CN113952315A - 一种抗癌药物及制备方法和具体应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗癌药物及制备方法和具体应用，将手性多肽金无限共价聚合物采用牛乳外泌体进行包被，通过手性肽寡聚化和纳米结构随着外泌体膜的融合而生长的方法进行制备。本发明工程化手性多肽外泌体及其制备方法为构建可口服的手性多肽衍生纳米结构提供了一种可行的策略，并有可能促进对包括癌症在内的更广泛疾病的手性纳米药物开发。

Description

一种抗癌药物及制备方法和具体应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体本发明涉及手性多肽技术领域。

背景技术

手性分子在我们的世界中无处不在，它们主要表现出现左旋和右旋旋光性，也称为对映异构体。然而，在生物界，包括碳水化合物、核酸和蛋白质在内的生命分子基本只有一种手性，在生物反应中产生对映体选择性。有趣的是，对映体的手性结构直接影响它们的生物学和药学活性，从而产生不同的生理效应。而且，天然多肽由L-对映体氨基酸组成，只提供天然L-蛋白酶才能特异性识别的结合位点。因此主链-侧链连接性和几何构型本质上的变化使得D-肽不能被天然L-蛋白蛋白酶识别，从而大大增加了其抗蛋白水解能力。受对映体选择性的启发，越来越多的D-对映体肽被开发用于克服天然L-肽的最大药学障碍，即对蛋白酶的敏感性和半衰期太短，其中一些已经被批准用于临床。

然而，细胞对D-肽的无效摄取限制了D-肽在细胞内的应用。研究表明，D-肽仅在细胞膜上富集而不在胞浆和细胞核中。为了克服穿过细胞膜的障碍，D-肽被直接显微注射到细胞内。这种方法虽然有效，但不能实际的应用到体内。细胞穿透肽(cell penetratingpeptides,CPPs)是另一种有效策略，被广泛用于增强细胞摄取D-肽。但其致命的缺陷限制了它的临床应用，其缺点不仅仅是对代谢下降的敏感性，细胞相容性差(尤其是阳离子CPPs)和体内靶向性不足。至于脂质体包裹技术，虽然先前的研究表明，聚乙二醇化脂质体中的D-肽具有极好的治疗效果，但是肽负载量低，脂质体精细的制造工艺以及迅速从肝脾排出的特点严重制约了其进一步应用。因此，现需要新的方法来促进D-肽的细胞摄取和靶向活性，使其可以从细胞外靶点扩展应用到细胞内靶点。

纳米药物已成为促进治疗药物内化的一种很有前景的方法。在这种情况下，可以通过改变药物的动力学特性，使细胞通过内吞或胞吞作用优先摄取。因此，将D-肽转化为纳米药物是实现高效细胞内化的可行方法。在纳米制造技术方面，一些手性生物纳米结构已经能通过光刻和分子自组装来制备。但是，大规模制备可靠的三维手性多肽衍生纳米结构仍然是一个挑战，而且虽然纳米技术和D-对映体可以保护治疗药物免受胃肠道严酷环境的影响，但药物从肠道吸收进入血液循环仍然是一个巨大的障碍。

发明内容

本发明针对现有技术中细胞对手性分子的无效摄取限制了手性分子在细胞内的应用，显微注射和细胞穿透肽都存在相应问题，聚乙二醇化脂质体中的手性分子负载量低，脂质体精细的制造工艺以及迅速从肝脾排出都不能满足手性分子的细胞摄取和靶向活性技术问题，本发明提供了一种抗癌药物及制备方法和具体应用，解决了现有技术中虽然手性在生物分子中普遍存在，但手性纳米药物，特别是口服的手性纳米药物极为罕见，手性纳米结构的制备还不成熟，生物利用度不足的技术问题。

