CN106466485B - 一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体‑药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，其特征在于，所述药物偶联体还包括具有介导作用的分子及与细胞表面受体特异性结合的配体，所述配体为多肽或小分子配体，所述分子与配体可互相偶联、并与药物分子或连接子偶联形成药物偶联体、或分别单独与药物分子和连接子之一偶联形成药物偶联体。本发明的有益效果主要体现在：靶向和内吞（穿膜）结构的结合，从而实现以任何配体靶向多肽做为制导部分，从而拓宽了此类药物的靶向范围。该偶联体保证了药物在体内循环时的稳定性，并降低药物毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物偶联体，尤其涉及一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，属于生物医药化学领域。
背景技术
通常病变细胞的病理及生理特征都与正常细胞有显著不同，其中之一表现为病变细胞表面具有特异性或过度表达的物质(如：抗原，化学信号，受体等)，这些物质在正常细胞中无表达或低表达。抗体药物偶联体(ADC)，多肽-药物偶联体(PDC)，就是基于这一原理对疾病进行治疗的。目前虽已有一些药物上市或进入临床研究，但由于药物设计原理的原因，ADC和PDC药物在临床应用中均具有很大的局限性。
ADC目前主要应用于在肿瘤治疗领域。其所使用的靶向抗体对肿瘤细胞表面抗原具有极高的亲和力10-9～10-12(Kd，mole/Liter),因此其与目标细胞高特异性结合的同时，对含有相同靶点的正常细胞也有较高的结合能力。同时由于ADC在体内的代谢时间较长(1-3周)，因此其在体内留存的时间内会不断地杀伤正常细胞，极大的增大了药物的毒副作用。因此其所适用的病症必须是肿瘤和正常细胞表面抗原数量悬殊极大的，而目前所知满足此要求的疾病很少。
PDC在临床或临床前研究中用于治疗多种疾病，例如CN104248770 A、及CN102397554 B中均有揭示相应的多肽药物，但这些只是简单的把化疗药物与多肽连接，或在包埋了化疗药物的纳米颗粒或高分子材料里添加多肽，这样带来的缺点是，大部分多肽由于分子量较大及带电荷的性质导致其无法进入细胞，因此目前此类PDC大多数只适用于胞外治疗，严重限制了PDC的应用范围和药效。
肿瘤细胞和其他病变细胞(如血管内皮细胞、白细胞、脑毛细血管内皮细胞)表面存在着多种特异性或过表达受体，如铁蛋白受体(TFR)、密度脂蛋白受体、叶酸受体、低、尿酸激酶受体、肿瘤坏死因子受体，ICAM，整合素受体LFA-1等。这些受体的配体可分为蛋白类(铁蛋白、载脂蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1即LRP1等)，多肽类(胰岛素、SOR-C13、黄体生成素释放激素LHRH、生长激素抑制素SST-14等)，小分子类(叶酸及类似物，糖类化合物)。这些配体与受体结合具有特异性好、亲和力适中和生物效应明显的特性，与治疗性药物偶联形成配体-药物偶联体(LDC)可以明显提高药物的靶向性和药效，同时降低毒性。
其中蛋白类配体由于分子量大不易人工合成，且稳定性差。而多肽和小分子类配体分子量较小，可化学合成，化学修饰改善特性，在体内代谢较快，同时与受体亲和力适中10-6～10-9(mole/liter,Kd)，因此其在特异性地结合病变细胞的同时，对较低水平表达目标受体的正常细胞的杀伤力大大降低。但此类配体-药物偶联体在应用过程中仍存在很多有待解决的问题，如达不到治疗窗口所需的较强的亲和力，合适的半衰期和快速的细胞内吞。因此它们偶联常规化疗药物(如多柔比星，紫杉醇)时疗效低，偶联高效药物分子(如ADC常用的药物分子MMAE,DM1,等)后毒性大，未达到肿瘤治疗有效剂量就导致动物中毒死亡。
因此需要通过改造LDC，使其可以作用于病变细胞表面广泛存在的较高表达受体，拓宽靶向范围和治疗窗口，增强药效、并避免药物副作用。
发明内容
本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，其特征在于，所述药物偶联体还包括具有介导作用的分子及与细胞表面受体特异性结合的配体，所述配体为多肽或小分子配体，所述分子与配体可互相偶联、并与药物分子或连接子偶联形成药物偶联体、或分别单独与药物分子和连接子之一偶联形成药物偶联体。
优选地，所述具有介导作用的分子为叶酸及其类似物，或穿膜肽。
优选地，所述叶酸类似物包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。
优选地，所述穿膜肽包括肿瘤归巢肽、线粒体穿透肽、可活化细胞穿膜肽、抗菌肽。
优选地，所述多肽的序列为Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，命名为P10。
优选地，所述多肽的序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名为P11。
优选地，所述多肽的序列为Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，命名为P12。
优选地，所述多肽的序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名为P13。
优选地，所述连接子为二肽序列的多肽类连接子、二硫键连接子或pH依赖型连接子。
优选地，所述二肽序列为包含有缬氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸序列，所述二硫键连接子为DMDS、MDS、DSDM、NDMDS，所述pH依赖型连接子为顺乌头酸酐。
优选地，所述多肽为序列与P10中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。
