CN108451907B - 聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，运用改进的纳米囊泡载体装载细胞内起作用的蛋白质，实现对全身肿瘤细胞的靶向递送，并在肿瘤细胞内快速释放药物，达到高效低毒治疗肿瘤的目标。结果说明HA‑RCP‑GrB在多发性骨髓瘤LP1皮下和原位瘤模型中具有高效抗肿瘤效率、低毒副作用，显著提高了原位骨髓瘤小鼠的生存期，极大改善了骨病变、骨小梁破坏的状态。

Description

聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗药物，具体涉及一种多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤是一类全身性浆细胞恶性增生的疾病，其重要特征包括骨髓中存在大量的恶性浆细胞及其产生大量的单克隆蛋白。临床病发症状有贫血、低血钙、肾功能受损、溶骨性损伤及外周神经病变等。与实体瘤不同的是，在多发性骨髓瘤中，肿瘤细胞遍布全身，且高度恶化，无法治愈。骨髓瘤的治疗长期以来受到强毒副作用、高复发率和耐药性等的困扰。多发性骨髓瘤是美国和欧洲第二大常见恶性血液病，是一类起源于骨髓、全身性浆细胞恶性增生的疾病，其重要特征包括骨髓中存在大量的恶性浆细胞及其产生大量的单克隆蛋白[Röllig C., et al. Lancet 2014, 385 (9983), 2197-2208.] [Mahindra A.,et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2012, 9 (3), 135-143.]。多发性骨髓瘤与年龄性别有关系，诊断出多发性骨髓瘤的平均年龄为69岁，被诊断为多发性骨髓瘤病人中约四分之三年龄大于55岁，且三分之二为男性[National Cancer Institute. SEER stat fact sheets on multiple myeloma. 2013.]。临床并发症状最有代表性的是肿瘤细胞侵犯骨髓及软骨组织，引起骨髓正常细胞受抑制及溶骨性损伤，此外还有贫血、肾功能受损、低血钙、及外周神经病变等[ Palumbo A., et al. J. Clin. Oncol. 2014, 32 (6), 587-600.][Kumar S., et al. Lancet Oncol. 2016, 17 (8), e328-e346.]。与实体瘤如乳腺癌、肺癌、宫颈癌等不同的是，在多发性骨髓瘤中，肿瘤细胞遍布全身，且高度恶化，无法治愈。此外，多发性骨髓瘤与骨髓微环境关系密切，如：肿瘤促进的骨髓衍生的抑制细胞可以通过抑制免疫效应细胞从而引发多发性骨髓瘤细胞的生长，而骨髓瘤细胞也可以增加抑制细胞数量的增加[Görgün GT, et al. Blood 2013, 121, 2975–2987.]。骨髓瘤的治疗长期以来受到强毒副作用、高复发率和耐药性等的困扰[Dimopoulos M. A., et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2015, 12 (1), 42-54.] [Laubach J., et al. Leukemia 2016, 30 (5),1005-1017.]。其高复发性和耐药性主要是由于骨髓瘤细胞中少量的肿瘤干细胞，以及骨髓瘤并非由单一肿瘤干细胞衍生而来，而是由多种遗传多样性的肿瘤细胞亚型衍生而来[Chapman M. A., et al. Nature 2011; 471, 467–472.]。在骨髓瘤疾病自然发生过程中，不同骨髓瘤细胞均会发生克隆性增生，而在治疗过程中，克隆性增生会发生转变[EganJ. B., et al. Blood 2012, 120, 1060–1066.]。
因此，骨髓瘤治疗急需要高选择性、高效低毒的靶向治疗。治疗性蛋白质是一类安全、高效的治疗剂，对于骨髓瘤的治疗具有很大的潜力，比如细胞外起作用的蛋白质药物elotuzumab（靶向到骨髓瘤和NK细胞表面CD319的人源化单克隆抗体）和daratumumab（靶向到骨髓瘤细胞表面CD38的人IgG单克隆抗体）；但是现有蛋白质治疗剂尤其是细胞内起作用的蛋白质的应用受到许多因素的限制，包括蛋白质在体内不稳定、易失活、半衰期短、免疫原性及无法穿透细胞膜等。因此，蛋白质药效的发挥需要寻找一个合适的载体。
发明内容
本发明公开了一种多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用；其中纳米囊泡因其独特的结构特征如亲水内腔、疏水保护膜和亲水“隐形”的外表面，可以克服蛋白质递送过程中的障碍，达到蛋白质装载效率高、肿瘤选择性好和肿瘤细胞内药物释放快的效果。
与其他肿瘤不同，在多发性骨髓瘤中，肿瘤细胞遍布全身，且高度恶化，这也是现有其他肿瘤治疗药物无法治愈多发性骨髓瘤的原因。为了解决现有技术问题，本发明运用改进的纳米囊泡载体装载细胞内起凋亡作用的蛋白质药物，实现对全身肿瘤细胞的靶向递送，并在肿瘤细胞内快速释放药物，达到高效低毒治疗肿瘤的目标。为此，本发明采用如下技术方案：
一种多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
一种多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物载体中的应用。
一种多功能聚合物囊泡载药体系在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
一种多功能聚合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
一种多功能聚合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物载体中的应用。
本发明中，所述多功能聚合物为聚合物A与聚合物B；所述聚合物A（PEG-P(TMC-DTC)-SP）的化学结构式如下：
Figure 598309DEST_PATH_IMAGE001
所述聚合物B（Mal-PEG-P(TMC-DTC)）的化学结构式如下：
Figure 1609DEST_PATH_IMAGE003