具体的，一方面，本发明提供了一种抗癌药物，所述工程化手性多肽采用靶向嵌合的蛋白质。

进一步的，所述工程化手性多肽为p53激活剂。

进一步的，所述工程化手性多肽为手性多肽金无限共价聚合物(CPAICP)。

进一步的，所述工程化手性多肽采用牛乳外泌体进行包被。

进一步的，所述工程化手性多肽包括与MDM2高亲和力结合的右旋十二聚体基序DMBP，柔性三聚乙二醇连接链，以及与E3泛素召集子结合的基序VHL。

进一步的，所述工程化手性多肽的C末端引入了一个额外的巯基手性Cys残基和一个亲水性手性Arg残基。

另外一方面，本发明还提高了一种抗癌药物的制备方法，包括如下步骤：

(1)手性肽寡聚化。

(2)纳米结构随着外泌体膜的融合而生长。

进一步的，本发明所述步骤(1)手性肽寡聚化中Au³⁺被手性MVP中的硫醇还原后形成[MVP-S-Au(I)]n的聚合结构。

进一步的，本发明步骤(2)中步骤(1)的产物由Au(I)之间的亲和性驱动自组装成球形纳米结构。

本发明使用的D-肽是一种p53激活剂，可以特异性地降解癌细胞中最重要的p53负调控蛋白——MDM2。

本发明通过口服工程化手性多肽衍生外泌体在体内发挥了预期的作用，通过恢复p53信号通路来治疗肿瘤。

本发明的有益效果:

本发明提供的一种抗癌药物及制备方法和具体应用，使用牛奶中的外泌体提高口服药物生物利用度。这些外泌体可以通过新发现的Fc受体——FcRn，从胃肠道被吸收。随着miRNA和药物口服给药的成功，牛乳外泌体(cow milk exosomes,ME)表现出足够的交叉反应性，能作为患者口服给药的载体。手性肽衍生的纳米药物的抗蛋白水解能力，能使其抵抗消化道中富含多种蛋白酶的酸性环境，使其具备口服给药的条件。特别是在癌症治疗方面，阶段口服给药可以降低用药量，从而更加安全有效且副作用低，并能使癌细胞长期、持续地暴露于相对较低的抗癌环境中，所以比目前的注射或输注疗法更具优势。此外，由于口服给药是非侵入性，可以避免注射带来的疼痛、不适以及避免污染的优点，是给药的最佳途径。

本发明药物具有良好的药学特性，在胃肠吸收和血液循环过程中保持稳定，且口服给药后在肿瘤处大量聚集。在B16F10同种移植恶性黑色素瘤模型、LLC Lewis原位肺癌模型和患者源性异种移植(PDOX)小鼠模型中，口服工程化手性多肽衍生外泌体在体内发挥了预期的作用，通过恢复p53信号通路来治疗肿瘤。此外，口服工程化手性多肽衍生外泌体通过进一步激活T细胞增强了抗PD1的免疫治疗作用。口服工程化手性多肽衍生外泌体通过进一步激活T细胞增强了抗PD1的免疫治疗作用。

总的来说，本发明工程化手性多肽外泌体及其制备方法为构建可口服的手性多肽衍生纳米结构提供了一种可行的策略，并有可能促进对包括癌症在内的更广泛疾病的手性纳米药物开发。

