CN114569706B - 双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法 - Google Patents

双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法，所述微针包括背衬层部分和针尖部分，所述背衬层部分由可溶性聚合物溶液制成，所述针尖部分的内部为胰岛素递药系统；胰岛素递药系统由苯硼酸酯复合物装载胰岛素和GOx后再经紫外光聚合后获得；苯硼酸酯复合物包括第一聚合物和第二聚合物；其中，羟基可修饰的高分子聚合物接枝含碳碳双键的小分子化合物得到接枝聚合物，所述接枝聚合物经带巯基的双羟基分子修饰后得到第一聚合物，所述接枝聚合物经带苯硼酸衍生物修饰后得到第二聚合物。苯硼酸衍生物系统和GOx系统同时作用，降低血糖。同时由于第一聚合物和第二聚合物进行双层交联，提高载体稳定性，增强胰岛素在体内的长效循环。

Description

双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法
技术领域
本发明涉及高分子材料学和经皮给药设备技术领域，尤其涉及一种双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法。
背景技术
根据国际糖尿病联合会(IDF)的统计，2021年有5.37亿人患有糖尿病，到2030年这个数字预计将达到6.43亿，2045年将达到7.83亿。据估计，2021年，年龄在20-79岁之间的670多万人死于糖尿病相关原因。糖尿病导致的直接医疗支出已经接近1万亿美元，到2030年将超过这一数字(International Diabetes Federation,http://www.diabetesatlas.org/,2021)。糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性疾病，属于代谢障碍型内分泌疾病，其已经逐渐发展为一种常见的困扰人们生活的疾病，同时，它引起的多种并发症严重影响着患者的生活。
临床主要使用外源胰岛素，使血糖水平降低并保持在3.5-7.0mmol/L的正常窄范围内，但其多为注射给药，不仅不易控制胰岛素的给药量，容易造成低血糖，而且糖尿病患者需要多次注射，皮肤刺激性大。微针作为一种非侵入型给药方式，改善了注射剂依从性差的问题。葡萄糖敏感性药物递送系统被称为“人工胰腺”，可以模拟人体胰腺分泌胰岛素的生理模式，响应血糖水平，控制胰岛素释放，从而调节血糖水平。构建化学合成的葡萄糖响应型胰岛素递送系统的葡萄糖响应材料主要为葡萄糖氧化酶(GOx)、葡萄糖结合蛋白(GBP)和苯硼酸(PBA)及其衍生物(European Polymer Journal,2021,161,110829)。GOx是血糖水平的重要传感器，可以催化体内的葡萄糖发生氧化反应，并形成局部低氧、酸性、高浓度H2O2环境，这些环境变化条件促进了触发微针贴片中胰岛素释放。例如Yu等开发了一种包含胰岛素负载的囊泡的无痛微针阵列贴片，该葡萄糖响应性聚合体基囊泡(d-GRPs)是由低氧和H2O2双敏双嵌段共聚物自组装而成，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化过程中产生的低氧和H2O2引发的葡萄糖反应性囊泡(d-GRPs)解离并释放胰岛素。体内实验表明，该智能胰岛素贴片应用于胰岛素的缓释递送有较好的缓释效果(Nano Letters.2017,17(2):733-739)。含PBA或其衍生物的聚合物可以与含有双羟基基团结构的物质结合，在适当的糖类分子存在下，硼酸与无环二醇形成的苯硼酸酯复合物很容易被解离。糖分子与无环二醇之间的这种竞争机制为开发用于长效循环的葡萄糖响应材料提供了良好的机会(Journal ofControlled Release,2019,305:50-64)。
胰岛素微针比传统的皮下注射给药更能实现长效缓释，但现存胰岛素微针仍存在一些问题，如载药量低、葡萄糖响应能力差、多次循环载体稳定性差，导致降糖时间短及效果差。
发明内容
发明目的：本发明的目的提供一种双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，经皮给药方式大大改善患者依从性，且所用载药系统结构稳定，载药量高，可智能响应血糖水平，促进胰岛素的缓控释放；本发明的另一目的是提供一种双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针的制备方法。
