L,例如3~12mmol/L。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂选自磷酸或其盐、醋酸或其盐、枸橼酸或其盐等。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂是磷酸盐缓冲对。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠二者的组合。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述渗透压调节剂选自氯化钠、葡萄糖、甘露醇等。在一个实施方案中,所述渗透压调节剂是氯化钠或葡萄糖。在一个实施方案中,所述渗透压调节剂是氯化钠。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述渗透压调节剂在溶液中的量是使得所述溶液的渗透达到或稍高于生理渗透压的量。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述渗透压调节剂是氯化钠,其在溶液中的浓度是0.7~1.0%(重量/体积)。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述渗透压调节剂是氯化钠,其在溶液中的浓度是0.8~0.95%(重量/体积)。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中所述的量是使注射液药物组合物达到平衡体积的量(例如达到使聚肌胞浓度在其所规定的范围内的量)。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中还包含山梨酸或其药用盐,例如其选自:山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸钙等。在一个实施方案中,山梨酸或其药用盐在所述注射液药物组合物述中的浓度是0.1~1.0%(重量/体积),例如0.2~0.75%(重量/体积),例如0.2~0.5%(重量/体积)。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其中还包含多羟基醇,例如其选自甘油、丙二醇、分子量200-600的聚乙二醇。在一个实施方案中,所述多羟基醇是丙二醇。在一个实施方案中,多羟基醇在所述注射液药物组合物述中的浓度是0.1~1.0%(重量/体积),例如0.1~0.5%(重量/体积),例如0.1~0.3%(重量/体积)。
根据本发明第一方面任一实施方案的药物组合物,其是照包括如下步骤的方法制备得到的:
(i)使酸碱缓冲剂和任选的山梨酸或其药用盐与适量(例如处理全量的50~80%的)注射用水溶解,将聚肌胞加至该溶液中,使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入渗透压调节剂和任选的多羟基醇使溶解,补加注射用水至处方全量;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
进一步地,本发明第二方面提供了制备聚肌胞注射液的药物组合物的方法,其包括如下步骤:
(i)使酸碱缓冲剂和任选的山梨酸或其药用盐与适量(例如处理全量的50~80%的)注射用水溶解,将聚肌胞加至该溶液中,使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入渗透压调节剂和任选的多羟基醇使溶解,补加注射用水至处方全量;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
在本发明第二方面所述方法的一个实施方案中,其中所述聚肌胞注射液是照如下方法制备得到的:
(1)将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用适量pH 6.5~8.0的磷酸盐缓冲液溶解,混合后加入稳定剂,混合均匀,在40~100℃下保温0.5~5小时;所述稳定剂为下列之一或其中两种以上的混合物:卡那霉素、壳寡糖、氯化钙、多聚赖氨酸(包括各种规格的ε-多聚赖氨酸、L-多聚赖氨酸等)、葡萄糖酸钙;所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1:0.5~1.5,稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2~2.0倍;所述磷酸盐缓冲液用量以将聚肌苷酸和聚胞苷酸充分溶解为宜,推荐用量为将聚肌苷酸和聚胞苷酸配制成10~100g/L的溶液;
(2)步骤(1)反应液自然冷却后与0.5~20倍体积的有机溶剂乙酸乙酯混合,静置沉淀0.5~72小时,取沉淀物20~60℃低温干燥,即得所述聚肌胞干粉;可替换地,所述有机溶剂还可以是下列之一或其中两种以上的混合物:乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、异丙醇、正丙醇;
(3)使步骤(2)所得聚肌胞干粉照包括如下步骤的方法制备成注射液:
(i)使酸碱缓冲剂和任选的山梨酸或其药用盐与适量(例如处理全量的50~80%的)注射用水溶解,将聚肌胞加至该溶液中,使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入渗透压调节剂和任选的多羟基醇使溶解,补加注射用水至处方全量;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案,只要它们不会相互矛盾,当然在相互之间适用时,必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。
下面对本发明的各个方面作进一步描述。
