CN102911326B - 一种酸敏感可降解聚合物囊泡及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸敏感可降解聚合物囊泡及其制备和应用。所述聚合物囊泡由A-B-C型嵌段聚合物形成，嵌段A为聚乙二醇，分布于囊泡外表面，嵌段B为疏水的pH敏感可降解聚合物聚（三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯），构成囊泡的膜核，嵌段C为聚电解质聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、或聚甲基丙烯酸二异丙氨乙酯中的一种，分布于囊泡膜内壁，用于高效负载带有相反电荷的药物。该pH敏感可降解囊泡制备方法简单，并且能高效负载小分子亲水抗癌药物、治疗性蛋白质药物、多肽类药物和核酸类药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物载体及其制备方法，具体涉及酸敏感可降解的具有不对称膜的聚合物囊泡的药物释放系统。
背景技术
多嵌段ABC型的聚合物，A和C是亲水性嵌段，B是疏水性嵌段，这样的聚合物能够形成囊泡，具有不对称的膜结构，即在囊泡膜的内部和外部表面的化学性质是不同的（F. T. Liu, J. Am. Chem. S℃. 2003, 125, 15059；A. Wittemann, Langmuir 2007, 23, 2224）。例如，Meier等人研究了带有不同阴离子亲水嵌段的聚合物PEO45-PDMS17-PMOXA341自组装形成的囊泡中，较短亲水嵌段的PEO和较长亲水嵌段的PMOXA分别分布在囊泡的内表面和外表面（R. Stoenescu, Chem. Commun. 2002, 3016）。
上述技术方案中，所述囊泡不可生物降解，并且Meier等人并未公布所得囊泡的相关应用。
近年来，为了解决蛋白质药物生物利用度低、包封率较低和易变性等问题，及小分子亲水抗癌药物的包封率较低、生物利用度低和已被排出体外的，应用具有大的亲水性内腔的聚合物囊泡来装载蛋白质和亲水小分子抗癌药物。但是，尽管具有很大的一个水质内腔，聚合物囊泡对水溶性小分子抗癌药物的装载水平和装载效率还是比较低（A. P. Choucair, Langmuir 2005，21，9308）。为了提高亲水药物如阿霉素盐酸盐（DOX·HCl）的包封效率，在脂质体和聚合物囊泡体系人们通常采用pH梯度法、铵盐梯度法和纳米沉淀法等。中国发明专利CN101792516A公开了一种生物可降解的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其用于高效包载蛋白质药物及小分子亲水抗癌药物的应用，聚合物囊泡由A-B-C型嵌段聚合物形成，嵌段A为聚乙二醇(PEG),分布于囊泡外表面，嵌段B为疏水的生物可降解聚合物，构成囊泡的膜核，嵌段C为聚电解质，分布于囊泡膜内壁。在上述技术方案中，药物仅靠聚合物的降解而缓慢释放，这样癌细胞易产生耐药性。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种pH酸敏感可降解、具有不对称膜的聚合物囊泡及其制备和应用，以利用癌细胞内的酸控制触发释放，避免癌细胞产生耐药性。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种三嵌段聚合物，所述三嵌段聚合物为A-B-C型嵌段聚合物，嵌段A为聚乙二醇嵌段，聚乙二醇分子量为3000～10000 Da；嵌段B为pH敏感可降解聚合物聚（三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯），分子量为10000～30000 Da；嵌段C为聚电解质，选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、或聚甲基丙烯酸二异丙氨乙酯中的一种；嵌段C的分子量是嵌段A的10～85%，嵌段A的分子量是嵌段B的15～40%。
上述技术方案中，嵌段B的聚合单体是三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯，其结构式如下所示：
相应地，嵌段B为聚三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯（PTTMA）；嵌段C为聚电解质，其中，聚丙烯酸（PAA）嵌段和聚甲基丙烯酸（PMA）嵌段的pKa为4.5～5.3,在生理环境中带负电荷；聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯（PDMA）嵌段、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（PDEA）嵌段、聚甲基丙烯酸二异丙氨乙酯（PDPA）嵌段的pKa为7.2～7.4,在酸性环境中带正电荷。
