CN113230232B - 一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊、制备方法和应用；所述微胶囊为w/o/w的双层核壳结构的微胶囊包载有蛋白质药物；所述制备方法为以丙烯酰碳酸酯和内酯为原料制备可降解的巯基化两性离子聚合物，通过微流控技术结合紫外光交联技术制备包载蛋白质药物的两性离子微胶囊微胶囊；所述微胶囊的应用，口服时在胃液中具有抗酸作用，结合两性离子改善粘膜渗透性和促进经皮吸收的作用，使微胶囊能跨过肠上皮细胞膜，促进蛋白质药物在肠道中的释放，克服蛋白质药物在胃肠道中易失活易降解的影响。

Description

一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种两性离子微胶囊，尤其涉及一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊，还涉及所述微胶囊的制备方法和应用。
背景技术
随着生物技术和基因工程的不断发展，活性多肽、蛋白质类药物不断涌现，药用多肽、蛋白质制剂的商品化生产已成为现实，用于预防和治疗肿瘤、肝炎、糖尿病、内分泌系统紊乱和心脑血管病等重大疾病。
蛋白质、多肽药物的应用优势是生理活性强、药效高、作用专一、但在常温下稳定性差，在体内易降解、半衰期很短，临床上常用的剂型为注射用溶液剂和注射用灭菌粉末，给药途径单一且必须频繁注射。长期用药后注射部位可能会出现炎症、硬结等副作用，甚至产生耐药性，不可避免地要求病人忍受多次重复注射引起的疼痛和给身体带来的不适，严重影响病人的生活质量，而且也不能满足日益增长的生物技术药物的临床应用需求。因此，发展使用方便、安全的蛋白质非注射给药途径，是目前国内外医药界广泛关注的重大问题。口服给药方便、安全、长期用药患者顺从性好。但蛋白质多肽药物由于胃内酸催化降解，胃肠道内的酶水解，肠道粘膜透过性差，因此需借助载体递送可实现口服给药。
两性离子是一种分子结构中同时含有阳离子和阴离子的电中性材料。根据其电荷分布，两性离子聚合物分为两类。一种是单一单体具有聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)(PMPC)、聚(磺基甜菜碱)(PSB)、聚(羧基甜菜碱)(PCB)和聚[2-(甲基丙烯酰氧乙基)乙基胆碱磷酸](PMCP)等正负电荷。第二种类型是两性离子电解质聚合物，不同的单体携带相同数量的正电荷和负电荷。两性聚合物是极性的，可以通过强离子溶剂化作用与水分子结合形成水合层。因其有效地阻断蛋白质、血小板等生物分子和细菌与表面的粘附，改善材料的血液相容性，越来越受到科学家的关注。如高亦鲲等(CN111450258A)以十八酸或胆酸将载药二氧化硅表面进行疏水化修饰，利用疏水作用力与两性离子表面活性剂十二烷基甜菜碱或二月桂酰基卵磷脂形成自组装纳米粒，促进蛋白质药物在胃肠道粘膜中渗透，提高药物跨膜吸收。
但是口服给药面临着三大生理障碍。第一种是在胃环境中，蛋白质药物在强酸环境中(pH＝1.2)中容易变性失活并且胃液中含有胃蛋白酶，使蛋白质药物降解失活；第二个是在肠道，蛋白质药物需要穿透保护上皮表面的黏液层；第三个是需要穿过肠道的上皮细胞层进入血液。通过酶抑制剂和药物包衣如肠溶包衣可以使蛋白质药物在胃酸环境中保持一定药理活性，但在肠道黏液层和透过上皮细胞层进入血液的时候仍会失活，导致目前口服蛋白药物的生物利用度低和治疗功能差。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中存在的蛋白药物的生物利用度低和治疗功能差的问题，提供一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊；还提供了上述微胶囊的制备方法和应用。
技术方案：本发明的pH可降解的两性离子微胶囊，所述的微胶囊是w/o/w的双层核壳结构的微胶囊。
其制备方法包括以下步骤：
(1)两嵌段聚合物的制备：丙烯酰碳酸酯溶于有机溶剂中，在无水无氧氮气保护的环境中反应一段时间后加入内酯，加入适量催化剂，反应一段时间得到两嵌段聚合物；
(2)含巯基分子修饰两性离子的制备：将两性离子溶于有机试剂，加入含有巯基结构的分子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有巯基分子修饰的两性离子；
