CN115671050A - 一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN115671050A CN202211189228.0A CN202211189228A CN115671050A CN 115671050 A CN115671050 A CN 115671050A CN 202211189228 A CN202211189228 A CN 202211189228A CN 115671050 A CN115671050 A CN 115671050A
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钱红亮
马俞宏
何沐姣
丰小龙
陈维
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Abstract

本发明公开了一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒及其制备方法和应用。该纳米颗粒是以聚丙烯酰碳酸酯‑聚己内酯为原料，分别经含巯基的双羟基小分子和苯硼酸衍生物修饰，将上述两种修饰后的聚丙烯酰碳酸酯‑聚己内酯和双键修饰的胆酸分子、两性离子材料混合，包载蛋白药物，结合W/O/W乳化法和紫外交联技术制得。该纳米颗粒中苯硼酸衍生物与双羟基形成苯硼酸酯复合物，使纳米颗粒具有葡萄糖响应性，按需多次开关释放胰岛素，经过紫外光交联提高载体结构稳定性；两性离子延长纳米颗粒与肠道的作用时间；该纳米颗粒以胆酸为肝靶向因子，经过蛋白介导的跨膜作用跨过肠上皮细胞，经过肝肠循环在肝脏中蓄积，实现肝靶向，提高胰岛素口服生物利用度。

Description

一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒及其制备方法和应用，属于高分子材料学和药物制剂领域。
背景技术
胰岛素是体内唯—能够降低血糖含量的激素，Ⅰ型糖尿病的治疗主要依靠外源胰岛素的补充，但目前利用胰岛素的方式多为注射，患者需要多次注射且胰岛素治疗的最大不良反应为低血糖，给患者带来居多痛苦与不便。
口服胰岛素作为一种便捷的胰岛素制剂，成为了众多学者的研究热潮。但胰岛素由于相对分子量大、半衰期短、脂溶性差，直接口服会主要存在以下3个屏障：(1) 物理屏障，即胃肠道上皮细胞会阻碍胰岛素的吸收；(2)化学屏障，即从高酸性的胃部环境到中性至微碱性的肠道环境的变化会导致胰岛素内部结构破坏；(3)酶屏障，即胃肠道中的蛋白酶会降解胰岛素，致其失活。目前常利用脂质体、纳米粒、微囊、凝胶等载体递送胰岛素来减少其破坏与降解，并且添加吸收促进剂促进其吸收效果。 CN113230232公开了一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊及其制备方法和应用，其制备了以两性离子修饰的聚合物包载胰岛素的微胶囊，改善了黏膜渗透性，促进微胶囊跨过肠上皮细胞和胰岛素在肠道中的释放，证明了两性离子在促进蛋白质药物的肠道吸收方面发挥的作用，但该微胶囊存在着由于囊材经过胃肠道降解，胰岛素绝大部分以游离形式进入肠道，同时缺少肝靶向能力，经肠道吸收后大部分直接进入血液，缺少血糖水平响应性，导致胰岛素作用时间短、口服生物利用度低的问题。
胆酸是一种内源性肝细胞特异性天然配体，在肝细胞中生成，与甘氨酸或牛磺酸结合后随胆汁流入小肠，由肠迅速吸收后重新进入肝脏。在肝肠循环的过程中，仅有少量胆酸进入血液，因此具有高度的器官特异性。以胆酸为靶向载体，不仅具有良好的生物兼容性，能够实现药物的肝靶向，还能减少毒副作用，提高药物的口服生物利用度。Bao等人制备了具有葡聚糖和胆酸表面的胰岛素纳米颗粒，该纳米颗粒实现了靶向运送胰岛素至肝脏的目的，增强了胰岛素在肠道和肝脏中的口服吸收，并将纳米颗粒口服生物利用度提高至20.5％(J Mater Chem B.2021,31(7):6234-6245)。
葡萄糖响应纳米药物递送系统因其良好的生物相容性、无毒性、可被降解、具有可开发的靶向性等优点可作为蛋白类的良好载体。含苯硼酸或其衍生物的聚合物，可以与含有多羟基基团结构的物质(糖、二醇、二酚等)结合，形成可逆复合物，一方面提高载体稳定性，同时引入葡萄糖响应性。高血糖时，糖分子与多羟基物质竞争苯硼酸上的结合位点，使苯硼酸酯复合物解离，实现药物的控制释放和葡萄糖的智能响应。糖分子与无环二醇之间的这种竞争机制为开发用于长效循环的葡萄糖响应材料提供了良好的机会，例如张建华等(CN106038478A)采用苯硼酸改性的多孔微球与多羟基聚合物水溶液共溶，表面的苯硼酸衍生物与顺式二羟基之间发生键合形成苯硼酸酯，应用于胰岛素的缓释递送有较好的缓释效果。
上述研究虽然能在一定程度上起到降低高血糖的效果，但同时具有可高效克服胃肠道屏障、葡萄糖响应性和肝靶向能力的口服药物载体研究较少，使长效循环效果大打折扣，这可能是限制药物发挥降糖作用的主要原因。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒；本发的第二目的是提供一种该纳米颗粒的制备方法，本发明的第三目的是提供该纳米颗粒在制备治疗糖尿病药物中的应用。