上述技术方案中，嵌段A为长度较长的亲水性嵌段，嵌段B为疏水的pH敏感可降解嵌段，嵌段C为长度较短的亲水性嵌段，可自组装形成pH敏感可降解、具有不对称膜结构的聚合物囊泡。B和C嵌段的长度可通过加入单体与大分子RAFT试剂的比例、反应时间、反应温度等来调节。所得到的嵌段聚合物的分子量可控，分子量分布在1.22～1.34，单峰分布。
上述三嵌段聚合物可通过可逆加成-断裂链转移（Reversible Addition -Fragmentation Chain Transfer，RAFT)聚合方法制备而得，以合成三嵌段聚合物聚（乙二醇）-聚（三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯）-聚（丙烯酸）（PEG-PTTMA-PAA）为例，首先，一端甲氧基保护的聚乙二醇通过氯甲酸对硝基苯酯（4-NC）活化后和乙二胺反应，制得PEG-NH2，然后通过DCC/NHS法制备大分子RAFT试剂PEG-CPADN，再以PEG-CPADN为链转移剂在65℃下，AIBN引发剂分别聚合PTTMA和AA单体，制备一系列分子量可控的嵌段聚合物PEG-PTTMA-PAA。
一种酸敏感可降解聚合物囊泡，由上述三嵌段聚合物自组装形成，所述囊泡的膜由疏水性嵌段B构成，囊泡膜内壁由嵌段C构成，囊泡膜外壁由嵌段A构成，所述囊泡的尺寸为60～120 nm，尺寸分布为0.15～0.21。
制备上述囊泡的方法是溶剂交换法，具体步骤是：首先将三嵌段聚合物溶于二甲亚砜（DMSO）中，然后在搅拌下向其中逐滴加入适当pH的缓冲溶液，最后透析除去DMSO。在这过程中聚合物进行自组装形成囊泡，疏水性的嵌段PTTMA构成囊泡的膜，较长的亲水嵌段PEG由于分子间的排斥力较大排列在膜的外侧，而较短的聚电解质C嵌段由于分子间的排斥力较小排列在膜的内侧，从而形成囊泡的稳定结构。
上述制得的聚合物囊泡在pH7.4下具有很高的稳定性，将其放置在4℃冰箱中经过一个月其粒径也没有发生明显变化。但是在弱酸性（如pH 5.0）条件下，聚合物囊泡疏水PTTMA水解使其疏水性下降、亲水性增强，囊泡因此会很快胀大，最后完全水解成水溶性的单分子。
上述聚合物囊泡的结构通过共聚焦显微镜（CLSM）和TEM得到验证。用HeLa细胞（宫颈癌细胞）测试该聚合物囊泡的细胞存活率（MTT assay），在所测定的浓度范围内（< 2.0 mg/mL）都大于90%，说明该聚合物囊泡生物相容性优良。
上述技术方案所得聚合物囊泡能和一些带相反电荷的药物包括小分子水溶性抗癌药物如盐酸多柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸柔红霉素、硫酸长春新碱、盐酸阿糖胞苷、巯嘌呤、塞替派、顺铂、5-氟尿嘧啶、白消安，和治疗性蛋白质药物、多肽类药物和核酸类药物（负电性）如DNA、siRNA可通过静电作用力、氢键相互作用力、和/或范德华力复合。
因此，上述酸敏感可降解聚合物囊泡可用于包裹亲水性药物，所述亲水性药物选自：水溶性小分子抗癌药物、蛋白质药物、多肽类药物或核酸类药物。
包裹方法是，将所述三嵌段聚合物溶解在二甲亚砜中，然后在搅拌下滴入溶有亲水性药物的缓冲溶液（二甲亚砜体积< 5 % v/v；pH的选择要依据所要包裹的物质的pKa和聚合物囊泡内部聚电解质的pKa来决定，要使二者的电离程度达到最大，相互吸引力最大)，再透析除去二甲亚砜和没有包裹的药物，得到包裹亲水性药物的聚合物囊泡。
例如，当理论包封量为5 wt.%时，PEG-PTTMA-PAA（2.7k）聚合物囊泡对阿霉素盐酸盐（DOX·HCl）的包封率能够达到88.7%。该载DOX·HCl的囊泡粒径为105.7nm，粒径分布为0.19，表面电位为-15.7mV；其在pH 5.0的环境下、经过孵育12 h，大约有80%的药物释放。PEG-PTTMA-PAA（2.7k）聚合物囊泡对HeLa细胞的抑制作用也是比较明显，其药效和自由的DOX·HCl相当，IC50（半致死量）分别为1.48和1.39 μg/mL。包封有DOX·HCl的聚合物囊泡的摄取细胞实验表明，在2小时就能观察到进入宫颈癌细胞HeLa里的DOX·HCl的荧光，说明蛋白质进入细胞质中；随着时间的延长，4小时后细胞内的荧光强度明显增加，荧光遍布整个细胞。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．本发明由于选用了合适的嵌段组合、嵌段长度，形成pH敏感可降解性的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物可自组装形成pH敏感可降解性、具有不对称膜的生物相容的聚合物囊泡。