技术方案：本发明的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，所述微针包括背衬层部分和针尖部分，所述背衬层部分由可溶性聚合物溶液制成，所述针尖部分的内部为胰岛素递药系统；所述胰岛素递药系统由苯硼酸酯复合物装载胰岛素和GOx后再经紫外光聚合后获得；苯硼酸酯复合物包括第一聚合物和第二聚合物；其中，羟基可修饰的高分子聚合物接枝含碳碳双键的小分子化合物得到接枝聚合物，所述接枝聚合物经带巯基的双羟基分子修饰后得到第一聚合物，所述接枝聚合物修饰苯硼酸衍生物后得到第二聚合物。
进一步地，背衬层部分的可溶性聚合物溶液为聚乙烯醇(PVA)溶液或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，其中聚乙烯醇的分子量为8200Da-15000 Da，聚乙烯吡咯烷酮的分子量为8000Da-16000 Da。
进一步地，苯硼酸酯复合物为第一聚合物和第二聚合物按照双羟基分子与苯硼酸衍生物小分子的物质的量比为1-3：1混合所得。
进一步地，胰岛素递药系统中胰岛素的载药量为0-34.6％。
进一步地，羟基可修饰的聚合物选自聚乙烯醇(PVA)或葡聚糖。
进一步地，碳碳双键的小分子化合物选自2-(乙烯氧基)乙基甲基丙烯酸酯(VEMA)、2-(乙烯氧基)乙基丙烯酸酯(VEA)、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧-5-基)丙烯酸甲酯(AC)中任意一种。
进一步地，含巯基的双羟基分子修饰，是由含巯基的双羟基结构的小分子通过迈克尔加成反应在含碳碳双键的小分子化合物的双键上部分连接。
进一步地，带羟基的双羟基分子选自巯基甘油(MPD)或1，4-二巯基-2，3-丁二醇。
进一步地，苯硼酸衍生物修饰，是先由含有羧基的小分子通过迈克尔加成反应在含碳碳双键的小分子化合物的双键上修饰部分，其次通过酰胺反应连接具有葡萄糖响应的苯硼酸衍生物分子。
进一步地，苯硼酸衍生物选自对氨基苯硼酸或间氨基苯硼酸。
另一方面，本发明的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针的制备方法，包括以下步骤：
(1)羟基可修饰聚合物接枝含碳碳双键的小分子化合物的制备
将羟基可修饰的聚合物溶在有机溶剂中，加入催化剂，在无水无氧氮气保护的环境中反应一段时间后加入含碳碳双键的小分子化合物，无水无氧反应一段时间后，加入终止剂搅拌一段时间，得到接枝聚合物；
(2)含双羟基分子修饰聚合物的制备
将步骤(1)中制备的接枝聚合物溶于有机溶剂中，氮气保护下加入含双羟基结构的分子，加入催化剂，保持无水无氧反应一段时间后，得到双羟基结构修饰的第一聚合物；
(3)苯硼酸衍生物修饰聚合物的制备
将步骤(1)中制备的接枝聚合物溶于有机溶剂中，加入含羧基结构的分子，再加入催化剂，反应得到含羧基结构修饰的聚合物，将该聚合物溶于溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，然后加入苯硼酸衍生物，通过酰胺反应修饰苯硼酸衍生物，得到苯硼酸衍生物修饰的第二聚合物；
(4)微针的制备
配制可溶性聚合物溶液，作为背衬层溶液，将双羟基分子修饰的第一聚合物溶液和苯硼酸衍生物修饰第二聚合物溶液混合，加入胰岛素和GOx、光交联剂作为针尖溶液。
将针尖溶液加入模具中，保持真空状态一段时间后，补加针尖溶液，离心后固化一段时间；加入背衬层溶液，离心后，保持真空状态一段时间，然后固化、脱模、紫外交联，得到双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针。
进一步地，步骤(1)所用有机溶剂选用无水二甲亚砜(DMSO)或无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，催化剂选用对甲苯磺酸一水合物(PTSA)或苯甲酸或硫酸；步骤(2)和步骤(3)所用有机溶剂选用无水二甲亚砜(DMSO)或无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，催化剂选用三乙胺、六氢吡啶及四级铵碱。
另一方面，本发明提供了上述双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针在治疗糖尿病中的应用。
具体地包括以下步骤：
(1)羟基可修饰聚合物接枝含碳碳双键的小分子化合物的制备：
称取一定量的羟基可修饰聚合物溶在适量溶剂中，加入适量催化剂，在无水无氧氮气保护的环境中反应一段时间后加入含碳碳双键的小分子化合物，无水无氧条件下反应一段时间后得到羟基可修饰聚合物接枝含碳碳双键小分子化合物；