技术方案：本发明所述肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒为W/O/W乳化型组合物，是包括内相为含蛋白药物的水溶液，油相为苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、含巯基的双羟基结构小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、丙烯酸-2-羟乙基酯(HEA)修饰的胆酸分子、两性离子材料形成的混合液，外相为含表面活性剂的水溶液，并通过紫外交联形成。
进一步地，所述蛋白药物为胰岛素、牛血清蛋白或生长素。
进一步地，所述聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯(PAC-PCL)为丙烯酰碳酸酯(AC)与己内酯(ε-CL)反应得到。
进一步地，所述苯硼酸衍生物修饰是先由含巯基的羧酸类小分子通过迈克尔加成反应在丙烯酰碳酸酯(AC)碳碳双键上修饰部分，其次通过酰胺反应连接具有葡萄糖响应的苯硼酸衍生物分子。
进一步地，所述含巯基的双羟基结构小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯是由含巯基的双羟基结构小分子通过迈克尔加成反应在PAC-PCL的碳碳双键上部分连接得到。
进一步地，所述苯硼酸衍生物为对氨基苯硼酸或间氨基苯硼酸。
进一步地，所述含巯基的双羟基结构小分子为硫代甘油(MPD)或4-二巯基-2， 3-丁二醇。
进一步地，所述胆酸分子为脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、熊去氧胆酸 (UDCA)或鹅去氧胆酸(CDCA)。
进一步地，所述两性离子材料为羧基甜菜碱(CB)或磺基甜菜碱(SB)。
进一步地，所述表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)或十二烷基苯磺酸钠。
本发明所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
氮气保护下，将丙烯酰碳酸酯溶于有机溶剂中，加入己内酯和催化剂，加热反应，加入终止剂，沉淀，分离，得到聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(2)含巯基的双羟基小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
将步骤(1)中制备的聚合物聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含巯基的双羟基结构的小分子与催化剂，在氮气保护下反应，沉淀，分离，得到含巯基的双羟基小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(3)苯硼酸衍生物分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
将步骤(1)中制备的聚合物聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含巯基的羧酸类小分子与催化剂，在氮气保护下反应，得到含巯基的羧酸类小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；将上述含巯基的羧酸类小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入苯硼酸衍生物和催化剂，反应，透析，沉淀，分离，得到苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(4)丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子的制备：
氮气保护下，将胆酸溶于有机溶剂，加入丙烯酸-2-羟乙基酯和催化剂，反应，沉淀，分离，得到终产物丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子；
(5)纳米颗粒的制备：
将步骤(2)得到的含巯基的双羟基分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯与步骤(3)得到的苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入步骤(4)得到的丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子与两性离子材料，加入光引发剂混合均匀，作为油相；再滴入蛋白药物水溶液和乳化剂形成初乳液；将上述乳液滴入含表面活性剂的水溶液中，形成二级乳液，结合紫外交联技术得到双层光交联的纳米颗粒。
进一步地，步骤(1)中，所述有机溶剂为无水甲苯或无水二氯甲烷，催化剂为双(双三甲基硅基)胺锌或辛酸亚锡(Zinc)或辛酸亚锡Sn(at)2，终止剂为冰醋酸或三乙胺。
更进一步地，所述有机溶剂为无水甲苯，催化剂为Sn(at)2，终止剂为冰醋酸。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 或无水二甲亚砜(DMSO)，催化剂为三乙胺或六氢吡啶。
进一步地，步骤(2)中，所述含巯基的双羟基小分子与聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯上双键的物质的量比为0.5-0.8:1。