附图说明

图1是本发明工程化手性多肽衍生外泌体的设计、合成和表征。

图2是本发明工程化手性多肽衍生外泌体口服给药后展现出良好的药学特性。

图3是本发明工程化手性多肽衍生外泌体可有效抑制同种移植B16F10黑色素瘤小鼠和原位LLC LUAD的肿瘤进展。

图4是本发明口服工程化手性多肽衍生外泌体能抑制结肠癌患者来源的原位异种移植(PDOX)模型中的肿瘤进展。

图5是本发明口服工程化手性多肽衍生外泌体增强同种移植B16F10黑色素瘤小鼠的免疫治疗。

图1中，

图1(A)手性MVP多肽的分子结构式。

图1(B)工程化手性多肽衍生外泌体合成示意图。

图1(C)HPLC-MS分析手性MVP肽的分子量和纯度。

图1(D)在含10％三氟乙醇的5mM磷酸缓冲液中，测定手性MVP肽和天然MVP在室温下的圆二色谱。

图1(E)手性MVP和p(chiralMVP)的Mark-Houwink分子量。

图1(F)p(chiralMVP)中Au4f的X射线光电子能谱分析。

图1(G)动态光散射仪在PBS中测量CPAICP和工程化手性多肽衍生外泌体的流体力学直径。

图1(H)工程化手性多肽衍生外泌体的透射电镜图像。

图1(I)在PBS中测量CPAICP和工程化手性多肽衍生外泌体在室温下的Zeta电位。

图1(J&K)工程化手性多肽衍生外泌体表面和膜内的Au4f(J)和S2p(K)的X射线光电子能谱分析。

图2中，

图2(A)在pH分别为4.0、6.5和7.4的含20％血清的PBS中，测量工程化手性多肽衍生外泌体的流体力学直径。

图2(B)在37℃标准的PBS缓冲液(pH6.0)中，工程化手性多肽衍生外泌体对10μg/mL胰蛋白酶和10μg/mL糜蛋白酶的抗蛋白水解测试。

图2(C)与RAW264.7细胞孵育4h后，巨噬细胞系对FITC标记的手性MVP、LPATIC、CPAICP和工程化手性多肽衍生外泌体的摄取。

图2(D)通过测定注射后不同时间点血液中Au的浓度，绘制工程化手性多肽衍生外泌体和CPAIC在C57/B6小鼠体内的血液循环曲线。误差线是三次重复样品的标准偏差。

图2(E)在灌胃给药后不同时间点测定工程化手性多肽衍生外泌体的肿瘤与正常器官或组织的比值。

图2(F)ICP-MS测定肿瘤中工程化手性多肽衍生外泌体或CPAICP的时间定量。

图2(G)灌胃给药后，工程化手性多肽衍生外泌体、CPAICP和LPAICP@ME在携带B16F10细胞的C57小鼠中的生物分布。

图2(H)工程化手性多肽衍生外泌体、CPAICP和LPAICP@ME的肿瘤与正常器官或组织的比值。

图2(I)灌胃给药后，工程化手性多肽衍生外泌体在C57/B6小鼠中的组织动力学。分别于给药后1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、168h处死。分离心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等器官/组织，采用ICP-MS测定金浓度。数据以均数±标准差表示。

图2(J)20mg/Kg工程化手性多肽衍生外泌体灌胃给药后C57/B6小鼠的体重。

图2(K)通过检测嗜酸粒细胞、细胞因子IL-2、IFN-γ和红细胞生成素的浓度，检测工程化手性多肽衍生外泌体在免疫活性的C57BL/6小鼠(n＝5)中的免疫原性。各组数据以均数±标准差表示。

图2(L)HPLC测定工程化手性多肽衍生外泌体在含谷胱甘肽或无谷胱甘肽的PBS缓冲液中的内容物释放曲线。数据以平均值±标准差表示。

图3中，

图3(A)同种移植B16F10黑色素瘤小鼠经指定治疗后的MDM2、MDMX、p53和p21免疫组化评分。

图3(B)工程化手性多肽衍生外泌体治疗小鼠同种移植瘤与对照组相比，差异表达基因的层次聚类。

图3(C)工程化手性多肽衍生外泌体治疗和对照组在p53信号通路和p53下游通路的GSEA分析。

图3(D)皮下接种黑素瘤小鼠的肿瘤生长曲线。数据以平均值±标准误差表示(n＝5)。

图3(E)实验结束时切除肿瘤的重量。P值采用t检验(*,P<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001)。

