CN107998082B - 囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用。嵌段聚合物PEG‑P(TMC‑DTC)、PEG‑P(LA‑DTC)、PEG‑P(TMC‑DTC)‑PEI、PEG‑P(LA‑DTC)‑PEI、PEG‑P(TMC‑DTC)‑Sp、PEG‑P(LA‑DTC)‑Sp及其靶向聚合物按不同比例组合，可以制备不同靶向分子比例的双靶向还原敏感可逆交联囊泡。利用交联囊泡巨大的亲水内腔和(或)PEI与精胺（Spermine）与蛋白药物或者基因药物的氢键作用或者其他静电相互作用可以实现对小分子化疗药物、蛋白药物以及基因药物的高效包载。在体内双靶向载药交联囊泡不仅可以高效穿透血脑屏障而且可以增强纳米药物在肿瘤组织的穿透深度。双靶向载药交联囊泡可以实现更高效的跨越血脑屏障、更深的组织穿透深度，更多的胶质瘤细胞内吞，是非常有潜力的治疗脑胶质瘤的高效纳米药。

Description

囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于聚合物纳米药物技术领域，具体涉及一种可穿透血脑屏障、深入肿瘤组织并靶向脑肿瘤细胞的双靶向还原响应聚合物囊泡载药系统的应用。
背景技术
在世界范围内，癌症都是人类死亡的主要原因。脑肿瘤虽然发病率低却有极高的死亡率，预后极差。尽管医疗技术不断发展，脑肿瘤的治疗并没有取的大的突破，这主要是因为如下几方面的原因：一、脑肿瘤独特的生理病理特点，脑肿瘤浸润生长，常处于手术禁区，手术切除难度很大。血脑屏障的存在又使化疗药物在脑肿瘤部位的富集很低达不到治疗浓度。因为病灶部位特殊，放疗也受到极大的限制；二、即使是纳米载药系统在对脑肿瘤进行药物递送时也存在巨大挑战，现有纳米载药系统对小分子抗癌药以及高效低毒的蛋白药物和基因药物的装载效率较低；同时还存在载药纳米系统体内循环不稳定、难以穿透血脑屏障，脑肿瘤细胞摄取低、细胞内药物浓度低等问题；在循环过程中药物被酶降解活性降低，进入癌细胞后不能快速逃离内涵体，导致纳米药物的药效不高，这些都极大的限制了纳米载药系统在脑肿瘤治疗中的应用；三、在选择靶向分子方面也存在很多问题，即使是利用靶向载药系统进行脑肿瘤治疗，结果也常常不理想。例如，具有双靶向效果的靶向分子修饰的载药脂质体取得的脑肿瘤治疗效果也常常很有限。因为动物体内是一个复杂的环境，除了病灶部位会表现出相应受体的高表达，正常组织也有相关受体的表达。因此如果靶向分子靶向的受体分布选择性差，靶向分子除了可以靶向病灶部位，还可以靶向其他正常组织。这会带来严重的副作用。所以选择对肿瘤部位靶向能力强，同时不靶向正常组织的靶向分子显得尤为重要。此外，通过在药物载体表面修饰靶向分子理论可以实现血脑屏障的穿透，但是实际纳米药物穿透血脑屏障的量以及在脑组织穿透深度有限，这依然限制了脑肿瘤的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是公开一种还原响应聚合物囊泡纳米药物用于脑肿瘤治疗药物的制备，可以高效穿透血脑屏障、深入肿瘤实质并且进入脑肿瘤细胞。双靶向还原响应聚合物囊泡纳米药物用于脑肿瘤治疗优势显著：一、纳米载药系统包载的药物高效低副作用，即包载的药物对脑肿瘤细胞毒性强，对正常器官和组织毒性低；二、聚合物纳米系统可以高效包载药物，并且纳米载药系统在血液循环时稳定，在脑肿瘤细胞中可以快速释放药物；三、纳米载药系统可以高效的穿透血脑屏障，深入肿瘤实质并且被脑肿瘤细胞内吞，然后及时逃离内涵体，在细胞内快速释放药物。尤其在ApoE的基础上联合靶向分子iNGR，可以实现囊泡纳米药物穿透血脑屏障的能力进一步提高并且在穿透血脑屏障后能进一步深入肿瘤实质。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还公开了一种用于脑肿瘤治疗的药物体系，由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到。
一种脑肿瘤治疗纳米药物，由脑肿瘤治疗药物与分散介质混合得到；所述脑肿瘤治疗药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到。
本发明中，所述还原响应聚合物囊泡纳米药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由高聚物自组装后交联得到；所述高聚物为式Ⅰ的聚合物，或者所述聚合物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物、式Ⅲ聚合物的混合物；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ
Figure 142605DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅱ
Figure 528587DEST_PATH_IMAGE003
式Ⅲ
其中，R1与R5不同；
R1为第一靶向分子；
R2为以下结构式中的一种：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 872106DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure DEST_PATH_IMAGE006
R3为以下结构式中的一种：
Figure 64053DEST_PATH_IMAGE007
；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
R4选自氢或者以下结构式中的一种：
Figure 940742DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure DEST_PATH_IMAGE010