(3)含有巯基分子的两性离子修饰聚合物的制备：将步骤(1)中制备的聚合物溶于有机试剂中，加入含有巯基分子的羧基甜菜碱，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有两性离子结构修饰的聚合物；
(4)将步骤(3)得到的聚合物，通过微流控技术制备出载有胰岛素的微胶囊，在紫外照射下得到光交联的聚合物微胶囊。
其中，步骤(1)中，所述内酯为ε-己内酯(ε-Cl)、乳酸(LA)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PGA)、三甲基化壳聚糖(TMC)等，溶剂为无水二氯甲烷，无水三氯甲烷，无水甲苯等，催化剂为Zinc、DBU、辛酸亚锡等。
优选的，步骤(1)为：称取一定量地丙烯酸碳酸酯溶于适量地无水甲苯中，在无水无氧氮气保护地环境中反应一段时间后加入ε-CL，加入适量地辛酸亚锡催化剂，反应一段时间后得到两嵌段聚合物。
其中，步骤(2)中，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基酰胺(DMF)等；所述两性离子化合物为磺基甜菜碱(SB),羧基甜菜碱(CB)等，催化剂为三乙胺、六氢吡啶、氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、三级丁醇钾、氨基钠或四级铵碱。
优选的，将两性离子化合物羧基甜菜碱溶于甲醇，在氮气保护下加入含有巯基的小分子，巯基的小分子与两性离子化合物的物质量比1：1，再加入适量的三乙胺(TEA)反应一段时间后再冰乙醚中沉淀出固体得到巯基化两性离子TCB。
其中，步骤(3)中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、二甲亚砜(DMSO)等，催化剂为三乙胺、六氢吡啶、氢氧化钠(钾)、乙醇钠、三级丁醇钾、氨基钠或四级铵碱。
优选的，将两嵌段聚合物溶于适量的DMF中，加入TCB，物质量比为1：2，再加入适量三乙胺(TEA)在氮气保护下反应一段时间后再冰乙醚中沉淀出固体得到TCB修饰的聚合物(P(AC(TCB)-co-Cl)。聚合物(P(AC(TCB)-co-Cl)可以溶于丙二酸二乙酯、大豆油等作为油相；乳化剂可选PGPR、司盘80、PVA、甘油等。
其中，所述步骤(4)具体为，通过微流控装置制备载有蛋白质药物的两性离子微胶囊，其中，微流控装置的内相是蛋白质药物的水溶液和内向乳化剂，中间相是步骤(3)得到的聚合物溶于中间相溶剂并加入中间相乳化剂，外相是外相乳化剂的水溶液，通过微流控技术得到的w/o/w或o/w/o的双层微球，加入光引发剂，经紫外照射，得到基于微流控技术和光交联技术的两性离子微胶囊。
进一步的，所述内相乳化剂为帕洛沙姆、吐温20～80、聚乙烯醇或聚氧乙烯醚；中间相乳化剂为司盘20～80、蔗糖酯、磷酸盐、大豆磷脂或德固赛；中间相溶剂为大豆油、橄榄油、石蜡油、丙二酸二乙酯、乙酸乙酯或氯仿；外相乳化剂为帕洛沙姆、吐温20～80、聚乙烯醇或聚氧乙烯醚。
优选的，将聚合物(P(AC(TCB)-co-Cl)用丙二酸二乙酯进行溶解，加入适量的乳化剂司盘80和光引发剂作为连续相，核心相为蛋白质药物水溶液和适量2％乳化剂PVA溶液，外水相为适量比例的PVA水溶液，通过微流控装置制备出载有蛋白质药物的w/o/w的微凝胶，经过紫外照射数分钟得到光交联的微胶囊，通过离心将多余的油相和未包载的蛋白质药物除掉。
本发明还公开了所述的pH敏感可降解的两性离子微胶囊在制备治疗糖尿病的口服蛋白质药物的递药系统中的应用。
进一步的，所述的递药系统具体为，由丙烯酰碳酸酯AC和内酯通过开环聚合形成共聚物，然后AC上的双键与巯基化两性离子进行Michael加成修饰，形成修饰后的生物可降解的巯基化两性离子聚合物，最后通过微流控技术制备包载蛋白质药物的微胶囊，形成所述的pH可降解两性离子的微胶囊递药系统。