所述聚合物A或者聚合物B中，PEG链段的分子量为2000-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～40%。
优选的，所述聚合物A或者聚合物B中，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～38%。
本发明中，所述聚合物A或者聚合物B中，DTC与TMC无规共聚形成疏水链段，n和m分别表示疏水链段中DTC的重复单元数以及TMC的重复单元数，中括号表示疏水部分为整体，其一端接有亲水PEG。
本发明中，所述多功能聚合物囊泡由多功能聚合物自组装得到，优选的，所述多功能聚合物囊泡由多功能聚合物自组装后表面修饰透明质酸得到，优选修饰的透明质酸的分子量为6000～40000 Da；比如，将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到HEPES缓冲溶液(pH7.4, 5 mM)中，滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中，在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时，期间更换5次透析介质，得到囊泡溶液；在氮气保护下向囊泡溶液中加入巯基化的透明质酸（HA-SH），37℃摇床中过夜，最后用超滤管超滤离心（MWCO 100 kDa，1000 rmp, 10min）三次除去过量的HA-SH，得到多功能聚合物囊泡。
本发明中，将多功能聚合物、药物自组装得到多功能聚合物囊泡载药体系；优选的将多功能聚合物置于溶剂中，然后在蛋白质药物溶液中自组装后表面修饰透明质酸得到多功能聚合物囊泡载药体系，比如将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中，滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中，在PB (pH 7.4, 5mM)溶液中透析8小时，更换5次透析介质，得到囊泡溶液；然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH，37℃摇床过夜，最后用超滤管超滤离心（MWCO 100 kDa，1000 rmp, 10 min）三次除去过量的HA-SH，得到自交联载蛋白质的HA修饰囊泡，即多功能聚合物囊泡载药体系。
本发明中，聚合物B的摩尔量为总聚合物摩尔量的0～40%，优选0～30%，最优选30%。
本发明还公开了一种治疗多发性骨髓瘤药物的制备方法，包括以下步骤，将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中，滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中，在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时，更换5次透析介质，得到囊泡溶液；然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH，并置于37℃摇床过夜，最后超滤管超滤离心（MWCO 100 kDa，1000 rmp, 10 min）三次除去HA-SH得到自交联载蛋白质药物的表面HA修饰的囊泡，即治疗多发性骨髓瘤药物。
本发明中，药物为蛋白药物，比如颗粒酶B（GrB）。
本发明设计了生物相容性优异、“隐形”、肿瘤特异性、可逆交联的不对称纳米囊泡作为多功能囊泡用于高效凋亡蛋白GrB在皮下和原位多发性骨髓瘤模型中的肿瘤靶向递送和治疗。该多功能纳米囊泡是基于生物相容且生物可降解的成分聚乙二醇（PEG）和聚碳酸酯，具有重要的临床转化意义，其中精胺是一种天然的小分子胺，参与真核生物的新陈代谢，且在生理环境下带正电，可用于带负电分子如蛋白质、DNA和RNA的复合。在此，本发明首次将精胺引入到纳米囊泡的亲水内腔中用于蛋白质的装载。纳米囊泡的疏水膜是聚三亚甲基碳酸酯（PTMC）和可逆交联的聚二硫戊环三亚甲基碳酸酯（PDTC），同时保证了纳米囊泡在血液循环中的稳定性和肿瘤细胞内的还原响应性；亲水壳PEG具有“隐形”的功能，可以避免囊泡与体内蛋白质和细胞的粘附而解离；同时在纳米囊泡表面修饰的透明质酸（HA）与多种肿瘤细胞具有高亲和力，利于纳米囊泡靶向内吞进入肿瘤细胞。到目前为止，这是采用多功能蛋白纳米载体用于治疗多发性骨髓瘤及其恶性溶骨并发症的首次报道。
附图说明
图1是实施例一中HA17k-SH核磁谱图；
图2是实施例一中PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-SP核磁谱图；
图3是实施例二、三中HA修饰的囊泡（HA-RCP）的表征，A、B、C分别为空囊泡的DLS、TEM、稳定性和还原响应性表征，D为载Cy5-CC囊泡的药物释放；
图4是实施例四、五中的HA-RCP在人多发性骨髓瘤LP1细胞层面的表征， A、B分别为空囊泡的细胞毒性和载Cy5-CC囊泡在LP1细胞的内吞情况，C、D分别为载颗粒酶B（GrB）囊泡对LP1的细胞毒性和诱导凋亡情况；
图5是实施例七中HA-RCP在人多发性骨髓瘤LP1皮下瘤小鼠模型中的活体成像（A）、离体成像（C）、生物分布（D）及在小鼠体内药代动力学曲线（B）；
图6是实施例八中载GrB的HA修饰囊泡（HA-RCP-GrB）对LP1皮下瘤小鼠模型的治疗情况，A为治疗期间肿瘤体积变化及治疗结束后各组肿瘤图，B为体重变化，C为生存曲线，D、E分别为治疗结束后各组肿瘤的TUNEL染色和H&E染色组织学分析图；
图7是实施例八中HA-RCP-GrB在LP1皮下瘤小鼠模型中治疗结束后各主要脏器的H&E染色组织学分析图；
图8是HA-RCP和HA-RCP-GrB在LP1原位瘤小鼠模型中的靶向和治疗情况，A、B分别为实施例九中HA-RCP在LP1原位瘤小鼠中的离体荧光成像和生物分布，C、D实施例十中分别为原位瘤小鼠治疗期间的生存曲线图和体重变化图；
图9是实施例十一中HA-RCP-GrB在LP1原位瘤小鼠治疗结束后对溶骨性病变的改善情况，A、B、C分别为各组小鼠股骨和胫骨的µCT图、二级松质骨µCT分析图和H&E染色组织学分析图，D为骨组织形态计量学分析图；