优选地，所述多肽为序列与P11中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。
优选地，所述多肽为序列与P12中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。
优选地，所述多肽为序列与P13中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽
优选地，所述一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体的应用，所述靶向配体-药物偶联体可应用于肿瘤、免疫调节、心血管疾病的治疗。
本发明的有益效果：1)靶向和内吞(穿膜)结构的结合，通过在受体靶向的多肽序列上加了具有内吞介导作用的分子或有穿膜功能的结构使得此药物均能进入细胞，实现以任何受体靶向的多肽做为制导部分。2)利用双靶向配体增强药物偶联体对病变细胞的亲和性和靶向性，从而可以携带高效的毒素药物如MMAE，拓宽此类药物的治疗窗口避免药物副作用。3)连接子在细胞外部(胞间质、血液循环系统等)无法释放药物分子，保证了药物在体内循环时的稳定性，并降低药物毒性，不会对正常细胞产生毒害作用。进入靶向细胞内部后，连接子裂解释放出具有治疗作用的药物分子，同时可避免产生多药耐药性(MDR)。4)该偶联体可以将药物分子更换为多种化学结构中含有可以发生酰化反应的游离氨基，肿瘤、免疫治疗、心血管疾病、抗生素等药物，如美登素类(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。此偶联体不仅拓宽了LDC类药物的靶向范围和治疗窗口，而且增强了药效、避免了毒副作用。
附图说明
图1是偶联体在移植肿瘤动物体内浓度变化对比图。
具体实施方式
以下结合实施例具体说明本发明的制备方法：
本发明揭示了一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，所述药物偶联体还包括具有内吞介导作用的分子及与细胞表面受体特异性结合的配体，所述配体可以是多肽或小分子配体，但也存在一些有特例的配体同时具有内吞功能和靶向受体结合的功能(如叶酸，P11,P12多肽)。所述内吞介导分子与配体可互相偶联后、再与药物分子或连接子偶联形成药物偶联体、或分别单独与药物分子和连接子之一偶联形成药物偶联体。
其中，所述具有内吞介导作用的分子为叶酸及其类似物，或穿膜肽。所述叶酸类似物包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。采用叶酸和穿膜肽的具体原因是，由于叶酸和穿膜肽根据不同的作用机理均可大幅度改善药物分子细胞内吞特性。其中叶酸相对分子质量小，易于修饰和穿透肿瘤细胞、免疫原性低，因而具有到达靶点时间短、血液清除速度快、穿透力强、人体免疫反应低等优点。同时，大多数肿瘤细胞表面的叶酸受体数目和活性明显高于正常细胞，其受体FR在某些肿瘤细胞表面高度表达，而在正常组织无或很少表达，因而具有良好的肿瘤组织特异性。
细胞穿膜肽是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。能够运载多种生物学活性物质进入细胞内，并发挥相应的生物学活性和治疗作用，其转导效率高且不会造成细胞损伤，这一特性保证了各种大分子药物细胞内的高效输送。
所述以配体形式存在的多肽序列可以有多种形式，例如，为Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，为Soricidin蛋白碳端的13个氨基酸SOR-C13，命名为P10(US7119168，US12/886397)。所述P10上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，至少保留40％同源性。
或为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黄体生成素释放激素LHRH(Trends Endocrinol Metab,2004,15(7):300-310,Arch Gynecol Obstet,2012,286(2):437-442.)，命名为P11。所述P11上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，至少保留40％同源性。
又或者为Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，即生长激素抑制素SST-14(Science，1973，179(68)：77-79)，命名为P12。所述P12上的氨基酸序列同样也可以以天然、非天然氨基酸进行替换，至少保留40％同源性。
也可以为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黄体生成素释放激素LHRH类似物(Trends Endocrinol Metab,2004,15(7):300-310,Arch GynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名为P13。所述P13上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，在序列同源区间至少保留40％同源性。
所述连接子为二肽序列的多肽类连接子、二硫键连接子或pH依赖型连接子。
具体的，所述二肽序列为包含有缬氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸序列，所述二硫键连接子可为DSDM、DMDS、MDS，所述pH依赖型连接子为顺乌头酸酐。以上所述连接子的具体结构式见下表1所示。
表1：二硫键连接子的结构式：