进一步地，步骤(3)中，所述含巯基的羧酸类小分子为巯基丙酸(MPA)或巯基乙酸。
进一步地，步骤(3)中，所述含巯基的羧酸类小分子与聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯上双键的物质的量比为0.5-0.8:1。
进一步地，步骤(3)中，所述苯硼酸衍生物与含巯基的羧酸类小分子的物质的量比为1-3:1。
更进一步地，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，催化剂为三乙胺，含巯基的羧酸类小分子为巯基丙酸(MPA)。
进一步地，步骤(4)中，所述有机溶剂为无水二氯甲烷，催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N-二环己甲碳二亚胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)。
进一步地，所述丙烯酸-2-羟乙基酯与胆酸分子的物质的量比为5-10:1。
进一步地，步骤(5)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮中的一种或几种混合液，所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2929)或2,4-二乙基硫杂蒽酮(DETX)，所述乳化剂为SPAN80或甘油，所述表面活性剂为聚乙烯醇 (PVA)或十二烷基苯磺酸钠。
更进一步地，有机溶剂为二氯甲烷:丙酮体积比为3:1的混合溶液，光引发剂为I2959，乳化剂为SPAN80，表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)。
进一步地，步骤(5)中，所述得到的苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、含巯基的双羟基分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子和两性离子材料的物质的量比为10:(10-30):1:(3)。
其制备过程作为优选地：
步骤(1)：氮气保护下，将AC溶于无水甲苯中，加入ε-己内酯(ε-CL)和辛酸亚锡Sn(at)2催化剂，加热反应，加入冰醋酸终止剂结束反应，在冰乙醚中沉淀出固体，分离，真空干燥，得到双键可修饰聚合物PAC-PCL；
步骤(2)：将步骤(1)所得产物PAC-PCL溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 中，在氮气保护下，加入硫代甘油(MPD)和三乙胺(TEA)，无水无氧条件下反应过夜，在冰乙醚中沉淀出固体，分离，真空干燥，得到含巯基的双羟基小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯PAC-PCL-MPD；
步骤(3)：将步骤(1)所得产物PAC-PCL溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 中，按照PAC-PCL与巯基丙酸(MPA)物质的量为1:10加入MPA，再加入三乙胺 (TEA)反应，得到巯基丙酸(MPA)修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯PAC-PCL- MPA；将PAC-PCL-MPA溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，然后加入间氨基苯硼酸通过酰胺反应修饰间氨基苯硼酸，透析，沉淀，分离，得到苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯PAC-PCL-MPBA；
步骤(4)：氮气保护下，将熊去氧胆酸(UDCA)溶于无水二氯甲烷，加入丙烯酸-2-羟乙基酯(HEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N,N-二环己甲碳二亚胺(DCC)，反应一段时间后，在冰乙醚中沉淀出固体，分离，真空干燥，得到终产物双键修饰的熊去氧胆酸小分子HEA-UDCA；
步骤(5)，将PAC-PCL-MPD、PAC-PCL-MPBA分别溶于二氯甲烷与丙酮的混合溶液(二氯甲烷与丙酮的体积比为3:1)中，加入HEA-UDCA和羧基甜菜碱(CB)，加入光引发剂I2959混合均匀，作为油相；滴入蛋白药物水溶液、SPAN80，混合均匀形成初乳液；将上述初乳液滴入含PVA的水溶液中，混合均匀形成二级乳液，紫外照射得到光交联的纳米颗粒。
本发明所述肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒在制备治疗糖尿病药物中的应用，
进一步地，所述应用包括在乳化过程中加入蛋白药物胰岛素，通过W/O/W乳化法结合紫外交联技术得到载胰岛素的纳米颗粒。
本发明所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒具有肝靶向和葡萄糖响应性，所述纳米颗粒是由丙烯酰碳酸酯(AC)和ε-己内酯(ε-CL)通过开环聚合反应形成双键可修饰聚合物，然后分别经过含巯基的双羟基小分子修饰和苯硼酸衍生物修饰，形成两种修饰后的聚合物；胆酸分子上修饰含活性羟基与双键的小分子，混合带双键的两性离子材料，作为交联剂，与上述两种修饰后的聚合物混合，作为油相；将蛋白药物的水溶液与适量乳化剂滴入油相，形成初级乳液；将初级乳液滴入含少量表面活性剂的水溶液中，形成双重乳液，结合W/O/W乳化法和紫外交联技术，形成所述的具有肝靶向和葡萄糖响应性的双层交联的纳米颗粒。