图10是实施例十一中HA-RCP-GrB在LP1原位瘤小鼠模型中治疗结束后各主要脏器的H&E染色组织学分析图。
具体实施方式
实施例一 HA-SH和PEG-P(TMC-DTC)-SP聚合物的合成
HA-SH（分子量约17000Da）是由HA经两步反应得到的。首先，在氮气保护下将硼氢氰钠(126 mg, 2.0 mmol)加入到透明质酸（200 mg, 0.012 mmol）和胱胺二盐酸盐(35 mg,0.157 mmol)的硼酸缓冲溶液(pH 8.5, 50 mM, 10.0 mL)中，整个反应溶液在40℃条件下搅拌反应5天。接着在氮气条件下向反应溶液中加入二硫代苏糖醇（DTT，0.15 g, 1.0mmol)，于室温下搅拌反应24小时。HA-SH在氮气保护下通过去离子水中透析(MWCO 3500)、冻干而分离得到。产率：84%。由ELLMAN试剂法可以测出HA-SH的转化率约为98%。氢核磁共振谱图显示除了HA的信号峰(δ 1.86, 3.28-4.02, 4.21-4.75)以外，在δ 2.68-2.98处有新的信号峰出现，这是HA端醛基与胱胺反应后形成仲胺旁边的亚甲质子峰和半胱胺上亚甲质子峰，通过比较HA (δ 4.21-4.75)处特征峰与δ 2.68-2.98处信号峰积分面积可知半胱胺的功能化度为100% (见附图1)。
在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH (Mn=5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol)、TMC (1.52 g, 14.55 mmol) 和DTC (0.23 g, 1.18 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0mL)中，搅拌加入催化剂磷酸二苯酯（DPP，DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40℃油浴中磁力搅拌下反应2天；三乙胺终止，冰乙醚中沉淀两次，抽滤，真空干燥后得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)。与PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)的合成类似，用Mal-PEG-OH(Mn=7.5kg/mol)替代MeO-PEG-OH(Mn=5.0 kg/mol)做引发剂，引发DTC和TMC的开环聚合得到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)。和设计的理论分子量吻合，且GPC测定分子量分布窄，均说明该反应活性可控。
PEG-P(TMC-DTC)-SP聚合物是由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)经两步反应得到。首先，于冰水浴及氮气保护下向PEG-P(TMC-DTC) (1.0 g, 46 mmol)和吡啶（18 mg, 230 mmol）的DCM溶液(10.0 mL)中逐滴加入NPC (48 mg, 240 mmol)的DCM溶液(1.0 mL)，冰水浴中搅拌反应2小时，后于30℃搅拌反应24小时。反应产物PEG-P(TMC-DTC)-NPC在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到。接着，将PEG-P(TMC-DTC)-NPC（1.0 g, 46mmol）的DCM (4.0 mL)溶液逐滴加入到精胺（0.186 g, 920 mmol）的DCM (5.0 mL)溶液中，滴加完毕后于30℃搅拌反应24小时后，用甲醇/DCM混合溶液（1/1）透析至澄清透明以除去反应中产生的对硝基苯酚，之后旋蒸再用DCM溶解所得产物，在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥即得到PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-SP。产率：89%。氢核磁共振谱图中发现PEG-P(TMC-DTC)的特征峰(δ 2.06, 3.02,3.64, 4.24, 4.32)、精胺的亚甲质子峰（δ 2.62-2.69）。通过比较PEG-P(TMC-DTC)与精胺信号峰积分面积比例计算出精胺的官能化度约为100% (见附图2)。
上述制备方法可表示如下：
Figure 729393DEST_PATH_IMAGE004
Figure 342777DEST_PATH_IMAGE005
通过类似方法可以通过改变开环聚合中的两种单体的比例、单体和引发剂的比例得到具有不同分子量的聚合物；聚合物PEG-P(TMC-DTC)-SP和Mal-PEG-P(TMC-DTC)中，PEG链段的分子量为2000～8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～40%。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
实施例二表面后修饰HA囊泡（HA-RCP）的制备
制备表面HA后修饰自交联囊泡用于主动靶向蛋白质药物的运载。与前修饰囊泡相比，HA后修饰囊泡可保证HA靶向分子充分暴露在囊泡外面以充分与肿瘤细胞表面的CD44作用，还可保证囊泡结构和尺寸不变。空白囊泡是通过溶剂交换法制备是在室温搅拌下将50mL的按特定比例混合的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的DMSO溶液（10 mg/mL）加入到950 μL HEPES缓冲溶液(pH 7.4)中，后在PB (pH 7.4, 5 mM)中透析8小时，更换5次透析介质。接着在氮气下加入相对于Mal基团1.2倍过量的HA-SH(17kDa)，37℃摇床过夜，最后用超滤管超滤离心（MWCO 100 kDa，1000 rmp, 10 min）三次以除去过量的HA-SH，得到自交联HA后修饰囊泡xHA-RCP，其中x代表HA在囊泡中的摩尔百分比。通过DLS跟踪HA-RCP的粒径来研究其胶体稳定性（10 mg/L）和在10 mM GSH处理后的行为。
