CN108542885A - 抗肿瘤药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明设公开了抗肿瘤药物及其制备方法；基于嵌段聚合物PEG‑P(TMC‑DTC)‑SP或者PEG‑P(LA‑DTC)‑SP的肿瘤靶向、具有带正电荷内膜的、还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡，能高效装载保护生物大分子如蛋白质、DNA和siRNA和生理环境带负电的小分子药物，并能输送其到活体的肿瘤细胞内，诱导其凋亡。该体系拥有多种独特优点，包括制备的简易操控性、杰出的生物相容性、对药物极好的控制释放性、超强的体内循环稳定性、优越的癌细胞靶向性、显著的癌细胞凋亡能力等。因此，其有望成为集简易、稳定、多功能等优点于一身的纳米系统平台，用于高效、主动靶向输送核酸至原位肿瘤。

Description

抗肿瘤药物及其制备方法
本发明属于发明名称为内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用，申请日为2016年7月15日，申请号为201610558116.6发明申请的分案申请，属于产品技术部分。
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在生物药物以及生理环境带负电的小分子药物的输送上的应用，具体涉及基于内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤药物及其制备方法。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要杀手，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。由双亲性聚合物自组装形成的聚合物囊泡性能可调度大，能同时装载亲水性药物和疏水性药物，是制备抗肿瘤纳米药物的理想载体。尤其是囊泡的水质内腔能为生物大分子药物如蛋白药物和核酸类药物提供理想空间。但是现有囊泡对这些毒副作用小的生物大分子药物以及生理环境带负电的小分子抗癌药物的装载效率低，极大地限制了其在这些药物制剂上的应用。
目前，尽管基因疗法能把具有特异性功能的基因输送到生物体特异性组织细胞来治疗疾病，尤其是近年来的小干扰RNAs(siRNA)更是作为一种新型核酸药物用于治疗包括癌症在内的不治之症，不同于DNA的小分子量、只需要在细胞质中、不需要进入细胞核发挥作用，具有巨大的应用潜力。但是这些基因药物易被核酸酶降解，进入细胞能力差、非特异性脱靶、免疫源性高等都阻碍了其临床应用。以病毒为核酸药物的载体虽然转染效率很高，但安全性堪忧，存在高免疫原性和潜在的致癌性。因此非病毒基因载体尤其是阳离子聚合物基因载体成为研究的热点，用含阳离子的脂质体和聚离子复合物等纳米载体来装载核酸的研究结果也并不令人满意，存在着体内不稳定、靶向性差、基因复合和转染效率不高、或细胞毒性高的问题。目前尚无能同时解决这些问题的方案。
蛋白质药物具有活性高、特异性强、副作用小、不受细胞耐药性影响等优势，是非常有发展潜力作为新型抗肿瘤药物。但是蛋白质体积大不易进入细胞内、易于被蛋白酶降解、易于变性。培美曲塞二钠是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。临床药物为注射液，用于治疗无法手术的恶性胸膜间皮瘤和非小细胞肺癌的二线药物。但是尤其生理环境下带负电荷导致其进入细胞发挥作用的效率差。
但是现有制备的聚合物囊泡技术中，尚缺乏在体内循环稳定、特异性靶向肿瘤、细胞内快速释放药物、毒副作用小的高效纳米囊泡，尤其是缺乏对的装载效率高、很好起到保护作用的生物相容性优异的聚合物囊泡。
发明内容
本发明的目的是公开一种内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，由聚合物自组装后交联得到；所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及精胺分子；所述疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段；所述亲水链段的分子量为2000-8000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.3-8.4倍。
优选的，本发明的聚合物化学结构式如下：
其中，R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
、；
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-10000Da；PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%。
本发明的聚合物中，精胺作为载体时毒性小，结合PEG链段与疏水链段，可以形成良好的药物包载效果，即使当siRNA含量高达80 wt.%，该囊泡仍可以完全、紧实包裹siRNA，并且能高效装载蛋白质如细胞色素C；同时本发明的聚合物避免了现有阳离子聚合物体系通过物理缠绕的方式结合核酸带来的不稳定、带正电易与细胞结合而迁移力差、释放效率差的缺陷；本发明通过静电作用力复合核酸、蛋白质或是带负电的小分子药物，再被交联的囊泡膜和外界分隔，避免在输送过程被细胞黏附而造成损失和毒副作用，能够高效送至病灶处，并在体内高浓度盐和还原剂GSH的作用下，快速释放核酸药物，解决疾病问题。
本发明中，聚合物囊泡为内膜具有正电荷的还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡；所述聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP，即聚合物由PEG亲水链段、疏水链段以及精胺分子组成，其中疏水链段的结构为：
；
当R2为时，为PTMC链段；当R2为时，为PLA链段，即疏水链段由P(TMC-co-DTC)或者P(LA-co-DTC)组成。
优选方案为：PEG分子量为5000-7500Da；PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2.5-5倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的18%-38%。
本发明设计的基于内膜具有正电荷的精胺的、可逆交联的生物可降解聚合物囊泡，能够实现对生物大分子药物和带负电的小分子抗癌药物的高效装载。精胺含有两个氨基和两个亚氨基，存在于细菌和大多数动物细胞中，是促进细胞增殖的重要物质。上述三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP，其中中间嵌段的TMC或者LA与DTC呈无规排列；精胺的分子量为202Da，远小于PEG分子量，在自组装、交联后得到内膜具有正电荷的交联的聚合物囊泡，囊泡膜的内壳为精胺用于复合生物大分子如蛋白质、DNA和siRNA和生理环境带负电的小分子药物；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC或者PLA，侧链的二硫戊环类似人体天然的抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感的可逆交联，不但支持生物药物在血液中的长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放药物到靶细胞细胞内。
