CN101519495A - 界面交联的温度敏感的聚合物囊泡及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种界面交联的温度敏感的聚合物囊泡及其制备方法，所述界面交联的温度敏感的聚合物囊泡由嵌段共聚物构成，所述嵌段共聚物至少包括亲水段、交联链段和温敏段，亲水段构成聚合物囊泡的膜壳，温敏段构成聚合物囊泡的膜核，交联链段构成聚合物囊泡的界面，对聚合物囊泡的界面进行交联来稳定囊泡结构，从而形成界面交联的温度敏感的聚合物囊泡；由于该囊泡在水溶液体系中形成，并且对其界面进行了交联，因此提高了聚合物囊泡对小分子药物、大分子药物以及探针分子的包载效率，在体内血液中循环的稳定性，被肿瘤细胞内吞的效率，从而提高药物的生物利用度，同时方便聚合物囊泡排除体外。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物载体及其制备方法，具体涉及交联的温度敏感的聚合物囊泡的药物释放系统。
背景技术
由双亲性聚合物利用分子间的相互作用在水中自组装形成的聚合物囊泡(polymersomes)，膜的稳定性高、性能(如厚度、弹性、韧性及降解性)可调、内容量大、能包裹亲水和疏水性物质，在药物的控制释放上具有巨大应用潜力。二嵌段、三嵌段共聚物、接枝共聚物和超枝化共聚物都被发现能形成囊泡，但多数制备用到有机溶剂。
能直接在水中制备得到囊泡将在水溶性药物的包裹和控制释放上更具有优势。如Discher小组研究了聚乙二醇-聚丁烯(PEO-PEE)及聚乙二醇-聚1，3-丁二烯(PEO-PBD)囊泡的生物相容性：该囊泡在血浆里保持稳定，不吸附也不被巨噬细胞吞噬，而且其存在不影响细胞的增殖。这些囊泡在大鼠体内的循环时间是隐形脂质囊泡的两倍多(参见：JCM Lee，Biotechnol.Bioeng.，2001，73(2)，135)。虽然生物相容性良好，但该体系和现有的大多数聚合物囊泡体系都不可生物降解或不易被排出体外。研究者把可生物降解的聚合物混入用以形成囊泡，包入抗癌药物阿酶素和紫杉醇后，在异种移植有人类乳腺肿瘤的裸鼠体内第五天时，囊泡治疗组的肿瘤尺寸是只有游离药物对照组的肿瘤的一半(参见：F Ahmed，Mol.Pharmaceutics，2006，3(3)，340)。
直接在水中制备得到囊泡将在是蛋白质、多肽类和DNA/siRNA等易破坏药物的包裹和控制释放上更具有优势。研究表明膜蛋白能被插在聚合物囊泡的厚膜中且保持生物活性(参见：P Broz，Nano Lett.，2006，6，2349；Meier，Angew.Chem.-Int.Edit.，2000，39，4599)。把蛋白质药物包在聚合物囊泡内腔也能很好地保护其不被降解，保持其生物活性不变(参见：S Rameez，Bioconjugate Chem.，2008，19，1025；A Napoli，Nat Mater，2004，3，183)。例如，日本东京大学的Kataoka等报道包在聚氨基酸聚离子囊泡(PICsome)中的肌红蛋白能够保持其生物活性(参见：A Kishimura，Angew.Chem.-Int.Edit.，2007，46，6085)；Palmer等报道包裹在PEG-PCL囊泡内腔的人和牛的血红蛋白有和人红细胞相近的氧气亲和性，可作为治疗性氧气载体(参见：S Rameez，Bioconjugate Chem.，2008，19，1025)。蒋新国等报道表面标有老鼠抗小鼠单抗(OX26)、内部载有模型多肽NC-1900的PEG-PCL囊泡能穿过血脑屏障(BBB)(参见：ZQ Pang，J.Control.Release，2008，128，120)。最近，Discher等报道PEO-PCL/PEO-PBD囊泡包载的胰岛素在血浆中能稳定存在(参见：DA Christian，Eur.J.Pharm.Biopharm.，2009，71(3)，463)。这些囊泡普遍存在产率低和对亲水药物的包裹效率低，药物的生物利用度也就低的问题；对靶向囊泡的研究还很少，药物释放到病灶部位如癌细胞区的效率低，这些都限制了聚合物囊泡生物的医学应用。
