CN108186571B - 可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用,运用改进的纳米囊泡载体装载细胞内起作用的蛋白质,实现对全身肿瘤细胞的靶向递送,并在肿瘤细胞内快速释放药物,达到高效低毒治疗肿瘤的目标。结果说明HA‑RCP‑GrB在人急性髓性白血病AML‑2皮下瘤模型中具有高效抗肿瘤效率、低毒副作用,显著提高了模型小鼠的生存期。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤治疗药物,具体涉及一种可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用。
背景技术
急性髓性白血病(AML)是最常见的一种白血病,表现为骨髓中不成熟骨髓细胞克隆性富集和增生,导致分化的抑制、不完全成熟的不同阶段细胞的富集以及正常造血要素的减少[Ferrara F., et al. Lancet 2013, 381 (9865), 484-495.]。AML在各个年龄段都会发生;其临床表现多样且非特定,但通常可归因于白血球在骨髓中浸润及随之而来的血球减少,具体表现为贫血(疲劳和劳力性呼吸困难)、嗜中性白血球减少(易感染)和血小板减少(易出血),这些症状通常出现在诊断以及治疗过程中。白血球还可以在各种组织中的浸润包括肝脏(肝肿大)、脾(脾肿大)、皮肤(皮肤白血病)、淋巴结(淋巴结病),骨骼(骨痛)、齿龈和中枢神经系统,产生多种其他的临床症状。孤立的白血球细胞增殖通常被称为粒细胞肉瘤。白细胞过量增殖(每立方毫米大于100,000个白细胞)会导致白细胞停滞的症状如眼睛和脑血管功能紊乱或出血,通常还常伴有新陈代谢异常(如高尿酸血和低血钙)[Löwenberg B., et al. N Engl J Med 1999, 341 (14), 1051-1062.]。
目前临床上针对AML的治疗药物包括蒽环类药物、阿糖胞苷、道诺霉素、嘌呤类似物等,然而这些治疗方法的毒副作用很大,如骨髓抑制、心脏毒性和高复发率。易复发的疾病通常表现出耐药性[Burnett A., et al. J Clin Oncol 2011, 29 (5), 487-494.]。最近,CPX-351(脂质体包载的阿糖胞苷和道诺霉素(5:1))在治疗AML中展现出比标准疗法阿糖胞苷+道诺霉素更优异的治疗效果[Feldman E. J., et al. J Clin Oncol 2011, 29(8), 979-985.] [Lancet J. E., et al. Blood 2014, 123 (21), 3239-3246.]。脂质体的递送可以解决药物低的水溶性和差的生物利用度等问题,然而对于AML,这类疾病其肿瘤细胞遍布全身,急需要肿瘤细胞特异性的治疗剂进一步提高治疗效果,降低毒副作用。
因此,AML治疗急需要高选择性、高效低毒的靶向治疗。治疗性蛋白质是一类安全、高效的治疗剂,对于骨髓瘤的治疗具有很大的潜力;但是现有蛋白质治疗剂尤其是细胞内起作用的蛋白质的应用受到许多因素的限制,包括蛋白质在体内不稳定、易失活、半衰期短、免疫原性及无法穿透细胞膜等。因此,蛋白质药效的发挥需要寻找一个合适的载体。
发明内容
本发明公开了一种可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用;其中纳米囊泡因其独特的结构特征如亲水内腔、疏水保护膜和亲水“隐形”的外表面,可以克服蛋白质递送过程中的障碍,达到蛋白质装载效率高、肿瘤选择性好和肿瘤细胞内药物释放快的效果。
与其他肿瘤不同,在急性白血病中,肿瘤细胞遍布全身,且高度恶化,这也是现有其他肿瘤治疗药物无法治愈急性白血病的原因。为了解决现有技术问题,本发明运用改进的纳米囊泡载体装载细胞内起凋亡作用的蛋白质药物,实现对全身肿瘤细胞的靶向递送,并在肿瘤细胞内快速释放药物,达到高效低毒治疗肿瘤的目标。为此,本发明采用如下技术方案:
一种可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用。
一种可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物载体中的应用。
一种可逆交联不对称囊泡载药体系在制备治疗急性白血病药物中的应用。
一种高聚物在制备治疗急性白血病药物中的应用。
一种高聚物在制备治疗急性白血病药物载体中的应用。
本发明中,所述高聚物为聚合物A与聚合物B;所述聚合物A(PEG-P(TMC-DTC)-SP)的化学结构式如下:
所述聚合物B(Mal-PEG-P(TMC-DTC))的化学结构式如下:
所述聚合物A或者聚合物B中,PEG链段的分子量为2500-8500Da;疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8~7.5倍;疏水链段中,PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%~40%。
优选的,所述聚合物A或者聚合物B中,PEG链段的分子量为3000-7800Da;疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的3~6.5倍;疏水链段中,PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%~38%。
本发明中,所述聚合物A或者聚合物B中,DTC与TMC无规共聚形成疏水链段,n和m分别表示疏水链段中DTC的重复单元数以及TMC的重复单元数,中括号表示疏水部分为整体,其一端接有亲水PEG。
本发明中,所述可逆交联不对称囊泡由高聚物自组装得到,优选的,所述可逆交联不对称囊泡由高聚物自组装后表面修饰透明质酸得到,优选修饰的透明质酸的分子量为6500~50000 Da;比如,将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5mM)中,滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中,在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时,期间更换5次透析介质,得到囊泡溶液;在氮气保护下向囊泡溶液中加入巯基化的透明质酸(HA-SH),37℃摇床中过夜,最后用超滤管超滤离心(MWCO 100 kDa,1000 rmp, 10min)三次除去过量的HA-SH,得到可逆交联不对称囊泡。
本发明中,将高聚物、药物自组装得到可逆交联不对称囊泡载药体系;优选的将高聚物置于溶剂中,然后在蛋白质药物溶液中自组装后表面修饰透明质酸得到可逆交联不对称囊泡载药体系,比如将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中,滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中,在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时,更换4次以上透析介质,得到囊泡溶液;然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH,37℃摇床过夜,最后用超滤管超滤离心(MWCO 100 kDa,1000 rmp, 10 min)三次除去过量的HA-SH,得到自交联载蛋白质的HA修饰囊泡,即可逆交联不对称囊泡载药体系。
本发明中,聚合物B的摩尔量为总聚合物摩尔量的0~40%,优选5~35%,最优选30%。
本发明还公开了一种治疗急性白血病药物的制备方法,包括以下步骤,将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中,滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中,在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时得到囊泡溶液;然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH,并置于37℃摇床过夜,最后超滤管超滤离心(MWCO100 kDa,1000 rmp, 10 min)三次除去HA-SH得到自交联载蛋白质药物的表面HA修饰的囊泡,即治疗急性白血病药物。
本发明中,药物为蛋白药物,比如颗粒酶B(GrB)。
本发明设计了生物相容性优异、“隐形”、肿瘤特异性、可逆交联的不对称纳米囊泡作为多功能囊泡用于高效凋亡蛋白GrB在皮下和原位急性白血病模型中的肿瘤靶向递送和治疗。该多功能纳米囊泡是基于生物相容且生物可降解的成分聚乙二醇(PEG)和聚碳酸酯,具有重要的临床转化意义,其中精胺是一种天然的小分子胺,参与真核生物的新陈代谢,且在生理环境下带正电,可用于带负电分子如蛋白质、DNA和RNA的复合。在此,本发明首次将精胺引入到纳米囊泡的亲水内腔中用于蛋白质的装载。纳米囊泡的疏水膜是聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)和可逆交联的聚二硫戊环三亚甲基碳酸酯(PDTC),同时保证了纳米囊泡在血液循环中的稳定性和肿瘤细胞内的还原响应性;亲水壳PEG具有“隐形”的功能,可以避免囊泡与体内蛋白质和细胞的粘附而解离;同时在纳米囊泡表面修饰的透明质酸(HA)与多种肿瘤细胞具有高亲和力,利于纳米囊泡靶向内吞进入肿瘤细胞。到目前为止,这是采用多功能蛋白纳米载体用于治疗急性白血病及其恶性并发症的首次报道。