其中，溶剂可以选无水二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等；羟基可修饰聚合物可以为PVA或葡聚糖；含碳碳双键的小分子化合物可为2-(乙烯氧基)乙基甲基丙烯酸酯(VEMA)、2-(乙烯氧基)乙基丙烯酸酯(VEA)、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧-5-基)丙烯酸甲酯(AC)等；催化剂可为对甲苯磺酸一水合物(PTSA)、苯甲酸、硫酸等；PVA与VEMA可按照不同比例得到不同分子量的聚合物。
作为优选，称取一定量的PVA 15000Da溶在适量无水二甲亚砜(DMSO)中，加入适量对甲苯磺酸一水合物(PTSA)催化剂，在无水无氧氮气保护的环境中反应一段时间后加入VEMA，无水无氧条件下反应一段时间后得到PVA-VEMA；
(2)含巯基的双羟基结构分子修饰聚合物的制备；
将一定量PVA-VEMA溶于适量溶剂中，在氮气保护下，加入一定量的含巯基的双羟基巯基结构的物质，再加入适量催化剂，无水无氧条件下反应一段时间后得到修饰的聚合物；
其中，溶剂可选择N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等；含巯基的双羟基结构的物质可以为巯基甘油(MPD)或1，4-二巯基-2，3-丁二醇；催化剂可以为三乙胺、六氢吡啶及四级铵碱等；按照双键与巯基物质的量比值范围为10％-90％；
作为优选，将一定量PVA-VEMA溶于适量无水二甲亚砜DMSO中，在氮气保护下，加入一定量的MPD，物质的量比为1：4，再加入适量三乙胺(TEA)，无水无氧条件下反应一段时间后，在冰乙醚中沉淀出固体，得到MPD修饰的聚合物PVA-VEMA(MPD)；
(3)苯硼酸衍生物修饰聚合物的制备：
将一定量PVA-VEMA溶于适量溶剂中，加入一定量的含羧基的化合物，再加入适量催化剂，反应一段时间得到中间产物，将该聚合物溶于适量溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，然后加入苯硼酸衍生物，通过酰胺反应修饰苯硼酸，得到苯硼酸衍生物修饰聚合物；
其中，溶剂可选择N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等；含羧基结构的物质可以为巯基丙酸、巯基乙酸及丁二酸酐等；催化剂可以为三乙胺、六氢吡啶及四级铵碱等；按照双键与巯基物质的量比值范围为10％-90％；苯硼酸衍生物可选对氨基苯硼酸、间氨基苯硼酸等；
作为优选，将一定量PVA-VEMA溶于适量二甲亚砜(DMSO)中，加入一定量的丁二酸酐，物质的量比值为1：10，再加入适量三乙胺(TEA)，反应一段时间到丁二酸酐修饰的聚合物，该聚合物溶于适量二甲亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，然后加入间氨基苯硼酸通过酰胺反应修饰间氨基苯硼酸，得到苯硼酸衍生物修饰的聚合物PVA-VEMA-COOH(PBA)；
(4)微针的制备：
分别将步骤(2)和(3)得到的聚合物按照双羟基分子与苯硼酸衍生物分子的适量物质的量比混合，加入适量胰岛素和GOx，加入适量光引发剂，以此作为微针针尖溶液。配制一定浓度可溶性聚合物溶液作为微针背衬层溶液。将针尖溶液与背衬层溶液依次加入微针模具中，分别经过离心抽真空后，固化一段时间，脱模。经过紫外照射数分钟，即得到双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针；
其中，双羟基分子与苯硼酸衍生物分子的物质的量比为(1-6)：1；可溶性聚合物溶液可为聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；
作为优选，分别将步骤(2)和(3)得到的聚合物按照巯基甘油与间氨基苯硼酸分子的物质的量比为3：2，加入适量胰岛素、GOx和光引发剂，以此作为微针针尖溶液。配制一定浓度聚乙烯醇(PVA)溶液作为微针背衬层溶液。将针尖溶液与背衬层溶液依次加入微针模具中，分别经过离心抽真空后，固化一段时间，脱模。经过紫外照射数分钟，即得到双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针；
进一步地，对制备的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针进行性能表征，包括力学性能、溶解性、载药量、细胞毒性和体内外药物释放葡萄糖响应性等。结果发现，该透皮微针系统具有良好的力学性能和水溶性，并有较高的载药量。同时对其细胞毒性进行探究发现，透皮微针系统溶解后能被细胞有效摄取，对正常细胞没有造成明显的细胞毒性。另外，由于双层交联双重响应的载药系统装载胰岛素和葡萄糖氧化酶(GOx)，该微针的胰岛素释放行为具有优异的葡萄糖响应和H2O2响应能力。在高血糖小鼠模型上进行动物实验发现，该双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针可以有效降低高血糖水平，持续时间长而且无明显副作用。