本发明设计和合成了新型生物可降解聚合物辅料，形成了具有肝靶向和葡萄糖响应性的双层交联的纳米颗粒。其利用糖分子与无环二醇之间的竞争机制实现胰岛素缓释，同时结合紫外交联技术，多次释放时载体稳定性很好，具有一定的抵抗胃酸的作用，达到按需释放和长效循环的目的；两性离子的加入延长了纳米颗粒在肠道中的停留时间，促进蛋白质药物的吸收；纳米颗粒壳层引入胆酸分子，通过蛋白介导的跨膜作用增加肠上皮细胞对纳米颗粒的吸收，经肝肠循环后，胆酸的肝靶向作用使纳米颗粒富集于肝脏，提高了胰岛素生物利用度，促进了肝糖原的合成，在糖尿病的治疗方面有潜在的应用前景。
有益效果：相对于现有技术，具有如下优势：
(1)操作简便且载药材料具有良好的生物相容性。本发明选用的载体材料毒性低，体内可降解，反应操作简便可控，且W/O/W的乳化方法和紫外光交联技术制备纳米颗粒技术成熟，条件简单。
(2)双重交联，载体结构稳定，载药量高，且具有葡糖糖响应性，通过响应血糖水平控制胰岛素释放，不引起突释，使胰岛素实现肝脏蓄积，提高肝脏葡萄糖利用率。本发明通过修饰间氨基苯硼酸和邻羟基基团得到苯硼酸酯交联结构，使胰岛素呈现葡萄糖水平依赖性释放的行为，同时利用双键紫外光交联固化，提高载体稳定性，实现载体多轮循环，胰岛素长效释放。
(3)肠道吸收能力良好。两性离子的加入延长了纳米颗粒与肠上皮细胞黏膜的作用时间，胆酸借助于蛋白介导的内吞作用提高了纳米颗粒跨肠上皮细胞的能力，二者均促进了纳米颗粒在肠道的吸收。
(4)具有肝靶向能力，改善肝脏葡萄糖利用。该纳米颗粒中熊去氧胆酸分子具有肝靶向能力，口服时，经肝肠循环，该纳米颗粒在肝脏聚集，模拟胰岛素的内源性降糖机制，提高肝脏葡萄糖利用率，促进肝糖原的合成，提高胰岛素的生物利用度。
附图说明
图1为实施例1中PAC-PCL的核磁氢谱图；
图2为实施例2中PAC-PCL-MPD的核磁氢谱图；
图3为实施例3中PAC-PCL-MPBA的核磁氢谱图；
图4为实施例4中HEA-UDCA的核磁氢谱图；
图5为实施例5中载药量为40％的纳米颗粒粒径图；
图6为实施例5中检测载药纳米颗粒体外释放性能实验结果图；
图7为实施例5中检测载药纳米颗粒体外酶抵抗性能实验结果图；
图8为实施例5中检测载药纳米颗粒“开关式”葡萄糖响应实验结果图；
图9为实施例5中双层交联纳米载体进行Caco-2细胞毒性试验的细胞存活率示意图；
图10为实施例6中为载药纳米颗粒肝细胞摄取实验结果图；
图11为实施例7中为载药纳米颗粒体内降糖实验结果图；
图12为实施例8中为口服载药纳米颗粒后肝糖原含量检测实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
PAC-PCL的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003868528910000071
无水无氧氮气气氛下，精密称量5g AC(2.5mmol)于真空瓶中，加入10-15mL 甲苯，搅拌至AC全部溶解。精密称量60mg异丙醇(IPA)，并滴入60滴甲苯混合均匀，滴入真空瓶中。精密称量2.1gε-CL(ε-己内酯，18.4mmol)加入真空瓶中，最后滴入3-4滴Sn(at)2催化反应。将真空瓶移出手套箱，100℃油浴中反应24h，加入3-4 滴冰醋酸终止反应，将最终所得粘稠溶液滴入至少20倍体积冰乙醚中进行沉淀，分离得到絮状物质，真空干燥，得到终产物PAC-PCL。产率为94.3％。
将本实施例制备的PAC-PCL进行氢核磁共振分析，结果如图1所示。
PAC-PCL的氢核磁表征见附图1，图1为实施例1中PAC-PCL的核磁氢谱图，由图1可见，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.27(d,3H),3.89-4.13(m,2H),6.12(t, 1H),5.83-6.41(m,2H).
实施例2
PAC-PCL-MPD的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003868528910000072
精密称量100mg PAC-PCL(3.03mmol)加入反应瓶内并溶解于5mL DMF中。以反应PAC-PCL上15个双键计算，精密量取4μL硫代甘油(45.4mmol)，氮气保护条件下加入至反应瓶中，滴加2-3滴三乙胺催化反应，反应过夜。将终溶液滴入至少 20倍体积冰乙醚中进行沉淀，分离得到白色固体，真空干燥得到终产物PAC-PCL- MPD。产率为78.4％。
将本实施例制备的PAC-PCL-MPD进行氢核磁共振分析，结果如图2所示。
PAC-PCL-MPD的氢核磁表征见附图2，图2为实施例2中PAC-PCL-MPD的核磁氢谱图，由图2可见，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.27(d,3H),2.45-2.83(t,2H), 3.53(d,2H)，3.89-4.13(m,2H),6.12(t,1H),5.83-6.41(m,2H).