图3(F)实验结束时切除肿瘤的代表性照片及H&E染色。

图3(G&H)经指定治疗后具有代表性的LLC LUAD原位移植模型肺的照片(G)和H&E染色(H)。

图3(I)小鼠注射LLC细胞后，经不同药物治疗的存活率。

图4中，

图4(A)模型构建和治疗的示意图描述。

图4(B)ICP-MS定量测定工程化手性多肽衍生外泌体或CPAICP组健康PDOX模型小鼠肿瘤和器官中的金含量。He：心；Li：肝；Sp：脾；Lu：肺；Ki：肾脏；St：胃；Co：结肠；Re：直肠。

图4(C)带有结肠癌患者来源的异种移植瘤小鼠采用相应治疗后的图像。

图4(D&E)小鼠采用相应治疗后收集的肿瘤重量(D)和照片(E)。

图4(F)小鼠采用相应治疗后，肿瘤H&E组织切片的代表性照片(比例尺：60μm)。

图4(G)小鼠采用相应治疗后，肿瘤的H&E、TUNEL和组化染色组织切片的代表性照片(比例尺：60μm)。

图5中，

图5(A&B)小鼠采用相应治疗后，肿瘤切片中细胞毒性T细胞(CD3⁺/CD8⁺)(A)和调节性T细胞(CD4⁺/CD25⁺)(B)的免疫荧光成像(比例尺：60μm)。

图5(C)工程化手性多肽衍生外泌体联合Anti-PD1处理同种移植黑色素瘤小鼠与单独Anti-PD1处理小鼠相比，差异表达基因的层次聚类。

图5(D-H)GSEA分析Anti-PD1单独治疗和Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体组合疗法差异的通路，包括参与免疫反应T细胞活化(D)，CD8TCR通路(E)，T细胞趋化性(F)，调节T细胞细胞因子的生产(G)和T细胞介导的细胞毒性(H)。

图5(I)小鼠皮下接种黑色素瘤的肿瘤生长曲线。数据以平均值±标准误差表示(n＝5)。

图5(J&K)实验结束时切除肿瘤的照片(J)和重量(K)。P值采用t检验(*,P<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001)。

具体实施方式

下面结合附图1-5和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

实施例一：工程化手性多肽衍生外泌体及制备方法

本实施例使用一种p53激活剂——D-肽，可以特异性地降解癌细胞中最重要的p53负调控蛋白——MDM2。如图1A所示，本实施例的手性多肽命名为的手性MVP(MDM2 and VHLbridging peptide)。

本实施例MVP是一种靶向嵌合的蛋白质，由三个功能部分组成：与MDM2高亲和力结合的右旋十二聚体基序^DMBP(MDM2 bind D-peptide)，柔性三聚乙二醇连接链，以及与E3泛素召集子结合的基序VHL(Von Hippel Lindau factor)。

本实施例中为了偶联Au³⁺与D-肽，在手性MVP的C末端引入了一个额外的巯基手性Cys残基和一个亲水性手性Arg残基。

本实施例中，与构建的天然的MVP相比，^DMBP与MDM2结合的基序被改为左旋十二聚体基序，但其与MDM2亲和力几乎没有改变(图1B)。手性MVP的制备采用先前的FMOC化学的标准全化学合成法，可获得大量具有准确分子量的多肽(纯度>95％)(图1C)。手性MVP具有α-螺旋构象，其特征圆二色谱(characteristiccircular dichroism,CD)峰位于195nm，208和222nm处(图1D)。同时，天然MVP的CD谱与已知的典型α-螺旋二级结构一致，其X轴与手性MVP对称(图1D)，手性MVP与天然MVP互为对映异构体。