附图说明
图1是实施例一中HA17k-SH核磁谱图;
图2是实施例一中PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-SP核磁谱图;
图3是实施例二、三中HA修饰的还原敏感可逆交联囊泡的体外表征,其中A、B、C分别为空囊泡的DLS、TEM、稳定性和还原响应性表征图,D为载Cy5-CC囊泡对药物的释放图;
图4是实施例四、五、六中的HA修饰的还原敏感可逆交联囊泡(HA-RCP)在人急性髓性白血病AML-2细胞层面的表征,其中,A为空囊泡对细胞的毒性,B为载Cy5-CC囊泡被AML-2细胞的内吞情况,C为载颗粒酶B的囊泡(HA-RCP-GrB)对AML-2的细胞毒性情况;
图5是实施例七中HA-RCP在小鼠体内药代动力学曲线;
图6是实施例八中HA修饰的还原敏感可逆交联囊泡(HA-RCP)在人急性髓性白血病AML-2皮下瘤小鼠模型中活体成像(A)和离体成像(B)图;
图7是实施例九中HA-RCP-GrB对荷AML-2皮下瘤小鼠的治疗情况,其中A为治疗期间肿瘤体积变化及治疗结束后各组肿瘤图,B为体重变化,C为生存曲线,D、E分别为治疗结束后各组肿瘤的TUNEL染色和H&E染色组织学分析图;
图8是实施例九中HA-RCP-GrB、RCP-GrB和PBS组在AML-2皮下瘤小鼠模型中治疗结束后各主要脏器的H&E染色组织学分析图。
具体实施方式
实施例一 HA-SH和PEG-P(TMC-DTC)-SP聚合物的合成
HA-SH(分子量约17000Da)是由HA经两步反应得到的。首先,在氮气保护下将硼氢氰钠(126 mg, 2.0 mmol)加入到透明质酸(200 mg, 0.012 mmol)和胱胺二盐酸盐(35 mg,0.157 mmol)的硼酸缓冲溶液(pH 8.5, 50 mM, 10.0 mL)中,整个反应溶液在40℃条件下搅拌反应5天。接着在氮气条件下向反应溶液中加入二硫代苏糖醇(DTT,0.15 g, 1.0mmol),于室温下搅拌反应24小时。HA-SH在氮气保护下通过去离子水中透析(MWCO 3500)、冻干而分离得到。产率:84%。由ELLMAN试剂法可以测出HA-SH的转化率约为98%。氢核磁共振谱图显示除了HA的信号峰(δ 1.86, 3.28-4.02, 4.21-4.75)以外,在δ 2.68-2.98处有新的信号峰出现,这是HA端醛基与胱胺反应后形成仲胺旁边的亚甲质子峰和半胱胺上亚甲质子峰,通过比较HA (δ 4.21-4.75)处特征峰与δ 2.68-2.98处信号峰积分面积可知半胱胺的功能化度为100% (见附图1)。
在氮气手套箱内,依次称取MeO-PEG-OH (Mn=5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol)、TMC (1.52 g, 14.55 mmol) 和DTC (0.23 g, 1.18 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM,7.0mL)中,搅拌加入催化剂磷酸二苯酯(DPP,DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40℃油浴中磁力搅拌下反应2天;三乙胺终止,冰乙醚中沉淀两次,抽滤,真空干燥后得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)。与PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)的合成类似,用Mal-PEG-OH(Mn=7.5kg/mol)替代MeO-PEG-OH(Mn=5.0 kg/mol)做引发剂,引发DTC和TMC的开环聚合得到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)。和设计的理论分子量吻合,且GPC测定分子量分布窄,均说明该反应活性可控。