R5为第二靶向分子；
所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物或者式Ⅲ聚合物中，PEG链段的分子量为2000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～30%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～55%。
本发明中，所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述第一靶向分子为ANG、ApoE或者iNGR，第二靶向分子为ANG、ApoE或者iNGR；优选第一靶向分子为ApoE，第二靶向分子为iNGR、ApoE靶向分子可以帮助囊泡纳米药物高效穿过血脑屏障，而iNGR可以帮助囊泡纳米药物进一步深入肿瘤实质，达到很好的协同作用。进入肿瘤实质后双靶向载药交联囊泡可以显著提高脑胶质瘤细胞的内吞效率，提高细胞内的药物浓度，诱导癌细胞凋亡；ApoE序列为Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys ArgLeu Leu Cys，iNGR序列为Cys Arg Asn Gly Arg Gly Pro Asp Cys。
本发明中，所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物或者式Ⅲ聚合物中，DTC与LA/TMC无规共聚形成疏水链段，xy分别表示疏水链段中DTC的重复单元数以及LA/TMC的重复单元数，中括号表示疏水部分为整体，其一端接有亲水PEG；，亲水段1为PEG，其分子量为2000-10000Da；疏水段的总分子量为PEG分子量的2.5-10倍；疏水段中PDTC的分子量占整个疏水段总分子量的10%-30%；当亲水段2为PEI时，其分子量为PEG分子量的20%-55%。
所述PEI为支化（bPEGI）或线性（LPEI），其化学结构式为以下结构式的一种：
Figure 825521DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
上述技术方案中，所述聚合物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物、式Ⅲ聚合物的混合物时，式Ⅱ聚合物的用量为总物质的量的10%-30%，式Ⅲ聚合物的用量为式Ⅱ聚合物的物质的量的15%-100%，所述还原响应囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。
本发明中，以高聚物和药物为原料，通过pH梯度法或者溶剂置换法制备靶向还原响应囊泡纳米药物。
本发明还公开了上述靶向还原响应囊泡纳米药物在制备穿透血脑屏障药物中的应用，以及上述可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，和上述高聚物在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用。
本发明中，疏水链段包括的PDTC的总分子量为整个疏水链段分子量的10%～30%；所述小分子药物包括阿霉素盐酸盐，大分子蛋白质药物包括皂草素（SAP）、颗粒酶B（GrB），基因药物包括siRNA、mRNA、DNA。
本发明中，所述靶向还原响应囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。本发明的聚合物可自组装形成囊泡，亲水内腔大可高效包载亲水小分子化疗药物，即使载药量达到20wt.%，载药囊泡依然保持稳定，无药物泄露。在聚合物链末端增加修饰PEI或者精胺（Spermine）后，通过静电相互作用和氢键作用可以大大提高囊泡包载大分子药物（蛋白药物或者基因药物）的效率，载药量达到15wt.%时，包封率依然超过80%。同时，上述囊泡在到达癌细胞内后，细胞内的还原性物质GSH又可以快速触发药物释放。此外，囊泡可以载药穿透血脑屏障进入癌细胞发挥作用。包括脑肿瘤的一系列脑部疾病给药非常困难，不管是大分子药物（蛋白药物和基因药物）还是小分子化疗药物都很难入脑达到有效的治疗浓度。本发明为脑肿瘤的系统给药提供了一种有效方法，较传统纳米载药系统，本发明中的囊泡载药效率、体外稳定性和在肿瘤部位的富集以及药物释放速率都显著提高。
本发明设计的囊泡具有体外以及循环时交联稳定、整个递送过程中保持很高的药物活性、癌细胞内可解交联、同时靶向血脑屏障和脑肿瘤细胞和生物安全性好的特点。囊泡膜的外表面由聚乙二醇（PEG）组成，减少了循环过程中蛋白的吸附，包载大分子药物时，囊泡膜的内表面修饰较低分子量的PEI（400-5500Da）或精胺，可将大分子药物包载在囊泡内，交联的囊泡膜可保护药物不被降解防止药物泄露，并可延长药物的体内循环时间。囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC或者PLA，侧链的二硫戊环可提供还原敏感的可逆交联，囊泡膜内PEI或精胺除了用于复合药物如蛋白质、多肽和小分子药物，还能通过质子海绵效应逃逸内涵体，这样的设计不但支持生物药物在血液中的长循环，还可保证在细胞内逃离内涵体，快速解交联，释放药物到靶细胞。囊泡可以载药高效穿透血脑屏障并被脑胶质瘤细胞内吞。