实施例3
PAC-PCL-MPBA的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003868528910000081
精密称量100mg PAC-PCL(3.03mmol)加入反应瓶内并溶解于5mL DMF中。以反应PAC-PCL上10个双键计算，精密量取32.1mg巯基丙酸(30.3mmol)，氮气保护条件下加入至反应瓶中，滴加2-3滴三乙胺催化反应，反应过夜。将终溶液滴入至少 20倍体积冰乙醚中进行沉淀，分离得到白色固体，真空干燥得到终产物PAC-PCL- MPA。
精密称量100mg PAC-PCL-MPA(3.40mmol)加入反应瓶内并溶解于5mL DMF 中。以反应PAC-PCL-MPA上10个羧基计算，精密称量13.7mg EDC·HCL(68mmol)、 7.82mg NHS(68mmol)，依次加入反应瓶中。氮气保护下向反应瓶中投入3倍量的3- 氨基苯硼酸(APBA)，即15.8mg APBA(102mmol)，将终溶液加入3.5kDa透析袋中，并用丙酮透析，后旋蒸除去丙酮，将剩余溶液滴入至少20倍体积冰乙醚中进行沉淀，分离得到白色固体，真空干燥，得到终产物PAC-PCL-MPBA。产率为73.5％。
将本实施例制备的PAC-PCL-MPBA进行氢核磁共振分析，结果如图3所示。
PAC-PCL-MPBA的氢核磁表征见附图3，图3为实施例3中PAC-PCL-MPBA的核磁氢谱图，由图3可知，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.27(d,3H),3.23(s, 1H),3.89-4.13(m,2H),4.2(s,1H),7.89-8.01(m,4H),10.03(s,1H).
实施例4
HEA-UDCA的合成，合成路线及过程如下：
Figure BDA0003868528910000091
精密量取100mg熊去氧胆酸(UDCA)(0.255mmol)，氮气保护下用5mL无水 CH2Cl2完全溶解，加入7.83μL HEA(2.55mmol)，依次加入62.3mg 4-二甲氨基吡啶 (DMAP，0.51mmol)、105.2mg N,N-二环己甲碳二亚胺(DCC，0.51mmol)催化反应，反应24h后，将反应液滴入至少20倍体积冰乙醚中进行沉淀，分离得到白色固体，真空干燥，得到终产物HEA-UDCA。产率为79％。
将本实施例制备的HEA-UDCA进行氢核磁共振分析，结果如图4所示。
HEA-UDCA的氢核磁表征见附图4，图4为实施例4中HEA-UDCA的核磁氢谱图，由图4可见，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.88-0.97(d,3H),1.04-1.14(d,1H), 1.65-1.90(q,2H),2.35(t,1H),3.24-3.54(m,1H),6.12(t,1H),5.83-6.41(m,2H).
实施例5
(1)载药纳米颗粒的制备
实施例2-4所制备的PAC-PCL-MPD、PAC-PCL-MPBA、CB和HEA-UDCA为纳米颗粒载体材料。用乙醇配制光交联剂I2959含量为20mg/mL的溶液备用。以上述 I2959溶液为溶剂，按照CB与HEA-UDCA物质的量比为2:1的比例配制总含量为15 mg/mL的混合溶液。将PAC-PCL-MPD和PAC-PCL-MPBA按照10mg/mL的浓度分别溶于二氯甲烷:丙酮体积比为3:1的有机溶液中，超声处理至完全溶解，将两种溶液按照PAC-PCL-MPD:PAC-PCL-MPBA体积比为3:2比列混合。取50μL上述CB和HEA- UDCA混合溶液、1mL上述PAC-PCL-MPD和PAC-PCL-MPBA混合溶液、载体材料总质量5％比例的上述光交联剂溶液，混合均匀，作为油相。按胰岛素照载药量为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、35wt％、40wt％，分别将对应体积的以 pH 2.0的盐酸溶液为溶剂配制的胰岛素溶液(15mg/mL)与一滴SPAN80滴入油相中，均质混合制成初始乳液。将初始乳液滴入8mL 0.2wt％的PVA水溶液中，超声混合均匀。旋蒸除去上述溶液中的有机溶剂，紫外光照射15min，得到载药纳米颗粒，记为 C+U@insulin NPs。不加入HEA-UDCA时，记为CB@insulin NPs；不装载胰岛素时，将胰岛素水溶液替换为pH为2的0.2wt％PVA水溶液，记为Blank CB NPs、Blank C+U NPs。
对本实施例制备的载药量为40wt％的载药纳米颗粒进行粒度分析，结果如图5所示。由图5可知，纳米颗粒C+U@insulin NPs的平均粒径在240nm左右，CB@insulin NPs的平均粒径在250nm左右，分布系数PDI为0.09-0.19，说明该纳米粒子粒度分布均一。
(2)载胰岛素胶束的包封率和载药量测定
质量包封率和载药量通常用来表示聚合物胶束的载药能力。本文采用间接法，利用考马斯亮蓝染色法测量未被包载的游离胰岛素的含量计算载药量和包封率。其中载药量是包载在纳米颗粒的药量和总质量(载体和包载的药量)的百分数，质量包封率是指包载在纳米颗粒的药量和投药量的质量百分数，计算公式分别如下：