2．本发明获得的酸敏感可降解具有不对称膜的聚合物囊泡可用于高效包载水溶性小分子抗癌药物如盐酸阿霉素（DOX·HCl）、盐酸米托蒽醌、盐酸柔红霉素和硫酸长春新碱等，并且可用于癌细胞内的酸控制的触发释放，通过细胞的内吞作用进入细胞并使药物在细胞内快速释放，可以作为脂质体的智能替代品而用于肿瘤靶向的DOX·HCl的输送。
3．本发明采用的聚合物囊泡显示出更好的胶体稳定性、更高的机械强度和更低的化学渗透性（故更低的药物渗漏）。
附图说明
附图1是实施例一、二、三中三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PAA合成的示意图；
例图2是实施例四中三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）合成的示意图；
附图3是实施例十中聚合物囊泡PEG-PTTMA-PAA在不同pH下水解速率的结果图；
附图4是实施例十一所得聚合物囊泡PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）在不同pH下水解速率的结果图；
附图5是实施例十二所得聚合物囊泡PEG-PTTMA-PAA（2.1k）在pH 5.0下的粒径变化结果；
附图6是实施例十三所得聚合物囊泡PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）在pH 5.0下的粒径变化结果；
附图7是实施例十五所得聚合物囊泡PEG-PTTMA-PAA在不同pH下阿霉素盐酸盐的体外释放结果；
附图8是实施例十六空白聚合物囊泡对HeLa细胞的毒性实验结果；
附图9是实施例十七包裹阿霉素盐酸盐的聚合物囊泡PEG-PTTMA-PAA（2.1k）和PEG-PTTMA-PAA（2.7k）对HeLa细胞的抗癌活性实验结果。
附表1，实施例十四聚合物囊泡对阿霉素盐酸盐的包封效率结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一，序贯RAFT法合成三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PAA（1.5k）
在氮气环境下，取0.16 g的TTMA（0.44 mmol）和0.05 g的PEG-CPADN（0.01 mmol）溶解在2 mL的DMF中，然后加入0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），反应体系鼓气30分钟，然后置于65℃的油浴中反应两天。反应结束后，取出一滴反应混合物来测定单体的转化率。剩下的用于继续反应，向反应体系加入第二种单体丙烯酸0.01 g（0.14 mmol）和0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），65 ℃下继续反应两天。反应结束后，混合物用无水乙醚沉淀，真空干燥一天得到粉红色的固体，产率73.2%。核磁结果表明其PAA的分子量为1500，其结构标为PEG-PTTMA-PAA（1.5k）。氢核磁共振图谱（400 MHz, CDCl3）：δ 6.03（s，aromatic protons），5.83（s，Ar-CH-），4.17（s，-CO℃H2C-），3.89（d，-℃H2CCH2O-），3.75（s，Ar-℃H3），3.65（s，PEG），2.23（m，-CHCOOH），1.87（m，-CH2CHCOOH，-CH2C-），0.59~1.26（m，CH3CCOO-，CH3C-）。
实施例二，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PAA（2.1k）
在氮气环境下，取0.16 g的TTMA（0.44 mmol）和0.05 g的PEG-CPADN（0.01 mmol）溶解在2 mL的DMF中，然后加入0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），反应体系鼓气30分钟，然后置于65℃的油浴中反应两天。反应结束后，取出一滴反应混合物来测定单体的转化率。剩下的用于继续反应，向反应体系加入第二种单体丙烯酸0.02 g（0.28 mmol）和0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），65℃下继续反应两天。反应结束后，混合物用无水乙醚沉淀，真空干燥一天得到粉红色的固体，产率79.0%。核磁结果表明PAA的分子量为2100，其结构标为PEG-PTTMA-PAA（2.1k）。