本发明还公开了上述内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的制备方法，包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的末端用羟基活化剂比如氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与精胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)–SP的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP或者靶向PEG-P(LA-DTC)-SP；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备肿瘤靶向、内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(LA-DTC)-SP和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备肿瘤靶向、内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(LA-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
优选以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)-SP和靶向PEG-P(LA-DTC)为原料共混，自组装、交联得到肿瘤主动靶向、内膜具有正电荷的聚合物囊泡，外壳为以PEG为背景、靶向分子对癌细胞可高特异性结合，增加载体的靶向性。靶向分子可以为多肽DP8、cNGQ、cRGD、CC9、叶酸FA或半乳糖Gal。比如通过PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP和偶联了肿瘤主动靶向分子的二嵌段聚合物如DP8-PEG-P(TMC-DTC)混合，共自组装、装载药物、交联后得到肿瘤主动靶向、内膜具有正电荷的聚合物囊泡(DP8-RCCPs)；所述DP8-PEG-P(TMC-DTC)的化学结构式为：
。
上述制备方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC溶于干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到活化的PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC溶液滴加到精胺溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP；步骤（2）为将得到聚合物溶于带有靶向分子的有机溶剂如DMSO或DMF中；步骤（3）为将原料溶液中加入非离子缓冲溶液中如HEPES，室温放置少许后对相同缓冲溶液透析，孵育交联，得到内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。本发明可以在加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）下室温交联得到内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
比如：
将PEG-P(TMC-DTC)的末端羟基用羟基活化剂如氯甲酸对硝基苯酯（NPC）活化，再与精胺的端基伯胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-SP。具体为，PEG-P(TMC-DTC)和NPC溶于干燥的二氯甲烷(DCM)中冰水浴下反应12-24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-NPC；然后将PEG-P(TMC-DTC)-NPC溶于干燥DCM，滴加到精胺的DCM中30-40℃下反应12-24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析24-48小时，接着沉淀、抽滤、真空干燥得到产物PEG-P(TMC-DTC)-SP；
以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电荷的自交联聚合物囊泡；具体为把PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)的DMSO溶液混合后加入HEPES缓冲液中，室温下放置过夜、透析、在加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）或谷胱甘肽（GSH）时孵育4 h囊泡交联，得到内膜具有正电荷的交联聚合物囊泡。
本发明进一步公开了一种抗肿瘤药物，由上述内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为蛋白质、核酸或生理环境带负电的小分子药物，如培美曲塞、甲氨蝶呤。本发明的药物以主动靶向、还原敏感可逆交联的纳米囊泡为载体、装载抗肿瘤药物，在小鼠体内治疗肿瘤表现了卓越的疗效和低毒性。
上述抗肿瘤药物的制备方法，为以下制备方法中的一种：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液或PEG-P(LA-DTC)-SP溶液与药物、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（2）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（3）将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP溶液、药物、非离子缓冲溶液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（4）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液与药物、非离子缓冲溶液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（5）将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)溶液与药物、非离子缓冲溶液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物。
其中，聚合物溶液、抗肿瘤药物溶液和非离子缓冲溶液三者共同混合得到包载药物的内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，优选条件为聚合物溶液加入至含蛋白质、DNA和生理环境带负电的小分子药物的HEPES缓冲溶液中，或聚合物溶液与siRNA溶液混合后再加入HEPES中，比如：
将蛋白质或DNA或生理环境带负电的小分子药物、非离子缓冲液如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液或者PEG-P(LA-DTC)-SP溶液，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将蛋白质或DNA或生理环境带负电的小分子药物、非离子缓冲液如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将蛋白质或DNA或生理环境带负电的小分子药物、非离子缓溶液如HEPES混合，再加入PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP溶液，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将蛋白质或DNA或生理环境带负电的小分子药物、非离子缓冲液如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将蛋白质或DNA或生理环境带负电的小分子药物、非离子缓冲液如HEPES混合，再加入PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)溶液，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物。