动态光散射(DLS)结果显示，当两种聚合物Mal-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比为0-3/7时，自交联囊泡在HA修饰前后粒径变化不大，均为95纳米左右，当Mal聚合物摩尔含量为40%时修饰前囊泡粒径增加到105纳米 (附图3A)。本发明采用Mal-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比在3/7以内的自交联囊泡进行后续研究，比如Mal-PEG-P(TMC-DTC)/PEG-P(TMC-DTC)-SP摩尔比在3/7的囊泡称为HA30-RCP。Zeta电位测试结果显示HA修饰后电位由-1.1～0.086 mV转变为-3.75～-8.12 mV (附图3A)，这说明HA成功地修饰在聚合物囊泡表面。TEM结果显示HA后修饰的纳米粒为球形、中空结构的囊泡且尺寸与DLS测定结果相似(附图3B)。以HA后修饰密度为30%的自交联囊泡（HA30-RCP）为例进行后续表征。DLS结果显示HA30-RCP在稀释100倍后仍具有良好的稳定性，然而在10 mM DTT作用下HA30-RCP在24小时内快速溶胀到约500纳米 (附图3C)。以上结果表明HA后修饰囊泡在正常生理条件下具有优异的稳定性而在模拟细胞质和细胞核的还原条件下则会快速破坏解离。
巯基化透明质酸HA-SH的分子量为8kDa和35kDa表面修饰的同上的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)囊泡，发现囊泡粒径均在90～100 nm;Zeta电位为-4～-10 mV。
实施例三表面后修饰HA囊泡装载颗粒酶B（HA-RCP-GrB）及还原触发的药物释放
HA囊泡对蛋白质如GrB的装载同实施例二。在室温搅拌下，将50 μL的按特定比例混合的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的DMSO溶液（10 mg/mL）加入到950 μL含有一定量GrB的HEPES缓冲溶液(pH 7.4, 5 mM)中，滴加完毕后转入透析袋(MWCO 350 kDa)中，在PB (pH 7.4, 5 mM)溶液中透析8小时，期间更换5次透析介质。用HA-SH后修饰载GrB囊泡的方法与空白囊泡一样：在氮气保护下于所得囊泡溶液中加入相对于Mal基团1.2倍量的特定量的HA-SH(17 kDa)，37℃摇床过夜，最后用超滤管超滤离心（MWCO100 kDa，1000 rmp, 10 min）三次除去过量的HA-SH，得到自交联载GrB的HA后修饰囊泡。为了测定蛋白的装载量，采用FITC标记的细胞色素C (CC)作为模型蛋白来评估囊泡对GrB的装载能力，CC与GrB结构类似这是用于，且GrB量少、贵重，定量检测困难，且CC与GrB结构类似。包裹的FITC-CC通过紫外分光光度计来测量（494 nm）。
蛋白质的装载量(PLC)和包封率(PLE)根据以下的公式计算得到：
载药量(wt.%)=(装载蛋白质的重量/聚合物和蛋白质的总重量)×100
包封率(%)=(装载蛋白质重量/蛋白质总投入量)×100
当理论装载量为1 wt.%、2 wt.%、4 wt.%、6 wt.%时，FITC-CC的实际装载量分别为0.99 wt.%、1.86 wt.%、3.1 wt.%、4.4 wt.%，包封率分别为99%、88%、78%和73%。表2 列出了几种代表性囊泡载蛋白质的结果，发现载有CC的聚合物囊泡粒径与载有GrB的聚合物囊泡粒径相似，因此采用CC来模拟GrB的装载效率和体外释放行为。
表2 代表性HA修饰囊泡载蛋白质的结果（HA-SH：17 kDa）
囊泡组成 蛋白质 理论装载量 粒径(nm) 实际装载量 包封率
PEG3.4k-P(DTC4.0k-TMC11k)-Sp和Mal-PEG5k-P(DTC5.7k-TMC13k) （7/3） FITC-CC 20 wt.% 105 14.4 wt.% 72%
PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-Sp和 Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2) （7/3） FITC-CC 1wt.% 98 1 wt.% ~100%
PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-Sp和 Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2) （7/3） FITC-CC 6 wt.% 96 4.7 wt.% 78%
PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-Sp和 Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2) （7/3） GrB 0.1 wt.% 95 0.1 wt.%*<sup>b</sup> ~100%*<sup>b</sup>
PEG4k-P(DTC8k-TMC21k)-Sp和Mal-PEG7.5k-P(DTC6k-TMC25k) （7/3） FITC-CC 6 wt.% 103 5.0 wt.% 83%
PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) （7/3） GrB 0.7 wt.% 99 0.7 wt.%*<sup>a</sup> ~100%*<sup>a</sup>
PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) （7/3） GrB 0.1 wt.% 97 0.1 wt.%*<sup>b</sup> ~100%*<sup>b</sup>
注：*代表估算值;a和b分别表示用于动物和细胞实验的配方。