本发明公开的靶向还原响应囊泡纳米药物的制备方法可举例包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的末端羟基用羟基活化剂比如氯甲酸对硝基苯酯（NPC）活化，再与PEI反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI；或者再与精胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-Sp或者PEG-P(LA-DTC)-Sp；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA -DTC)–PEI的PEG端偶联不同靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC- DTC)或者靶向PEG-P(LA-DTC)；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(TMC-DTC)、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(LA-DTC)、靶向PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；以PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；PEG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备具有抗肿瘤药物；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；以PEG-P(TMC-DTC)和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料，或者PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料，或者PEG-P(TMC-DTC)-Sp和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)-Sp和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料共混自组装、装载药物、交联得到肿瘤主动靶向具有不对称膜结构的药物囊泡，外壳为PEG、靶向分子可介导穿透血脑屏障增加脑胶质瘤细胞的内吞。第一靶向分子、第二靶向分子独立的选择多肽Angiopep-2-SH（ANG）、ApoE-SH及iNGR-SH，第一靶向分子、第二靶向分子不同。
比如上述制备方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC溶于干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到活化的PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC) -NPC；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC溶液滴加到PEI溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC -DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC溶液滴加到精胺溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-Sp或者PEG-P(LA- DTC)-Sp；步骤（2）为将得到聚合物Mal-PEG-P(TMC-DTC)或者Mal-PEG-P(LA-DTC)溶于带有靶向分子的有机溶剂如DMSO中反应得到靶向聚合物；步骤（3）为将原料溶液中加入缓冲溶液中，37摄氏度放置后在相同缓冲溶液中透析，室温孵育交联，得到抗肿瘤纳米药物。本发明可以在加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）下室温交联得到可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
本发明首次公开了双靶向还原响应聚合物囊泡纳米药物在脑肿瘤治疗中的应用，不仅具有制备方法简单、优良的控制释放能力、载体生物相容好、在体内长循环、保护包载药物不被降解的优点，更主要的是本发明双靶向聚合物囊泡可以高效的穿透血脑屏障、深入肿瘤组织、进入脑胶质瘤细胞并及时逃离内涵体释放药物，所以该双靶向囊泡纳米药物是脑肿瘤治疗的一个有力工具。
附图说明
图1是实例七囊泡穿透BBB体外模型的结果（A）、实施例八囊泡纳米药物的细胞毒性结果（B）；
图2是实例九囊泡在荷脑原位肿瘤鼠体内的分布结果；
图3是实例十治疗后荷瘤鼠的肿瘤生物荧光图；
图4是实例十治疗后荷瘤鼠的肿瘤生物荧光半定量结果（A）、治疗后荷瘤鼠的生存期(B)；；
图5是实例十治疗后荷瘤鼠肿瘤组织切片的TUNEl染色图。
具体实施方式
实施例一合成嵌段共聚物PEG5k-P(DTC2k-TMC15k) 和PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k
在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol),TMC (1.52 g, 14.55 mmol) 和DTC (0.23 g, 1.18 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0mL)中，搅拌快速加入催化剂磷酸二苯酯（DPP，DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40度油浴中磁力搅拌下反应2天。三乙胺终止、冰乙醚中沉淀两次、抽滤、真空干燥后得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)。
PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)的末端羟基氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与支化PEI（bPEI）的伯胺反应制得。具体的，PEG5k-P(DTC2k-TMC15k) (0.4 g, 羟基0.017 mmol)和NPC(50 mg, 0.09 mmol)溶于干燥的DCM中在0℃下反应24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-NPC。然后将产物溶于3 mL DCM后滴加到3 mL溶有bPEI (M n=1.8 kg/mol) (235mg, 0.13mmol)的DCM中，30℃下反应24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 7000) 48小时，接着在冰乙醚中沉淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k。产率：93.4%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02, PEI: δ 2.56-2.98。通过积分可知，聚合物的分子量和设计的理论分子量吻合，且GPC测定分子量分布窄，均说明该反应活性可控。
Figure 512461DEST_PATH_IMAGE013
实施例二靶向聚合物的合成
靶向聚合物的合成有多种方式，取决于PEG的端功能化基团。靶向二嵌段聚合物ApoE-PEG7.5k-P(DTC4.4k-LA19.8k)的合成分两步，第一步与PEG5k-P(DTC4.4k-LA19.8k)的合成类似，首先用Mal-PEG-OH (Mn = 7.5 kg/mol)替代MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol)引发DTC和LA的开环聚合得到Mal-PEG7.5k-P(DTC4.4k-LA19.8k)。第二步按多肽ApoE（序列为Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Cys）和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k)物质的量比为1.2：1反应，在氮气下将DMSO溶解的ApoE滴加到DMSO溶解的Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k)中，37度搅拌反应8小时。先用DMSO透析24时再用二次水透析12时后，冷冻干燥得到ApoE-PEG7.5k- P(DTC4.4k-LA19.8k)。通过核磁和BCA法表征多肽ApoE的接枝率为95%。
类似地，Mal-PEG7.5k-P(DTC4.4k-LA19.8k)和多肽iNGR（序列为Cys Arg Asn GlyArg Gly Pro Asp Cys）按照1：1.2物质的量比反应，可制备iNGR-PEG7.5k-P(DTC4.4k-LA19.8k)。通过核磁和BCA法表征多肽iNGR的接枝率为94%。
类似地，Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) 和多肽ApoE或iNGR 按照1：1.2物质的量比反应，可制备ApoE-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)或iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)，通过核磁和BCA法表征多肽ApoE或iNGR的接枝率分别为95%或92%。
类似地，Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) 和多肽ANG或iNGR按照1：1.2物质的量比反应，可制备ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)或iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)。核磁和BCA法表征多肽ANG或iNGR的接枝率分别为97%或92%。
类似地，NHS-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)，和多肽ApoE或ANG（序列为Thr Phe PheTyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr Cys）按照1：1.2物质的量比反应，可制备ApoE-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)或ANG-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)。核磁和BCA法表征多肽ApoE和ANG的接枝率分别为95%和93%。
实施例三 合成嵌段聚合物 PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-Sp
同实施例一法合成的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-NPC溶于3 mL DCM后，滴加到3 mL溶有精胺(26 mg, 0.13mmol)的DCM中，30℃下反应48小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 7000) 48小时、冰乙醚沉淀两次、抽滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp。产率：94.7%。核磁和TNBSA法表征Sp的接枝率为97%。表1列出了各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果，通过连接基团可以接上靶向分子。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例四 制备载DOX•HCl、以ApoE、iNGR为靶向分子的双靶向囊泡