本次发明将两性离子TCB和微流控技术紫外光交联有机结合起来，通过设计和合成新型生物可降解的辅料，通过微流控技术制备出的微胶囊在一定程度上可以抵抗酶的降解，同时由于紫外光交联，可以使微胶囊具有一定抗酸的作用。两性离子具有良好的膜粘附性，在肠道中易质子化与肠道上皮细胞相互作用，可以延长蛋白质药物在肠道中的停留时间并促进蛋白质药物的吸收，有效克服了蛋白药物的生物利用度低和治疗功能差的问题。因此，上述在口服蛋白质药物治疗糖尿病等疾病方面有潜在的应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明通过PAC部分双键实现紫外光交联固化，在口服时胃酸中有一定的抗酸性，两性离子良好的膜粘附性，在肠道中易质子化与肠道上皮细胞相互作用，可以延长蛋白质药物在肠道中的停留时间并促进蛋白质药物的吸收，延长时间大约7个小时，克服了蛋白质药物口服递送存在的在胃肠道中易失活、易降解、吸收差的缺点。
(2)通过本发明所述制备方法所制备出来的微球尺寸均一、形貌规整、高包封率和高载药量，载有胰岛素的微球包载率有42.3％，相较于自组装技术提高了4.67倍左右，包封效率有98.7％。
(3)本发明选用的环状碳酸脂类化合物，丙烯酰碳酸脂(AC)和内酯容易通过开环聚合反应得到高分子聚合物，开环反应操作简便、可控，聚碳酸酯类化合物毒性低，在体内可被降解，安全有效；碳碳双键与巯基的迈克尔加成反应，在聚合物上修饰目标分子，操作简便、条件简单。
附图说明
图1：实施例1中PAC-PCl的氢核磁图谱；
图2：实施例2中TCB的氢核磁图谱；
图3：实施例3中P(AC(TCB)-co-PCl)的氢核磁图谱；
图4：实施例4微胶囊的制备示意图；
图5：实施例4微胶囊的荧光图；
图6：光交联微胶囊进行Caco-2细胞和HT-29细胞的细胞毒性的细胞存活率示意图；
图7为载胰岛素微胶囊体外胰岛素累积释放图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
PAC-PCl的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003066035450000051
精确称取AC 0.5g(2.5mmol)置于密封瓶中，真空干燥数小时，置于无水无氧手套箱环境内，精确分别称取5g(4.4mmol)ε-Cl和60mg异丙醇(引发剂)于小玻璃瓶中，用注射器量取60mL的无水甲苯溶解AC并在密封瓶内搅拌，将ε-Cl转移入装有AC的密封瓶内搅拌混合，用玻璃胶头滴管滴加5滴辛酸亚锡催化剂，密封反应瓶在100℃油浴中搅拌反应24h后，滴加2滴冰醋酸终止反应，逐滴加入至600mL冰乙醚中沉淀出絮状固体，过滤干燥得到白色固体PAC-PCl4.22g，产率83％。
PAC-PCl的氢核磁表征见附图1，1H NMR分别显示出PAC上甲基(δ1.02，-CH3)，亚甲基(δ4.12，-O(C＝O)CH2)和双键(δ5.82-6.47，-CH＝CH2)，PCl上亚甲基(δ1.34，-OCOCH2CH2CH2)，(δ1.65，-OCOCH2CH2CH2)，(δ2.42，-OCOCH2CH2CH2)，异丙醇上甲基(δ1.32，-(CH3)2)的明显特征峰信号。
实施例2
巯基化两性离子TCB的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003066035450000052
精确称取0.3g(1.316mmol)置于反应瓶中，加入4mL的甲醇溶解，在氮气保护下加入3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇(0.7g，3.9mmol)充分溶解于10mL的甲醇中，加入2-3滴三乙胺反应过夜，然后再冰乙醚中沉淀出油状固体，产率90.6％。氢核磁共振谱图(400MHz,CD3OD):1H NMR CB上的两个甲基峰(δ2.9-3，-CH3)，氧附近的亚甲基峰(δ3.2-3.8，-OCH2CH2),硫附近的亚甲基峰(δ2.5-2.8，-CH2)，季胺上的甲基(δ2.82，-CH3)，羧基(δ4.00，COO-)。
实施例3
P(AC(TCB)-co-PCl)的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003066035450000053
称取PAC-PCl(0.5g，0.0125mmol)溶于DMF中，巯基化两性离子TCB(0.6g，0.0375mmol)溶于甲醇，向二者混合体系中加入2-3滴三乙胺，油浴50℃反应过夜。在乙醚中沉淀，所得产物真空干燥,得到聚合物P(AC(TCB)-co-PCl)。产率：70％.氢核磁共振谱图(400MHz,CDCl3)：1H NMR显示出PAC上部分双键(δ5.82-6.47，-CH＝CH2)，甲基(δ1.02，-CH3)，亚甲基(δ4.12，-O(C＝O)CH2)，PCl上异丙醇端基上两个甲基(δ1.32，-(CH3)2)，两性离子TCB的羧基(δ4.00，COO-)，季胺上的甲基(δ2.82，-CH3)。