Figure BDA0003868528910000101
Figure BDA0003868528910000102
其中，m总为投入胰岛素的质量(mg)，m游为游离的胰岛素质量(mg)；m药为包载在纳米颗粒内胰岛素的质量(mg)，m载体为载体材料的质量(mg)。
如表1，对于C+U@insulin NPs，在理论载药量(即投入胰岛素的质量/载体材料与投入胰岛素的质量之和)为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、35wt％、 40wt％时，纳米颗粒对胰岛素的包封率约为86.90-98.40％。
表1载胰岛素纳米颗粒的表征
Figure BDA0003868528910000103
(3)模拟体外释放性能
以pH 2.0的盐酸溶液为溶剂配制胰岛素含量为2mg/mL的溶液，分别稀释为0 μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、9μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、24μg/mL、180μg/mL、 240μg/mL的浓度梯度溶液。分别取50μL上述不同浓度梯度的溶液于96孔板中，分别加入150μL考马斯亮蓝试剂，混合均匀，利用酶标仪在ABS(紫外吸收)模式下，选定测量波长为562nm，测量其吸光度，并绘制吸光度与胰岛素浓度的标准曲线。
通过pH的变化模拟纳米颗粒在唾液、胃液和肠道的人体环境的释放行为，模拟载胰岛素纳米颗粒药物从胃到肠道的运输过程。以5mL pH 1.2、pH 6.8和pH 7.4的100 mM磷酸缓冲液(PBS溶液)作为释放介质，分别将1mL本实施例步骤(1)中制备的CB@insulin NPs和C+U@insulin NPs置于12kDa透析袋中，放于37℃，80r/min摇床保温箱中，在2h、8h时分别更换释放介质，并在对应时间点取出50μL样品液，于96孔板中，加入150μL考马斯亮蓝试剂，在562nm波长下每个样品平行测三次紫外吸光度(每次取完样品，补充150μL相应pH的磷酸缓冲液，保证体积不发生变化)，根据吸光度与胰岛素标准曲线测定释放的胰岛素的量，累积释放结果见附图6。图6为实施例5中检测载药纳米粒子体外释放性能实验结果图，由图6可见，CB@insulin NPs和C+U@insulin NPs中胰岛素的释放量随着pH的升高而增加，且在前两小时pH 1.2溶液中，胰岛素释放量很少，随着pH增大，胰岛素的释放速率明显增大，表明两种纳米粒子在胃中释放少，避免了胃酸的降解，这可能归因于纳米粒子的双重交联增大了对胃酸的抵抗性，同时纳米粒子在肠道中释放较多，胰岛素的生物利用度得以提高。
(4)酶降解实验
酶降解实验步骤同本实施例中的步骤(3)，以5mL按照中国药典配置的胃液(SGF)、肠液(SIF)分别作为释放介质，将1mL本实施例步骤(1)中制备的 CB@insulin NPs和CB+UDCA@insulin NPs置于12kDa透析袋中，放于37℃，80 r/min摇床保温箱中，在1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h时间点，分别取出50μL样品液，于96孔板中，加入150μL考马斯亮蓝试剂，在562nm波长下每个样品平行测三次紫外吸光度(每次取完样品，要加入150μL相应胃液、肠液，保证体积不发生变化)，根据胰岛素标准曲线测定释放的胰岛素的量，累积释放结果见附图7。图7为实施例5中检测载药纳米粒子体外酶抵抗性能实验结果图，从图7中可以看出，CB@insulin NPs和C+U@insulin NPs在胃液中基本不释放，胰岛素保留量达到了90％以上，表明纳米粒子能在胃部保持良好的稳定性，有效抵抗胃酸和酶降解。在肠液中胰岛素随着时间增加而缓慢减少，8h后仍有约25％，这表明CB@insulin NPs和 C+U@insulin NPs能在肠道中缓慢释放胰岛素。
(5)“开关式”葡萄糖响应试验
将1mL本实施例步骤(1)中制备的CB@insulin NPs和C+U@insulin NPs分别置于12kDa透析袋中置于5mL 4mg/mL葡萄糖溶液中，在37℃，80r/min摇床保温箱释放两个小时，分别取出50μL样品液，于96孔板中，加入150μL考马斯亮蓝试剂，在 562nm波长下每个样品平行测三次紫外吸光度(每次取完样品，要加入150mL4 mg/mL葡萄糖溶液，保证体积不发生变化)，紧接着置于1mg/mL葡萄糖溶液中相同条件释放两个小时，取样检测。反复测试4次，计算在相同时间不同葡萄糖浓度的释放速率。其累积释放结果见附图8，图8为实施例5中检测载药纳米粒子“开关式”葡萄糖响应实验结果图，从图8中可以看出，在高浓度葡萄糖中胰岛素释放比正常浓度快，在连续交替的高低浓度葡萄糖环境转换下呈现胰岛素释放“开关”模式。CB@insulin NPs和C+U@insulin NPs都能跟随葡萄糖浓度的“高-低-高-低”转变呈现“快-慢-快-慢”的释放模式，这说明纳米颗粒具有葡萄糖智能响应性。当环境中葡萄糖浓度高时，胰岛素的释放速率增大，当环境中葡萄糖浓度低时，胰岛素的释放速率减慢。