如图1B所示，工程化外泌体工程化手性多肽衍生外泌体制备方法，包括两个步骤：1)手性肽寡聚化；2)纳米结构随着外泌体膜的融合而生长。

在步骤1)中，Au³⁺被手性MVP中的硫醇还原后形成[MVP-S-Au(I)]_n的聚合结构，称为多聚手性MVP(p(chiralMVP))，其Mark-Houwink分子量显著增加(图1E)。此外，X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析表明，Au-4f-p(chiralMVP)的峰出现在82.4eV和85.9eV，与金元素Au-4f的基峰相比有负移(图1F)。XPS结果表明Au和硫醇之间存在配位键，且符合图1B所示的p(chiralMVP)的预期化学结构，并通过傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared,FT-IR)中Au-S键给出的特征红外吸收进一步证明了该结构(图S1)。

在步骤2)中，p(chiralMVP)由Au(I)之间的亲和性驱动自组装成球形纳米结构。动态光散射分析(dynamic light scattering,DLS)和FT-IR证实了CPAICP的成型结构，其流体力学直径为13.4nm(图1G)，特征红外吸光度符合指定多肽特征(图S1)。自发组装后，将超声破碎的外泌体膜加入到CPAICP胶体中，磁力搅拌5分钟，工程化手性多肽衍生外泌体形成均质且单分散的纳米颗粒(图1H)。值得一提的是，牛奶外泌体是从新鲜牛奶中超速离心提取的，且经过透射电镜图像(Transmission Electron Microscope,TEM)和CD63标记物的鉴定(图S2)。与CPAICP相比，增大的流体力学直径(图1G)和Zeta电位的右移(图1I)表明工程化手性多肽衍生外泌体被ME膜包被。工程化手性多肽衍生外泌体的XPS显示Au在工程化手性多肽衍生外泌体表面的信号不明显，但经Ar等离子体刻蚀后信号明显增加(图1J)，表明工程化手性多肽衍生外泌体的膜表面没有Au，这进一步支持了上述结论。此外，XPS测量的S2p电子能带表明，工程化手性多肽衍生外泌体表面的S为巯基形式，而不是工程化手性多肽衍生外泌体蚀刻后的配位形式，这与外泌体膜蛋白质中的巯基形式一致。

实施例二：工程化手性多肽衍生外泌体的制备方法

与实施例一不同的是：本实施例D-肽更换为靶向抑制beta-catenin的多肽类分子，靶向激活p53的多肽类分子～靶向抑制PD-L1的多肽类分子等靶向调节致病蛋白的多肽类分子。

本实施例牛乳外泌体更换为人源骨髓干细胞、间充质干细胞、脐带干细胞提取的外泌体或者可食用植物提取液来源的外泌体进行实验。

实施例二：工程化手性多肽衍生外泌体药物稳定性验证实验

工程化手性多肽衍生外泌体构建后，通过本实施例测试了其在中性和酸性pH值下的胶体稳定性。如图2A所示，工程化手性多肽衍生外泌体在pH7.4、6.5和4.0的PBS缓冲液中培养24h期间保持单分散，表明其在消化道中具有可靠的胶体稳定性。此外，为了验证工程化手性多肽衍生外泌体对胃肠道蛋白水解酶的抗性，将100μM工程化手性多肽衍生外泌体或其L-对映异构体，LPAICP@ME，与10μg/mL胰蛋白酶和10μg/mL糜蛋白酶在37℃标准PBS缓冲液(pH6.0)中孵育。经过48h孵育，LPAICP@ME中超过80％的L-肽被降解，而工程化手性多肽衍生外泌体中超过90％的D-肽依旧保持完整(图2A)。另外，本实施例合成了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的手性MVP、LPAICP、CPAICP和工程化手性多肽衍生外泌体，用流式细胞术检测巨噬细胞RAW264.7对这些多肽的摄取。如图2C所示，D-对映异构化和ME包被明显降低了巨噬细胞的摄取。理论上，抑制巨噬细胞摄取和良好的稳定性将延长工程化手性多肽衍生外泌体的血液循环。为了验证这一假设，本实施例通过电感耦合等离子质谱(ICP-MS)对健康C57/B6小鼠的¹⁹⁷Au进行定量，检测工程化手性多肽衍生外泌体和CPAICP的血液循环。小鼠血液代谢动力学的时间依赖性ICP-MS测量结果表明ME包被后能延长的血液循环时间(图2D)。总而言之，这些结果表明工程化手性多肽衍生外泌体具有良好的药物特性，可以在胃肠道吸收和血液循环过程中保持稳定。