由于本发明中的连接子需要在细胞内通过特定的条件如低PH裂解，二硫键还原，或溶酶体酶解后才能释放所携带药物，偶连体所携带的药物在没有释放下来前是没有毒性的，使得偶联体具有较低的毒性，同时保证了本发明中药物的稳定性。
所述药物分子为具有治疗作用的药物基团，包括细胞毒素(美登素衍生物MMAE、MMAF、DM1、卡奇霉素、多卡霉素、阿多来新、安曲霉素等)、化疗药物(紫杉醇，多柔比星)、酶抑制剂、酶激动剂、SiRNA或其他生物活性分子。其共同特点是化学结构中含有可以发生酰化反应的游离氨基，这些游离氨基被其他化学基团修饰后，将显著降低药物的细胞毒性，并在去除化学基团后可以恢复。
以下阐述本发明的作用机理：
首先，该配体-药物偶联体与靶向细胞的受体结合后，通过具有内吞介导作用的分子的透膜递送功能，被靶向细胞内吞，进入细胞内部。
进入靶向细胞内部后，通过细胞内部环境的变化(特异性酶切、pH变化、二硫键还原等)连接子可以裂解释放出具有治疗作用的药物分子(相当于去除药物分子的修饰基团)。而在细胞外部(胞间质)、血液循环系统等部位连接子无法释放药物分子，则该偶联体是一个无细胞毒性或低毒性的药物，不会对正常细胞产生毒害作用。
该偶联体可以将药物分子更换为多种肿瘤、免疫治疗、心血管疾病、抗生素等药物，如美登素类(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。
以下当内吞介导分子为叶酸或穿膜肽R9，多肽为P10，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，具体阐述本发明的合成方法及过程：
步骤一、P10保护肽树脂的合成
称取替代度为1.1mmol/g的Wang Resin 100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30分钟；称取Fmoc-Arg(pbf)-OH 142.7g(220mmol)，HOBt 35.6g(264mmol)，DMAP 2.7g(22mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入40.8ml DIC(264mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应3小时后，抽干，洗涤3遍。
将104ml醋酸酐、88.5ml吡啶溶于500mlDMF中，混合加入以上洗涤后的树脂，室温封闭5h，DMF洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Arg(pbf)-Wang Resin，检测替代度为0.53mmol/g。
称取Fmoc-Arg(pbf)-Wang Resin(Sub＝0.53mmol/g)75.5克(40mmol)于反应柱中，用DMF清洗3次，再用DMF溶胀30分钟。然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，再用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Pro-OH 40.4g(120mmol)，HOBt 19.4g(144mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入22.2ml DIC(144mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用DBLK脱除Fmoc保护基团。
重复上述操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH,然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，然后用DMF洗涤6次，用甲醇收缩两次，抽干，获得P10保护肽树脂171.6g。
步骤二、Folate-NHS的合成
将叶酸(44.1g，100mmol)溶解在2升DMSO中，然后用DCC(24.8g,120mmol)和NHS(23g，200mmol)混合，将混合物于常温下避光搅拌18小时。过滤不溶物，真空抽干，得到胶状固体。用冰乙醚洗3遍，抽干成黄色粉末，得到53.8g，无需进一步纯化，可以做下一步反应。
步骤三、中间体Folate-P10(Folate-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH)的合成
称取Folate-NHS 32.3g(60mmol)，用DMSO溶解，加入85.8g上述P10保护肽树脂，反应5分钟，滴加21ml(120mmol)DIEA，室温继续反应4h。DFM洗3遍，甲醇收缩，真空抽干，得到全保护肽树脂320.3g。
将上一步得到的肽树脂80g加入到1000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液640ml，TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚＝90:5:3：2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用100mlTFA洗涤，合并滤液，加入到4500ml无水乙醚中析出黄色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到黄色固体40.6g，粗肽收率97.1％。HPLC纯度76.3％。经HPLC纯化制备，冻干得到Folate-P1028.25g，纯度为98.6％。
步骤四、中间体R9-P10(Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH)的合成
称取部分第二步骤中得到的P10保护肽树脂，按照R9的序列依次偶联，得到R9-P10中间体。
步骤五、中间体(Mc-Val-Cit-PAB-MMAE)的合成