实施例三，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PAA（2.7k）
在氮气环境下，取0.16 g的TTMA（0.44 mmol）和0.05 g的PEG-CPADN（0.01 mmol）溶解在2 mL的DMF中，然后加入0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），反应体系鼓气30分钟，然后置于65 ℃的油浴中反应两天。反应结束后，取出一滴反应混合物来测定单体的转化率。剩下的用于继续反应，向反应体系加入第二种单体丙烯酸0.03 g（0.42 mmol）和0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），65 ℃下继续反应两天。反应结束后，混合物用无水乙醚沉淀，真空干燥一天得到粉红色的固体，产率81.7%。核磁结果表明PAA的分子量为2700，其结构标为PEG-PTTMA-PAA（2.7k）。
实施例四，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）
在氮气环境下，取0.15g的TTMA（0.41 mmol）和0.05 g的PEG-CPADN（0.01 mmol）溶解在2 mL的DMF中，然后加入0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），反应体系鼓气30分钟，然后置于65℃的油浴中反应两天。反应结束后，取出一滴反应混合物来测定单体的转化率。剩下的用于继续反应，向反应体系加入第二种单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯0.0375 g（0.24 mmol）和0.23 mg的AIBN（0.0014 mmol），65 ℃下继续反应两天。反应结束后，混合物用无水乙醚沉淀，真空干燥一天得到粉红色的固体，产率74.5 %。核磁结果表明PDMAEMA的分子量为2100，其结构标为PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）。氢核磁共振图谱（400 MHz, CDCl3）：δ 6.04（s，aromatic protons），5.82（s，Ar-CH-），4.38（s，-CO℃H2C-），4.19（s，-CH2CH2N（CH3）2）4.05（d，-℃H2CCH2O-），3.75（s，Ar-℃H3），3.65（s，PEG），2.56（s，-CH2N（CH3）2），2.28（s，-CH2CH2N（CH3）2），2.23（m，-CHCOOH），1.87（m，-CH2CHCOOH，-CH2C-），0.59~1.26（m，CH3CCOO-，CH3C-）。
实施例五，溶剂交换法制备PEG-PTTMA-PAA（1.5k）聚合物囊泡
室温下向0.1 mL浓度为2.1 mg/mL的聚合物的DMSO溶液中逐滴加入2 mL的磷酸盐缓冲溶液（10 mM，pH 7.4）。滴加完毕，混合溶液超声2小时，转入透析袋（MWCO = 7000）室温下透析除去有机溶剂。动态光散射仪测得囊泡平均粒径为112.1 nm，粒径分布指数为0.20，表面电位为-12.7 mV。
实施例六，溶剂交换法制备PEG-PTTMA-PAA（2.1k）聚合物囊泡
室温下向0.1 mL浓度为2.1 mg/mL的聚合物的DMSO溶液中逐滴加入2 mL的磷酸盐缓冲溶液（10 mM，pH 7.4）。滴加完毕，混合溶液超声2小时，转入透析袋（MWCO = 7000）室温下透析除去有机溶剂。动态光散射仪测得囊泡平均粒径为86.4 nm，粒径分布指数为0.15，表面电位为-15.6 mV。
实施例七，溶剂交换法制备PEG-PTTMA-PAA（2.7k）聚合物囊泡
室温下向0.1 mL浓度为2.1 mg/mL的聚合物的DMSO溶液中逐滴加入2 mL的磷酸盐缓冲溶液（10 mM，pH 7.4）。滴加完毕，混合溶液超声2小时，转入透析袋（MWCO = 7000）室温下透析除去有机溶剂。动态光散射仪测得囊泡平均粒径为63.9 nm，粒径分布指数为0.21，表面电位为-17.5 mV。
实施例八，荧光探针法测试聚合物囊泡的临界聚集浓度
所有的聚合物囊泡样品都是通过透析的方法制得。将聚合物浓度从0.2 mg/mL 稀释到 1.0×10-5 mg/mL不等的10个不同浓度，向其中分别加入相同量的荧光素芘的丙酮溶液10 mL，溶液中芘的最终浓度为1.0×10-6 M。37 ℃下摇晃4小时使丙酮挥发后，测量荧光发射强度。测试使用的是FLS920荧光分析仪，激发波长设定在为330 nm。荧光发射波长选在372 nm和383 nm处两点，根据在低浓度和高浓度范围内的I383/I372 的比值外推的交点计算出CAC的值。