将PEG5k-P(DTC2k-LA15k)、ApoE-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k)和iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k) 按物质的量比7:2:1分别溶于DMF（10 mg/mL），把100μL该聚合物溶液滴入950μL匀速搅拌的柠檬酸缓冲溶液（5 mM，pH 4.0）中，加入磷酸氢二钠饱和溶液将pH调至7.8，快速加入相应体积的阿霉素盐酸盐溶液（5mg/mL）,继续搅拌10min，37度静置交联12h，用磷酸盐缓冲溶液（10mM，pH 7.4）透析（MWCO 7,000）8h，每2h换一次缓冲溶液即得到载DOX×HCl的囊泡iNGR/ApoE-PS-DOX。将聚合物替换为PEG5k-P(DTC2k-LA15k)，采用同样的方法可得到无靶向的载DOX•HCl囊泡PS-DOX。将聚合物替换为PEG5k-P(DTC2k-LA15k)和iNGR-PEG5k-P(DTC2k-LA15k)（物质的量比为9：1），采用同样的方法可得到单靶向的载DOX•HCl囊泡iNGR-PS-DOX。
聚合物PEG5k-P(DTC2k-LA15k)和ApoE-PEG5k-P(DTC2k-LA15k)按照物质的量比为4：1混合，用同样的方法可得到单靶向的载DOX•HCl囊泡ApoE-PS-DOX。表2显示载不同比例DOX•HCl（10%-20wt%）的交联囊泡粒径为90-114 nm，粒径分布为0.02-0.14。紫外分光光度计测定DOX•HCl的包载效率为53.7%-67.3%。
表2 载DOX•HCl囊泡的表征结果
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE018
实施例五 制备载SAP、以ApoE、iNGR为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物
将PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k、ApoE-PEG7.5k-P(DTC2k- TMC15k)、iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)分别溶于DMSO（10mg /mL），按物质的量比15：4：1，7：2：1，13：4：3，3：1：1把50μL聚合物溶液注入950μL含不同浓度SAP的HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲溶液中，37℃静置，交联过夜。将得到溶液在PB中（10 Mm，pH 7.4）透析（MWCO 350,000）即得到载SAP的囊泡ApoE/iNGR-PS-SAP，表3显示载不同比例SAP（5%-15wt%）的交联囊泡粒径为69-91nm，粒径分布为0.03-0.15。BCA法测定SAP的包载效率为76.1%-87.1%。将聚合物替换为PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k，同样的方法可以制得PS-SAP。PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k和ApoE-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)按物质的量比为4：1混合，用同样的方法可以制得ApoE-PS-SAP。PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k和iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)按物质的量比为9：1混合，同样的方法可以制得iNGR-PS-SAP。
类似地，基于PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)和一种或两种靶向聚合物ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)或iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)可以制备载SAP、以ANG、iNGR为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物ANG/iNGR-PS-SAP，其粒径范围为60-95 nm，粒径分布为0.03-0.12。BCA法测定SAP的包载效率为75.5%-90.1%。
类似地，基于PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)和一种或两种靶向聚合物ApoE-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)或ANG-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)可以制备载SAP、以ApoE和ANG为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物ApoE/ANG-PS-SAP，其粒径范围为65-88 nm，粒径分布为0.04-0.11。BCA法测定SAP的包载效率为70.2%-93.1%。
表3 载SAP囊泡的表征结果