称取MMAE 7.18g(10mmol)加入到250ml三口烧瓶中，用无水DMF溶解，N2保护室温搅拌至澄清。加入Mc-Val-Cit-PAB-PNP 7.37g，HOAt 72mg(2mmol),反应5分钟，再滴加3.5ml(20mmol)DIEA，继续室温反应30分钟，升温40～50度反应至20h，期间通过HPLC监测反应。真空抽干DMF，通过进一步纯化得到产品Mc-Val-Cit-PAB-MMAE 10.7g，纯度为99.3％。
步骤六、偶联体LDC10B、LDC10H的合成：
称取上一步制备的得到Mc-Val-Cit-PAB-MMAE 6.59g(5mmol)加入到5000ml单口烧瓶中，并加入3300ml磷酸缓冲液，搅拌，保持PH＝7.2至澄清，加入中间体10.5g(5.02mmol)Folate-P10或R9-P10，室温反应2h，期间HPLC监测反应。反应完全后，过滤，通过HPLC制备，冻干分别得到14.53gLDC10B,12.37g LDC10H纯度99.2％，98.7％，收率分别为85.02％，81.34％。
同理，通过以上方法可获得具有偶联体LDC11B，LDC12B，LDC13B，LDC11H，LDC12H。
LDC10B，LDC11B，LDC12B，LDC13B，LDC10H，LDC11H，LDC12H的化学结构式分别如下表2所示：
表2：偶联体化学结构式示意表
以下对偶联体进行性能的测试，其中涉及的偶联体为：
LDC1为Folate-(PEG)3-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
LDC10A为P10-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
LDC11A为P11-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
偶联体LDC10B对相关肿瘤细胞毒性实验
样品：LDC10B
对照样品：MMAE，LDC1，LDC10A
主要细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3。
培养基：RPMI 1640Medium,no folic acid
实验方法：
1)人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞使用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
2)将人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。
3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100ul/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150ul/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。
4)用CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。
5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。
结果与分析：
LDC10B对人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3等大多肿瘤细胞都有杀伤作用，且IC50值低于LDC1，LDC10A对照，其结果如表3所示。
表3:偶联体LDC10B肿瘤细胞毒性(IC50值)对照表
单位(摩尔/升，M)
| 细胞名称 | H1299 | K562 | H460 | SKOV3 | HCC1954 | N87 | SK-BR-3 | 293A |
| MMAE | 0.86×10<sup>-9</sup> | 0.54×10<sup>-9</sup> | 0.77×10<sup>-9</sup> | 0.62×10<sup>-9</sup> | 0.45×10<sup>-9</sup> | 0.68×10<sup>-9</sup> | 0.52×10<sup>-9</sup> | 1.15×10<sup>-9</sup> |
| LDC1 | 2.62×10<sup>-7</sup> | 9.31×10<sup>-8</sup> | 1.92×10<sup>-7</sup> | 1.02×10<sup>-7</sup> | 9.44×10<sup>-8</sup> | 2.39×10<sup>-7</sup> | 9.82×10<sup>-8</sup> | 5.10×10<sup>-7</sup> |
| LDC10A | 5.09×10<sup>-7</sup> | 1.11×10<sup>-7</sup> | 4.83×10<sup>-7</sup> | 1.25×10<sup>-7</sup> | 1.06×10<sup>-7</sup> | 5.17×10<sup>-7</sup> | 1.09×10<sup>-7</sup> | 9.28×10<sup>-7</sup> |
| LDC10B | 5.88×10<sup>-8</sup> | 1.48×10<sup>-8</sup> | 5.04×10<sup>-8</sup> | 1.57×10<sup>-8</sup> | 1.41×10<sup>-8</sup> | 7.51×10<sup>-8</sup> | 1.59×10<sup>-8</sup> | 4.33×10<sup>-7</sup> |
LDC11B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验
样品：LDC11B
对照样品：MMAE，LDC1，LDC11A
主要细胞株：人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3。