本发明采用碱基互补配对原则将多聚肌苷酸、多聚胞苷酸,并加入稳定剂聚合后,再用有机溶剂沉淀得到高质量的双链形式的聚肌胞干粉。该干粉中双链聚肌胞含量高,可直接用于各种剂型制剂的制备,可以使制剂的制备过程更加简单,易于操作,目前市场需求量很大。另外,加入稳定剂不仅可以增大分子量,还可以使双链聚肌胞的稳定性(由于PIC为大分子聚阴离子,加入稳定剂后可以使PIC双链结构的稳定性增加)增强,优于溶液形式,易于保存。另外经过有机溶剂沉淀处理后样品的增色效应(通过碱处理使双链聚肌胞的双螺旋结构破坏,碱基充分外露,导致紫外吸收增加的现象称为增色效应,该指标直接影响产品的功效)指标更优。
根据本发明的一些实施方案,步骤(1)所述稳定剂为壳聚糖,多聚赖氨酸(包括各种规格的ε-多聚赖氨酸、L-多聚赖氨酸等)或卡那霉素。
根据本发明的一些实施方案,步骤(1)中,所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1∶0.8~1.2,稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2~1.5倍。
根据本发明的一些实施方案,所述双链聚肌胞干粉可进一步制成双链聚肌胞水溶液,因此所述方法在步骤(2)之后还可包括步骤(A):配制pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲液,加入适量的双链聚肌胞干粉和NaCl,定容至双链聚肌胞干粉终浓度为0.01~1.0g/L,NaCl终浓度为4.5g~9.0g/L,即得所述双链聚肌胞水溶液。按此方法制得的双链聚肌胞水溶液,疗效高,安全可靠,无毒、无害、无残留,工艺简单,实用性强,可用于预防和治疗人和动物病毒性疾病,也可用作免疫佐剂。
本发明一些实施方案提供了一种双链聚肌胞干粉的制备方法,制成的聚肌胞干粉具有完整的双螺旋结构特征和生理活性,并且该双链聚肌胞干粉的质量和稳定性要比溶液状态下的聚肌胞要好很多,进入生物体内较裸露的聚肌胞有更强的抗酶性能,从而增强了疗效。而且在双链聚肌胞溶液制成干粉的过程中对其进行了纯化,去除了很多小分子物质和杂质,降低了毒副作用,提高了双链聚肌胞的质量。
在本发明的一些实施方案中,提供了一种聚肌胞注射液(Polyinosinic-Polycytidylic Acid Injection),这种注射液通常为无色的澄明液体。聚肌胞由多分子核苷酸组合而成,在体内能诱生干扰素,对多种病毒引起的疾病有较好的疗效。并能增强抗体形成和刺激巨噬细胞吞噬作用。聚肌胞注射液的药代动力学特征为:肌内注射后约10~20分钟血液浓度达高峰,代谢产物主要从尿液排出。其适应症为:用于治疗病毒性角膜炎、单纯疱疹,慢性病毒性肝炎的辅助治疗。通常的用法用量为:肌内注射,一次1~2mg,隔日1次;结膜内注射,一次0.2~0.5mg,隔三日1次;患带状胞疹者可配合局部外用,一日数次。
本发明另一些实施方案提供了制备聚肌胞注射液的方法以及制备得到的聚肌胞注射液,出人意料地发现,本发明制备得到的聚肌胞注射液呈现优异的药学性质。
附图说明
图1为本发明产物的紫外鉴别结果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
一、质量检测方法
1、鉴别方法
下述鉴别方法可用于鉴别各种形式的物料,包括作为药用原料或制药中间体的聚肌胞,还可以用于鉴别添加了药用辅料的药物组合物例如注射液。
【鉴别】(1)取本品,加水制成每1ml含1mg的溶液,取10μl点于色谱滤纸上,照纸色谱法(中国药典1995年版二部附录)试验,以异丁酸-氢氧化铵液(1mol/L)-乙二胺四醋酸二钠液(0.1mol/L)(100∶60∶1.6)为展开剂,在室温下照上行法展开12小时,取出,阴干,在254nm波长的紫外灯下检视,仅在原点处呈紫蓝色斑点。
(2)取本品1ml,加氢氧化钠液(6mol/L)1滴,置65~70℃水浴中保温1小时,取20μl点于色谱滤纸上,照纸色谱法(中国药典1995年版二部附录)试验,以异丁酸-氢氧化铵液(1mol/L)-乙二胺四醋酸二钠液(0.1mol/L)(100∶60∶1.6)为展开剂,在室温下照上行法展开12~20小时,取出阴干,在254nm波长的紫外灯下检视,应有上下两个紫色斑点,描划出斑点位置,分别将两个斑点剪下,剪成细条之后,分置各试管中,各加盐酸液(0.01mol/L)5ml,在37℃保温4小时,取上清液,照分光光度法(中国药典1995年版二部附录)测定,上点应在275~280nm的波长处,下点应在248nm的波长处有最大吸收。
(3)取本品,配制成1mg/ml的水溶液,加入pH7.2氯化钠-磷酸盐缓冲液[取磷酸氢二钠1.546g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.262g,氯化钠8.768g,加水溶解并稀释至1000ml,pH7.2]制成每1ml中约含0.08mg的溶液,照分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)测定,对于合格产品,在266nm±2nm的波长处有最大吸收,在231nm±2nm的波长处有最小吸收。
上述【鉴别】(1)中,如果测试样品是溶液,则在必要时可以稀释,制成浓度0.5~2mg/ml的溶液测定。上述【鉴别】(2)中,如果测试样品是固体粉末,则将其用水稀释制成浓度约1mg/ml的溶液进行测定。
2、增色效应测定方法
增色效应 取本品0.2ml置10ml量瓶中,加氯化钠-磷酸盐缓冲液(pH7.2)〔取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)21.50g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)9.36g、氯化钠18.77g,加水溶解使成1000ml,即得〕稀释至刻度,照分光光度法(中国药典1995年版二部附录),在248nm的波长处测定吸收度(A1),然后滴加氢氧化钠液(6mol/L)2滴,混匀后放置10分钟,在248nm的波长处测定吸收度A2,按下式计算,即得。
上述增色效应测定方法中,如果测试样品是固体粉末,则将其用水稀释制成浓度约1mg/ml的溶液进行测定。通常地对于注射液而言,本领域通常要求增色效应大于55%的产品认为合格。
3、沉降系数(S)测定方法