优选的，将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液或者PEG-P(LA-DTC)-SP溶液与siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲液如HEPES中，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液与siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲液中如HEPES中，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP溶液与siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲液如HEPES中，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液与siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲液中如HEPES中，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)溶液与siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲液中如HEPES中，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物。
本发明还公开了上述内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡作为抗肿瘤纳米药物载体的应用，比如作为蛋白质、siRNA、DNA和培美曲塞、甲氨蝶呤等生理环境带负电的小分子药物的载体的应用。
本发明还公开了上述内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备生物抗肿瘤药物中的应用。
本发明还公开了一种聚合物，其特征在于，所述聚合物的化学结构式如下：
其中， R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
、；
所述聚合物中，PEG的分子量为2000-8000Da；PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1. 本发明设计了内膜具有正电荷的交联聚合物囊泡用于抗肿瘤药物的体内传递；首先合成了嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-SP，精胺由于分子量远小于PEG分子量，在聚合物自组装、交联后得到囊泡膜的内壳为精胺的交联聚合物囊泡，囊泡膜内壳的精胺用于高效装载蛋白质、DNA、siRNA和生理环境带负电的小分子药物如培美曲塞、甲氨蝶呤；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC，侧链的二硫戊环类似人体天然抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感的可逆交联，不但支持纳米药物在血液中长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放核酸到靶细胞细胞内；外壳以PEG为背景同时具有靶向分子，对癌细胞可高特异性结合；囊泡的纳米尺寸以及肿瘤特异性靶向使得囊泡可输送核酸高效进入肿瘤细胞。
2. 本发明通过对内部具有带正电的精胺的交联聚合物囊泡能用来装载复合功能性siRNA和DNA药物、其体内外具有显著的基因沉默效果。这里使用的精胺是生物体天然存在的多胺，无毒，在结合PEG链段与疏水链段后可形成囊泡结构，具有良好的药物包载效果；同时本发明的聚合物载体避免了现有非病毒阳离子聚合物通过静电相互作用结合核酸形成的复合物带来的不稳定、带正电易与细胞结合而迁移力差、释放效率差的缺陷。
3. 本发明的内膜具有正电荷的、还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡载体避免了现有蛋白质纳米载体装载效率低、蛋白质易变性、或是蛋白质释放慢等导致的生物利用率低、药效低的缺陷；同时本发明的聚合物载体避免了现有在生理环境下带负电荷的小分子药物如培美曲塞、甲氨蝶呤等缺乏合适的载体、或装载效率低、释放慢、药物的生物利用率低、药效低等缺陷。
4. 该囊泡体系拥有多种独特的优点，包括制备的简易操控性、杰出的生物相容性、对药物极好的控制释放性、超强的体内循环稳定性、对癌细胞的优越靶向性、显著的特异性基因沉默能、卓越的抑制肿瘤生长和转移的能力。因此，本发明的囊泡有望成为集便捷、稳定、多功能等于一身的纳米药物平台，用于高效、主动靶向输送蛋白质、核酸和生理环境带负电的小分子药物至肿瘤。
附图说明
图1为实施例一中PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP核磁谱图；
图2为实施例三中DP8-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)核磁谱图；
图3为实施例八中靶向交联囊泡的稳定性、TEM、还原响应图；
图4 为实施例十一中载FITC-CC交联囊泡FITC-CC-DP8/RCCPs的释放图；
图5 为实施例十七中空交联囊泡DP8/RCCPs对MCF-7乳腺癌癌细胞的毒性图；
图6为实施例十八中载颗粒酶GrB交联囊泡GrB-DP8/RCCPs对MCF-7乳腺癌细胞、HepG2肝癌细胞的细胞毒性图；
图7为实施例十九中载FITC-CC交联囊泡FITC-CC-DP8/RCCPs对MCF-7乳腺癌细胞、HepG2肝癌的细胞CLSM图；
图8为实施例二十中载CC-Cy5交联囊泡CC-Cy5-DP8/RCCPs在小鼠体内的药力动力学曲线图；
图9为实施例二十一中载CC-Cy5交联囊泡CC-Cy5-DP8/RCCPs对MCF-7乳腺癌皮下瘤模型的生物分布图；
图10为实施例二十二中载CC-Cy5交联囊泡CC-Cy5-DP8/RCCPs对MCF-7乳腺癌皮下瘤模型的成像图；
图11为实施例二十三中载培美曲塞交联囊泡PEM-CC9-RCCPs对荷H460皮下肺癌治疗实验图，其中A治疗期间各组肿瘤生长曲线，B为治疗后各组肿瘤图，C为体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一 合成聚合物PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP
合成分为两步，首先是开环聚合制备PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)二嵌段共聚物，具体操作如下，在氮气环境下，依次称取MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol, 0.20 g, 40 μmol),TMC (0.6 g, 5.9 mmol) 和DTC (0.192g, 1.0 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，6.8 mL)中，快速加入开环聚合催化剂，如双（双三甲基硅基）胺锌(7.7 mg, 20 μmol)。密闭反应器密封好放置40 °C油浴中磁力搅拌下反应24小时。冰醋酸终止反应后在冰乙醚中沉淀两次、抽滤、常温真空干燥后得到产物。产率：90.3%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ 3.38,3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02 ，经核磁计算可知聚合物各段的分子量为5.0-(4.6-13.5) kg/mol。GPC 测得分子量分布：1.39。
接着，得到的PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)的末端羟基和氯甲酸对硝基苯酯NPC反应活化，再与精胺(M n=202.34 kg/mol)的伯胺反应制得。具体的，PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k) (0.2g, 羟基0.0087 mmol)和吡啶（3.5µL）溶于干燥的二氯甲烷(DCM)中，冰浴下缓慢滴加NPC(9.2mg, 0.046 mmol)的DCM溶液，后室温反应12小时，然后在冰乙醚中沉淀两次、过滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-NPC。接下来，将产物溶于3 mL DCM后滴加到2mL溶有精胺(SP，34.7 mg, 0.172 mmol)的DCM中，25℃下反应24小时后在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 3500) 48小时，浓缩、冰乙醚中沉淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP。产率：87.3%。附图1为PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP的核磁图谱，其1H NMR (400 MHz, DTCl3)表征显示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外（PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02），还有精胺的特征峰在2.6-2.8和3.23。
实施例二 合成嵌段共聚物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC15.2k)-SP
Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC15.2k)-SP的合成与实施例一类似，也是分为两步，只是将其中的第一步中的引发剂MeO-PEG-OH换为马来酰亚胺官能化的Mal-PEG6k-OH，开环聚合TMC和DTC得到Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC15.2k)，然后其末端羟基用NPC活化，再与精胺的伯胺反应制得。具体操作与实施例一类似。产率：90.2%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02，以及Mal和精胺的特征峰。聚合物数均分子量通过特征峰面积积分比值计算为6.0-(4.8-15.2)-0.2 kg/mol。
实施例三 合成靶向二嵌段聚合物 DP8-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)
DP8-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k) 的合成与实施例一类似，也是分为两步。第一步将实施例一的第一步中的引发剂MeO-PEG-OH换为N-羟基琥珀酰亚胺官能化的NHS-PEG6.5k-OH，开环聚合TMC和DTC得到NHS-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)，即氮气环境下、密闭反应器中顺序加入0.15 g ( 0.781 mmol) DTC、 0.43 g的TMC 、0.2 g ( 0.0154 mmol) NHS-PEG6.5k-OH和5 ml 的DCM，溶解，然后加入5.9 mg （0.0154 mmol） 的开环聚合催化剂如 双（ 双三甲基硅基）胺锌，之后处理同实施例一。核磁通过积分面积计算NHS-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)。第二步，多肽DMAPTVLP(DP8)按照其氨基和NHS-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)摩尔比3:1加入，30oC酰胺化反应24-72小时，透析除去游离的DP8，冷冻干燥得到DP8-PEG6.5k-b-P(DTC6k-TMC 15k)，通过核磁（附图2）和TNBSA计算DP8 接枝率接近100%。
实施例四 合成靶向二嵌段聚合物cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)
cNGQ-PEG7k-P(DTC2.8k-TMC14.2k)的合成与实施例一类似，也是分为两步，将第一步中的引发剂MeO-PEG-OH换为N-羟基琥珀酰亚胺官能化的NHS-PEG-OH，开环聚合TMC和DTC得到NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)；其次，具有自由伯胺的多肽C(NGQGEQ) (cNGQ)与NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)通过酰胺化反应而键合。简要的说，NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k) (0.5 g, 0.017 mmol) 与cNGQ (20 mg, 0.033 mmol) 相继溶解在5 mL DMF中, 常温反应2天后，在蒸馏水中透析两天(MWCO 3500)，冷冻干燥得产物cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)。产率：81.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): PEG: δ 3.51; TMC: δ4.23, 1.94; DTC: δ 4.13, 2.99; cNGQ: δ 6.84–7.61。BCA蛋白试剂盒(Thermoscientific)测得cNGQ的接枝率为89.7%。通过使用具有不同的活性PEG可得到不同靶向分子的聚合物。
实施例五 合成聚合物Azide-PEG6.5k-P(DTC4.0k-LA15.3)-SP
Azide-PEG6.5k-P(DTC4.0k-LA15.3)-SP的合成与实施例一类似，也是分为两步，只是将其第一步的引发剂MeO-PEG-OH换为叠氮官能化的Azide-PEG6.5k-OH，开环聚合LA和DTC得到Azide-PEG6.5k-P(DTC4.0k-LA15.3)，然后其末端羟基用NPC活化，再与精胺的伯胺反应制得。具体操作与实施例一类似。产率：90.2%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ 3.38,3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02，以及精胺的特征峰。聚合物数均分子量通过特征峰面积积分比值计算为6.5-(4.0-15.3)-0.2 kg/mol。