实验测得PEG-PTTMA-PAA（1.5k）、PEG-PTTMA-PAA（2.1k）和PEG-PTTMA-PAA（2.7k）三种聚合物囊泡都具有较低的临界聚集浓度，分别为1.45、1.26和1.25 mg/L。
实施例九，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）测试
DOX·HCl通过以下方法载入囊泡中：向0.2 mL浓度为2 mg/mL的聚合物四氢呋喃溶液中分别滴加40 μL的浓度为1 mg/mL DOX·HCl水溶液和2 mL 磷酸缓冲溶液（10 mM，pH 7.4），避光超声2小时，然后在磷酸缓冲溶液（10 mM，pH 7.4）中透析（MWCO=7000），除去残留的有机溶剂和未被包裹的自由DOX·HCl。透析过后，10 μL 尼罗红的丙酮溶液（1×10-4 M）加入载有DOX·HCl的囊泡溶液中，在37 ℃摇晃4小时除去有机溶剂。载有亲水DOX·HCl和疏水nile red的聚合物囊泡利用CLSM观察其结构，DOX·HCl和尼罗红用CLSM观察所用的激发波长分别是480和553 nm。
实施例十，PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡中缩醛水解速率的测定
制备好的1 mg/mL聚合物囊泡溶液，分成三份（2 mL），用400 μL的pH分别为4和5浓度为0.1 M的醋酸缓冲溶液和pH为7.4浓度为0.1 M的磷酸缓冲溶液把三份样品溶液调至相应的pH值，这样也保证了缓冲介质浓度的一致。样品溶液放入37 ℃摇床中，在每个测样时间点取出40 μL溶液加入到3.5 mL PB（0.1 M，pH7.4）中，测其在290 nm处的吸收强度。最后用两滴浓盐酸使缩醛完全水解，这时测得的吸光度标定为缩醛100%水解。实验结果取三次平行实验的平均值。
如图3，结果表明，囊泡膜中缩醛的水解速率是高度依赖于溶液pH值的，在弱酸性的环境下，缩醛的水解速率明显加快。例如，在pH 7.4的环境下，经过33 h后PEG-PTTMA-PAA(2.1k)囊泡也没有明显的水解现象。但是，在pH 4.0和5.0下，聚合物囊泡则快速水解，半衰期大概是4 小时和10 小时。
实施例十一，PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）聚合物囊泡中缩醛的水解速率的测定
制备好的2 mg/mL聚合物囊泡溶液，分成三份（2 mL），用400 μL的pH分别为4和5浓度为0.1 M的醋酸缓冲溶液和pH为7.4浓度为0.1 M的磷酸缓冲溶液把三份样品溶液调至相应的pH值，这样也保证了缓冲介质浓度的一致。样品溶液放入37 ℃摇床中，在每个测样时间点取出40 μL溶液加入到3.5 mL PB（0.1 M，pH7.4）中，测其在290 nm处的吸收强度。最后用两滴浓盐酸使缩醛完全水解，这时测得的吸光度标定为缩醛100%水解。实验结果取三次平行实验的平均值。
如图4，结果表明，囊泡膜中缩醛的水解速率是高度依赖于溶液pH值的，在弱酸性的环境下，缩醛的水解速率明显加快。例如，在pH 7.4的环境下，经过120 h后PEG-PTTMA-PDMAEMA(2.1k)囊泡只有10%的水解。但是，在pH 4.0和5.0下，聚合物囊泡水解速率明显加快，半衰期大概是20小时和80小时。
实施例十二，PEG-PTTMA-PAA（2.1k）聚合物囊泡弱酸性条件下粒径变化的测定
我们取1 mL的制备好的聚合物浓度为0.2 mg/mL的囊泡样品，用300 μL浓度为0.1 M的pH 5.0的醋酸缓冲溶液调至相应的pH。样品在37 ℃下摇晃，在指定时间点用动态光散射仪（DLS）测定其粒径的变化。
如图5，在pH 7.4下，囊泡的粒径在经过一天后也没有发生明显的变化。有意思的是，经过3小时和7小时后，在pH 5.0下（30 mM的醋酸-醋酸钠缓冲液），囊泡会很快的涨大或者是聚集形成亚微米和微米的粒子。20小时后，pH 5.0下只能检测到很小尺寸的粒子（大概6 nm），这说明在pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液环境下，由于缩醛键的完全水解，囊泡降解成了完全水溶性的单分子。
实施例十三，PEG-PTTMA-PDMAEMA（2.1k）聚合物囊泡弱酸性条件下粒径变化的测定
我们取1 mL的制备好的聚合物浓度为0.2 mg/mL的囊泡样品，用25 μL浓度为4 M的pH 5.0的醋酸缓冲溶液调至相应的pH。样品在37 ℃下摇晃，在指定时间点用动态光散射仪（DLS）测定其粒径的变化。