沉降系数(S) 对照品溶液的制备 取已知沉降系数为4S的酵母核糖核酸(tRNA)(电泳纯)制成每1ml含1mg的溶液,每1ml加入溴酚蓝指示液2滴及约0.4g蔗糖,使溶解,备用。
供试品溶液的制备 取本品,制成每1ml含1mg的溶液,取1ml,加溴酚蓝指示液2滴及约0.4g蔗糖,使溶解,备用。
聚丙烯酰胺凝胶柱的制备 取丙烯酰胺溶液(精密称取丙烯酰胺1.875g、N′,N′-亚甲基双丙烯酰胺0.0563g,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(取三羟甲基氨基甲烷14.54g、醋酸钠4.93g、乙二胺四醋酸二钠1.1g,加水溶解,用冰醋酸调pH=7.4,加水至1000ml)48.8ml,10%过硫酸铵溶液1.0ml,混合后,置真空干燥器中,抽去空气,再加N,N,N′,N′-四甲基乙二胺0.2ml,混合,分别注入直径为0.5cm、长约8cm的干燥玻璃管中,加至距管口1cm处,然后再轻轻注入少量水覆盖其上,放置,聚合,备用。
测定法 取上述凝胶柱,置圆盘电泳槽中,于对照管和样品管中分别加对照品溶液和供试品溶液30μl,然后用电泳缓冲液(取上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液一份加水二份混合摇匀)将玻璃管上部充满,用电泳缓冲液充满电泳槽,点样端接负极,调整电流每管电流约5mA,电泳,时间约1.5~2小时(待溴酚蓝色环达到距底端2cm处,即可),取出,剥胶,用1mol/L醋酸固定20分钟,再用2%次甲基蓝的醋酸溶液(1mol/L)染色30分钟,用水冲洗,脱色,至胶条透明为止,测量样品带距始点长度和脱色后胶长,求出对照品和供试品的迁移率(Rf)值,再求出样品的沉降系数(S)。
上述沉降系数(S)测定方法的供试品溶液的制备中,如果测试样品是溶液,则在必要时可以稀释,制成浓度0.5~1mg/ml的溶液测定。上述沉降系数(S)测定方法的供试品溶液的制备中,如果测试样品是固体粉末,则将其用水稀释制成浓度约1mg/ml的溶液进行测定。
通常地对于注射液而言,本领域通常要求沉降系数大于4s的产品认为合格。
4、注射液中聚肌胞的含量测定方法
【含量测定】 标准曲线的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的核糖对照品,精密称取适量,加水制成每1ml含20μg的溶液,取试管6支,分别加入0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml上述对照品溶液,再分别加水至2ml,然后每管中加入3,5-甲苯二酚试液(取3,5-甲苯二酚0.1g,加1%三氯化铁盐酸溶液2ml,再加盐酸使成100ml,临用现配)4ml,摇匀,在沸水浴中加热15分钟,取出冷却至室温,以第一管为空白,在665nm波长处分别测定各管的吸收度(A),以A值为纵座标,核糖的量(μg)为横座标,绘制标准曲线。
供试品的测定 取本品,加水制成每1ml中含40μg聚肌胞的溶液,精密量取1ml置试管中,照标准曲线制备项下,自“加水2ml……”起,依法操作。测出吸收度A,在标准曲线上查出对应的核糖含量C,按下式计算,即得。
实施例1:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH6.4)溶解后混合,加入10.7g壳寡糖混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙醇沉淀2小时,得到聚肌胞沉淀物,20℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为52.1%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为56.2%,制成干粉后的增色效应为65.9%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为66.6%。
实施例2:
称取3.5g聚肌苷酸和5.2g聚胞苷酸(1:1.5)各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入8.7g卡那霉素混合均匀,80℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙醇沉淀12小时,得到聚肌胞沉淀物,35℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为51.5%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为54.5%,制成干粉后的增色效应为58.4%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为66.4%。
实施例3:
称取5.4g聚肌苷酸和5.1g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)溶解后混合,加入10.5g卡那霉素和1.5g氯化钙混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的甲醇沉淀24小时,得到聚肌胞沉淀物,60℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为46.3%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为65.1%,制成干粉后的增色效应为68.0%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为51.3%。
实施例4:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入10.7g卡那霉素混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙醇沉淀0.5小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为52.3%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为64.8%,制成干粉后的增色效应为67.3%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为68.2%。