(6)纳米载体的细胞毒性实验(MTT)
将本实施例步骤(1)中制备得到的未载药的Blank CB NPs和Blank C+U NPs进行人克隆结肠腺癌(Caco-2)细胞毒性实验(MTT)，结果见附图9。图9为实施例6 中双层交联纳米载体进行Caco-2细胞毒性试验的细胞存活率示意图，由图9可知，随着纳米载体浓度的增加，与空白细胞培养液中细胞活性相比，加入纳米载体的细胞培养液中细胞活性没有明显降低，并且存活率在80％以上，因此，证明该纳米载体材料对生物细胞毒性较小。
实施例6
利用AML12细胞(小鼠正常肝细胞)摄取研究载药纳米颗粒在动物肝脏中的摄取。将AML12细胞在12孔板(1×105个/孔)中的玻璃盖玻片上培养3天。将培养后的 AML12细胞与分别添加有200μL灭菌PBS溶液、CB@insulin NPs、C+U@insulin NPs 的1mL细胞培养基一起孵育4h(使载药纳米颗粒浓度为0.2mg/mL)。然后，将 AML12细胞用500μL灭菌PBS溶液洗涤三次，然后用4％多聚甲醛(覆盖住细胞即可) 固定。为了可视化载药纳米颗粒的摄取，提前用5-氨基荧光素(5-AF)标记纳米颗粒中的胰岛素，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1.25μg/mL，覆盖住细胞即可)染色细胞核10分钟后，用200μL灭菌PBS溶液清洗载玻片并通过激光扫描共聚焦显微镜 CLSM观察AML12细胞。为了定量测量摄取并进一步评估UDCA在肝脏摄取的作用，使用流式细胞术(Flow cytometer)分析定量测定胰岛素的细胞摄取。AML12细胞摄取胰岛素的结果见附图10所示。图10为实施例6中为载药纳米粒子肝细胞摄取实验结果图，由图10可见，合并图像(Merge)显示C+U@insulin NPs组在细胞核周围荧光信号比其他组强得多，其对应的流式细胞仪的荧光强度结果也显示出更大的荧光强度，均证实了C+U@insulin NPs中的熊去氧胆酸(UDCA)增强了胰岛素的肝脏摄取。
实施例7
将高血糖模型小鼠随机分为5组，每组3只老鼠，分别皮下注射胰岛素(S.C.，剂量为5U/kg)、口服C+U@insulin NPs(胰岛素剂量为25U/kg)、口服CB@insulin NPs (胰岛素剂量为25U/kg)、口服Blank CB NPs、口服Blank C+U NPs，以健康小鼠 (Normal mice)为对照，进行体内实验。通过尾静脉采集血样(～3μL)，用血糖仪连续监测血糖变化并记录。血糖变化曲线见附图11所示。图11为实施例7中为载药纳米颗粒体内降糖实验结果图，由图11可见，皮下注射胰岛素在2h内迅速下降到正常值，在接下来的1h内迅速失去控制，Blank CBNPs组动物血糖无明显下降，而Blank C+U NPs组别小鼠口服后有微弱的降糖效果，但均未降到正常血糖水平。口服C+U@insulin NPs和CB@insulin NPs的小鼠血糖在2h内迅速降至10mmol/L左右。CB@insulin NPs组可以维持在正常血糖水平12h左右。C+U@insulin NPs组在24h左右维持在正常血糖范围(<11.6mmol/L)，随后血糖水平逐渐升高，表明熊去氧胆酸分子的加入延长了纳米颗粒的作用效果。
实施例8
将高血糖模型小鼠随机分为3组，每组3只老鼠，分别皮下注射胰岛素(S.C.，剂量为5U/kg)、口服C+U@insulin NPs(胰岛素剂量为25U/kg)、口服CB@insulin NPs (胰岛素剂量为25U/kg)。给药后，分别在1、2、3天后用糖原检测试剂盒测定各小鼠肝脏内的肝糖原含量。肝糖原变化见附图12所示。图12为实施例8中为口服载药纳米颗粒后肝糖原含量检测实验结果图，由图12可见，皮下注射胰岛素组别的小鼠其肝糖原含量于另外两组相比，均存在显著性差异，而相较于口服CB@insulin NPs，熊去氧胆酸因子的加入大大改善了肝糖原的利用，有利于治疗糖尿病时血糖的稳定。

Claims (10)

1.一种肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为W/O/W乳化型组合物，是包括内相为含蛋白药物的水溶液，油相为苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、含巯基的双羟基结构小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子、两性离子材料形成的混合液，外相为含表面活性剂的水溶液，并通过紫外交联形成。
2.根据权利要求1所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白药物为胰岛素、牛血清蛋白或生长素，所述聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯为丙烯酰碳酸酯与己内酯反应得到。
3.根据权利要求1所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒，其特征在于，所述苯硼酸衍生物为对氨基苯硼酸或间氨基苯硼酸；所述含巯基的双羟基结构小分子为硫代甘油或4-二巯基-2,3-丁二醇。