通过调整使用的原料比例可得到不同分子量的聚合物，见表1。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
实施例六 制备交联聚合物囊泡PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP
溶剂置换法制备。室温下向950μL的HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲液中加入50 μL浓度为5mg/ml 的PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP 的DMSO 溶液，室温静置1h, 缓慢转动混合液，使之分散均匀后，（不）加入相当于DTC摩尔量10%-30%的DTT溶液（最终0.1 mM）后在37oC摇床中震荡12h充分（自）交联。然后透析（MWCO: 3500）12h 除去有机溶剂和游离蛋白，期间换5次介质，由此得到可逆核交联囊泡，简称为RCCPs。
实施例七 靶向聚合物的合成和靶向聚合物囊泡的制备
靶向聚合物的合成有多种方式。
炔功能化的Alkynyl-PEG5k-OH引发DTC与LA开环聚合、端羟基活化、与精胺反应得到末端为活性炔基的Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-SP；最后，与叠氮功能化的靶向分子，如多肽cNGQ-N3或半乳糖Gal-N3，通过叠氮-炔基的点击化学反应得到靶向聚合物Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-SP。然后靶向囊泡的制备即是在Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-SP和PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-SP混合在DMSO中后打入HEPES溶液中，同实施例六制备得到Gal-RCCPs。
叠氮功能化的Azide-PEG3k-OH引发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与精胺反应得到末端为活性叠氮基的Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-SP，最后，与炔基功能化的靶向分子，如alk-CC9或是cRGD-alk，通过叠氮-炔基的点击化学得到靶向聚合物CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-SP。然后靶向囊泡的制备即是把CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-SP和PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-SP混合在DMSO中后打入HEPES溶液中，同实施例六制备得到 CC9-RCCPs。
叠氮或炔基功能化的聚合物为无末端精胺的二嵌段聚合物，即Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)和Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)，其键合cNGQ等多肽的方式和制备靶向囊泡（和无靶向的三嵌段聚合物混合）的方式与上述例子类似。
马来酰亚胺Mal功能化的Mal-PEG6k-OH或者丙烯酸酯功能化的AA-PEG6.5k-OH引发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与精胺反应得到聚合物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-SP或AA-PEG6.5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-SP。然后，他们和相应的无活性端的聚合物PEG5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-SP混合溶于DMSO中后，打入HEPES溶液中，同实施例六制备得到交联囊泡。最后，在囊泡溶液中加入含有自由巯基的靶向分子如多肽cNGQ-SH或叶酸FA-SH或CPP33-SH，通过迈克尔加成反应和表面有活性Mal或AA的囊泡键合，得到靶向聚合物囊泡CPP33-RCCPs、FA-RCCP等。
马来酰亚胺Mal和丙烯酸酯功能化的嵌段聚合物为无末端精胺的二嵌段聚合物，即Mal-PEG6k-P(DTC3.2k-TMC15.4k)和AA-PEG5k-P(DTC4.5k-TMC19.3k)，其和末端有精胺的三嵌段聚合物混合制备囊泡、键合cNGQ等多肽的方式和制备靶向囊泡的方式与上述例子类似。
实施例八 制备靶向自交联聚合物囊泡DP8-RCCPs
溶剂置换法制备。靶向聚合物囊泡通过几种方式制备。第一种基于三嵌段聚合物和靶向二嵌段聚合物。例如，实施例三制备的DP8-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)和PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP按特定比例混合，溶于DMSO中，加入到HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲液中，同实施例六静置、交联、透析，得到靶向交联囊泡，标记为DP8-RCCPs。靶向聚合物DP8-PEG6.5k-b-P(DTC6k-TMC15k)的含量为5~40wt.%。DLS测定制备的自交联聚合物囊泡尺寸为80-125nm左右，粒径分布为0.11-0.16。图3是上述自交联囊泡粒径分布及稳定性的测试（A）及电子透射显微镜图片（B），交联囊泡及还原响应性测试（C）；得到的自交联囊泡的尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测的形成的纳米粒囊泡为80~125nm,粒径分布很窄，且高倍稀释后仍然保持不变的粒径和粒径分布（图3A）；由图3B 可知，TEM 测得的纳米粒子为中空的囊泡结构；但在模拟肿瘤细胞还原环境下快速释放，解交联（图3C）。由此可知，得到的囊泡可自交联，并具有还原敏感的解交联的性质。
实施例九 制备靶向自交联聚合物囊泡cRGD-RCCPs
基于两种三嵌段聚合物制备靶向聚合物囊泡。例如，按特定比例混合的两种PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP和cRGD-PEG6.5k-P(DTC6k-TMC15k)-SP溶于DMSO中，加入到HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲液中，同实施例六静置、加入相当于DTC摩尔量10%-30%的DTT溶液（最终0.1 mM），透析，得到靶向交联囊泡，标记为cRGD-RCCPs。取决于不同靶向聚合物的比例和聚合物的溶解时间，得到的囊泡平均粒径为50-125nm左右，粒径分布为0.04-0.17。具有囊泡的特征，体外稳定、具有还原敏感性。
实施例十 制备靶向自交联聚合物囊泡FA-RCCPs
基于三嵌段聚合物和有活性基团的二或三嵌段聚合物，例如，实施例二的Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC15.2k)-SP和PEG5k-P(DTC4.6k-TMC13.5k)-SP按特定比例混合溶于DMSO，加入到HEPES（5 mM，pH 6.8）缓冲液中，同实施例六静置、交联、透析，得到交联囊泡。然后，通过迈克尔加成与含有自由巯基的靶向分子如叶酸FA-SH在室温反应后得到靶向交联囊泡，标记为FA-RCCPs。取决于不同靶向聚合物的比例和聚合物的溶解时间，得到的囊泡平均粒径为58-130nm，粒径分布为0.06-0.17。囊泡体外稳定、具有还原敏感性。