PEG-P(TMC-DTC)-SP聚合物是由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)经两步反应得到。首先,于冰水浴及氮气保护下向PEG-P(TMC-DTC) (1.0 g, 46μmol)和吡啶(18 mg, 230μmol)的DCM溶液(10.0 mL)中逐滴加入NPC (48 mg, 240μmol)的DCM溶液(1.0 mL),冰水浴中搅拌反应2小时,后于30℃搅拌反应24小时。反应产物PEG-P(TMC-DTC)-NPC在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到。接着,将PEG-P(TMC-DTC)-NPC(1.0 g, 46μmol)的DCM (4.0 mL)溶液逐滴加入到精胺(0.186 g, 920μmol)的DCM (5.0 mL)溶液中,滴加完毕后于30℃搅拌反应24小时后,用甲醇/DCM混合溶液(1/1)透析至澄清透明以除去反应中产生的对硝基苯酚,之后旋蒸再用DCM溶解所得产物,在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥即得到PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-SP。产率:89%。氢核磁共振谱图中发现PEG-P(TMC-DTC)的特征峰(δ 2.06, 3.02,3.64, 4.24, 4.32)、精胺的亚甲质子峰(δ 2.62-2.69)。通过比较PEG-P(TMC-DTC)与精胺信号峰积分面积比例计算出精胺的官能化度约为100% (见附图2)。
上述制备方法可表示如下:
通过类似方法可以通过改变开环聚合中的两种单体的比例、单体和引发剂的比例得到具有不同分子量的聚合物;聚合物PEG-P(TMC-DTC)-SP和Mal-PEG-P(TMC-DTC)中,PEG链段的分子量为2500~8500Da;疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8~7.5倍;疏水链段中,PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%~40%。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
实施例二 表面后修饰HA囊泡(HA-RCP)的制备
制备表面HA后修饰自交联囊泡用于主动靶向蛋白质药物的运载。与前修饰囊泡相比,HA后修饰囊泡可保证HA靶向分子充分暴露在囊泡外面以充分与肿瘤细胞表面的CD44作用,还可保证囊泡结构和尺寸不变。空白囊泡RCP是通过溶剂交换法制备是在室温搅拌下将50μL的按特定比例混合的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的DMSO溶液(10 mg/mL)加入到950 L HEPES缓冲溶液(pH 7.4)中,后在PB (pH 7.4, 5 mM)中透析8小时,更换6次透析介质。接着在氮气下加入相对于Mal基团1.2倍过量的HA-SH(17kDa),37℃摇床过夜,最后用超滤管超滤离心(MWCO 100 kDa,1000 rmp, 10 min)三次以除去过量的HA-SH,得到自交联HA后修饰囊泡xHA-RCP,其中x代表HA在囊泡中的摩尔百分比。通过DLS跟踪HA-RCP的粒径来研究其胶体稳定性(10 mg/L)和在10 mM GSH处理后的行为。
动态光散射(DLS)结果显示,当两种聚合物Mal-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比为0-3/7时,自交联囊泡在HA修饰前后粒径变化不大,均为95纳米左右,当Mal聚合物摩尔含量为40%时修饰前囊泡粒径增加到105纳米 (附图3A)。本发明采用Mal-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比在3/7以内的自交联囊泡进行后续研究,比如Mal-PEG-P(TMC-DTC)/PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比在3/7的囊泡称为HA30-RCP。Zeta电位测试结果显示HA修饰后电位由-1.1~0.086 mV转变为-3.75~ -8.12 mV (附图3A),这说明HA成功地修饰在聚合物囊泡表面。TEM结果显示HA后修饰的纳米粒为球形、中空结构的囊泡且尺寸与DLS测定结果相似(附图3B)。以HA后修饰密度为30%的自交联囊泡(HA30-RCP)为例进行后续表征。DLS结果显示HA30-RCP在稀释100倍后仍具有良好的稳定性,然而在10 mM DTT作用下HA30-RCP在24小时内快速溶胀到约500纳米 (附图3C)。以上结果表明HA后修饰囊泡在正常生理条件下具有优异的稳定性而在模拟细胞质和细胞核的还原条件下则会快速破坏解离。
巯基化透明质酸HA-SH的分子量为8kDa和35kDa表面修饰的同上的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)囊泡,发现囊泡粒径均在90~100 nm、Zeta电位为-4~-10 mV。