设计对信号(pH、温度等)响应的聚合物囊泡体系(参见：JZ Du，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，12800；127，17982；SH Qin，Adv.Mater.，2006，18，2905)能够解决上述问题，但目前对这类体系的报道不多见。同时，自组装结构不稳定，注入体内大量稀释后解离，造成药物过早释放，交联聚合物囊泡方面，尤其是用有刺激响应性的交联剂交联的体系的研究还没有报导。
发明内容
本发明目的是提供一种界面交联的温度敏感的聚合物囊泡及其制备方法，以克服现有技术的缺陷，提高囊泡对小分子药物、大分子药物以及探针分子的包载效率，提高囊泡在体内血液中循环的稳定性，提高囊泡被肿瘤细胞内吞的效率，从而提高药物的生物利用度，同时方便囊泡生物降解和排除体外。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，包括以下步骤：
(1)取嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含：亲水段，交联链段和温敏段，亲水段和温敏段位于嵌段共聚物的两端，交联链段位于亲水段和温敏段之间；在最低临界溶解温度(lower critical solution temperature，LCST)以下，将嵌段共聚物溶于水溶液或缓冲溶液中，升温至嵌段共聚物的最低临界溶解温度以上，嵌段共聚物中的温敏段转变为疏水性，原位自组装形成聚合物囊泡，亲水段构成聚合物囊泡的膜壳，温敏段构成聚合物囊泡的膜核，交联链段构成聚合物囊泡的界面；
所述聚合物囊泡在温度降到LCST以下时因为温敏段变为亲水性，因此聚合物囊泡溶解；所述缓冲液为本领域常用的缓冲溶液体系。
(2)对步骤(1)形成的聚合物囊泡的界面进行交联来稳定囊泡结构，得到界面交联的温度敏感的聚合物囊泡。
上述技术方案中，所述嵌段共聚物至少包含亲水段，交联链段和温敏段三个功能嵌段，其中，亲水段和温敏段位于嵌段共聚物的两端，交联链段位于亲水段和温敏段之间，在亲水段和温敏段之间还可以加入其他功能嵌段。
所述嵌段共聚物中的亲水段的分子量为1000～8000Da，制备亲水段可选用的原料和方法为本领域技术人员公知的技术，例如可以选自但不局限于：聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸β羟丙酯(PHPMA)或聚乙烯醇(PVA)中的一种；
嵌段聚合物的交联链段的侧链含有羧基，因此，当嵌段聚合物形成聚合物囊泡之后，交联链段构成聚合物囊泡的界面，从而可以用二氨基化合物对其进行界面交联；交联链段的重复单元数为5～40个，交联链段为侧链含有羧基的聚合物，可以选自但不局限于：聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚丁烯酸、聚戊烯酸、聚己烯酸或聚庚烯酸中的一种；通式为：
其中，R1选自氢或甲基，R3选自氢或甲基，R2选自—COOH、或
中的一种，n＝5～40；
嵌段聚合物的温敏段的分子量为5000～35000Da，为温度敏感聚合物，可选自但不局限于：聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)(PDEA)或聚(甲基乙烯醚)(PMVE)中的一种；嵌段聚合物的温敏段的分子量占嵌段聚合物总分子量的60～90％；
上述技术方案中，反应温度需要高于具体反应嵌段聚合物的低临界溶液温度(LCST)，反应温度的上限本领域技术人员可以根据囊泡所需包封的药物的种类来确定合适的温度，而且因为反应体系是水溶液，所以常压下，最高不超过100℃。
所述嵌段聚合物在其低临界溶液温度(LCST)以下时，温敏段表现为亲水性，因此嵌段聚合物分子在水溶液中单分子溶解，当温度上升到嵌段聚合物的低临界溶液温度(LCST)以上时，温敏段转变为疏水性，于是嵌段聚合物分子间发生原位自组装；所述嵌段共聚物的制备方法为本领域技术人员公知的技术，在此，以PEG-PAA-PNIPAM共聚物的制备作为例来说明三嵌段共聚物的制备方法，PEG-PAA-PNIPAM共聚物可通过可逆加成-断裂链转移(ReversibleAddition-Fragmentation Chain Transfer，RAFT)聚合方法方便合得到：首先通过DCC/NHS法制备大分子RAFT试剂PEG-DMP，然后以PEG-DMP为链转移剂通过一锅两步顺序加料分别聚合AA和NIPAM单体，PEG-DMP先后引发AA和NIPAM的RAFT聚合，制备一系列分子量可控的PEG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物，其合成路线如下图所示：