Figure 570416DEST_PATH_IMAGE019
Figure 708136DEST_PATH_IMAGE021
Figure 796440DEST_PATH_IMAGE023
实施例六 制备载GrB、以ApoE、iNGR为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物
将PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp、ApoE-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)、iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) 分别溶于DMSO（10mg/mL）。按物质的量比7:2:1把100 μL聚合物溶液注入950μL含不同浓度颗粒酶B的HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲溶液中，37度静置，交联过夜。将得到溶液在PB中（10 Mm, pH 7.4）透析（MWCO 350,000）即得到载颗粒酶B的囊泡iNGR/ApoE-RCCP-GrB。PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp用同样的方法可制得RCCP-GrB。PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp和ApoE-PEG7.5k-P (DTC2k-TMC15k)按物质的量比为4：1混合，用同样的方法可以制得ApoE-RCCP-GrB。PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp和iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)按物质的量比为9：1混合，同样的方法可以制得iNGR-RCCP-GrB。表4显示载颗粒酶B的交联囊泡粒径为61-68nm，粒径分布很窄（PDI=0.04-0.13）。
类似地，基于PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)和一种或两种靶向聚合物ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)或iNGR-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)可以制备载GrB、以ANG、iNGR为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物ANG/iNGR-PS- GrB，其粒径范围为60-85 nm，粒径分布为0.04-0.15。BCA法测定GrB的包载效率为79.5%-97.1%。
类似地，基于PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)和一种或两种靶向聚合物ApoE-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)或ANG-PEG7.5k-P(DTC5k-TMC23k)可以制备载GrB、以ApoE和ANG为靶向分子的双靶向囊泡纳米药物ApoE/ANG-PS-GrB，其粒径范围为60-88 nm，粒径分布为0.06-0.16。BCA法测定GrB的包载效率为80.2%-98.1%。
表4 载GrB囊泡的表征结果
Figure 19611DEST_PATH_IMAGE025
Figure 84519DEST_PATH_IMAGE027
实施例七 SAP的体外释放实验
实施例五制备的载SAP囊泡ApoE/iNGR-PS-SAP中SAP的体外释放实验在37℃恒温摇床中震荡（200 rpm）进行，每组各有三个平行样。分别在两种环境下释放，第一种，载SAP的交联囊泡在加入10 mM GSH模拟细胞内还原环境PB(10 mM, pH 7.4)中；第二组，载SAP的交联囊泡在PB (10 mM, pH 7.4)中；载药交联囊泡的SAP浓度为0.1 mg/mL，取0.5 mL 放入透析袋（MWCO: 350000）中，每个试管中加入相应的透析溶剂25 mL，预定时间间隔取5.0 mL透析袋外介质，同时向试管中补加5.0 m相应介质再用二次水透析（MWCO 3500），然后冻干再用BCA法测试SAP的浓度。结果发现，加入模拟细胞内还原环境的GSH后，SAP释放明显快于没加GSH的组，说明载药交联囊泡在10 mM的GSH的存在下能快速的释放药物，并且释放出的SAP二级结构完整保持了高的蛋白活性。
实施例八 囊泡纳米药物穿透血脑屏障体外模型评价
用BBB的体外模型来研究Cy5标记的载药囊泡穿透血脑屏障的效率。首先将bEnd.3细胞 (1 × 105细胞/孔) 铺于24孔板的上室内，下室加入800 μL DMEM培养基孵育48小时后，通过跨内皮电阻（TEER）仪（World Precision Instruments）测量bEnd.3单层的紧密度。其次，将培养液更换为无FBS 的DMEM，当bEnd.3细胞单层TEER值超过200 Ω.cm2时，50 μLHEPES的不同囊泡（ApoE/iNGR-PS-SAP、ApoE-PS-SAP、iNGR-PS-SAP、PS-SAP）加入transwell上室，37 ℃、50 rpm的摇床中孵育24小时收集下室或上室培养基，并用等体积的新鲜培养基代替。每收集一次都对TEER进行监测。随后通过荧光分光光度计（Thermo Scientific）测量外流比率。结果表明，与只修饰ApoE或iNGR的囊泡ApoE-PS-SAP、iNGR-PS-SAP相比，靶向联合囊泡ApoE/iNGR-PS-SAP有更高的穿透效率（图1A），显示出靶向联合的效果；同时，靶向分子密度也是影响靶向的重要因素（图1A），选择20%ApoE摩尔密度组合不同摩尔密度的iNGR（5%，10%，15%，20%）。实验结果显示，iNGR密度从5%提高至15%，囊泡的穿透效率显著提高，穿透率从21%提高至42%，当iNGR密度从15%提高至20%时穿透效率接近。所以，20%ApoE联合15%的iNGR是最佳的靶向密度，穿透BBB体外模型的效率最高。说明本发明的囊泡可以有效载药穿透血脑屏障。