实施例三 表面后修饰HA囊泡装载颗粒酶B(HA-RCP-GrB)及还原触发的药物释放
HA囊泡对蛋白质如GrB的装载同实施例二。在室温搅拌下,将50 L的按特定比例混合的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的DMSO溶液(10 mg/mL)加入到950 L含有一定量GrB的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中,滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中,在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时,期间更换5次透析介质。用HA-SH后修饰载GrB囊泡的方法与空白囊泡一样:在氮气保护下于所得囊泡溶液中加入相对于Mal基团1.2倍量的特定量的HA-SH(17 kDa),37℃摇床过夜,最后用超滤管超滤离心(MWCO100 kDa,1000 rmp, 10 min)三次除去过量的HA-SH,得到自交联载GrB的HA后修饰囊泡。为了测定蛋白的装载量,采用FITC标记的细胞色素C (CC)作为模型蛋白来评估囊泡对GrB的装载能力,CC与GrB结构类似这是用于,且GrB量少、贵重,定量检测困难,且CC与GrB结构类似。包裹的FITC-CC通过紫外分光光度计来测量(494 nm)。
蛋白质的装载量(PLC)和包封率(PLE)根据以下的公式计算得到:
载药量(wt.%)=(装载蛋白质的重量/聚合物和蛋白质的总重量)×100
包封率(%)=(装载蛋白质重量/蛋白质总投入量)×100
当理论装载量为1 wt.%、2 wt.%、4 wt.%、6 wt.%时,FITC-CC的实际装载量分别为0.99 wt.%、1.86 wt.%、3.1 wt.%、4.4 wt.%,包封率分别为99%、88%、78%和73%。表2 列出了几种代表性囊泡载蛋白质的结果,发现载有CC的聚合物囊泡粒径与载有GrB的聚合物囊泡粒径相似,因此采用CC来模拟GrB的装载效率和体外释放行为。
表2 代表性HA修饰囊泡载蛋白质的结果(HA-SH:17 kDa)
注:*代表估算值;a和b分别表示用于动物和细胞实验的配方。
FITC-CC的体外释放实验于37℃下在两种不同的释放介质中进行,其中包括PB(pH 7.4, 5 mM)和10 mM GSH的PB (pH 7.4, 5 mM)溶液。将0.6 mL载有FITC-CC的囊泡(其制备方法与装载GrB一样)溶液装入透析袋(MWCO 350 kDa)中并置于20 mL相应的释放介质中。在每个取样时间点,取出6.0 mL释放介质,并补加6.0 mL相应的新鲜介质。FITC-CC的释放量通过荧光分光光度计(FLS920, 激发波长为492纳米,发射波长为517纳米)测定,每个释放实验平行进行三次,最终显示的是实验所得的平均值。结果显示,在正常生理条件(pH7,4 37℃)下,HA-RCP和PS抑制了FITC-CC的释放,24小时之内FITC-CC的累积释放量分别为14.6%和14.0%,而在10 mM DTT作用下HA-RCP和RCP的FITC-CC的累积释放量显著增加,在24小时内FITC-CC的累积释放量分别为82.1%和86.1% (附图3D)。以上结果说明该聚合物囊泡在还原条件下可以快速解交联破坏囊泡结构从而将蛋白质有效释放出来。
实施例四 MTT试验空囊泡的细胞毒性
HA后修饰比例不同的自交联囊泡(HA-RCP)的细胞毒性是采用人急性髓系白血病细胞AML-2通过MTT测定的。首先将100 µL细胞的IMDM悬浮液铺于96孔培养板(5×103个细胞/孔)中,并置于37℃,5% 二氧化碳条件下培养12 h。然后将20 µL空白的HA后修饰囊泡的PB (5 mM, pH 7.4)溶液(最终囊泡的浓度为1.0 mg/mL)加入到每孔中,于37℃,5% 二氧化碳条件下培养48小时。待培养结束后,向每孔中加入20 µL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5 mg/mL),并放入培养箱继续培养4 h以使MTT与活细胞作用。随后离心并移除上清液,向每孔中加入150 μL DMSO以溶解活细胞与MTT产生的紫色结晶甲瓒,并使用酶标仪(BioTek)测定每个孔在570 nm处的紫外吸收。细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在570 nm处的吸收相比得到(n=4)。
细胞存活率(%)=(OD490样品/OD490对照)×100%