上述技术方案中，所述嵌段聚合物的LCST受中间段的比例、盐浓度、溶液pH的影响，可在28℃至50℃之间调节。例如PEG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物的LCST在pH7.4，150mM NaCl时，中间段PAA的重复单元数和温敏PNIPAM段的重复单元数的比值为(10～12):100时，LCST为38～40℃，该PEG-PAA-PNIPAM嵌段共聚物构成的共聚物囊泡解交联后在体温37℃时溶解，将包裹物释放出来。
上述技术方案中，步骤(2)所述的交联可采用但不局限于下列方法：
利用碳二亚胺缩合法(CARBODIIMIDE Chemistry)，用二胺基化合物对步骤(1)所得聚合物囊泡进行化学交联；
所述二胺基化合物可选自但不局限于：含pH敏感键的二胺基化合物或还原敏感的二胺基化合物，所述含pH敏感键的二胺基化合物选自但不局限于： 
或
中的一种；所述还原敏感的二胺基化合物选自但不局限于：胱胺
经化学交联后的聚合物囊泡对温度稳定，即使降温至低临界溶液温度(LCST)以下也不发生解离；对大量稀释稳定，即使稀释1000倍也不发生解离；对2M的氯化钠盐的水溶液稳定，粒径不变；用上述含pH敏感键的二胺界面交联的聚合物囊泡在酸性环境下(pH5～6.5)解交联；用上述还原敏感的二胺界面交联的聚合物囊泡在还原环境下(如DTT 10mM)解交联。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：利用上述技术方案得到的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡，所述界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的尺寸为50～350纳米，优选的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的尺寸为50～200纳米，粒径分布小于等于0.1。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：应用上述界面交联的温度敏感的聚合物囊泡包封药物，在室温下，药物先溶在嵌段共聚物水溶液或缓冲溶液中，然后再升温到嵌段共聚物的LCST以上，将药物包封在聚合物囊泡内；对形成的聚合物囊泡的界面进行交联来稳定囊泡结构，即得包裹药物的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡。
上述技术方案中，所述药物选自但不局限于：小分子亲水性药物或大分子亲水性药物中的一种，所述小分子亲水性药物，可以选自但不局限于：盐酸阿霉素，所述大分子亲水性药物，可以选自但不局限于：蛋白质、DNA或SIRNA中的一种，本领域技术人员可以根据需要选择所需包封的药物分子。
进一步的技术方案中，在室温下单分子溶解的三嵌段聚合物的水溶液中加入水溶性分子探针就可以把水溶性分子探针包裹在囊泡中，所述水溶性分子探针可以选自但不局限于：磁性纳米粒、轧剂、量子点或近红外染料中的一种。
进一步技术方案中，为了解决蛋白质释放中细胞穿透/渗透性差的问题，通常可以通过受体介导的细胞内吞(receptor mediated endocytosis)来促进细胞摄取，或通过蛋白质转导(cell penetrating protein mediated transduction)来实现对治疗性蛋白质药物的高效细胞内释放。受体介导的细胞内吞一般通过生物靶向分子如单抗、多肽(RGD)、激素、糖或凝集素(lectin)、叶酸和一些维生素的主动靶向来实现细胞内吞，从而增加药物的生物利用度。由穿透细胞蛋白质介导的蛋白质转导在瘤内注射后能够直接穿透细胞膜把药物快速、有效地释放到细胞质中，发挥疗效。
以PEG-PAA-PNIPAM三嵌段共聚物为例，在共聚物囊泡表面引入靶向分子anti-HER2和TAT：首先通过DCC/NHS法活化RAFT试剂CPDP上的羧基，然后与NH2-PEG-COOH反应，得到大分子RAFT试剂HOOC-PEG-CPDP；用该大分子RAFT试剂进行AA和NIPAM的序贯RAFT聚合即得到HOOC-PEG-PAA-PNIPAM；其羧基通过EDC/NHS与anti-HER2或TAT上的氨基反应即得到靶向载体。