如图6，在pH 7.4下，囊泡的粒径在经过一天后也没有发生明显的变化。但是，经过12小时后，在pH 5.0下（100 mM的醋酸-醋酸钠缓冲液），囊泡会很快的涨大到200 nm。
实施例十四，PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡对阿霉素盐酸盐（DOX·HCl）的包裹
向聚合物PEG-PTTMA-PAA(1.5k)的DMSO溶液（5 mg/mL）中分别滴加0.05 mL的DOX·HCl的水溶液(2 mg/mL)（以10 %的投料比计算）和2 mL的磷酸缓冲溶液，溶液超声2小时，用磷酸缓冲溶液(10 mM, pH 7.4)透析（MWCO = 7000）8小时，期间至少换5次介质。囊泡的最终浓度为0.5 mg/mL。包裹DOX·HCl的囊泡通过荧光分光光度计（FLS920）来测量（激发波长为480nm，发射波长在600 nm）。载药量（DLC）和包封率（DLE）通过下面的算式来计算：
载药量（wt %）=（装载药物重量/（聚合物重量+装载药物重量）×100 %
包封率（%）=（装载药物重量/药物总投入量）×100 %
为了测定载药量，我们将载有DOX·HCl的聚合物囊泡溶解在DMF中，然后测定荧光，标准曲线用不同浓度的DOX·HCl的DMF溶液来测定。
如表1，在理论载药量（即DOX·HCl/（聚合物+DOX·HCl）比例）为5、10和20 wt. %时，所有的PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡对DOX·HCl都能够达到很高的包封效率（DLE），约为62.5 %~88.8 %。值得注意的是，包封效率随着PAA链段的增加而增加，可能主要由于囊泡内表面的PAA与DOX·HCl的静电相互作用增强的缘故。
表1：包裹DOX·HCl的聚合物囊泡的表征a。
a囊泡的最终浓度为0.5 mg/mL。
b平均粒径（nm）和粒径分布在25 °C、pH 7.4下通过DLS测定。
c表面电位在25 °C、PB（pH 7.4, 10 mM）中通过DLS测定。
实施例十五，载DOX·HCl、PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡的体外释放实验
DOX·HCl的体外释放实验在37 ℃下，三种不同的介质：（i）醋酸缓冲溶液，pH 4.0；（ii）醋酸缓冲溶液，pH 4.0；（iii）磷酸缓冲溶液，pH 7.4中测定。这三种介质的浓度都是10 mM。制备好的载有DOX·HCl的囊泡样品分成三份（每份0.5 mL），然后转移到透析袋（MWCO = 12000~14000）中，将透析袋置于20 mL的相应缓冲介质当中，然后放入37 ℃恒温摇床。在指定的时间点，从释放体系取出5 mL的释放介质，然后补充相等体积的新鲜的介质。释放的DOX·HCl和没有释放的DOX·HCl的量用荧光分光光度计测定。该释放实验重复三次。
如图7，相对于生理pH（7.4）下的释放而言，在酸性条件下的DOX·HCl从囊泡中释放速率要快得多，这和缩醛水解的结果相一致。对于PEG-PTTMA-PAA(2.1k)，在24小时内，pH 4.0和pH 5.0下，从囊泡中释放了大约83.3 %和69.5 %的DOX·HCl。而在相同条件下，pH 7.4下只有少量的药物缓慢的释放出来（<29.8%）。
实施例十六，PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡的细胞毒性实验（MTT）
PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡的细胞毒性实验采用MTT法。HeLa细胞在37 ℃，5 %二氧化碳条件下，在含有10 %血清的Dulbecco’s modified Eagle培养基（DMEM）中培养，细胞密度为1×104个/孔。24小时后，培养基用80 μL含有10 %血清的DMEM和20 μL不同浓度的PEG-PTTMA-PAA囊泡溶液（浓度分别为1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL和10.0 mg/mL）替换，细胞继续培养48小时；接着培养基用100 μL新鲜的DMEM替换，并加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）。继续培养4小时，加入100 μL DMSO溶解生成的结晶子。样品的光学密度用BioTek微盘测量仪在570 nm处测定。细胞单独在10 %血清的DMEM培养基中（没有囊泡）培养的结果作为标准，记为100%存活。