实施例5:
称取5.1g聚肌苷酸和5.3g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入10.7g卡那霉素混合均匀,100℃保温60min,自然冷却后,再用600mL的乙醇沉淀72小时,得到聚肌胞沉淀物,45℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为49.7%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为61.4%,制成干粉后的增色效应为64.3%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为63.3%。
实施例6:
称取5.5g聚肌苷酸和2.7g聚胞苷酸(1:0.5)各用100mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)溶解后混合,加入8.2g卡那霉素混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用800mL的乙醇沉淀12小时,得到聚肌胞沉淀物,30℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为50.5%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为56.8%,制成干粉后的增色效应为58.6%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为58.4%。
实施例7:
取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入2.2gε-多聚赖氨酸混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用600mL的乙醇沉淀4小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为80.2%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为65.4%,制成干粉后的增色效应为70.6%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为54.4%。
实施例8:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入5.3gε-多聚赖氨酸混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400ml的乙醇沉淀2小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为70.3%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为71.7%,制成干粉后的增色效应为75.4%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为63.5%。
实施例9:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH6.4)溶解后混合,加入10.7g壳寡糖混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙酸乙酯沉淀2小时,得到聚肌胞沉淀物,20℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为53.6%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为56.5%,制成干粉后的增色效应为66.3%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为89.7%。
实施例10:
称取3.5g聚肌苷酸和5.2g聚胞苷酸(1:1.5)各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入8.7g卡那霉素混合均匀,80℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙酸乙酯沉淀12小时,得到聚肌胞沉淀物,35℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为53.4%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为57.4%,制成干粉后的增色效应为61.2%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为91.2%。
实施例11:
称取5.4g聚肌苷酸和5.1g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)溶解后混合,加入10.5g卡那霉素和1.5g氯化钙混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙酸乙酯沉淀24小时,得到聚肌胞沉淀物,60℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为46.7%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为65.8%,制成干粉后的增色效应为68.5%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为90.5%。