FITC-CC的体外释放实验于37℃下在两种不同的释放介质中进行，其中包括PB(pH 7.4, 5 mM)和10 mM GSH的PB (pH 7.4, 5 mM)溶液。将0.6 mL载有FITC-CC的囊泡（其制备方法与装载GrB一样）溶液装入透析袋(MWCO 350 kDa)中并置于20 mL相应的释放介质中。在每个取样时间点，取出6.0 mL释放介质，并补加6.0 mL相应的新鲜介质。FITC-CC的释放量通过荧光分光光度计(FLS920, 激发波长为492纳米，发射波长为517纳米)测定，每个释放实验平行进行三次，最终显示的是实验所得的平均值。结果显示，在正常生理条件(pH7,4, 37℃)下，HA-RCP和PS抑制了FITC-CC的释放，24小时之内FITC-CC的累积释放量分别为14.6%和14.0%，而在10 mM DTT作用下HA-RCP和RCP的FITC-CC的累积释放量显著增加，在24小时内FITC-CC的累积释放量分别为82.1%和86.1% (附图3D)。以上结果说明该聚合物囊泡在还原条件下可以快速解交联破坏囊泡结构从而将蛋白质有效释放出来。
实施例四细胞毒性测试（MTT 试验）
HA后修饰的自交联囊泡（HA-RCP）的细胞毒性在CD44过表达的人多发性骨髓瘤细胞(LP1)通过MTT测定。首先将100 µL细胞的IMDM悬浮液铺于96孔培养板(5×103个细胞/孔)中，37℃、5% 二氧化碳下培养12 h。然后将20 µL空HA-RCP的PB (5 mM, pH 7.4)溶液(最终囊泡浓度为1.0 mg/mL)加入，37℃、5% 二氧化碳下培养48小时。然后向孔中加入20 µL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5 mg/mL)，继续培养4h，随后离心移除上清液，加入150 μL DMSO溶解活细胞与MTT产生的紫色结晶甲瓒，酶标仪测定每孔在490 nm处的紫外吸收。细胞存活率通过与空白细胞的对照孔在490 nm处的吸收相比得到（n=4）。
细胞存活率(%)=(OD490样品/OD490对照)×100%
载GrB的HA后修饰囊泡（HA-RCP-GrB）和非修饰囊泡（RCP-GrB）在LP1细胞中的抗肿瘤活性也是通过MTT测定。首先用聚赖氨酸预处理96孔板，后将100 µL细胞的IMDM悬浮液铺于96孔培养板(3×103个细胞/孔)中，37℃、5% 二氧化碳下培养12 h。然后将20 µL不同蛋白质浓度的HA-RCP-GrB和RCP-GrB的PB (5 mM, pH 7.4)溶液加入，37℃、5% 二氧化碳下培养4小时后将培养板离心，吸走上清液并置换新鲜培养基，37℃、5% 二氧化碳下培养68小时。之后，加入20 µL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h后离心，移除上清液，加入150 μLDMSO以溶解甲瓒，酶标仪测定每孔在490 nm处的紫外吸收。细胞相对存活率的计算方法同上。
MTT结果显示，空RCP和HA-RCP在囊泡浓度为1.0 mg/mL对LP1细胞均无毒(附图4A)。表2中所有空囊泡在检测的浓度范围£1.0 mg/mL内细胞存活率均在85%以上，说明该系统具有良好的生物相容性。
由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) （7/3）制备、载GrB的囊泡HA-RCP-GrB具有低的半致死浓度(IC50)，约为0.21 μg/mL，而RCP-GrB 的半致死浓度(IC50)约为0.71 μg/mL (附图4D)，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-Sp和Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2)制备的载GrB囊泡的IC50约为0.63 μg/mL；结果说明HA-RCP-GrB与LP1细胞具有强相互作用，可被LP1细胞有效摄取、快速解交联并释放蛋白质，从而有效杀死LP1细胞。
实施例五细胞内蛋白释放及细胞凋亡研究（FACS试验）
采用流式细胞仪(FACS)研究了HA-RCP在LP1细胞内蛋白质释放及其与LP1细胞作用并导致其凋亡的行为。将1.0 mL LP1细胞的IMDM培养液铺于6孔培养板(1×106个细胞/孔)中，37℃、5% 二氧化碳下培养12 h。然后将200 mL载Cy5-CC的HA-RCP和RCP的PB (10mM, pH 7.4)溶液分别加入，37℃、5% 二氧化碳下培养4小时后用PBS离心洗涤2次，最终将细胞悬浮于500 μL PB溶液中。荧光数据柱状图通过BD FACSCalibur (BecktonDickinson，USA)流式细胞仪记录和Cell Quest软件分析得到。如附图4B所示，由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) （7/3）制备、RCP和修饰不同HA比例的HA-RCP均能进入LP1细胞，且随着HA比例的增加Cy5的荧光强度增强，当HA为30%时荧光值最强，约为无HA的荧光值的3.6倍；说明HA-RCP较之RCP能更有效地进入LP1细胞内且在肿瘤细胞内能有效释放蛋白质。
用流式细胞仪的Annexin V-FITC/PI双染色技术评估了载GrB的囊泡对LP1细胞诱导凋亡的能力。将1.0 mL LP1细胞的IMDM悬浮液铺于6孔培养板(5×105个细胞/孔)中，37℃、5%二氧化碳下培养12 h。然后将200 μL HA-RCP-GrB和RCP-GrB溶液(0.1和0.4 μg/mL)加入，37℃、5% 二氧化碳下培养4小时后，离心后吸走上清液，换成新鲜培养基继续培养68小时。之后用冷PBS离心洗涤2次，加入500 μL结合液并转移至流式管中，随后在避光条件下依次加入5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液，于室温下反应15 min一个小时内测定在BD FACSCalibur (Beckton Dickinson，USA)流式细胞仪测定，用Cell Quest软件分析数据。