实施例三：口服工程化手性多肽衍生外泌体肿瘤积累效验证实验

本实施例为了验证肿瘤靶向，通过在臀部右侧皮下注射5×10⁵个肿瘤细胞，建立B16F10黑色素瘤同种移植小鼠模型。以2mg/Kg的剂量口服工程化手性多肽衍生外泌体或CPAICP后，采用ICP-MS对携带肿瘤小鼠组织中的¹⁹⁷Au进行定量。如图2E所示，工程化手性多肽衍生外泌体在肿瘤与正常器官或组织中的时间依赖性积累比例显示肿瘤积累的趋势。更重要的是，工程化手性多肽衍生外泌体的肿瘤积累量是不含ME的CPAICP的近十倍(图2F)。此外，虽然工程化手性多肽衍生外泌体、CPAICP和LPAICP@ME呈现肝、脾、肾和肺堆积，但工程化手性多肽衍生外泌体能增加肿瘤积累和减少健康组织积累(图2G&H)。该结果表明D-对映异构化和ME包被具有优秀的肿瘤靶向能力，可能是因为稳定性增强和巨噬细胞逃逸。如图2I所示，ICP-MS结果显示积累在心脏、肝脏、肾脾和肺中的工程化手性多肽衍生外泌体在5天内被消除80％以上，表明工程化手性多肽衍生外泌体从生物体中可排出。另外，本实施例还测试了单次口服20mg/Kg工程化手性多肽衍生外泌体对健康C57/B6小鼠的急性毒性。结果显示给药后1周内未发现明显的体重减轻(图2J)，未观察到肝毒性(图S3)、肾毒性(图S4)、心脏毒性(图S5)和血液毒性(图S6)。更重要的是，工程化手性多肽衍生外泌体的高剂量给药对图2K中显示的四个免疫原性指标没有影响，表明本实施例的工程外泌体没有过敏反应和T细胞免疫原性反应。简而言之，这些结果表明本发明药物具有肿瘤靶向且安全的工程化口服手性肽外泌体。

工程化手性多肽衍生外泌体的另一个关键设计是它对细胞内还原环境的响应。通过高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)，在有或无10mMGSH的情况下模拟细胞内还原环境，监测手性MVP的释放动力学。工程化手性多肽衍生外泌体通常能保持其完整性。在没有GSH的情况下孵育12h后，大约有十分之一的肽释放，而与10mMGSH孵育，在6h内累积释放五分之四的肽(图2L)。1μM工程化手性多肽衍生外泌体孵育B16F10黑色素瘤细胞后，通过蛋白质免疫印迹分析(图S7)、流式细胞凋亡分析(图S8A)和细胞周期分析(图S8A)，表明释放的手性MVP可导致p53作用的恢复和随后的周期停滞以及细胞凋亡。

实施例四：口服工程化手性多肽衍生外泌体抑制肿瘤效果验证实验

为了进一步验证工程化手性多肽衍生外泌体的体内作用，本实施例探索了肿瘤体积范围为70-150mm³的B16F10黑色素瘤小鼠的p53恢复作用。设置等体积生理盐水对照组、工程化手性多肽衍生外泌体组、LPAICP@ME组(LPAICP中负载得多肽分子结构

