CN103536900B - 含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物，其还含有10%～15%重量的表面活性剂、10%～15%重量的稳定剂、42%～46%重量的等渗调节剂和16～20%重量的缓冲液。本发明的有益效果是针对特定的促红细胞生成素模拟肽筛选出特定的药用辅料得到稳定的药物组合物。

Description

含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物

技术领域

本发明涉及含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物，其还包含10%～15%重量的表面活性剂、10%～15%重量的稳定剂、42%～46%重量的等渗调节剂和16～20%重量的缓冲液。

背景技术

多肽类药物目前已广泛应用于临床研究或治疗过程中。稳定的、高品质的、能够产业化生产的治疗性多肽类药物制剂，对于研究人员来说，还是一个重大的挑战。多肽类药物制剂的稳定性包括：化学稳定性和物理稳定性两大方面；影响其化学稳定性的因素主要是共价键的变化，如水解、脱氨、氧化、消旋或交联作用；影响物理稳定性因素包括变性、聚集、吸附或沉淀等。

促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和β型，其中，α型含34%的碳水化合物，β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素（recombinant humanerythropoietin,rHuEPO）,广泛用于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie,JC,Strickland,TW,Lane,J等(986）免疫生物学（lmmunobiol)72:213-224），其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞）中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人EPO的多肽链的分子量是18236Da.在完整的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40%(J.Biol.Chem.262:12059)。

促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正肾性贫血的疗效几乎100％，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占了119亿美元，有巨大的市场容量。

早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素（EPOGEN）用于肾性贫血的治疗，但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25%，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了30%。

促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。

在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。

当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。

当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的：过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答,促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素(Danna,RP,Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一国际展望（Erythropoietin inClinical Applications-An International Perspective.Marcel Dekker;1990:p301-324)。

促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作用来调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为85000～100000KD（Sawyer,et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3690-3694）由比较详细的叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有800～1000个位点。在这些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的结合位点的结合力比较弱，大约有570pM.有研究表明从感染了friend病毒贫血株的小鼠的脾脏红细胞对EPO的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为100pM，Kd水平低的为800pM。

随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，这个基因已经被克隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在WO90/08822中已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红细胞生成素受体的活化和二聚，这种二聚进一步导致了信号传导的开始。

促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找这些重要受体的激动剂和拮抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能刺激促红细胞生成素细胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间,因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制.

采用不同的制备工艺以及加添不同种类的稳定剂，常用于多肽类药物制剂的开发中，以提高其稳定性。对于非胃肠道制剂来说，储存期限至少为一年或者更长。考虑到样品运输过程的温度变化及震荡情况，有必要改善促红细胞生成素模拟肽药物组合物的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供含有式（Ⅰ）所示促红细胞生成素模拟肽的药物组合物，

其中还含有以下组份：

10%～15%重量的表面活性剂，选自聚山梨酯80和泊洛沙姆188；

10%～15%重量的稳定剂，选自L-谷胱甘肽和L-精氨酸；

42%～46%重量的等渗调节剂，选自氯化钠和甘露醇；和

16～20%重量的缓冲液，选自磷酸盐。

优选地，表面活性剂重量为13%。

优选地，稳定剂重量为14%。

优选地，等渗调节剂重量为24%。

优选地，缓冲液重量为18%。

优选地，缓冲液为磷酸氢二钾。

其中，所用术语具有以下含义：

术语“药物组合物”指包含活性化合物或其衍生物以及药物赋形剂（如缓冲液、防腐剂和张力调节剂）的产品。该药物组合物可用作治疗、预防和诊断的试剂；

术语“储存稳定的药物组合物”指其至少在2~8℃条件下稳定一年。稳定性包括化学稳定性和物理稳定性；

术语“药学可接受的”指正常药物开发中可以应用，即对患者的应用不产生毒副作用；

术语“药学可接受缓冲液”指药学上常用来保持药物的pH值环境恒定，缓冲液包括磷酸盐、醋酸盐、Tris、组氨酸盐和柠檬酸盐；

术语“等渗剂”指在药物组合物中用来改变药物组合物的渗透压的化合物。等渗剂包括NaCl、甘露醇、山梨醇、甘油和木糖醇等；

术语“稳定剂”指加至包含促红细胞生成素模拟肽的药物组合物中，用来起稳定作用的化合物。用于药物制剂的稳定剂的实例包括L-精氨酸、L-组氨酸、精氨酸和L-谷胱甘肽；

术语“表面活性剂”指是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的界面能定向排列，并能使表面张力显著下降的分子或离子。表面活性剂优选在界面积蓄，其亲水部分朝向水（亲水相），亲脂部分朝向油或疏水相（即玻璃、空气、油等等）。常用的阴离子表面活性剂有：去氧胆酸钠盐、十二烷基磺酸钠、氨基丁三醇十二烷基磺酸钠、辛酸钠；常用的阳离子表面活性剂有：溴化烷基三甲基铵、氯化苯甲烃铵、溴化十二烷基三甲基铵等；常用的非离子型表面活性剂可选自：泊洛沙姆、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、Brij35、Brij56、Brij72、Brij76等；