如图8，空载的PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡即使在聚合物浓度达到2.0 mg/mL时也表现得基本无毒，细胞存活率均大于90%，说明PEG-PTTMA-PAA囊泡有很好的生物相容性。
实施例十七，载DOX·HCl的、PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡的抗癌活性测定
包裹DOX·HCl的PEG-PTTMA-PAA囊泡细胞毒性测试方法与上面类似。HeLa细胞在37 ℃下培育24小时后，用80 μL含有10 % FBS的DMEM培养基和20 μL载有的PEG-PTTMA-PAA囊泡溶液更换培养基（最终DOX·HCl浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.5、5.0、10、15和20 mg/mL），自由DOX·HCl也加入作为对照组。细胞继续培养48小时。用100 μL新鲜的培养基更换，然后加入10 μL的MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4小时后，向其中加入100 μL DMSO来溶解紫色的晶状体。各细胞孔中的570 nm的荧光吸收值用microplate reader（Bio-TEK, ELX808IU）来测定。空白孔中细胞培养结果作为100 %存活率。IC50（细胞凋亡一半对应的药物浓度）的值通过非线性回归（sigmoidal）分析计算得到。最后所得数据为四组的平均值。
如图9，包裹DOX·HCl的PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡表现了和自由DOX·HCl一样高的药效。例如，当与载有2.5 μg/mL的DOX·HCl的PEG-PTTMA-PAA(2.1k)聚合物囊泡与HeLa细胞培养48小时后，HeLa细胞的存活率下降到了42.0 %。载DOX·HCl的PEG-PTTMA-PAA聚合物囊泡的高抗肿瘤细胞活性说明了DOX·HCl可被有效地输送、释放到HeLa细胞的细胞核中。
实施例十八，载DOX·HCl囊泡的内吞和细胞内释放实验
载有DOX·HCl的聚合物囊泡在HeLa细胞中的内吞和释放行为通过共聚焦激光显微镜（CLSM）来观察表征。HeLa细胞在37 ℃，5 %二氧化碳条件下，在含有10 %血清的Dulbecco’s modified Eagle培养基（DMEM）中培养，细胞密度为5×104个/孔。24小时后，培养基用新鲜的含10 %血清的DMEM和50 μL的载有DOX·HCl的囊泡或者自由的DOX·HCl来替换。最终的DOX·HCl的浓度都保持在5 μg/mL。细胞继续培养2、4小时，移除培养基，培养孔中的细胞用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。细胞用4 %的多聚甲醛固定20 min，细胞核用DAPI染色。细胞的CLSM照片通过共聚焦激光扫描显微镜测定（TCS SP2）。
载DOX·HCl的PEG-PTTMA-PAA（2.1k）囊泡和HeLa细胞经过2小时孵育之后，我们就能看到在细胞核中有比较明显的DOX·HCl的红色荧光，说明囊泡能够很快被摄取并且在细胞内有效地快速释放出来。在4小时孵育之后，细胞核显示出更强的DOX·HCl的荧光，这和自由DOX·HCl进入细胞核的效果没有区别。
Claims (3)
1. 一种三嵌段聚合物，所述三嵌段聚合物为A-B-C型嵌段聚合物，其特征在于：嵌段A为聚乙二醇嵌段，聚乙二醇分子量为3000～10000 Da；嵌段B为pH敏感可降解聚合物聚（三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷-甲基丙烯酸酯），分子量为10000～30000 Da；嵌段C为聚电解质，选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、或聚甲基丙烯酸二异丙氨乙酯中的一种；嵌段C的分子量是嵌段A的10～85%，嵌段A的分子量是嵌段B的15～40%。
2. 一种酸敏感可降解聚合物囊泡，其特征在于：由权利要求1所述三嵌段聚合物自组装形成，所述囊泡的膜由疏水性嵌段B构成，囊泡膜内壁由嵌段C构成，囊泡膜外壁由嵌段A构成，所述囊泡的尺寸为60～120 nm，尺寸分布为0.15～0.21。
3. 权利要求2所述酸敏感可降解聚合物囊泡用于包裹亲水性药物的应用，所述亲水性药物选自：水溶性小分子抗癌药物、蛋白质药物、多肽类药物或核酸类药物。
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