MTT结果显示空白的纳米囊泡和HA后修饰的纳米囊泡在浓度为1.0 mg/mL对AML-2细胞均无毒(图4A),表2中所有空囊泡在检测的浓度范围≤1.0 mg/mL内细胞存活率均在85%以上,说明RCP和HA-RCP均具有良好的生物相容性。表2中所有空囊泡在检测的浓度范围≤1.0 mg/mL内细胞存活率均在85%以上,说明该系统具有良好的生物相容性。
实施例五 细胞内蛋白释放及细胞凋亡研究(FACS试验)
通过流式细胞仪采用荧光标记的Cy5-CC来研究载蛋白质的囊泡在AML-2细胞中内吞及细胞内蛋白质释放情况。将1.0 mL LP1细胞的IMDM培养液铺于6孔培养板(1×106个细胞/孔)中,37℃、5% 二氧化碳下培养12 h。然后将200μL载Cy5-CC的具有不同HA比例(10%、20%、30%)的HA-RCP和RCP的PB (10 mM, pH 7.4)溶液分别加入,37℃、5% 二氧化碳下培养4小时后用PBS离心洗涤2次,最终将细胞悬浮于500μL PB溶液中。荧光数据柱状图通过BDFACSCalibur (Beckton Dickinson,USA)流式细胞仪记录和Cell Quest软件分析得到。如附图4B所示,由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) (7/3)制备、RCP和修饰不同HA比例的HA-RCP均能进入AML-2细胞,且30%的HA后修饰囊泡组的荧光值更强,约为RCP荧光值的2.3-2.9倍。这些结果说明HA-RCP较之非靶向囊泡能够更有效地进入到AML-2细胞内且在肿瘤细胞内能有效释放蛋白质药物。
实施例六 MTT试验载蛋白药囊泡的细胞毒性
载有GrB的自交联囊泡(HA-RCP-GrB)对AML-2细胞的抗肿瘤活性也通过MTT实验测定。采用靶向能力最强的30% HA-RCP来进行实验,非靶向囊泡作为阴性对照。首先采用聚赖氨酸预处理96孔培养板,后将100 µL细胞的IMDM悬浮液铺于96孔培养板(3×103个细胞/孔)中,并置于37℃,5% 二氧化碳条件下培养12 h。然后将20 µL不同蛋白质浓度的30% HA-RCP-GrB和RCP-GrB的PB (5 mM, pH 7.4)溶液加入,37℃、5% 二氧化碳下培养4小时,培养板离心,吸走上清液并置换新鲜培养基,37℃、5% 二氧化碳下继续培养68小时。待培养结束后,向每孔中加入20 µL MTT的PBS溶液(5 mg/mL),继续培养4 h,离心并移除上清液,加入150 μL DMSO以溶解活细胞与MTT产生的紫色结晶甲瓒。用酶标仪(BioTek)测定每个孔在570 nm处的紫外吸收。细胞相对存活率的计算方法同实施例四。
MTT结果(附图4C)显示,对于由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) (7/3)制备、载GrB的囊泡HA-RCP-GrB毒性较强:在GrB浓度为0.05,0.1,0.5μg/mL时,载有GrB的30% HA-RCP(30% HA-RCP-GrB)比载有GrB的RCP (RCP-GrB) 的细胞存活率均更低,且当GrB浓度为0.5μg/mL时,30% HA-RCP-GrB的细胞存活率为55.0%,比RCP-GrB低17.7%。另外,由聚合物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-Sp和Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2)制备的载GrB囊泡含30% HA时,当GrB浓度为0.5μg/mL时,其细胞存活率为48.0%。说明30%HA-RCP-GrB与AML-2细胞具有强的相互作用,可被AML-2细胞有效摄取、快速解交联并释放蛋白质,从而有效杀死AML-2细胞。
实施例七 AML-2皮下瘤裸鼠动物模型的建立和HA-RCP的血液循环研究
所有动物实验操作均获得了苏州大学实验动物中心及苏州大学动物保护和使用委员会批准。血液循环实验采用健康的Balb/C小鼠(18~22 g)。荷AML-2皮下肿瘤的裸鼠的建立:在重量为18-20 g的雌性裸鼠的右侧背部皮下注射50 μL的AML-2细胞悬浮液(1×107个细胞/只)。两周后当肿瘤体积约为200 mm3时取出肿瘤,去除坏死部分取中间部分切成体积约为20 mm3的小块,然后在裸鼠右后背皮下注射肿块。当肿瘤体积达到约100~150 mm3时,可以开始肿瘤治疗实验,当肿瘤体积达到150~200 mm3时开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