术语“约”指所述数值适当的接近，如加减10％。

本发明提供的含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物稳定性良好。

具体实施方式

本发明进一步通过如下实施例进行说明，所述实施例不理解为进一步的限定。本领域技术人员易于理解所述的特定方法和结果仅仅是说明性的。

参考例EPO

1、单体肽SEQ ID NO:8的制备

促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽的合成采用的是固相多肽合成的方法，这类多肽合成方法在许多文献中都有报道，可参见stewart,J.M.,and Young,J.D.,solidphase peptide synthesis 2d edition,novabiochem peptide synthesis notes.本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽采用手工合成的方法，树脂为rink amindresin，所用的氨基酸衍生物的α氨基由Fmoc（芴甲酰羰基）保护，半胱氨酸侧链巯基、谷胺酰胺侧链氨基、组氨酸侧链咪唑基由Trt（三苯甲基）保护、精氨酸侧链胍基由Pbf（2,2,4,6,7-五甲基二氢化苯并呋喃－5－磺酰基）保护，色氨酸侧链吲哚基、赖氨酸侧链氨基由Boc（叔丁氧羰基）保护，苏氨酸侧链羟基、酪氨酸侧链苯酚基、丝氨酸侧链羟基由tBu（叔丁基）保护。将所要合成促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽肽链的C末端氨基酸的羧基以共价键的结构同高分子的不溶性树脂（rink amind resin）相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过20％六氢吡啶/DMF溶液脱去氨基保护基，然后和过量的氨基酸衍生物反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后用三氟乙酸：水：乙二硫醇、三异丙基硅烷＝92.5：2.5：2.5：2.5混合溶液将肽链从树脂上裂解下来，经乙醚沉降得到促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽粗品，单体肽粗品使用C18反相制备柱分离纯化，即得所要的促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽。其中缩合和去保护反应步骤的中间控制采取的是茚三酮检测的方法，即当树脂肽链上有游离的氨基时，经茚三酮试剂检测会显蓝色，没有游离氨基时不显色（茚三酮试剂本身为黄色）。因此在进行缩合反应完毕后，通过茚三酮检测，如果显黄色（茚三酮试剂本身的颜色），则说明本步偶合完毕可以进行下一个氨基酸的偶合前的脱保护操作，如果显蓝色，则证明肽链上还有些游离氨基，需进一步的重复偶合或改变现有的缩合剂直至树脂肽经茚三酮检测为黄色。

2、SEQ ID NO:8环肽的制备

将27g促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽SEQ ID NO:8溶于3000ml20%冰醋酸中，然后缓慢滴加5%碘甲醇溶液，直到黄色不消失为止。反应液直接进行制备纯化，采用反相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters Symmetry Shield^TM RP183.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃,检测波长为214nm；以水（含0.05%的三氟乙酸）和乙腈（含0.05%的三氟乙酸）的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥得SEQ ID NO:8环肽9.3g（收率：15.7%）

3、功能小分子（LG-2）的制备

将4g LG-1-B（13mmol）溶于100mL N,N－二甲基甲酰胺中，加入羟基琥珀酰亚胺（3.1g，21mmol），DIC（4mL，26mmol）和DMAP（4-二甲基氨基吡啶）（12mg，0.08mmol）。搅拌过夜，减压浓缩。残余物溶于80ml乙酸乙酯，滤去不溶物。有机相依次用40ml饱和碳酸氢钠溶液，40ml饱和食盐水，40ml0.5N的HCl溶液，40ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机层并用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液减压浓缩，得白色固体LG-2：4.4g（产率约为68％）。

4、HH-EPO-008B的制备

将SEQ ID NO:8环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150ml N,N－二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol),322mg功能小分子（LG-2）(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分N,N－二甲基甲酰胺，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃,检测波长为214nm；以水（含0.05%的三氟乙酸）和乙腈（含0.05%的三氟乙酸）的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-008B:1.3g(收率约43％)。

5、HH-EPO-018B的制备

将0.5g HH-EPO-008B（0.98mmol）溶解在100mlN,N－二甲基甲酰胺中，加入39.6mg三乙胺(0.196mmol)，3.8g mPEG2-OSU（0.96mmol）,室温搅拌6小时。将反应液直接冲析入600ml冷乙醚中，析出固体，冰箱放置2小时后离心，经干燥得HH-EPO-018粗品。采用反相色谱法纯化HH-EPO-018B粗品，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(WatersSymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃,检测波长为214nm；以水（含0.05%的三氟乙酸）和乙腈（含0.05%的三氟乙酸）的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-018B:1.7g(收率约45％)。

实施例一

处方：

HH-EPO-018B，8g

泊洛沙姆188，15g

L-精氨酸，15g

甘露醇，42g

磷酸二氢钾，20g

实施例二

处方：

HH-EPO-018B，11g

聚山梨酯80，13g

L-谷胱甘肽，14g

氯化钠，44g

磷酸二氢钾，18g

实施例三

处方：

HH-EPO-018B，18g

泊洛沙姆188，10g

L-谷胱甘肽，10g

甘露醇，46g

磷酸二氢钾，16g

实验例一稳定性实验

将样品分别置25℃和40℃条件下考察其稳定性，考察指标为性状、有关物质、含量及浊度，结果见表1。

表1稳定性实验结果

结论：本发明提供的含有促红细胞生成素模拟肽的药物组合物稳定性良好。

Claims (5)

1.含有式(Ⅰ)所示促红细胞生成素模拟肽的药物组合物，

其中还含有以下组份：

10％～15％重量的表面活性剂，选自聚山梨酯80和泊洛沙姆188；

10％～15％重量的稳定剂，选自L-谷胱甘肽和L-精氨酸；

42％～46％重量的等渗调节剂，选自氯化钠和甘露醇；和

16～20％重量的缓冲液，选自磷酸氢二钾。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的表面活性剂重量为13％。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的稳定剂重量为14％。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的等渗调节剂重量为44％。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的缓冲液重量为18％。