实施例4
(1)微胶囊的制备
取P(AC(TCB)-co-PCl)溶解在丙二酸二乙酯中并加入适量的乳化剂司盘80和光引发剂作为中间油相，内相核心相为胰岛素酸性水溶液和2％的PVA水溶液，外水相是8％的PVA水溶液，通过微流控技术制备出载有胰岛素的w/o/w的双层乳液，再紫外灯照射5min后得到光交联的微胶囊，同样的方法制备不含有两性离子聚合物PAC-PCl的微凝胶作为对照。制备出的微凝胶荧光图见附图4。
(2)载胰岛素微胶囊的包封率和载药量测定
质量包封率和载药量通常用来表示聚合物包载药物的能力。本文采用间接法，利用BCA蛋白检测法测量未被包载在聚合物微胶囊中的游离胰岛素的含量，通过测得游离的胰岛素质量，进一步计算载药量和包封率。其中载药量是包载在胶束的药量和总质量(载体和包载的药量)的百分数，质量包封率是指包载在胶束的药量和投药量的质量百分数，计算公式分别如下：
Figure BDA0003066035450000061
Figure BDA0003066035450000062
其中，m总为投入胰岛素质量(mg)，m游为游离胰岛素质量(mg)；m药为包载在胶束内胰岛素的质量(mg)，m载体为聚合物的质量(mg)。
如表1所示，制备的载胰岛素微凝胶的包封率和载药量分别达到98.7％和42.3％。
表1制备的载胰岛素微凝胶的包封率和载药量
Figure BDA0003066035450000063
Figure BDA0003066035450000071
实施例5
微凝胶的细胞毒性实验(MTT)
将光交联的空微凝胶P(AC(TCB)-o-Cl)和PAC-PCl和载有胰岛素的微胶囊P(AC(TCB)-o-Cl)和PAC-PCl进行Caco-2细胞和HT-29细胞的细胞毒性实验，结果见图6。通过图6(A)，载有不同浓度胰岛素的ACTs和ACs对Caco-2细胞和HT-29细胞的存活率无影响，说明在胰岛素的微胶囊对细胞并无毒性影响。如附图6(B)，随着微胶囊的浓度的增加，与空白细胞培养液中细胞活性相比，加入微胶囊的细胞培养液中的细胞活性没有明显降低，并且存活率在80％以上，因此，该微胶囊对生物细胞毒性较小。
实施例6
模拟体外释放实验
将20mg/mL的光交联胰岛素微凝胶置于4mL的ep管中，在0-30min时置于唾液溶液中模拟血糖环境，放于37℃，80r/min摇床保温箱中，在5min,15min,30min不同时取出样品液，于96孔板中，加入考马斯亮蓝试剂，每个样品平行测三次，根据标准曲线测定胰岛素的浓度。在30min-2h模拟胃液pH＝1.2放情况，放于37℃，80r/min摇床保温箱中，在1h，2h不同时间取出样品液于96孔板中；在2h-6h模拟小肠pH＝6.8环境取出样品液于96孔板中；在6-10h模拟血液pH＝7.4的环境取出样品液于96孔板中，加入考马斯亮蓝试剂，每个样品平行测三次，根据标准曲线测定胰岛素的浓度。相同的方法用于不含有两性离子TCB的载胰岛素微凝胶作为对照试验，采用下述公式计算胰岛素在不同时间的累计释放百分率：
胰岛素累积释放量(％)＝(V×C)/(W×LC)×100％
其中，V为释放介质体积(模拟高血糖环境，mL)，C为游离的胰岛素浓度(mg/mL)，W为载胰岛素聚合物胶束的质量(mg)，LC为载胰岛素聚合物微胶囊的载药量(％)。累积释放结果见图7为研究胰岛素微胶囊在胃肠道不同介质中的释放行为。将包载胰岛素的微胶囊分散在pH1.2,6.8和7.4的缓冲溶液来模拟胃，十二指肠和小肠的pH环境。如图7，胰岛素在pH1.2中有接近40.7％的累计释放行为，这是由于胰岛素负电荷丢失，导致胰岛素的释放，而ACs和ACTs的胰岛素累计释放量均低于20％，说明紫外交联微胶囊能够显著延缓颗粒中胰岛素的释放，防止胰岛素在酸性条件下被降解失活。因此紫外光交联微胶囊可以降低胰岛素在胃环境中的酸性降解。随后在pH6.8和pH7.4中连续孵育，进一步探索其释放行为。与游离胰岛素相比，ACs和ACTs的胰岛素释放较慢，ACTs的胰岛素释放速率略低ACs。结果表明，紫外交联能有效提高微胶囊的结构稳定性，两性离子能有效延缓胰岛素的释放，与预期结果一致。