实施例十一 制备装载蛋白质或DNA的交联囊泡和靶向交联囊泡
载蛋白质如细胞色素C、颗粒酶B和DNA的交联囊泡的制备同实施例七，只是HEPES溶液中预先溶解有不同浓度的蛋白质或DNA。例如载不同比例（2-30wt.%）的FITC标记的细胞色素C（FITC-CC）的交联聚合物囊泡的粒径在90-108 nm, 粒径分布在0.13-0.19.得到的囊泡的为FITC-CC-DP8-RCCPs。其荧光分光光度计测定FITC-CC的包裹效率为50%-100%。
颗粒酶B（GrB）和DNA的装载相同。载药靶向囊泡制备同实施例八、九、十，只是HEPES溶液中预先溶解有不同浓度的蛋白质或DNA，得到GrB-DP8-RCCPs和DNA-DP8-RCCPs。
体外释放采用透析法。以FITC-CC的体外释放为例说明，在37oC恒温摇床中震荡(200rpm) 进行，每组各有三个平行样。第一组，载FITC-CC 的交联聚合物囊泡加入10mMDTT 的还原环境PB（10Mm, pH 7.4)中；第二组，载FITC-CC的聚合物囊泡在PB(10Mm,Ph7.4)中；载药交联囊泡的浓度为50mg/L, 取0.5 ml放入透析袋中（MWCO: 350kDa）中，每个试管中加入相应的透析介质25ml, 在预定时间取5.0ml 透析袋外介质用作测试，补加5.0ml新鲜介质。荧光光谱仪测定溶液中药物浓度。附图4为FITC-CC的累积释放量与时间的关系，可以看出，加入模拟细胞内DTT后，其释放明显要快于没加DTT的样本，说明载药交联囊泡在10 mM的DTT的存在下，能有效释放药物。
实施例十二 制备装载DNA的交联囊泡和靶向交联囊泡
通过溶剂交换法可制备包裹DNA的DNA-RCCPs。DNA为pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ），pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）或小牛胸腺DNA等。例如PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-SP制备DNA-RCCPs具体操作为下，100 μL PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-SP的DMSO溶液(5.0 mg/mL) 缓慢打入900 μL溶解了预定数量的DNA (1 mg/mL)的HEPES (10 mM, pH 6.8)的混合溶液中，室温放置过夜，透析、加入催化量还原剂二硫苏糖醇（DTT）交联得到DNA-RCCPs。DLS结果显示，DNA-RCCPs粒径随着DNA含量的增加而增大，见表2。以后体内试验用含量为20wt%DNA的样品。
表2 DNA-cNGQ/RCCPs的粒径与DNA含量的关系
实施例十三 装载DNA的交联靶向囊泡DNA-cNGQ-RCCPs的凝胶电泳分析
同实施例十二制备DNA-cNGQ/RCCPs。按照重量比4:1混合PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-SP和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)。DNA采用了pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ）和pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）。在70 mL四溴乙烷(TBE)缓冲溶液中加入0.7 g琼脂糖，加热溶解琼脂糖粉末，在冷却后加入1 μL溴化乙锭，得到琼脂糖胶待用。DNA-cNGQ-RCCPs或DNA-RCCPs 在DNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分别设定为10%、20%、30%、40%、50%。在胶中分别加入20 μL的DNA-cNGQ-RCCPs、DNA-RCCPs、自由DNA，在TBE电泳缓冲液中跑胶(100V, 30 min)。之后，由Molecular Imager FX(Bio-Rad, Hercules，Ex/Em: 532/605 nm)拍照凝胶图片，通过Quantity One 软件(Bio-Rad)分析。琼脂糖凝胶阻留实验结果表明，即使当DNA含量达50 wt.%，cNGQ-RCCPs仍可完全紧实包裹DNA，证明DNA-cNGQ-RCCPs稳定性优异。结果显示囊泡可有效复合DNA（pIL-12）。
实施例十四 制备载siRNA的交联囊泡和靶向交联囊泡siRNA-RCCPs
装载siRNA的交联囊泡通过溶剂交换法制备。例如，装载无特异性的对照siRNA(siScramble) 得到siRNA-RCCPs的方法。预定数量siRNA的HEPES缓冲溶液(1 mg/mL, 10mM, pH 7.4)和100 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-SP的DMSO溶液(5.0 mg/mL)混合，再打入900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)，室温放置过夜、HEPES中透析、孵育4 h交联得到siRNA-RCCPs。DLS结果显示包裹10 wt% siRNA时，粒径为100 纳米左右，且TEM证实了其中空结构。表3为siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径与siRNA含量的关系；随着siRNA含量从0增加到50wt.%，siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径也由109增长到175 nm。以后的细胞实验和体内试验如无特殊说明均实验在siRNA为10wt%的样品。
表3 siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径与siScramble含量的关系
装载荧光标记Cy5-siRNA或荧光素酶基因标记siGL3或治疗性siPLK1的囊泡与此类似。装载不同量siRNA（10%- 80%）时，粒径为90-180 纳米。
实施例十五 siScramble-cNGQ/RCCPs的凝胶电泳分析
如实施例十四制备siScramble-cNGQ/RCCPs，如实施例十三制备凝胶并跑胶，siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs在siRNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分别设定为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%。在胶中分别加入20 μL的siRNA-cNGQ/RCCPs、siRNA-RCCPs、自由siRNA，以及用10 mM GSH处理20 h后的siRNA-cNGQ/RCCPs。实验结果表明，即使当siRNA含量高达80 wt.%，cNGQ/RCCPs仍可以完全、紧实包裹siRNA，证明siRNA-cNGQ/RCCPs稳定性优异。然而，当它在10 mM GSH存在下孵育20 h后发现，由于交联囊泡的解交联及溶胀大部分siRNA释放出来。
实施例十六 制备载培美曲塞的交联囊泡和靶向交联囊泡PEM-RCCPs