培养基：RPMI 1640Medium,no folic acid
实验方法：
1)人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞使用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基在37℃，5％CO2条件下培养，细胞2-3天传一次。
2)将人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3,以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。
3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100ul/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150ul/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。
4)用CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。
5)然后在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。
结果与分析：
LDC11B对人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3等大多肿瘤细胞都有杀伤作用，且IC50值低于LDC1，LDC11A对照，具体结果如表4所示。
表4：LDC11B偶联体对相关肿瘤细胞毒性(IC50值)对照表
单位(摩尔/升，M)
| 细胞名称 | H460 | SKOV3 | 293A |
| MMAE | 0.58×10<sup>-9</sup> | 0.44×10<sup>-9</sup> | 0.86×10<sup>-9</sup> |
| LDC1 | 5.26×10<sup>-7</sup> | 2.95×10<sup>-7</sup> | 7.15×10<sup>-7</sup> |
| LDC11A | 6.67×10<sup>-7</sup> | 3.41×10<sup>-7</sup> | 1.31×10<sup>-6</sup> |
| LDC11B | 8.13×10<sup>-8</sup> | 4.38×10<sup>-8</sup> | 5.24×10<sup>-7</sup> |
LDC12B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验
样品：LDC12B
对照样品：MMAE
主要细胞株：人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，人胃癌细胞N87。
培养基：RPMI 1640 Medium,no folic acid
实验方法：
1)人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，人胃癌细胞N87，细胞使用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
2)将人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，人胃癌细胞N87，以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。
3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100ul/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150ul/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。
4)用CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。
5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。
结果与分析：
LDC12B对人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，人胃癌细胞N87等肿瘤细胞都有杀伤作用，具体结果如表5所示。
表5：LDC12B偶联体对相关肿瘤细胞毒性(IC50值)对照表
单位(摩尔/升，M)
| 细胞名称 | HCT-116 | GTL-16 | HEC-1A | SH-SY5Y | N87 |
| MMAE | 1.27×10<sup>-8</sup> | 6.38×10<sup>-9</sup> | 8.74×10<sup>-9</sup> | 2.4×10<sup>-8</sup> | 3.83×10<sup>-9</sup> |
| LDC12B | 8.26×10<sup>-7</sup> | 6.12×10<sup>-7</sup> | 6.31×10<sup>-7</sup> | 3.96×10<sup>-7</sup> | 1.2×10<sup>-6</sup> |
LDC13B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验
样品：LDC13B
对照样品：MMAE
主要细胞株：人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87。
培养基：RPMI 1640Medium,no folic acid
实验方法：
1)人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87，细胞使用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