实施例九 用MTT法测试空囊泡和载SAP囊泡对U-87 MG-Luc的细胞毒性
采用MTT法对空囊泡和载SAP囊泡对人脑胶质瘤细胞U-87 MG-Luc的毒性进行考察。将3×103的细胞接种到96空板中，培养24h后，加入不同浓度的载SAP囊泡ApoE/iNGR-PS-SAP、ApoE-PS-SAP、iNGR-PS-SAP、PS-SAP和自由SAP，另设细胞空白对照孔，平行4个复孔。培养4h后换掉培养基，加入新鲜培养基再培养68h。对于载体空囊泡，加入后一起直接孵育48小时。然后加入10微升MTT(5mg/mL)，37℃环境下作用4小时，弃掉培养基，加入150微升DMSO溶解甲瓒晶体，用酶标仪于492nm处测吸光度值，计算细胞存活率。结果表明，空载体在浓度不超过0.5 mg/mL时，细胞存活率超过88%，表明本发明的靶向和非靶向的空载体都显示出优异的生物相容性。如图1B所示，自由 SAP在50 nM时，细胞存活率依然高于85%；而对载SAP囊泡细胞毒性显著提升：SAP为50 nM时PS-SAP的细胞存活率下降至67%，而单靶向的ApoE-PS-SAP、iNGR-PS-SAP对U-87 MG 细胞毒性为40%；双靶向ApoE/iNGR-PS-SAP的细胞毒性为20%，远高于单靶向组，远高于无靶向组，其半致死浓度约为为5 nM。上述结果表明双靶向ApoE/iNGR可以近一步提高载药囊泡的细胞内吞效率，提高药物的细胞毒性。
实施例十 载DiR的囊泡纳米药物在荷原位脑胶质瘤小鼠体内的生物分布
所有动物实验操作均在苏州大学动物中心及动物保护及使用委员会批准下进行。活体成像系统就被用来考察修饰不同靶向分子的囊泡在脑肿瘤部位富集。肿瘤细胞的生物荧光可以清楚显示肿瘤的位置和相对大小。原位脑胶质瘤模型的建立：将U-87 MG-Luc细胞（1×107细胞悬浮于50 μL的0.9％NaCl中）注射到载体裸鼠BALB/c裸鼠的侧腹。当其肿瘤体积增长至约300 mm 3时，将载体小鼠处死以收获皮下肿瘤。然后将约2 mg切碎的脑肿瘤组织用专门制作的螺旋桨植入到每只麻醉动物的左侧纹状体（前颅侧2 mm，深3 mm）中（使用24＃套管针腹膜内注射戊巴比妥钠，剂量80 mg/kg）。由IVIS Lumina系统观察肿瘤生长情况，在成像前10-15分钟，腹腔注射100 μL荧光素酶(150 mg/kg)为底物。约两周后开始实验。尾静脉注射载荧光分子DiR的、不同靶向分子修饰的囊泡（ApoE/iNGR-PS、ApoE-PS、iNGR-PS和PS）后，不同时间点载荧光分子DiR囊泡在小鼠体内的分布情况。活体成像结果（图2）表明，囊泡选择性的富集在脑肿瘤部位，正常脑组织几乎观察不到荧光。注射纳米药物24h后，将荷瘤鼠的脑取出后发现，囊泡的确选择性地富集在脑肿瘤部位这与活体观察到的结果一致。ApoE/iNGR-PS 囊泡在脑肿瘤部位的荧光强度明显强于单靶向囊泡ApoE-PS、iNGR-PS和无靶向囊泡，表明本发明的靶向联合可以实现在小鼠原位脑肿瘤部位更高效的富集。
实施例十一 载SAP囊泡纳米药物治疗荷原位脑胶质瘤小鼠
用荷脑胶质瘤裸鼠模型进行载SAP囊泡的体内抗肿瘤效果的考察。如实施例十建立小鼠原位脑胶质瘤模型。尾静脉注射不同靶向分子修饰的囊泡（ApoE/iNGR-PS-SAP、ApoE-PS-SAP、iNGR-PS-SAP和PS-SAP）后，在特定时间点跟踪小鼠的生物发光情况和体重已经存活期。图3是荷脑肿瘤鼠不同时间点的肿瘤生物发光图，生物荧光强度可以半定量肿瘤的相对大小。图4A是不同药物治疗组的肿瘤生物荧光强度的半定量结果。图中显示连续给药后，尾静脉注射SAP组与PBS组无明显差异。无靶向组PS-SAP因为不能跨越血脑屏障，没有肿瘤抑制作用。单靶向ApoE-PS-SAP组和iNGR-PS-SAP组显示出较好的肿瘤抑制效果，而ApoE/iNGR-PS-SAP组则取得了最佳的肿瘤抑制效果，肿瘤的生物发光基本没有增长，这也证明了靶向联合使囊泡纳米药物可以实现更高效的血脑屏障穿透和肿瘤组织穿透。
脑胶质瘤病灶部位特殊且脑胶质瘤呈浸润生长，恶性程度高，到接种后第18天，PBS组小鼠状态明显变差，并且有小鼠死亡。PS-SAP组只有微弱的抗肿瘤效果，小鼠体重下降，状态变差，而iNGR-PS-SAP组和 ApoE-PS-SAP组直到32天和43天才开始有小鼠死亡。较两个单靶向组，ApoE/iNGR-PS-SAP组小鼠体重基本不变，生存期有进一步的延长，并且统计学分析有显著性差异。不同组的中位生存期分别为25天(PBS)、22天(SAP)、36天(PS-SAP)、41天(iNGR-PS-SAP)、54天(ApoE-PS-SAP)、63天(ApoE/iNGR-PS-SAP)（图4B）。
在给药结束后第6天，从各组随机取出一只，处死后取脑肿瘤做TUNEl染色，可以发现PBS组和SAP组的肿瘤组织无凋亡细胞，PS-SAP组只有很少的细胞凋亡，单靶向的ApoE-PS-SAP组和iNGR-PS-SAP组有明显的凋亡，而ApoE/iNGR-PS-SAP组小鼠的肿瘤组织的凋亡细胞则要显著得多。这再次证明了靶向联合ApoE/iNGR可以使载SAP囊泡在脑肿瘤部位有更多的富集，诱导更大程度的细胞凋亡（图5）。
实施例十二双靶向囊泡ApoE/ANG-PS-GrB 治疗荷原位脑胶质瘤小鼠