将Cy5标记的HA-RCP和RCP溶液尾静脉注射到两组Balb/C小鼠中,不同时间点眼眶取血50 μL溶在100 μL 1%的曲拉通溶液,并用900 μL含20 mM DTT的DMSO萃取过夜后,离心取上层清液荧光(FLS920,激发波长为646 nm)定量。每组血液循环实验平行进行三次,最终显示的是实验所得的平均值。血液循环遵循典型的两室模型,第一相是分布相,通常呈现快速的降低,第二相是消除相,通常持续时间较长且在药物清除过程中起到主导作用。采用以下公式计算两相的半衰期(分布相为t1;消除相为t2):
y = A1 × exp (-x / t1) + A2 × exp (-x / t2) + y0
附图5为体内药代动力学结果,其表明由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)(7/3)制备的HA-RCP和RCP的血液循环曲线相似,但HA-RCP的分布相半衰期为5.23 h,比非修饰囊泡要长些(5.05 h),可能是由于与HA连接的PEG的链段较长(7.5vs 5.0 kg/mol)。表2中的其他组成的囊泡在HA-SH分子量为17 kDa时血液循环时间大致在4.8-5.8小时;而组成的囊泡在HA-SH分子量为8 kDa时血液循环时间大致在4.5-5.5小时;而组成的囊泡在HA-SH分子量为35 kDa时血液循环时间大致在5-6.5小时。
实施例八HA-RCP 在荷AML-2皮下瘤裸鼠的活体、离体荧光成像研究
如实施例七建立AML-2皮下瘤裸鼠模型来研究HA-RCP体内肿瘤靶向性。为了用荧光成像的方法检测荷瘤裸鼠体内囊泡释放蛋白质的分布情况,采用荧光分子Cy5-CC作为模型蛋白。当肿瘤体积达到~ 200 mm3时,将载有Cy5-CC、不同比例HA修饰的交联囊泡通过尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内,在不同时间点(6、9、12和24小时)使用小动物近红外成像系统(IVIS Lumina II)扫描拍摄并分析(Ex. 643 nm和Em. 668 nm)实时进行监测。附图6A可见,当注射6和9小时时,Cy5荧光随着HA后修饰比例增加而增加,在12小时时,20% HA-RCP组中Cy5荧光最强,在24小时时,30% HA-RCP组中Cy5荧光最强 (图6A),说明HA-RCP可大量富集到AML-2肿瘤部位并能将蛋白质有效释放。综合细胞流式和体内活体荧光成像结果,发现30% HA-RCP对AML-2肿瘤具有最强的靶向能力,因此在后续的动物实验中,均采用30% HA-RCP进行实验,并简称为HA-RCP。
荷瘤裸鼠器官离体荧光成像和生物分布研究是将载Cy5-CC、HA修饰的交联囊泡通过尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内,9小时后将肿瘤及心、肝、脾、肺、肾等主要器官收集、清洗、干燥并用Maestro小动物成像系统(CRi Inc.)进行荧光成像。附图6B显示了载Cy5-CC的30%HA-RCP和RCP经尾静脉注射到荷AML-2皮下瘤小鼠9小时后肿瘤及各主要器官中Cy5-CC的体外荧光成像图片。发现30% HA-RCP组裸鼠在肿瘤部位的荧光强度比在其他主要脏器如心、肝、脾、肺、肾等强很多;相比较而言,RCP组裸鼠在肿瘤部位的荧光较弱而在肝和脾的荧光更强。这些结果表明由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)(摩尔比7/3)组成、30%HA后修饰的HA-RCP可以高效地靶向到AML-2肿瘤部位并在肿瘤部位有效释放出蛋白质。
实施例九 HA-RCP-GrB在荷皮下AML-2瘤裸鼠体内的抗肿瘤活性研究
如实施例七建立AML-2皮下瘤裸鼠模型。当肿瘤体积达到约100 mm3时,将荷瘤裸鼠随机分为4组(每组6只),并以此量得的肿瘤体积和裸鼠体重作为第0天时的数据。将HA-RCP-GrB、RCP-GrB和PBS通过尾静脉分别注射入荷瘤裸鼠体内,每3天给药一次,GrB的给药浓度为50 μg/kg。定期用游标卡尺测量肿瘤的尺寸,并通过V = 0.5 × L × W2公式计算得到肿瘤体积(L为肿瘤的长度,W为肿瘤的宽度),相对肿瘤体积是通过V/V0(V0为第0天测定的肿瘤体积)计算得到的,而相对体重变化是通过M/M0(M0为第0天测定的裸鼠体重)计算得到的。给药结束2个周期,每组随机取出一只裸鼠处死,取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤在福尔马林中固定,然后石蜡包埋切片,用苏木精和伊红(H&E)染色,最后用莱卡正置显微镜(Leica QWin)观察。肿瘤组织用TUNEL染色试剂盒染色并通过荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡情况。每组裸鼠中出现自然死亡或者肿瘤体积超过1000 mm3的裸鼠均被视为死亡用以计算存活率。