附图4C显示，由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP-GrB可显著诱导LP1细胞的凋亡。当GrB浓度为0.1 μg/mL时，在孵育4+68小时后HA-RCP-GrB诱导早期和晚期凋亡的能力要高于RCP-GrB，细胞凋亡的百分率分别为38.47%和30.57%；当GrB浓度为0.4 μg/mL时，HA-RCP-GrB和RCP-GrB诱导早期凋亡的能力没有明显增加，而诱导晚期凋亡的能力比低浓度时均显著增加，且HA-RCP-GrB诱导晚期凋亡的能力要显著高于RCP-GrB，细胞凋亡的百分率分别为77.3%和42.07%，这与前面的MTT实验结果是一致的。表2中的其他组成的囊泡在GrB浓度为0.4 μg/mL时，能诱导细胞早期和晚期凋亡的百分率分别为67-80%和35-50%。以上实验结果证明了HA-RCP-GrB通过特异性的内吞作用进入癌细胞中，细胞内还原环境使囊泡结构破坏，将GrB有效释放到癌细胞细胞质中，就如同NK细胞和CTLs细胞把分泌的GrB注入靶细胞中一样，接着，GrB会降解细胞浆及细胞核中的底物蛋白，诱导细胞凋亡。
实施例六多发性骨髓瘤LP1动物模型的建立和体内血液循环研究
所有动物实验操作均获得了苏州大学实验动物中心及苏州大学动物保护和使用委员会批准。血液循环实验采用健康的Balb/C小鼠（18~22 g）。荷LP1皮下肿瘤的裸鼠的建立：在重量为18-20 g的雌性裸鼠的右侧背部皮下注射50 μL的LP1细胞悬浮液（1×107个细胞/只）。两周后当肿瘤体积约为200 mm3时取出肿瘤，去除坏死部分取中间部分切成体积约为20 mm3的小块，然后在裸鼠右后背皮下注射肿块。当肿瘤体积达到约100~150 mm3时，可以开始肿瘤治疗实验，当肿瘤体积达到150~200 mm3时开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
将Cy5标记的HA-RCP和RCP溶液尾静脉注射到两组Balb/C小鼠中，不同时间点眼眶取血50 μL溶在100 μL 1%的曲拉通溶液，并用900 μL含20 mM DTT的DMSO萃取过夜后，离心取上层清液荧光(FLS920，激发波长为646 nm)定量。每组血液循环实验平行进行三次，最终显示的是实验所得的平均值。血液循环遵循典型的两室模型，第一相是分布相，通常呈现快速的降低，第二相是消除相，通常持续时间较长且在药物清除过程中起到主导作用。采用以下公式计算两相的半衰期(分布相为t1；消除相为t2)：
y = A1× exp (-x / t1) + A2× exp (-x / t2) + y0
附图5B为体内药代动力学结果，其表明由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP和RCP的血液循环曲线相似，但HA-RCP的分布相半衰期为5.23 h，比非修饰囊泡要长些（5.05 h），可能是由于与HA连接的PEG的链段较长（7.5 vs 5.0 kg/mol）。表2中的其他组成的囊泡在HA-SH分子量为17 kDa时血液循环时间大致在4.8-5.8小时；而组成的囊泡在HA-SH分子量为8 kDa时血液循环时间大致在4.5-5.5小时；而组成的囊泡在HA-SH分子量为35 kDa时血液循环时间大致在5-6.5小时。
实施例七 HA-RCP在荷LP1皮下瘤鼠活体、离体荧光成像和生物分布研究
如实施例六建立LP1皮下瘤裸鼠模型来研究HA-RCP体内肿瘤靶向性。为了用荧光成像的方法检测荷瘤裸鼠体内囊泡释放蛋白质的分布情况，采用荧光分子Cy5-CC作为模型蛋白。当肿瘤体积达到~ 200 mm3时，将载有Cy5-CC的囊泡HA-RCP-Cy5-CC尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内，在不同时间点（6、9、12和24小时）使用小动物近红外成像系统（IVIS LuminaII）扫描拍摄实时进行监测并分析（Ex. 643 nm和Em. 668 nm）。附图5A结果表明，当注射后不同时间点，随着HA后修饰比例不断增加，Cy5荧光逐渐增强，且HA30-RCP组中Cy5荧光在所有实验组小鼠中最强，说明HA30-RCP可大量富集到LP1肿瘤部位并能将蛋白质有效释放。当注射9小时后，所有修饰组小鼠肿瘤部位Cy5荧光达到最强，24小时后肿瘤部位Cy5荧光仍然较强，说明由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP可在LP1肿瘤部位较长时间滞留。表2中的其他组成的囊泡在HA-SH分子量为17 kDa也具有较长肿瘤富集和滞留时间。综合细胞流式和体内活体荧光成像结果，发现HA30-RCP具有最强的靶向能力，因此在后续的动物实验中，均采用HA30-RCP进行实验，并简称为HA-RCP。
荷瘤裸鼠器官离体荧光成像和生物分布研究是将HA-RCP-Cy5-CC尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内，9小时后将肿瘤及心、肝、脾、肺、肾等主要器官收集、清洗、擦干并用Maestro小动物成像系统(CRi Inc.)进行荧光成像。为了定量测定肿瘤和各组织器官中Cy5-CC的含量，将主要器官溶解在0.5 mL裂解液(1% SDS, 1% Triton X-100, 40 mM tris acetate)中并用F6/10超细匀浆机(Fluko)将各组织器官充分搅拌均匀，再加入1.5 mL含20 mM DTT的DMSO萃取过夜，各组织器官中Cy5-CC含量通过离心(14.8 krpm, 30 min)提取并通过荧光(FLS920，激发波长为646 nm)测定。每组生物分布实验平行进行三次，最终显示的是实验所得的平均值。体外荧光图像附图5C，显示HA-RCP组裸鼠在肿瘤部位的荧光强度较之其他主要脏器如心、肝、脾、肺、肾等强很多。相比之下，RCP组裸鼠在肿瘤部位的荧光较弱而在肝和脾的荧光更强。这些结果表明由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP可高效地进入LP1裸鼠的肿瘤部位并在肿瘤部位有效释放出蛋白质。定量的生物分布实验结果表明，HA-RCP在肿瘤部位每克肿瘤组织中所摄取的Cy5-CC量占注射Cy5-CC量的9.58% (9.58%ID/g)，比RCP组（Cy5-CC摄取量为3.9%ID/g）高2.5倍(附图5D)。此外，HA-RCP组在肝和脾部位的富集比RCP组低。以上结果说明HA-RCP可有效降低正常脏器尤其是肝和脾对Cy5-CC的摄取而显著增加肿瘤部位Cy5-CC的富集。
实施例八 HA-RCP-GrB在荷LP1皮下瘤裸鼠体内抗肿瘤活性