，属于L型多肽)和NPAICP@ME(NPAICP为[PEG-S-Au(I)]n，负载的多肽分子结构为

，属于D型手型多肽)无药物载体组，以2mg/Kg灌胃给药，两天一次，共9天。免疫组化染色分析表明，工程化手性多肽衍生外泌体在降解MDM2及其同源蛋白MDMX和重新激活p53方面比其L-对映异构体LPAICP@ME更具活性，并与对照组和NPAICP@ME组形成鲜明对比(图3A和S9)。此外，转录组测序的信号通路分析显示，与对照组相比，工程化手性多肽衍生外泌体激活了894个差异表达基因(differential expressed genes,DEG)(图3B)。基因集富集分析(gene setenrichment analysis,GSEA)结果表明，在工程化手性多肽衍生外泌体处理的小鼠黑色素瘤同种移植模型中，最明显的差异上调通路中包含p53信号通路和p53下游信号通路(图3C)。因此，与对照组和NPAICP@ME组相比，工程化手性多肽衍生外泌体有效抑制小鼠黑色素瘤同种移植物的生长，在抑制肿瘤体积和重量方面，其体内活性高于LPAICP@ME(图3D-F)。

实施例五：口服工程化手性多肽衍生外泌体抑制肿瘤验证实验

本实施例中，采用小鼠肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)原位移植模型中再次验证药物药效。18只C57BL/6小鼠静脉注射接种5×10⁵LLC细胞，随机分为三组。小鼠荷瘤三天后，分别用2mg/Kg工程化手性多肽衍生外泌体、LPAICP@ME或等体积生理盐水灌胃给药，两天一次，共治疗14天。在给药14天后，与对照组和LPAICP@ME组相比，工程化手性多肽衍生外泌体显着降低了LUAD负担，肺结节数量(图3G)和肿瘤面积(图3H)明显减少。更重要的是，工程化手性多肽衍生外泌体将小鼠的中位生存时间(median survival time，MS)延长至40.5天，与模拟治疗小鼠的29.5天形成鲜明对比，而LPAICP@ME仅将MS提高至35.5天，显著低于工程化手性多肽衍生外泌体组(p<0.001)(图3I)。

实施例六：口服工程化手性多肽衍生外泌体抑制肿瘤验证实验

为了进一步验证口服工程化手性多肽衍生外泌体的效力，通过将结肠直肠癌患者的肿瘤组织原位植入NOD/SCID小鼠的结肠，建立了小鼠PDOX模型(图4A)。为验证肿瘤靶向性，PDOX小鼠模型灌胃给予100μg工程化手性多肽衍生外泌体或CPAICP(n＝3)，并通过ICP-MS进行生物分布测量。如图4B所示，给药后6小时，CPAICP主要分布在胃部，而工程化手性多肽衍生外泌体则集中在植入肿瘤组织的结肠和直肠(图4B)。治疗前，PDOX肿瘤的全外显子组测序揭示了有害的KRAS突变和野生型p53(图S10)，表明适用工程化手性多肽衍生外泌体治疗。将10只携带结肠癌PDOX的NOD/SCID小鼠随机分为两组(n＝5)，每两天灌胃给予2.0mg/Kg工程化手性多肽衍生外泌体或等体积生理盐水，共14天(图4A)。治疗后，与生理盐水组相比，工程化手性多肽衍生外泌体治疗可以明显缩小肿瘤体积(图4C-E)，且H&E和TUNEL染色显示工程化手性多肽衍生外泌体治疗中肿瘤组织凋亡细胞数量增加(图4F&G)。此外，下调的MDM2/MDMX和上调的p53/p21再次表明工程化手性多肽衍生外泌体的抗肿瘤机制是MDM2或MDMX降解和随后的p53恢复(图4G)。总的来说，这些结果表明，本发明的工程化口服外泌体工程化手性多肽衍生外泌体有效抑制了癌症进展。