装载生理环境带负电的小分子药物如培美曲塞的交联囊泡通过溶剂交换法制备，与实施例十一中蛋白质的包载类似。将100 μL 的聚合物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-SP的DMSO溶液(5.0 mg/mL)打入900 μL的含预定数量的培美曲塞的HEPES缓冲溶液(1 mg/mL,10 mM, pH 6.6)，室温放置过夜、HEPES中透析、孵育4 h交联得到PEM-RCCPs。载20 wt% 培美曲塞的交联聚合物囊泡的粒径在90 nm, 粒径分布在0.14.得到的囊泡的为PEM-RCCPs。其紫外分光光度计测定PEM的包裹效率为89%。
实施例十七 MTT法测囊泡对乳腺癌细胞MCF-7的毒性
MTT法使用人乳腺癌癌细胞（MCF-7），以5×103个/mL将细胞种于96孔板，每孔80 μL，24小时后培养至细胞贴壁70%左右。交联聚合物囊泡的制备按实施例七、八制备。然后，实验组各孔中分别加入含有不同浓度（0.1-0.5 mg/mL)的囊泡，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔（复4孔）。培养24小时后，每孔加入MTT（5.0 mg/mL）10 μL，继续培养4小时后每孔加入150 μL DMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于492 nm处测吸光度值（A），以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。图5中结果显示，当交联聚合物囊泡的浓度从0.1增到0.5 mg/mL时，MCF-7的存活率仍高于85%，说明该交联聚合物囊泡具有良好的生物相容性。
另外制备了表面具有不同靶向分子的交联囊泡，例如，同上MTT法研究了FA体系对卵巢癌SKOV-3细胞、人口腔表皮样癌细胞KB细胞的作用，cNGQ体系对肺癌A549细胞，Gal体系对肝癌细胞HepG2，和cRGD体系对黑色素瘤B16细胞的细胞毒性，结果也说明了这些空交联靶向囊泡具有良好的生物相容性。
实施例十八 MTT法测载GrB的靶向交联囊泡对乳腺癌细胞MCF-7的毒性
测试对象为实施例十一GrB-DP8-RCCPs，用无靶向和5%，10%，20%，30%，40%靶向的载药囊泡研究对MCF-7细胞的毒性，GrB浓度范围为0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.32 μg/mL。细胞的培养同实施例十七，共同培养4小时后，吸出样品换上新鲜培养基继续孵育68 h后，而后的MTT加入、处理和测定吸光度同实施例十七。我们还做了载药聚合物囊泡对多肽封端的MCF-7乳腺癌细胞的毒性实验，加入载药纳米粒前先加入自由多肽DP8孵育4h，再同上述实验操作相同。由图6A、B中结果可知，载GrB的含30%DP8靶向交联聚合物囊泡对MCF-7细胞的半致死浓度（IC50）为0.188 μg/mL，远低于无靶向囊泡的半致死浓度，说明本发明的囊泡能很好的将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌细胞，而靶向纳米粒的效果要更好，而封端的细胞存活率均在70%以上。另外，载药交联囊泡对细胞表面核仁素表达低的HepG2肝癌细胞的毒性较差，由图6C中结果显示，核仁素在MCF-7细胞表面的特殊表达以及DP8的很好的靶向性。
制备了表面具有不同靶向分子的交联囊泡、装载培美曲塞、甲氨蝶呤、细胞色素C、或是凋亡素等，用MTT法研究FA体系对卵巢癌SKOV-3细胞、人口腔表皮样癌细胞KB细胞的作用，cNGQ体系对肺癌A549细胞，Gal体系对肝癌细胞HepG2，和cRGD体系对黑色素瘤B16细胞的细胞毒性，均体现了靶向的特异性，载药的靶向聚合物囊泡能更快的进入细胞并发挥效果。
实施例十九 靶向载药囊泡的内吞和细胞内释放实验
靶向载药囊泡的内吞和细胞内释放实验以载药囊泡FITC-CC-DP8-RCCPs为例、采用激光共聚焦显微镜（CLSM）跟踪测定。将450µL的MCF-7细胞和HepG2细胞的DMEM(含10%牛血清、100IU/ml青霉素及100µg/ml链霉素)悬浮液铺于24孔培养板（每孔5×104个细胞）中，37℃、5%二氧化碳条件下培养24h。将50µL的FITC-CC-RCCPs和FITC-CC-DP8-RCCPs的PBS溶液加入孔中（FITC终浓度为10µg/ml）,接着继续孵育4h、8h、12h后，移去培养基并用PBS洗三次、用4%的多聚甲醛溶液200µL固定15min、PBS洗3次。最后用CLSM（TCS SP5）观察拍照。由图7结果表明FITC-CC-DP8-RCCPs (图7A8h、B12h)相对于无靶向FITC-CC-RCCPs（图7C 12h）可以通过介导作用更有效内吞进入MCF-7细胞且FITC-CC在细胞内可以快速释放，引起有效细胞凋亡，而对HepG2细胞基本上没有靶向效果（图7D）。
制备了表面具有不同靶向分子的载药交联囊泡、利用CLSM实验研究FA体系对卵巢癌SKOV-3细胞、人口腔表皮样癌细胞KB细胞的作用，cNGQ体系对肺癌A549细胞，Gal体系对肝癌细胞HepG2，和cRGD体系对黑色素瘤B16细胞的细胞内吞和细胞内释放行为，结果均表明靶向聚合物物囊泡能更快、更有效地被靶细胞内吞并快速释放药物。
实施例二十 Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC-DP8-RCCPs交联囊泡的血液循环
所有动物实验操作符合苏州大学动物实验中心规定严格进行。实验选用体重为18~20克左右、4~6周龄的Balb/C裸鼠。首先用Cy5-NHS和CC通过酰胺化反应制备Cy5标记的蛋白Cy5-CC。囊泡Cy5-CC-DP8-RCCPs（130纳米，粒径分布为 0.17）和无靶向Cy5-CC-RCCPs尾静脉注射小鼠体内（Cy5浓度为4 μM），在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 小时定点取血约10 μL，通过差量法准确计算血液重量，再加100 μL、浓度为1%的曲拉通和500 μL 二甲亚砜萃取（其中含有20 mM的DTT）；然后离心（20000转/分钟，20分钟）取上层清液，通过荧光光谱仪测得每个时间点Cy5的量。由计算可知，靶向交联囊泡、非靶向交联囊泡在小鼠体内的消除半衰期分别为4.36和3.33小时，所以本发明的交联囊泡在小鼠体内稳定，有较长循环时间，如图8所示。
研究了几个具有代表性的样品在小鼠体内的循环时间，结果表明，载药的PEG8k-P(DTC8k-LA30k)-SP 交联囊泡、PEG7k-P(DTC4k-LA18k)-SP交联囊泡和PEG3k-P(DTC0.9k-TMC6k)-SP交联囊泡中药物在小鼠体内的血液循环时间分别为7.56小时、6.51小时和2.18小时。
实施例二十一 载蛋白交联囊泡Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC-DP8-RCCPs在荷MCF-7乳腺癌小鼠的体内生物分布
动物同实施例二十。在皮下注射1×107个MCF-7细胞，大约3~4周后，肿瘤大小为100~200 mm3时开始实验。将Cy5-CC-DP8-RCCPs、自由蛋白Cy5-CC和非靶向Cy5-CC-RCCPs尾静脉注射小鼠体内（Cy5-CC：0.25 mg equiv./kg），8 小时后处死老鼠，将肿瘤及心，肝，脾，肺和肾组织取出，清洗称重后加入500 μL 1% 的曲拉通通过匀浆机磨碎，再加入900 μL二甲亚砜萃取（其中含20 mM的DTT）。离心（20000转/分钟，20分钟）取上清液，荧光光谱仪测每个时间点Cy5-CC的量。由图9可知，Cy5-CC-DP8-RCCPs和Cy5-CC-RCCPs注射8小时在肿瘤积累的Cy5-CC量分别为9.5和5.4 ID%/g，前者是后者的1.76倍，说明Cy5-CC-DP8-RCCPs通过主动靶向在肿瘤积累较多。