本领域技术人员可以根据公知的技术，引入所需靶向分子，所述靶向分子可选自但不局限于：叶酸、抗体、RGD、糖或TAT中的一种。
优选的技术方案中，所述嵌段共聚物选自：聚乙二醇-聚丙烯酸-聚异丙基丙烯酰胺(PEG-PAA-PNIPAM)，其中，PEG具有优异的水溶性和生物相容性，能有效屏蔽电荷和包裹物，可长时间在体内循环，通过PEG链端引入生物靶向分子可实现高效肿瘤细胞内吞；PNIPAM具有温敏性；中间PAA段侧链带有羧基官能团，可用于调节PNIPAM的最低临界溶解温度(LCST)到38～43℃，且可与二胺分子反应交联，得到稳定的聚合物囊泡。PEG和PAA为FDA批准的生物材料，PNIPAM也因其独特的温敏性而在生物医学上应用广泛。研究表明水溶性聚合物的分子量小于4万时，可以通过泌尿系统排出体外。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)聚合物囊泡在水溶液中自组装形成，不涉及有机溶剂，可方便且高效包载小分子药物、大分子药物(如蛋白质)、探针分子等，克服了药物包载效率低、易变性失活等缺陷；而且可调节其LCST使聚合物囊泡在体温37度下解交联后，聚合物单分子溶解，最终可排出体外。
(2)通过还原敏感分子或pH敏感分子对囊泡进行交联，得到稳定的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡，使得囊泡在细胞外和血液中不被降解，从而保证囊泡包封的蛋药物稳定；一旦进入肿瘤细胞，囊泡则开始解交联、聚合物溶解，蛋白质药物则快速释放，产生高效治疗作用；克服了蛋白质在体内易被降解、要求大量药物等不足。
(3)在囊泡表面引入肿瘤靶向基团(如叶酸、抗体)或细胞膜穿透的蛋白质(如TAT多肽)，实现高效肿瘤细胞内吞，从而实现高效细胞内蛋白质释放，有效克服了蛋白质药物进入细胞量少、疗效差的缺点。
附图说明
附图1，基于实施例一所得三嵌段共聚物PEG113-PAA24-PNIPAM211的交联、温度敏感的纳米聚合物囊泡的工作原理示意图；
其中，(a)实施例五、六和七中简单升温形成聚合物囊泡；(b)实施例八和九中通过对聚合物囊泡的界面进行交联来得到稳定的聚合物囊泡；(c)降温到LCST以下，囊泡溶胀；(d)实施例十、十一和十二中，在10mM DTT存在下、降温到LCST以下，囊泡解体。
具体实施方式
下面结合附图1及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一，RAFT聚合得到三嵌段共聚物PEG-PAA-PNIPAM
氩气保护下，将引发剂AIBN(0.62mg，3.77μmol)，大分子RAFT试剂PEG-DMP(0.10g，19μmol)，丙烯酸单体AA(0.0328g，0.456mmol)和5.0mL的二氧六环加入到10mL的Schlenk真空密封瓶中，通氩气30分钟后把瓶子放在70℃的油浴中，搅拌反应24小时后，取样测定AA单体的转化率，并向其余部分加入第二单体NIPAAM(0.4260g，3.8mmol)和一些AIBN(0.2mg溶在0.2mL二氧六环中)使其在70℃下再反应24小时，反应结束后在冷乙醚中沉淀，后真空干燥48小时，得到三嵌段共聚物，产率为70～86％。核磁结果表明其结构为PEG113-PAA24-PNIPAM211，其中PNIPAM所占的整个分子的分子量的比例约78％，在PBS中其LCST为38.5℃。
实施例二，RAFT聚合得到嵌段共聚物DEX-PMA-NIPAM
氩气保护下，将引发剂AIBN(0.62mg，3.77μmol)，大分子RAFT试剂DEX-CPDPA(0.127g，20μmol)，甲基丙烯酸单体MA(9.46mg，110μmol)和5.0mL的二氧六环加入到10mL的Schlenk真空密封瓶中，通氩气30分钟后把瓶子放在75℃的油浴中，搅拌反应24小时后，取样测定MA单体的转化率，并向其余部分加入第二单体NIPAAM(0.7230g，6.4mmol)和一些AIBN(0.2mg溶在0.2mL二氧六环中)使其在75℃下再反应24小时，反应结束后在冷乙醚中沉淀，后真空干燥48小时，得到三嵌段共聚物，产率为70～75％。核磁结果表明其结构为DEX37-PMA5-PNIPAM356，其中PNIPAM所占的整个分子的分子量的比例约86％，在PBS中其LCST为33℃。