如实施例六制备的装载GrB双靶向囊泡ApoE/ANG-PS-GrB，尾静脉给药到荷脑胶质瘤裸鼠体内(0.1 mg GrB/kg)。结果显示，和PBS组相比，PS-GrB无明显差异，基本没有体现肿瘤抑制作用。ApoE-PS-GrB组和iNGR-PS-GrB组显示出较好的肿瘤抑制效果，而ApoE/iNGR-PS-GrB组则取得了最佳的肿瘤抑制效果，肿瘤的生物发光基本没有增长。PBS组接种后第18天开始有小鼠死亡；PS-GrB组小鼠体重下降明显，第30天出现小鼠死亡。ApoE-PS-GrB组和iNGR-PS-GrB组小鼠脑部肿瘤的生物发光显著减弱；而ApoE/ANG-PS-GrB的肿瘤抑瘤效果最好：肿瘤的生物发光有一定程度的下降，56天才开始有小鼠死亡。各组的中位生存期分别为22天(PBS)、36天(PS-GrB)，44天(iNGR-PS-GrB)，58天(ApoE-PS-GrB)和70天(ApoE/iNGR-PS-GrB)。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 1
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu
1 5 10 15
Leu Cys
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 2
Cys Arg Asn Gly Arg Gly Pro Asp Cys
1 5

Claims (10)

1.还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述还原响应聚合物囊泡纳米药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由高聚物自组装后交联得到；所述高聚物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物、式Ⅲ聚合物的混合物；
Figure 194653DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1与R5不同；
R1为第一靶向分子，所述第一靶向分子为ApoE或者iNGR；
R2为以下结构式中的一种：
Figure 783897DEST_PATH_IMAGE002
R3为以下结构式中的一种：
Figure 970159DEST_PATH_IMAGE003
R4选自氢或者以下结构式中的一种：
Figure 975155DEST_PATH_IMAGE004
R5为第二靶向分子；第二靶向分子为ApoE或者iNGR；
所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物或者式Ⅲ聚合物中，PEG链段的分子量为2000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～30%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～55%；
所述聚合物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物、式Ⅲ聚合物的混合物时，式Ⅱ聚合物的用量为总物质的量的10%-30%，式Ⅲ聚合物的用量为式Ⅱ聚合物的物质的量的15%-100%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述PEI的化学结构式为以下结构式的一种：
Figure 461631DEST_PATH_IMAGE005
所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物或者式Ⅲ聚合物中，PEG链段的分子量为3000-9000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～26%；PEI的分子量为PEG链段分子量的30%～50%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述还原响应聚合物囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以高聚物和药物为原料，通过pH梯度法或者溶剂置换法制备还原响应聚合物囊泡纳米药物。
5.还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备穿透血脑屏障药物中的应用，其特征在于，所述还原响应聚合物囊泡纳米药物为权利要求1所述还原响应聚合物囊泡纳米药物。
6.可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡为权利要求1所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
7.高聚物在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述高聚物为权利要求1所述高聚物。
8.一种用于脑肿瘤治疗的药物体系，其特征在于，由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由权利要求1所述高聚物自组装后交联得到。
9.根据权利要求8所述用于脑肿瘤治疗的药物体系，其特征在于，所述用于脑肿瘤治疗的药物体系中，药物的质量百分数为1%～30%。
10.一种脑肿瘤治疗纳米药物，由脑肿瘤治疗药物与分散介质混合得到；所述脑肿瘤治疗药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由权利要求1所述高聚物自组装后交联得到。
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