4.根据权利要求1所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒，其特征在于，所述胆酸分子为脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸或鹅去氧胆酸，所述两性离子材料为羧基甜菜碱或磺基甜菜碱。
5.根据权利要求1所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒，其特征在于，所述表面活性剂为聚乙烯醇或十二烷基苯磺酸钠。
6.权利要求1-5任一所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
氮气保护下，将丙烯酰碳酸酯溶于有机溶剂中，加入己内酯和催化剂，加热反应，加入终止剂，沉淀，分离，得到聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(2)含巯基的双羟基小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
将步骤(1)中制备的聚合物聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含巯基的双羟基结构的小分子与催化剂，在氮气保护下反应，沉淀，分离，得到含巯基的双羟基小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(3)苯硼酸衍生物分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯的制备：
将步骤(1)中制备的聚合物聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含巯基的羧酸类小分子与催化剂，在氮气保护下反应，得到含巯基的羧酸类小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；将上述含巯基的羧酸类小分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入苯硼酸衍生物和催化剂，反应，透析，沉淀，分离，得到苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯；
(4)丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子的制备：
氮气保护下，将胆酸溶于有机溶剂，加入丙烯酸-2-羟乙基酯和催化剂，反应，沉淀，分离，得到终产物丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子；
(5)纳米颗粒的制备：
将步骤(2)得到的含巯基的双羟基分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯与步骤(3)得到的苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯溶于有机溶剂中，加入步骤(4)得到的丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子与两性离子材料，加入光引发剂混合均匀，作为油相；再滴入蛋白药物水溶液和乳化剂形成初乳液；将上述乳液滴入含表面活性剂的水溶液中，形成二级乳液，结合紫外交联技术得到双层光交联的纳米颗粒。
7.权利要求6所述肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述催化剂为双(双三甲基硅基)胺锌或辛酸亚锡；步骤(2)中，所述含巯基的双羟基小分子与聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯上双键的物质的量比为0.5-0.8:1；步骤(3)中，所述含巯基的羧酸类小分子为巯基丙酸或巯基乙酸，含巯基的羧酸类小分子与聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯上双键的物质的量比为0.5-0.8:1，苯硼酸衍生物与含巯基的羧酸类小分子的物质的量比为1-3:1。
8.权利要求6所述肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述丙烯酸-2-羟乙基酯与胆酸分子的物质的量比为5-10:1；步骤(5)中，所述得到的苯硼酸衍生物修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、含巯基的双羟基分子修饰的聚丙烯酰碳酸酯-聚己内酯、丙烯酸-2-羟乙基酯修饰的胆酸分子和两性离子材料的物质的量比为10:10-30:1:3。
9.权利要求1-5任一项所述的肝靶向的葡萄糖响应性纳米颗粒在制备治疗糖尿病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括在乳化过程中加入蛋白药物胰岛素，通过W/O/W乳化法结合紫外交联技术得到载胰岛素的纳米颗粒。
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