实施例三，RAFT聚合得到嵌段共聚物PEG113-PHA10-NIPAM90
氩气保护下，将引发剂AIBN(0.62mg，3.77μmol)，大分子RAFT试剂PEG-CPDPA(0.10g，19μmol)，5-己烯酸单体HA(22.8mg，200μmol)和4.0mL的二氧六环加入到10mL的Schlenk真空密封瓶中，通氩气30分钟后把瓶子放在75℃的油浴中，搅拌反应24小时后，取样测定HA单体的转化率，并向其余部分加入第二单体NIPAM(0.1930g，1.70mmol)和一些AIBN(0.2mg溶在0.2mL二氧六环中)使其在70℃下再反应24小时，反应结束后在冷乙醚中沉淀，后真空干燥48小时，得到三嵌段共聚物，产率为70～75％。核磁结果表明其结构为PEG113-PHA10-NIPAM90，其中PNIPAM所占的整个分子的分子量的比例约61％，在PBS中其LCST为38℃。
实施例四，RAFT聚合得到嵌段共聚物PEG-PAA-PNIPAM
氩气保护下，将引发剂AIBN(0.62mg，3.77μmol)，大分子RAFT试剂PEG-CPDPA(MW 2200，0.1g，45.5μmol)，丙烯酸单体AA(115mg，1.60mmol)和5.0mL的二氧六环加入到10mL的Schlenk真空密封瓶中，通氩气30分钟后把瓶子放在75℃的油浴中，搅拌反应24小时后，取样测定MA单体的转化率，并向其余部分加入第二单体NIPAM(0.0520g，0.460mmol)和一些AIBN(0.2mg溶在0.2mL二氧六环中)使其在70℃下再反应24小时，反应结束后在冷乙醚中沉淀，后真空干燥48小时，得到三嵌段共聚物，产率为70％。核磁结果表明其结构为PEG43-PAA35-PNIPAM100，其中PNIPAM所占的整个分子的分子量的比例约72％，在PBS中其LCST为45℃。
实施例一至四制备不同的三嵌段共聚物，并测试所得三嵌段共聚物在PBS缓冲溶液(pH7.4，0.02M，[NaCl]＝150mM)中的LCST，结果如下所示：
| 嵌段聚合物 | 温敏段分子量占整个嵌段共聚物分子量的比例 | 溶液体系 | 溶液pH | LCST |
| PEG113-PAA24-NIPAM211 | 78％ | PBS | 7.4 | 38.5℃ |
| PEG113-PHA10-NIPAM90 | 61％ | PBS | 7.4 | 38℃ |
| DEX37-PMA5-NIPAM356 | 86％ | PBS | 7.4 | 33℃ |
| PEG43-PAA35-NIPAM100 | 72％ | PBS | 7.4 | 45℃ |
实施例五，聚合物囊泡的形成
嵌段聚合物PEG113-PAA10-PNIPAM180(5.0mg)在4℃下溶解于5mL纯水中，通过0.22μm的针头过滤器过滤后，将溶液置于40℃的恒温摇床中200RPM摇60分钟，以得到尺寸为253.1±1.3纳米、分布均匀(PDI为0.08±0.003)的聚合物囊泡；
实施例六，聚合物囊泡的形成
嵌段聚合物PEG113-PAA24-PNIPAM211(5.0mg)在4℃下溶解于5mLPBS(生理盐水，pH7.4，0.02M，[NaCl]＝150mM)中，通过0.22μm的针头过滤器过滤后，将溶液置于40℃的恒温摇床中200RPM摇60分钟，以得到尺寸为51.1±1.3纳米、分布均匀(PDI为0.18±0.003)的聚合物囊泡；
实施例七，聚合物囊泡的形成
嵌段聚合物PEG113-PAA24-NIPAM215(5.0mg)在4℃下溶解于0.5mL的MES缓冲溶液中(0.5ml，pH5.5，0.02M)，通过0.22μm的针头过滤器过滤后，将溶液置于40℃的恒温摇床中200RPM摇60分钟，得到尺寸为148.1±0.3纳米、分布均匀(PDI为0.058±0.003)的聚合物囊泡；
实施例八，胱胺交联聚合物囊泡
为了得到交联的聚合物囊泡，向实施例七中形成的聚合物囊泡溶液中，在40℃下，加入预热好的0.2mL胱胺二盐酸盐(0.375mg，1.67μmol)水溶液，1小时后加入预热的0.1mL NHS(0.575mg，5.0μmol)水溶液和0.2mL的EDC(3.84mg，20μmol)水溶液，共聚物的最终浓度是5g/L，胱胺/羧基的摩尔比保持在1:2，反应混合物在40℃的恒温摇床中200RPM摇一夜即得到交联的聚合物囊泡。