实施例七：口服工程化手性多肽衍生外泌体免疫治疗实验

本实施例中，p53的激活总是倾向于通过进一步激活T细胞来增强免疫治疗。为了验证工程化手性多肽衍生外泌体的免疫治疗致敏作用，本实施例在同种移植B16F10黑素瘤小鼠RNA测序结果中进一步分析了T细胞相关信号通路。GSEA分析显示工程化手性多肽衍生外泌体治疗后CD4⁺细胞、CD8⁺细胞和T淋巴细胞的信号富集显著上调(图S11A-C)。同种移植B16F10黑色素瘤小鼠接受工程化手性多肽衍生外泌体治疗后细胞毒性T细胞(cytotoxicityTcells,CTCs)浸润增加再次证明了该结果(图S11D)。为了进一步验证，本实施例将15只肿瘤体积在70-150mm³的B16F10小鼠黑色素瘤小鼠平均分为三组：生理盐水组、Anti-PD1组和Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体联合治疗组。值得注意的是，工程化手性多肽衍生外泌体按上述治疗方案灌胃给药，抗PD1——抗小鼠PD1的中和单克隆抗体在治疗的第1天和第5天经静脉给药。治疗9天后，与Anti-PD1单药治疗相比，Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体联合治疗显示CTCs数量增加(图5A)，CTCs活性增强(图S12)，调节性T细胞数量减少(图5B)，提示免疫治疗作用增强。

对比GSEA分析Anti-PD1单药治疗和Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体联合治疗结果再次证实Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体联合治疗增强免疫治疗作用。其中，联合治疗中上调最高的通路包括参与免疫应答中的上调T细胞活性的基因、CD8TCR通路、T细胞趋化、调节T细胞细胞因子的产生和T细胞介导的细胞毒性(图5C-H)。因此，Anti-PD1/工程化手性多肽衍生外泌体联合疗法在抑制肿瘤进展方面比Anti-PD1单药疗法在体内更有效，这可以从肿瘤体积曲线(图5I)、肿瘤照片(图5J)和肿瘤重量(图5K)中得以证明。综上所述，这些结果说明工程化手性多肽衍生外泌体通过过度激活CTCs的功能而提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (15)

1.一种抗癌药物，其特征在于，所述药物包括内容物和外壳，所述内容物为手性多肽或者工程化手性多肽衍生体，手性多肽外包被有外壳。

2.如权利要求1所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述外壳为外泌体。

3.如权利要求1所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述手性多肽采用靶向嵌合的蛋白质。

4.如权利要求1所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述手性多肽为工程化手性多肽，所述工程化手性多肽为p53激活剂。

5.如权利要求4所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述工程化手性多肽衍生体为手性多肽金无限共价聚合物。

6.如权利要求2所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述外泌体采用牛乳外泌体。

7.如权利要求5所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述工程化手性多肽包括与MDM2高亲和力结合的右旋十二聚体基序^DMBP，柔性三聚乙二醇连接链，以及与E3泛素召集子结合的基序VHL。

8.如权利要求5所述的一种抗癌药物，其特征在于，所述工程化手性多肽的C末端引入了一个额外的巯基手性Cys残基和一个亲水性手性Arg残基。

9.如权利要求1-8任一项所述的一种抗癌药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)手性肽寡聚化；

(2)纳米结构随着外泌体膜的融合而生长。

10.如权利要求9所述的一种抗癌药物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)手性肽寡聚化中Au³⁺被手性MVP中的硫醇还原后形成[MVP-S-Au(I)]n的聚合结构。

11.如权利要求9所述的一种抗癌药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中步骤(1)的产物由Au(I)之间的亲和性驱动自组装成球形纳米结构。

12.根据权利要求1-8任一项所述抗癌药物为口服药物。

13.根据权利要求1-8任一项所述抗癌药物为恢复p53信号通路的药物。

14.根据权利要求1-8任一项所述抗癌药物为肺腺癌、黑色素瘤或者肠癌任意一种的药物。

15.根据权利要求1-8任一项所述抗癌药物为免疫治疗药物。

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