本发明所制备的pH敏感可降解的两性离子微胶囊，以丙烯酰碳酸酯和内酯为原料制备可降解的巯基化两性离子聚合物，通过微流控技术结合紫外光交联技术制备包载蛋白质药物的两性离子微胶囊微胶囊；口服时在胃液中具有抗酸作用，结合两性离子改善粘膜渗透性和促进经皮吸收的作用，使微胶囊能跨过肠上皮细胞膜，促进蛋白质药物在肠道中的释放，克服蛋白质药物在胃肠道中易失活易降解的影响。

Claims (8)

1.一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊，其特征在于，所述的微胶囊是w/o/w的双层核壳结构，所述微胶囊核层包载有蛋白质药物，所述蛋白质药物为胰岛素、牛血清蛋白、多肽、基因工程药物、单克隆抗体或重组疫苗，所述微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）两嵌段聚合物的制备：将丙烯酰碳酸酯溶于溶剂中，加入内酯，加入催化剂，在氮气环境反应得到两嵌段聚合物；
（2）含巯基分子修饰两性离子的制备：将两性离子化合物溶于有机试剂，加入含有巯基结构的分子和催化剂，在氮气环境反应得到含有巯基分子修饰的两性离子；
（3）含有巯基分子的两性离子修饰聚合物的制备：将步骤（1）中制得的两嵌段聚合物溶于有机溶剂中，加入步骤（2）制得的含有巯基分子的修饰的两性离子和催化剂，在氮气环境反应得到含有巯基分子的两性离子修饰聚合物；
（4）将步骤（3）得到的聚合物，通过微流控技术制备出载有蛋白质药物的微胶囊，通过光交联法，在紫外照射下得到pH敏感可降解的两性离子微胶囊。
2.根据权利要求1所述的两性离子微胶囊，其特征在于，步骤（1）中，所述内酯为ε-己内酯、乳酸、聚氨基甲酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或三甲基化壳聚糖，所述溶剂为无水二氯甲烷，无水三氯甲烷或无水甲苯，催化剂为Zinc、DBU或辛酸亚锡。
3.根据权利要求1所述的两性离子微胶囊，其特征在于，步骤（2）中，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜或N,N-二甲基酰胺，所述两性离子化合物为磺基甜菜碱或羧基甜菜碱，催化剂为三乙胺、六氢吡啶、氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、三级丁醇钾、氨基钠或四级铵碱。
4.根据权利要求1所述的两性离子微胶囊，其特征在于，步骤（3）中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲醇或二甲亚砜，催化剂为三乙胺、六氢吡啶、氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、三级丁醇钾、氨基钠或四级铵碱。
5.根据权利要求1所述的两性离子微胶囊，其特征在于，步骤（4）具体为，通过微流控装置制备载有蛋白质药物的两性离子微胶囊，其中，微流控装置的内相是蛋白质药物的水溶液和内相乳化剂，中间相是步骤（3）得到的聚合物溶于中间相溶剂并加入中间相乳化剂，外相是外相乳化剂的水溶液，通过微流控技术得到的w/o/w的双层微球，加入光引发剂，经紫外照射，得到基于微流控技术和光交联技术的两性离子微胶囊。
6.根据权利要求5所述的两性离子微胶囊，其特征在于，所述内相乳化剂为帕洛沙姆、吐温20~80、聚乙烯醇或聚氧乙烯醚；中间相乳化剂为司盘20~80、蔗糖酯、磷酸盐、大豆磷脂或德固赛；中间相溶剂为大豆油、橄榄油、石蜡油、丙二酸二乙酯、乙酸乙酯或氯仿；外相乳化剂为帕洛沙姆、吐温20~80、聚乙烯醇或聚氧乙烯醚。
7.一种权利要求1所述的pH敏感可降解的两性离子微胶囊在制备治疗糖尿病的口服蛋白质药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在口服蛋白质药物递药系统中，其递药系统具体为，由丙烯酰碳酸酯和内酯通过开环聚合形成共聚物，然后丙烯酰碳酸酯上的双键与巯基化两性离子进行Michael加成修饰，形成修饰后的生物可降解的含有巯基分子的两性离子修饰聚合物，最后通过微流控技术制备包载蛋白质药物的微胶囊，形成所述的pH敏感可降解的两性离子微胶囊递药系统。
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