实施例九，用酸敏感的含缩酮的二胺交联聚合物囊泡
三嵌段聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211(5.0mg)在4℃下溶解于0.5mL的PB缓冲溶液中(0.5ml，pH7.0，0.02M)，通过0.22μm的针头过滤器过滤后，将溶液置于43℃的恒温摇床中200RPM摇60分钟，得到尺寸为78.5±0.3纳米、分布均匀(PDI为0.07±0.003)的聚合物囊泡；
为了得到酸敏感交联的聚合物囊泡，加入43℃下预热好的0.2mL含缩酮的二胺(0.271mg，1.67μmol)PB水溶液(PH7.0)，1小时后加入预热的0.1mL NHS(0.575mg，5.0μmol)水溶液和0.2mL的EDC(3.84mg，20μmol)水溶液，共聚物的最终浓度是5g/L，二胺/羧基的摩尔比保持在1:2，反应混合物在43℃的恒温摇床中200RPM摇24小时即得到交联的聚合物囊泡。
实施例十：DTT还原胱胺交联的聚合物囊泡解交联
氩气保护下，将称好的DTT加到内有不同pH值的1.5ml交联了的DEX37-PMA5-NIPAM356聚合物囊泡CLP(0.1毫克/毫升)的玻璃样品池中，使最终DTT的浓度是0，10或100mM，然后玻璃样品池用橡胶塞封住，交联的聚合物囊泡CLP溶液摇晃均匀后，置于25℃空气恒温箱中，在选定时间、25℃下，通过动态激光光散射(DLS)来跟踪测定颗粒的粒径变化。结果表明，pH越大，粒径变化越快，DTT的还原解交联的速度越快；DTT的浓度越大，粒径变化越快，DTT的还原解交联的速度越快；如pH7.4时，加10mM DTT需要30-40分钟就使粒径从原来的210纳米降到15纳米，加100mM DTT只需要1-3分钟，粒径就会降到15纳米左右。
实施例十一：DTT还原胱胺交联的聚合物囊泡后，在生理条件溶解
氩气保护下，将称好的DTT加到1.5ml交联了的PEG113-PAA24-NIPAM211聚合物囊泡CLP(0.1毫克/毫升，生理盐水(PBS，pH7.4，0.02M，[NaCl]＝150mM))的玻璃样品池中，使最终DTT的浓度是0或10mM，然后玻璃样品池用橡胶塞封住，交联的聚合物囊泡CLP溶液摇晃均匀后，置于25℃和37℃空气恒温箱中，分别在25℃和37℃下，通过动态激光光散射(DLS)来跟踪测定颗粒的粒径变化。结果表明，在25℃和37℃下、10mM DTT存在时，30分钟都使粒径从原来的210纳米降到15纳米以下，而37℃下未加DTT时，10小时内囊泡的粒径保持不变；说明在生理条件下解交联的囊泡能够溶解在水溶液中。
实施例十二：酸刺激的聚合物囊泡解交联
室温下，将有不同pH值(4，5，6和7.4)的1.5ml如实施例九得到的交联聚合物囊泡CLP(0.1毫克/毫升)分别加到不同DLS的玻璃样品池，然后玻璃样品池用橡胶塞封住，交联的聚合物囊泡溶液摇晃均匀后，置于25℃空气恒温箱中，通过动态激光光散射(DLS)来跟踪测定颗粒的粒径变化。结果表明，pH越小，粒径变化越快，说明酸敏感解交联的速度越快；如使粒径从原来的210纳米降到15纳米，pH4时只需约10分钟，pH5时需要约20分钟，pH6时需要约40分钟，而pH7.4时，24小时内粒径基本不变。
实施例十三：靶向聚合物囊泡的制备
以PEG-PAA-PNIPAM三嵌段共聚物为例，在共聚物囊泡表面引入靶向分子anti-HER2：首先通过DCC/NHS法活化RAFT试剂CPDP上的羧基，然后与NH2-PEG-COOH反应，得到大分子RAFT试剂HOOC-PEG-CPDP；用该大分子RAFT试剂进行AA和NIPAM的序贯RAFT聚合即得到HOOC-PEG-PAA-PNIPAM；其羧基通过EDC/NHS与anti-HER2上的氨基反应即得到靶向载体。
实施例十四：包裹蛋白质模型FITC-葡聚糖(MW4000)及DTT触发释放
聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211(1.25mg)和FITC-葡聚糖(1.25mg，0.0125mol/mol glucose)在4℃下被溶解在0.125mL的MES缓冲溶液(pH5.5，0.02M)，聚合物囊泡如前面实施例八描述的一样进行交联后，40℃下对PB(pH7.4，0.02M)透析(MWCO 100kDa)48小时，除去未被包裹的FITC-葡聚糖，透析液至少要更换5次。