如实施例六建立LP1皮下瘤裸鼠模型，当肿瘤体积达到约100 mm3时，将荷瘤裸鼠随机分为3组（每组6只），并以此量得的肿瘤体积和裸鼠体重作为第0天时的数据。将HA-RCP-GrB、RCP-GrB和PBS尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，每3天给药一次且GrB的给药浓度为50μg/kg。之后定期用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，并通过V = 0.5 × L × W2公式计算得到肿瘤体积（L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度），相对肿瘤体积是通过V/V0（V0为第0天测定的肿瘤体积）计算得到，相对体重是通过M/M0（M0为第0天测定的裸鼠体重）计算得到。给药结束2个周期，每组随机取出一只裸鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤在福尔马林中固定，然后石蜡包埋切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，最后用莱卡正置显微镜(Leica QWin)观察。肿瘤组织用TUNEL染色试剂盒染色并通过荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡情况。每组裸鼠中出现自然死亡或者肿瘤体积超过1000 mm3的裸鼠均被视为死亡用以计算存活率。结果显示，由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP-GrB可以更有效抑制肿瘤生长，给药24天后HA-RCP-GrB组和RCP-GrB组及PBS组的相对肿瘤体积分别为2.3、6.7和19.9 (附图6A)。这表明HA主动靶向性和肿瘤还原条件触发的药物释放可有效抑制肿瘤的生长。给药25天后所有实验组荷瘤裸鼠的体重均有所增加(附图6B)，说明HA-RCP-GrB对裸鼠的毒副作用小。Kaplan-Meier生存曲线显示，与PBS和RCP-GrB组裸鼠相比，HA-RCP-GrB组裸鼠具有更长的生存期，三组小鼠的生存中值分别为18、32和40天 (附图6C)。采用TUNEL染色的组织学分析结果显示HA-RCP-GrB显著提高了肿瘤组织的细胞凋亡，H&E染色结果显示HA-RCP-GrB对肿瘤组织引起了大范围的坏死，RCP-GrB组肿瘤组织坏死情况减少，而PBS组肿瘤细胞生长旺盛(附图6D)。心、肝、脾、肺、肾等的H&E染色结果显示HA-RCP-GrB和RCP-GrB组主要脏器组织几乎没有损伤 (附图7)。以上结果说明HA-RCP-GrB在LP1皮下异种移植瘤模型中不仅具有高效的抗肿瘤效率而且可以有效降低其对正常脏器的毒副作用。表2中的其他组成的囊泡装载GrB（0.7wt.%）、HA-SH分子量为17 kDa，治疗荷LP1皮下瘤裸鼠时也能够显著抑制肿瘤的增值，使得小鼠的生存期到38-45天，同时系统毒副作用低。
实施例九 LP1原位瘤小鼠模型的建立，离体荧光成像和生物分布研究
为了与临床多发性骨髓瘤更接近，建立了原位人多发性骨髓瘤LP1小鼠模型，并通过此模型进一步研究HA-RCP-GrB的抗肿瘤活性能力。原位LP1小鼠肿瘤模型的建立：将200μL LP1细胞悬浮液（8×106个细胞/只）经尾静脉注射到NOD/SCID小鼠血液中，约10天后开始进行肿瘤治疗实验。LP1原位瘤小鼠器官离体荧光成像和生物分布研究是在LP1肿瘤细胞原位接种14天后将HA-RCP-Cy5-CC尾静脉注射到原位瘤小鼠体内，9小时后将小鼠股骨胫骨及心、肝、脾、肺、肾等主要器官收集、清洗、干燥并使用小动物近红外成像系统（IVISLumina II）扫描拍摄并分析（Ex. 643 nm和Em. 668 nm）。并用 IVIS Lumina II软件中ROI荧光定量来分析计算各脏器中Cy5-CC的荧光强度（n = 3）。结果显示，HA-RCP-Cy5-CC实验组在骨髓瘤细胞集中的骨组织中的荧光强度是RCP-Cy5-CC组的1.8倍 (附图8A)；而在肝、脾、肾、肺等的富集要低于RCP-Cy5-CC组，说明HA-RCP可以有效靶向到骨髓瘤细胞富集的骨组织中。ROI荧光定量分析计算各脏器中Cy5-CC的荧光强度的结果和图像吻合(附图8B)。
实施例十HA-RCP-GrB在LP1原位瘤小鼠体内抗肿瘤活性研究
如实施例九建立原位LP1小鼠肿瘤，当LP1肿瘤细胞原位接种10天后，将原位瘤小鼠随机分为3组（每组10只）。将HA-RCP-GrB、RCP-GrB和PBS尾静脉注射入原位瘤小鼠体内，每3天给药一次共给药6次且GrB的给药浓度为50 μg/kg。之后定期称量小鼠体重，相对体重变化是通过M/M0（M0为第一次给药时测定的小鼠体重）计算得到。观察记录小鼠状态，每组小鼠中出现自然死亡或者体重降低超过原体重的15%的小鼠均被视为死亡以此来判断小鼠的生存期。小鼠的生存曲线结果（附图8C）显示由PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)（7/3）制备的HA-RCP-GrB能显著延长骨髓瘤小鼠的生存时间，PBS组、RCP-GrB组和HA-RCP-GrB组小鼠的生存中值分别为31、38和43天。在30天内各实验组小鼠的体重均无明显差异(附图8D)，说明RCP-GrB和HA-RCP-GrB对小鼠体重无影响。表2中其他组成装载GrB（0.7wt.%）、HA-SH分子量为17 kDa的囊泡在治疗荷LP1原位瘤裸鼠时也能显著抑制肿瘤的增值，极大程度缓解小鼠不适症状，使得小鼠的生存期到41-50天，同时系统毒副作用低。
实施例十一 LP1原位瘤小鼠离体骨组织（μCT扫描）分析及骨组织形态学分析研究
如实施例九建立原位LP1小鼠肿瘤，当LP1肿瘤细胞原位接种30天时，将小鼠牺牲，将各治疗组小鼠（各取三只）同一侧腿骨取出并固定用于mCT扫描和分析骨髓瘤小鼠股骨、胫骨中骨小梁情况。将其中一只小鼠的另一侧腿骨取出，在福尔马林中固定一天，后加入EDTA脱钙，然后进行石蜡包埋切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，最后使用莱卡正置显微镜(Leica QWin)观察。将每组中一只小鼠的心、肝、脾、肺、肾取出进行组织切片分析。将取出的脏器在福尔马林中固定，然后进行石蜡包埋切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，最后使用莱卡正置显微镜(Leica QWin)观察。