实施例12:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入10.7g卡那霉素混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400mL的乙酸乙酯沉淀0.5小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为52.8%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为65.4%,制成干粉后的增色效应为67.6%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为88.7%。其照【鉴别】(3)进行紫外鉴别结果的图谱见图1,显示与经典的聚肌胞紫外图谱吻合。
实施例13:
称取5.1g聚肌苷酸和5.3g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入10.7g卡那霉素混合均匀,100℃保温60min,自然冷却后,再用600mL的乙酸乙酯沉淀72小时,得到聚肌胞沉淀物,45℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为50.4%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为61.9%,制成干粉后的增色效应为65.1%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为89.6%。
实施例14:
称取5.5g聚肌苷酸和2.7g聚胞苷酸(1:0.5)各用100mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)溶解后混合,加入8.2g卡那霉素混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用800mL的乙酸乙酯沉淀12小时,得到聚肌胞沉淀物,30℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为51.6%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为56.4%,制成干粉后的增色效应为58.9%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为87.9%。
实施例15:
取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入2.2gε-多聚赖氨酸混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用600mL的乙酸乙酯沉淀4小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为80.8%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为65.7%,制成干粉后的增色效应为71.2%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为92.1%。
实施例16:
称取5.2g聚肌苷酸和5.5g聚胞苷酸各用100mL磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解后混合,加入5.3gε-多聚赖氨酸混合均匀,60℃保温60min,自然冷却后,再用400ml的乙酸乙酯沉淀2小时,得到聚肌胞沉淀物,55℃干燥,即得双链聚肌胞干粉(其双链聚肌胞含量为71.2%)。
分别检测混合液和干粉248nm下的增色效应,结果如下:溶液时的增色效应为72.3%,制成干粉后的增色效应为75.1%。
本实施例中,按聚肌苷酸起始投料量计算双链聚肌胞的收率,为89.7%。
测试例1:聚肌胞的稳定性检测实验
分别取实施例1~16制备的双链聚肌胞干粉,进行稳定性检测,方法如下:将样品放置在30℃±2℃,相对湿度65%±5%的条件下,放置6个月。分别在1、2、3、6个月末取样,考察其含量、增色效应等项目。结果显示,全部试样在经6个月处置后,含量无明显变化(全部试样的含量与相应试样在0月时相比均在96.3~99.7%范围内),增色效应亦无明显变化(全部试样的增色效果与相应试样在0月时相比均在95.6~99.4%范围内)。表明采用本发明方法,制得双链聚肌胞干粉稳定性好,质量高,并且产率高。
以下制备注射液的实例中,使用实施例12所得聚肌胞为原料投料。
实施例21:
精确称取1.85g的Na2HPO4·12H2O和1.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为6.7的双磷酸盐缓冲液,依次加入0.2g双链聚肌胞干粉、8.50gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例22:
精确称取2.04g的Na2HPO4·12H2O和0.05g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为7.2的双磷酸盐缓冲液,依次加入2g双链聚肌胞干粉、8.77g NaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例23:
精确称取:2.26g的Na2HPO4·12H2O和0.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为8.0的双磷酸盐缓冲液,依次加入2g双链聚肌胞干粉、8.70gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例24:
精确称取1.85g的Na2HPO4·12H2O和1.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为6.7的双磷酸盐缓冲液,依次加入0.2g双链聚肌胞干粉、1g丙二醇、8.50gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例25:
精确称取2.04g的Na2HPO4·12H2O和0.05g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为7.2的双磷酸盐缓冲液,依次加入2g双链聚肌胞干粉、2g丙二醇、8.77g NaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例26:
精确称取2.26g的Na2HPO4·12H2O和0.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为8.0的双磷酸盐缓冲液,依次加入2g双链聚肌胞干粉、3g丙二醇、8.70gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例27:
精确称取1.85g的Na2HPO4·12H2O和1.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为6.7的双磷酸盐缓冲液,加入山梨酸钙2g使溶解,依次加入0.2g双链聚肌胞干粉、1g丙二醇、8.50gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例28:
精确称取2.04g的Na2HPO4·12H2O和0.05g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为7.2的双磷酸盐缓冲液,加入山梨酸钙3.5g使溶解,依次加入2g双链聚肌胞干粉、2g丙二醇、8.77gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例29:
精确称取2.26g的Na2HPO4·12H2O和0.06g的NaH2PO4·2H2O配成pH值为8.0的双磷酸盐缓冲液,加入山梨酸钙5g使溶解,依次加入2g双链聚肌胞干粉、3g丙二醇、8.70gNaCl溶解,溶液最终定容至1000ml。溶液除菌过滤;灌封;质检:产品各项指标均合格。
实施例30:
(i)向700ml注射用水中,添加使溶液pH值可达至7.2的Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O适量(二者总量以磷酸根计为8mmol)、以及山梨酸钙3.5g使溶解,将1g聚肌胞加至该溶液中使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入氯化钠8.5g和丙二醇2g使溶解,补加注射用水至1000ml,混合均匀;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
实施例31:
(i)向800ml注射用水中,添加使溶液pH值可达至6.6的Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O适量(二者总量以磷酸根计为3mmol)、以及山梨酸钙5g使溶解,将0.5g聚肌胞加至该溶液中使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入氯化钠9.5g和丙二醇3g使溶解,补加注射用水至1000ml,混合均匀;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
实施例32:
(i)向500ml注射用水中,添加使溶液pH值可达至8.4的Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O适量(二者总量以磷酸根计为12mmol)、以及山梨酸钙2g使溶解,将2.5g聚肌胞加至该溶液中使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入氯化钠8g和丙二醇1g使溶解,补加注射用水至1000ml,混合均匀;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
实施例33:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O替换为枸橼酸钠和枸橼酸(二者总摩尔量分别为8mmol、3mmol、12mmol,并分别将溶液的pH值调节至7.2、6.6、8.4),得到三个批次的注射液。
实施例34:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O替换为醋酸钠和醋酸(二者总摩尔量分别为8mmol、3mmol、12mmol,并分别将溶液的pH值调节至7.2、6.6、8.4),得到三个批次的注射液。
实施例35:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的山梨酸钙替换为山梨酸钾,得到三个批次的注射液。
实施例36:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的山梨酸钙替换为山梨酸,得到三个批次的注射液。
实施例37:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的丙二醇替换为甘油,得到三个批次的注射液。
实施例38:
分别参照实施例30-32的配方和方法,不同的仅是将其中的丙二醇替换为PEG400,得到三个批次的注射液。
实施例39:
取聚肌苷酸和聚胞苷酸纯化液(1:1),于50℃水浴中混合,搅拌60min,用0.45μm滤芯过滤,用Millipore超滤系统300KD的膜包浓缩成浓度为2.0mg/ml的液体,加入单硫酸卡那霉素3000单位/ml,精氨酸1.0%、抗坏血酸钠0.2%,甘露醇3.8%,混匀,无菌过滤,得到注射液。
实施例40:
(1)缓冲液的配制:取磷酸氢二钠1.5g和磷酸二氢钠0.2g,用注射用水1000ml溶解,即得。