载有FITC-葡聚糖的CLPs被分成几份：一个是加入10mM DTT，温度为20℃，一个是加入10mM DTT，温度为37℃，另一个是只加入PB，温度为20℃(control)，这些溶液被马上转移到透析袋中，后者被浸入30mL相同DTT浓度，相同温度的PB中，到一定时间取5mL的透析袋外的透析液用来测定其荧光强度，并把5mL的新鲜液体加入透析袋外，FITC-葡聚糖在聚合物囊泡中的包封率和释放后仍在囊泡中包着的FITC-葡聚糖可以通过室温下用100mM的DTT还原囊泡1小时后溶解，并稀释2000倍后测量荧光强度，基于已知浓度的FITC-葡聚糖标准曲线而得到。
结果表明：模型蛋白质FITC-葡聚糖(MW 4000和40000)不影响囊泡的形成(尺寸基本不变)，并能高效地包裹在囊泡中(负载率>85％)。载有FITC-葡聚的交联囊泡在10mM DTT下、20℃时很快解交联，触发释放FITC-葡聚糖：2小时释放近50％；37℃时FITC-葡聚糖的释放也较快：2小时释放38％；形成对比的是，无DTT条件下，20℃时FITC-葡聚糖的释放在6小时仅释放18％。
实施例十五：包裹模型蛋白质FITC-BSA(牛血清白蛋白)及其酸触发释放
聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211(1.25mg)和FITC-BSA(0.625mg，4FITC/BSA)在4℃下被溶解在0.125mL的PB缓冲溶液(pH7.0，0.02M)，聚合物囊泡如前面实施例九描述的一样进行交联后，40℃下对PB(pH7.4，0.02M)透析(MWCO 500kDa)48小时，除去未被包裹的FITC-BSA，透析液至少要更换5次。
提纯后的载有FITC-BSA的CLPs被分成三份：分别MES缓冲溶液(pH6，0.5M)和醋酸盐缓冲溶液(pH5，0.5M)把原来的CLP溶液的PH调节到6和5，和在PB(pH7.4)的原样。这些溶液被马上转移到透析袋中，后者被浸入30mL相同浓度和pH值得缓冲溶液中，置于20℃的恒温摇床中以200RPM速度摇晃。到一定时间取5mL的透析袋外的透析液用来测定其荧光强度，并把5mL的新鲜液体加入透析袋外，FITC-BSA在聚合物囊泡中的包封率和释放后仍在囊泡中包着的FITC-BSA可以通过室温下用100mM的DTT还原囊泡1小时后溶解，并稀释后测量荧光强度，基于已知浓度的FITC-BSA标准曲线而得到。
结果表明：模型蛋白质FITC-BSA对囊泡的形成影响不大，尺寸基本不变，并能高效地包裹在囊泡中(负载率30-90％)。载有FITC-BSA的交联囊泡在酸性条件下，很快解交联并把蛋白质释放出来：FITC-BSA在pH6下5-6小时内释放出约50％；在pH5下，5小时内释放出约70-80％；而在pH7.4下，12小时内仅释放出约10％。
实施例十六：包裹模型小分子抗癌药物阿霉素及其DTT触发释放
聚合物PEG113-PAA24-NIPAM211(1.25mg)和阿霉素(0.25mg)在4℃下被溶解在0.125mL的MES缓冲溶液(pH5.5，0.02M)，40℃下聚合物囊泡如前面实施例八描述的一样进行交联8小时后，用浓磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4，0.05M，氯化钠150mM)把原来的CLP溶液的PH调节到7.4，继续40℃下摇4小时。40℃下对相同PBS透析(MWCO 12kDa)48小时，除去未被包裹的阿霉素，透析液至少要更换6次。
把载有DOX的CLPs被分成几份：一个是加入10mM DTT，温度为20℃，一个是加入10mM DTT，温度为37℃，另一个是只加入PBS(pH7.4，0.05M)，温度为20℃(control)，这些溶液被马上转移到透析袋中，后者被浸入30mL相同DTT浓度，相同温度的PBS中，到一定时间取5mL的透析袋外的透析液用来测定其荧光强度，并把5mL的新鲜液体加入透析袋外，DOX在聚合物囊泡中的包封率和释放后仍在囊泡中包着的DOX可以通过室温下用100mM的DTT还原囊泡1小时后溶解，并稀释后测量荧光强度得到。