μCT图像显示，各组小鼠股骨或胫骨中骨小梁体积大小依次为：HA-RCP-GrB >RCP-GrB > PBS (附图9A和B)。骨组织H&E染色结果显示，PBS组股骨和胫骨组织中有肿瘤细胞，而HA-RCP-GrB组股骨胫骨结构形态正常(附图9C)。组织形态定量分析结果(附图9D)显示，HA-RCP-GrB组小鼠的骨密度（BMD）、骨体积与总体积的百分比(BV/TV)、骨小梁厚度（Trabecular thickness）和骨小梁数量（Trabecular number）比RCP-GrB组和PBS组小鼠高，而骨小梁分离度（Trabecular separation）降低。以上骨组织形态学参数的分析结果表明，HA-RCP-GrB和RCP-GrB的治疗可以极大改善骨髓瘤小鼠骨量丢失和骨损伤的状况，其中HA-RCP-GrB因其与骨髓瘤细胞强的相互作用和增强的内吞能力，能够更有效地改善骨髓瘤小鼠骨病变、瘫痪、无力的情况。另外，对小鼠主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾等进行了H&E组织学分析结果显示，HA-RCP-GrB、RCP-GrB和PBS组小鼠的主要脏器均没有受到损伤，说明载GrB囊泡对小鼠的毒副作用小(附图10)。
本发明首次报道了基于透明质酸修饰的多功能还原敏感自交联囊泡可以实现主动靶向将蛋白质的运载，和多发性骨髓瘤LP1具有高抗肿瘤活性。这些多功能囊泡药物具有以下优异特性：(i)该囊泡是由生物相容，生物可降解的聚合物组成的；(ii)该囊泡亲水内腔的精胺是天然小分子，具有良好的生物相容性，且可通过静电作用更好地装载蛋白质；(iii)具有良好的稳定性、对装载的药物渗漏少和延长的血液循环时间；(iv)该囊泡采用HA后修饰的方式可以使靶向分子更多暴露在囊泡外层且对囊泡结构和大小的影响很小；(v)主动靶向到多发性骨髓瘤细胞，实现肿瘤组织高的药物富集量；(iv)该囊泡通过受体介导的内吞机制被肿瘤细胞摄取、在细胞质还原环境下解交联并释放药物，在体内皮下多发性骨髓瘤裸鼠模型及原位多发性骨髓瘤小鼠模型中均表现出高效的抗肿瘤效率。值得注意的是，HA后修饰的囊泡药物显著提高了原位骨髓瘤小鼠的生存期且极大改善了其骨病变、骨小梁破坏的状态。这些透明质酸后修饰的多功能囊泡药物具有高效装载蛋白质、主动靶向性、强抗肿瘤活性且毒副作用小，有望用于多发性骨髓瘤的治疗。

Claims (6)

1.多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用或者在制备治疗多发性骨髓瘤药物载体中的应用；所述多功能聚合物囊泡由多功能聚合物在溶液中自组装后表面修饰透明质酸得到；所述多功能聚合物为聚合物A与聚合物B；
所述聚合物A的化学结构式如下：
Figure 756176DEST_PATH_IMAGE002
所述聚合物B的化学结构式如下：
Figure 673317DEST_PATH_IMAGE003
所述聚合物A或者聚合物B中，PEG链段的分子量为2000～8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～40%；聚合物B的摩尔量为高聚物摩尔量的0～30%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为6000～40000Da。
3.多功能聚合物囊泡载药体系在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用；将多功能聚合物溶于溶剂中，然后加入含有药物的溶液中，自组装后，再在表面修饰透明质酸，得到多功能聚合物囊泡载药体系；所述多功能聚合物为聚合物A与聚合物B；聚合物B的摩尔量为高聚物摩尔量的0～30%；
所述聚合物A的化学结构式如下：
Figure 187475DEST_PATH_IMAGE004
所述聚合物B的化学结构式如下：
Figure 317105DEST_PATH_IMAGE005
所述聚合物A或者聚合物B中，PEG链段的分子量为2000～8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～40%。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为蛋白药物；所述透明质酸的分子量为6000～40000 Da。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液中，滴加完毕后转入透析袋中，在PB溶液中透析，得到囊泡溶液；然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH，37℃摇床中过夜，最后超滤管超滤离心得到多功能聚合物囊泡载药体系。
6.一种治疗多发性骨髓瘤药物，其特征在于，将聚合物A与聚合物B的DMSO溶液加入到含有药物的HEPES缓冲溶液中，滴加完毕后转入透析袋中，在PB溶液中透析，得到囊泡溶液；然后在氮气保护下向囊泡溶液中加入HA-SH，37℃摇床中过夜，最后超滤管超滤离心得到治疗多发性骨髓瘤药物；
所述聚合物A的化学结构式如下：
Figure 131477DEST_PATH_IMAGE004
所述聚合物B的化学结构式如下：
Figure 688360DEST_PATH_IMAGE006
所述聚合物A或者聚合物B中，PEG链段的分子量为2000～8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中，PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～40%；所述HA-SH的分子量为6000～40000 Da；聚合物B的摩尔量为聚合物总摩尔量的0～30%；所述药物为蛋白药物GrB。
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