(2)水饱和酚氯仿抽提:将聚肌苷酸和聚肌胞酸用0.5%的SDS溶液溶解,配制成30mg/ml溶液,用1/4体积的水饱和酚、氯仿抽提,100r/min搅拌10分钟,然后静置20分钟,取上清液加入2.5mol/L醋酸钠溶液至浓度为0.15mol/L,混匀后再加入2倍体积乙醇,4℃放置12小时,3000r/min离心20分钟,取沉淀。取沉淀加入一定量的PBS溶解备用。
(3)聚肌苷酸和聚胞苷酸的精制:将溶解好的聚肌苷酸和聚胞苷酸溶液,用注射器打入柱床内,用磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集洗脱峰。
(4)合并聚肌苷酸和聚胞苷酸:将精致的聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液分别加热至60±5℃,然后将聚胞苷酸溶液缓慢加入聚肌苷酸溶液中,在100rpm转速下搅拌60分钟,同时调节PH8.0左右,滴加硫酸卡那霉素200万单位,在滴加的同时不断搅拌。
(5)超滤:在无菌环境下用截留分子量为5KD超滤膜对样品进行浓缩,首先用无菌的每升含100万单位硫酸卡那霉素的磷酸盐缓冲液循环平衡超滤膜2L,将合并好的聚肌胞浓缩2倍,然后用含有硫酸卡那霉素的磷酸盐缓冲液洗脱4L。
(6)过滤:用0.45um滤芯对超滤后的聚肌胞溶液进行过滤。
(7)配制聚肌胞:取上述聚肌胞样品0.2ml,即含1mg聚肌胞、含200单位硫酸卡那霉素;加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.017ml,加入8mol/L磷酸盐缓冲液0.017ml,最后补加甘露醇注射液至0.5ml,混匀,无菌过滤,得到注射液。
实施例41:
取注射用水约900ml,搅拌溶解磷酸氢二钠1.55g、磷酸二氢钠0.26g、氯化钠8.77g。将此缓冲液平分成2份,并加热至50℃;一份溶解聚肌苷酸0.49g,另一份溶解聚胞苷酸0.51g。充分溶解后,在缓慢搅拌下,将聚胞苷酸溶液混入聚肌苷酸溶液中,混匀。向溶液中缓慢滴加葡萄糖酸钙溶液至终浓度为4mmol,并在缓慢搅拌下维持30分钟。冷却至室温,定容至1000ml。0.45μm滤芯过滤,灌封,得到注射液。
测试例2:注射液的稳定性检测实验
分别取实施例21~41制备的全部聚肌胞注射液进行稳定性检测,方法如下:将样品在30℃±2℃,相对湿度65%±5%的条件下,放置6个月。分别在0月时和6个月末取样,考察每一试样在6月时相对于其在0月时的百分含量、百分增色效应和百分沉降系数。这些百分含量、百分增色效应和百分沉降系数的计算方式为:6月值除以0月值再乘以100%所得的百分值。
结果:
对于全部试样,它们在6月时的百分含量均在94~98%范围内;
对于全部试样,它们在6月时的百分增色效应均在95~99%范围内;
对于实施例21-26以及实施例35-41中制备的全部注射液,它们在6月时的百分沉降系数均在73~85%范围内;对于实施例27-34中制备的全部注射液,它们在6月时的百分沉降系数均在93~97%范围内。
Claims (10)
1.一种聚肌胞注射液的药物组合物,其每1ml中包含:
聚肌胞0.5~5mg;
酸碱缓冲剂,其选自磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸,其在所述药物组合物中的浓度是2~15mmol/L且使得所述药物组合物的pH值在6.5~8.0范围内;
渗透压调节剂氯化钠,其在溶液中的重量/体积浓度是0.7~1.0%;
山梨酸钙,其在所述注射液药物组合物中的重量/体积浓度是0.2~0.5%;
丙二醇,其在所述注射液药物组合物中的重量/体积浓度是0.1~0.3%;
水。
2.根据权利要求1的药物组合物,其每1ml中包含聚肌胞的量为0.5~2.5mg。
3.根据权利要求1的药物组合物,其每1ml中包含聚肌胞的量为1mg。
4.根据权利要求1的药物组合物,其每1ml中包含聚肌胞的量为2mg。
5.根据权利要求1的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂在所述药物组合物中的浓度是3~12 mmol/L。
6.根据权利要求1的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂是磷酸盐缓冲对。
7.根据权利要求1的药物组合物,其中所述酸碱缓冲剂是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠二者的组合。
8.根据权利要求1的药物组合物,所述氯化钠在溶液中的重量/体积浓度是0.8~0.95%。
9.根据权利要求1-8任一项的药物组合物,其是照包括如下步骤的方法制备得到的:
(i)使酸碱缓冲剂和山梨酸钙用处方全量的50~80%的注射用水溶解,将聚肌胞加至该溶液中,使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入渗透压调节剂和丙二醇使溶解,补加注射用水至处方全量;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
10.制备权利要求1-8任一项所述药物组合物的方法,其包括如下步骤:
(i)使酸碱缓冲剂和山梨酸钙用处方全量的50~80%的注射用水溶解,将聚肌胞加至该溶液中,使溶解;
(ii)向步骤(i)所得溶液中加入渗透压调节剂和丙二醇使溶解,补加注射用水至处方全量;
(iii)使用微孔滤膜对步骤(ii)所得溶液过滤除菌,灌封至玻璃瓶中,密封,即得。
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聚肌胞注射液;无;《百度百科,http://baike.baidu.com/history/聚肌胞注射液/61577140》;20140619;第1页"成分"、"规格"章节。 * |
聚肌胞注射液检验方法的探讨;张梅村,等;《食品与药品》;20051231;第7卷(第6A期);第51-53页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN104434784A (zh) | 2015-03-25 |
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