结果显示,由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)(7/3)制备、30%HA后修饰的HA-RCP-GrB可以更有效抑制肿瘤生长,给药21天后HA-RCP-GrB组和RCP-GrB组及PBS组的相对肿瘤体积分别为3.0, 14.4和25.3(图7A)。这表明HA主动靶向性和肿瘤还原条件触发的药物释放可有效抑制肿瘤的生长。重要的是,给药21天后所有实验组荷瘤裸鼠的体重均有所增加(图7B),说明HA-RCP-GrB和RCP-GrB对裸鼠的毒副作用均较小。Kaplan-Meier生存曲线显示,与PBS和RCP-GrB组裸鼠相比,HA-RCP-GrB组裸鼠具有更长的生存期,三组小鼠的生存中值分别为16、21和38天 (图7C)。采用TUNEL染色的组织学分析结果显示HA-RCP-GrB显著提高了肿瘤组织的细胞凋亡。HE染色结果显示HA-RCP-GrB对肿瘤组织引起了大范围的坏死,RCP-GrB组肿瘤组织坏死情况减少,而PBS组肿瘤细胞生长旺盛(图7D&E)。
心、肝、脾、肺、肾等的HE染色结果显示HA-RCP-GrB、RCP-GrB组主要脏器组织几乎没有损伤 (图8)。以上结果说明30% HA-RCP-GrB在AML-2皮下异种移植瘤模型中不仅具有高效的抗肿瘤效率而且可以有效降低其对正常脏器的毒副作用。表2中的其他组成的囊泡装载GrB(0.7wt.%)、HA-SH分子量为17 kDa,治疗荷AML-2皮下瘤裸鼠时也能够显著抑制肿瘤的增值,使得小鼠的生存期到38-45天,同时系统毒副作用低。
本发明报道了多功能还原敏感自交联囊泡可以实现对蛋白质GrB的主动靶向运载,对人急性髓系白血病AML-2具有高的抗肿瘤活性。这些多功能囊泡药物具有以下优异特性:(i)该囊泡是由生物相容,生物可降解的聚合物组成的;(ii)该囊泡亲水内腔的精胺是天然小分子,具有良好的生物相容性,且可通过静电作用更好地包载蛋白质;(iii)具有良好的稳定性、对包载的药物渗漏少和延长的血液循环时间;(iv)该囊泡采用HA后修饰的方式可以使靶向分子更多暴露在囊泡外层且对囊泡结构和大小的影响很小;(v)主动靶向到人急性髓系白血病细胞,实现肿瘤组织高的药物富集量;(iv)该囊泡通过受体介导的内吞机制被肿瘤细胞摄取、在细胞质还原环境下解交联并释放药物,在体内皮下人急性髓系白血病裸鼠模型中均表现出高效的抗肿瘤效率。值得注意的是,该体系采用了后修饰的方式引入靶向配体,这些配体后修饰的多功能囊泡药物具有高效装载蛋白质、主动靶向性、强抗肿瘤活性且毒副作用小,已成为急性髓系白血病治疗中强有力的载体之一。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述透明质酸的分子量为6500~50000Da。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述药物为蛋白药物;所述透明质酸的分子量为6500~50000 Da。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液中,滴加完毕后转入透析袋中,在PB溶液中透析,得到囊泡溶液;然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH,37℃摇床中过夜,最后超滤管超滤离心得到可逆交联不对称囊泡载药体系。
6.根据权利要求1或者3 所述的应用,其特征在于,聚合物B的摩尔量为高聚物摩尔量的30%。
7.一种治疗急性白血病药物,其特征在于,将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液中,滴加完毕后转入透析袋中,在PB溶液中透析,得到囊泡溶液;然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH,37℃摇床中过夜,最后超滤管超滤离心得到治疗急性白血病药物;
所述聚合物A的化学结构式如下:
所述聚合物B的化学结构式如下:
所述聚合物A或者聚合物B中,PEG链段的分子量为2500~8500Da;疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8~7.5倍;疏水链段中,PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%~40%;所述HA-SH的分子量为6500~42000 Da;聚合物B的摩尔量为聚合物总摩尔量的5~35%;所述药物为蛋白药物GrB。
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