2)将人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87，以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。
3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100ul/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150ul/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。
4)用CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。
5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。
结果与分析：
LDC13B对人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87等肿瘤细胞都有杀伤作用，具体结果如表6所示。
表6：LDC13B偶联体对相关肿瘤细胞毒性对照表,单位(摩尔/升，M)
| 细胞名称 | HCT-116 | GTL-16 | HEC-1A | PC-3 | N87 |
| MMAE | 1.27×10<sup>-8</sup> | 6.38×10<sup>-9</sup> | 8.74×10<sup>-9</sup> | 1.28×10<sup>-8</sup> | 3.83×10<sup>-9</sup> |
| LDC13B | 1.07×10<sup>-6</sup> | 7.55×10<sup>-7</sup> | 9.4×10<sup>-7</sup> | 1.18×10<sup>-6</sup> | 3.26×10<sup>-7</sup> |
LDC10H偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验
样品：LDC10H
对照样品：MMAE，LDC1，LDC10A
主要细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3。
培养基：RPMI 1640Medium,no folic acid
方法：
1)人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞使用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
2)将人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。
3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100ul/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150ul/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。
4)用CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。
5)然后在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。
结果与分析：
LDC10H对人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3等大多种瘤细胞都有杀死肿瘤细胞抑制生长，且IC50值低于LDC1，LDC10A对照，具体结果如表7所示。
表7：LDC10H偶联体对相关肿瘤细胞毒性对照表
单位(摩尔/升，M)
| 细胞名称 | HCC1954 | H1299 | SKOV3 | H460 | 293A |
| MMAE | 0.29×10<sup>-9</sup> | 0.71×10<sup>-9</sup> | 0.49×10<sup>-9</sup> | 0.56×10<sup>-9</sup> | 1.18×10<sup>-9</sup> |
| LDC1 | 7.79×10<sup>-8</sup> | 1.86×10<sup>-7</sup> | 2.01×10<sup>-7</sup> | 1.37×10<sup>-7</sup> | 6.33×10<sup>-7</sup> |
| LDC10A | 4.18×10<sup>-7</sup> | 7.88×10<sup>-7</sup> | 6.41×10<sup>-7</sup> | 7.24×10<sup>-7</sup> | 9.62×10<sup>-7</sup> |
| LDC10H | 3.6×10<sup>-8</sup> | 9.04×10<sup>-8</sup> | 7.38×10<sup>-8</sup> | 8.53×10<sup>-8</sup> | 2.13×10<sup>-7</sup> |
偶联体动物模型药效研究
实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解偶联体的抗肿瘤药效
LDC10系列偶联体对移植肿瘤抑制实验
治疗药物：LDC10B，LDC10H
动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；
实验方法
人大细胞肺癌细胞H460，人肺癌细胞A549，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100左右，开始分组给药治疗。
治疗过程：小鼠以3只为1组，用5、10mg/kg剂量，7天间隔4次注射，LDC10B，LDC10H及对照MMAE，PBS进行治疗。