实施例二十二 载药交联囊泡泡Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC-DP8-RCCPs在MCF-7乳腺癌小鼠的活体成像实验
动物选择同实施例二十。Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC-DP8-RCCPs尾静脉注射小鼠体内，在时间点4、8、12、24小时用小动物活体成像仪来追踪囊泡的去向。实验结果由图10可知，Cy5-CC-DP8-RCCPs在肿瘤部位很快积累，且在24小时后荧光仍然很强。说明Cy5-CC-DP8-RCCPs能主动靶向及富集到乳腺癌肿瘤部位，对乳腺癌细胞具有极强的特异性。而载药Cy5-CC-RCCPs交联囊泡在进入肿瘤后很快代谢，荧光强度低。
实施例二十三 载药靶向交联囊泡PEM-CC9-RCCPs在荷H460皮下肺癌的小鼠中的抑瘤效果、体重变化和存活率
动物选择同实施例二十，在皮下注射1×107个H460人肺癌细胞，大约3~4周后，肿瘤大小为100~200 mm3时开始实验。PEM-CC9-RCCPs、PEM-RCCPs、临床注射液Alimta以及PBS在0、4、8和12天通过尾静脉注射小鼠体内（PEM：12.5 mg/kg；Alimta：25 mg/kg）。在0~18天，每两天称量小鼠的体重，游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积计算方法为：V=（L×W×H）/2，（其中L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度，H为肿瘤的厚度）。持续观察小鼠的生存到60天。由图11中可知，PEM-CC9-RCCPs治疗组20天时，肿瘤得到明显抑制，而载药PEM-RCCPs组肿瘤有一定的增长。相比之下，PEM-CPP-RCCPs和PEM-RCCPs组的小鼠体重几乎没有改变，说明载药交联囊泡对小鼠没有毒副作用。PEM-CC9-RCCPs治疗组在60天后全部存活，Alimta组在38天时也全部死亡，PBS组在30天时也全部死亡。因此，本发明的靶向交联囊泡载药后可有效抑制肿瘤的增长，对小鼠没有毒副作用，还可以延长荷瘤老鼠的生存时间。
采用类似的实验方法研究了多种不同载药(凋亡蛋白、植物毒素蛋白、甲氨蝶呤、治疗性DNA和siRNA)的交联囊泡和靶向交联囊泡对荷瘤小鼠的影响，结果表明均可有效抑制肿瘤增长，对小鼠没有毒副作用，还可以延长荷瘤老鼠的生存时间。

Claims (6)

1.一种抗肿瘤药物，由内膜具有正电荷的可逆交联聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为蛋白质、核酸或生理环境带负电的小分子药物；所述内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，由聚合物自组装后交联得到；所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及精胺分子；所述疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段；所述亲水链段的分子量为2000-8000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.3-8.4倍。
2.根据权利要求1所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述聚合物的化学结构式如下：
其中，R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
、；
所述聚合物中，PEG的分子量为2000-8000Da；PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的15%-40%。
3.根据权利要求2所述抗肿瘤药物，其特征在于：PEG的分子量为4000-8000Da；PTMC或PLA的总分子量为PEG分子量的2.5-5倍；PDTC的总分子量为PTMC或PLA总分子量的18%-38%。
4.根据权利要求1所述抗肿瘤药物，其特征在于，内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的端羟基通过羟基活化剂活化，再与精胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP或者靶向PEG-P(LA-DTC)-SP；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(LA-DTC)-SP和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(LA-DTC)-SP和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
5.根据权利要求4所述抗肿瘤药物，其特征在于，步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂在干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到端羟基活化的PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)；将端羟基活化的PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的溶液滴加到精胺溶液中反应，然后透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP；步骤（2）为将步骤（1）的PEG-P(TMC-DTC)-SP或者PEG-P(LA-DTC)-SP和溶于有机溶剂的靶向分子反应得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP或者靶向PEG-P(LA-DTC)-SP；步骤（3）为将原料溶液中加入非离子缓冲溶液中，室温放置后透析、交联，得到内膜具有正电的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
6.权利要求1所述抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，为以下制备方法中的一种：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液或者PEG-P(LA-DTC)-SP溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（2）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（3）将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)-SP溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（4）将PEG-P(TMC-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物；
（5）将PEG-P(LA-DTC)-SP溶液和靶向PEG-P(LA-DTC)溶液与药物溶液、非离子缓冲液混合，室温放置，然后透析、孵育交联得到抗肿瘤药物。
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