结果表明；DOX不影响囊泡的形成且尺寸基本不变，包封率为10-20％。载有DOX的交联囊泡在10mM DTT、20℃和37℃下、PBS中，很快解交联，DOX在5小时内释放出约60-70％。
实施例十七：聚合物囊泡对疏水药物紫杉醇的包裹和酸刺激药物释放聚合物PEG113-PAA36-NIPAM320(5mg)在4℃下被溶解在0.5mL的MES缓冲溶液(pH5.5，0.02M)，加入溶在0.1mL的THF中的紫杉醇(1mg)，升温至40℃，如实施例七形成囊泡；然后，开盖半小时使THF挥发；而后聚合物囊泡如实施例八描述的一样进行交联8小时后，40℃下对PB(pH7.4，0.02M)透析(MWCO 12kDa)48小时，除去未被包裹的紫杉醇，透析液至少要更换6次。
提纯后的载有紫杉醇的CLPs被分成三份：分别MES缓冲溶液(pH6，0.5M)和醋酸盐缓冲溶液(pH5，0.5M)把原来的CLP溶液的PH调节到6和5，和在PB(pH7.4)中的原样。这些溶液被马上转移到透析袋中，后者分别被浸入30mL相同浓度和pH值的缓冲溶液中，置于20℃的恒温摇床中以200RPM速度摇晃。到一定时间取出5mL的透析袋外的透析液，并把5mL的新鲜液体加入透析袋外。用HPLC测定不同时间释放出来的紫杉醇的量和紫杉醇在聚合物囊泡中的包封率。
结果表明：紫杉醇对囊泡的形成影响不大，尺寸基本不变；紫杉醇能包裹在囊泡中，包封率为50-70％。载有紫杉醇的交联囊泡在酸性条件下会很快解交联并把紫杉醇释放出来：紫杉醇在pH6下5-6小时内释放出约50％；在pH5下，5小时内释放出约70-80％；而在pH7.4下，24小时内仅释放出约15％。
Claims (10)
1.一种制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含：亲水段，交联链段和温敏段，亲水段和温敏段位于嵌段共聚物的两端，交联链段位于亲水段和温敏段之间；在最低临界溶解温度以下，将嵌段共聚物溶于水溶液或缓冲溶液中，升温至嵌段共聚物的最低临界溶解温度以上，嵌段共聚物中的温敏段转变为疏水性，原位自组装形成聚合物囊泡，亲水段构成聚合物囊泡的膜壳，温敏段构成聚合物囊泡的膜核，交联链段构成聚合物囊泡的界面；
(2)对步骤(1)形成的聚合物囊泡的界面进行交联来稳定囊泡结构，得到界面交联的温度敏感的聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：所述温敏段选自：聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)或聚(甲基乙烯醚)中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：所述温敏段的分子量为5000～35000Da。
4.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：所述温敏段的分子量占整个嵌段共聚物的分子量的60％～90％。
5.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：所述嵌段共聚物中的亲水段的分子量为1000～8000Da。
6.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：嵌段聚合物的交联链段的重复单元数为5～40个，所述交联链段为侧链含有羧基的聚合物。
7.根据权利要求1所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：步骤(2)为：利用碳二亚胺化学法，用二胺基化合物对步骤(1)所得聚合物囊泡进行化学交联。
8.根据权利要求7所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法，其特征在于：所述二胺基化合物可选自：含pH敏感键的二胺基化合物或还原敏感的二胺基化合物中的一种。
9.权利要求1～8所述的制备界面交联的温度敏感的聚合物囊泡的方法制得的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡。
10.权利要求9所述的界面交联的温度敏感的聚合物囊泡在作为药物载体中的应用。
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