监控动物的身体表现、体重和肿瘤尺寸。在实验过程中记录实验动物的死亡数。
结果与讨论：
LDC10B，LDC10H均能抑制人大细胞肺癌细胞H460，人肺癌细胞A549,卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，大多肿瘤在5、10mg/kg剂量连续3次给药后萎缩消失，具体结果如表8.1与表8.2所示。
表8.1：LDC10B偶联体对移植肿瘤抑制的效果对照表
表8.2：LDC10H偶联体对移植肿瘤抑制的效果对照表
LDC11系列偶联体对移植肿瘤抑制实验
治疗药物：LDC11A，LDC11B
动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；
实验方法
人大细胞肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100～200mm3左右，开始分组给药治疗。
治疗过程：小鼠以3只为1组，用5、10mg/kg剂量，7天间隔4次注射，LDC11A，LDC11B及对照MMAE，PBS进行治疗。
监控动物的身体表现、体重和肿瘤尺寸。在实验过程中记录实验动物的死亡数。
结果与讨论：
LDC11B在10mg/kg剂量下均能抑制人大细胞肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3肿瘤的生长，大多肿瘤连续3次给药后萎缩消失。LDC11A由于毒性较大第一次注射后即导致动物的死亡。具体结果如表9.1和表9.2所示。
表9.1：LDC11A偶联体对移植肿瘤抑制的对照数据表
表9.2：LDC11B偶联体对移植肿瘤抑制的对照数据表
偶联体在移植肿瘤动物体内药物浓度变化检测
样品：LDC10B，LDC10H
动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；
实验方法
人卵巢癌细胞SKOV3，乳腺癌细胞株HCC1954，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。
肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100～200mm3，开始分组给药。
分组给药：小鼠以3只为1组，用10mg/kg剂量，腹膜注射。
采血：给药前采血设定为0，给药后20min、2h、4h、24h采血，采血后离心取血清冷冻保存。
检测：采用鼠抗MMAE Elisa试剂盒检测血清中MMAE，LDC10B、LDC10H，及LDC10B、LDC10H代谢物的总含量。
结果与讨论：
在给药后24小时后，仅能检测到LDC10B在体内具有极少的药物含量，而LDC10H药物含量检测为零，说明其游离态药物在体内清除速度很快。具体结果如表10及图1所示。
表10：偶联体在移植肿瘤动物体内药物浓度变化数据对照表
| 浓度ug/ml | LDC10B | LDC10H |
| 给药前 | 0 | 0 |
| 20min | 10.8 | 0.77 |
| 2h | 5.035 | 0.58 |
| 4h | 0.53 | 0.196 |
| 24h | 0.1179 | 0 |
Claims (5)
1.一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，其特征在于，所述药物偶联体还包括具有介导作用的分子及与细胞表面受体特异性结合的配体，所述具有介导作用的分子与所述配体可互相偶联、并与所述连接子偶联形成药物偶联体，或分别单独与所述药物分子和所述连接子之一偶联形成药物偶联体；
所述具有介导作用的分子为穿膜肽，所述配体为多肽，所述多肽的序列为Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg、Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys、Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]或Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys。
2.根据权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，其特征在于：所述穿膜肽包括肿瘤归巢肽、线粒体穿透肽、可活化细胞穿膜肽、抗菌肽。
3.根据权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，其特征在于：所述连接子为二肽序列的多肽类连接子、二硫键连接子或pH依赖型连接子。
4.根据权利要求3所述的一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体，其特征在于：所述二肽序列为缬氨酸−瓜氨酸、苯丙酰胺-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸序列，所述二硫键连接子为DMDS、MDS、DSDM、NDMDS，所述pH依赖型连接子为顺乌头酸酐。
5.根据权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体在制备用于治疗肿瘤、免疫调节、心血管疾病的药物中的用途。
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| 促黄体激素释放激素类似物在肿瘤疾病中的应用;陈巍，等;《海峡药学》;20141230;第26卷(第9期);第80页右栏第1段-第81页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106466485A (zh) | 2017-03-01 |
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