本发明所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，克服了胰岛素注射与口服制剂存在的缺点，通过设计与合成新型可降解聚合物材料，形成双层交联双重响应的葡萄糖响应型胰岛素载药系统，将药物包埋于针尖，便捷无痛地控制药物在皮下的释放速率。双羟基分子与苯硼酸衍生物分子形成苯硼酸酯实现第一次交联，装载胰岛素和GOx，利用聚合物上VEMA片段上剩余的碳碳双键进行二次交联，作为微针基质材料，设计并制备了一种可以双重响应血糖水平并长效释放胰岛素的可溶微针。高血糖时，GOx通过催化葡萄糖代谢降低血糖，同时产出H2O2；H2O2和葡萄糖可以和苯硼酸衍生物分子形成二价络合物，使双羟基分子与苯硼酸衍生物分子形成苯硼酸酯(PBA和MPD中邻羟基形成)解离。PBA系统和GOx系统同时作用，使微针释放胰岛素，降低血糖，同时由于两聚合物进行双层交联，提高了载体稳定性，增强了胰岛素在体内的长效循环。体内血糖浓度低时，苯硼酸衍生物分子主要与双羟基分子结合，使胰岛素无法释放，从而不会引起低血糖，达到智能响应体内葡萄糖水平的目的，在糖尿病的治疗方面有潜在的应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)具有良好的生物相容性和快速溶解性，选用聚乙烯醇作为主要原料，安全可靠、价格便宜、使用方便；双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针载入胰岛素和葡萄糖氧化酶GOx后，采用原位光聚合的方法制备为双层交联的胰岛素递送系统，相较于传统的纳米粒子包载法载药量大大提高，有利于实现胰岛素的长效循环。
(2)可智能响应血糖水平，促进胰岛素的缓控释放，通过修饰间氨基苯硼酸和邻羟基基团得到苯硼酸酯交联结构，利用VEMA上双键实现紫外光交联固化。当高血糖时，由于葡萄糖存在邻羟基的结构，可以和PVA-VEMA(MPD)竞争在PVA-VEMA-COOH(PBA)上的结合位点，同时，葡萄糖被葡萄糖氧化酶催化代谢，形成高浓度H2O2环境，H2O2也可以和PVA-VEMA-COOH(PBA)形成二价络合物，PBA系统和GOx系统同时作用，加速载体解离，释放胰岛素，从而发挥疗效，降低血糖。体内血糖浓度低时，PVA-VEMA-COOH(PBA)主要与PVA-VEMA(MPD)结合，使胰岛素无法释放，从而不会引起血糖过低的情况发生，达到智能响应体内葡萄糖水平的目的。
(3)由于载体进行了二次交联，载体结构更加稳定，显著提高葡萄糖响应的可控性和载体稳定性，实现载体多轮循环，胰岛素长效释放。
(4)微针结构完整均匀，机械强度高，且在溶解性等物化性质方面可靠性强，细胞毒性方面表现良好，通过体内外葡萄糖响应性实验验证了微针贴片具有葡萄糖响应性胰岛素释放行为；本发明实现了胰岛素的闭环给药和最小侵袭，为糖尿病的治疗提供了巨大的潜在应用。
附图说明
图1为实施例1中PVA-VEMA的氢核磁图谱；
图2为实施例2中PVA-VEMA(MPD)的氢核磁图谱；
图3为实施例3中PVA-VEMA-COOH(PBA)的氢核磁图谱；
图4为实施例4中微针光学显微镜图；
图5为实施例5中微针力学性能图；
图6为实施例5中微针溶解性能图；
图7为实施例5中检测微针“开关式”葡萄糖响应实验结果图；
图8为实施例5中为微针体内降糖实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
PVA-VEMA的合成，合成路线及过程如下：
精确称取2g PVA-203(0.133mmol)，加入20mL DMSO，搅拌使之溶解。快速加入240mg PTSA(1.26mmol)，继续抽真空一段时间后加入5mL VEMA(0.032mol)，反应过夜后，加入264μL三乙胺结束反应。注意反应全程保证无水无氧状态。反应后的溶液用甲醇透析，旋蒸浓缩后缓慢滴入乙醚中，最后将得到的白色沉淀用水溶解后冻干。测1H NMR得到产物结构。产率为79％。
PVA-VEMA的氢核磁表征见图1，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.93(s,1H),4.79(s,0H),4.66(s,1H),4.46(s,0H),4.20(s,0H),4.14(s,1H),3.93(s,0H),3.33(s,3H),2.14(s,0H),2.00-1.87(m,2H),1.76(s,0H),1.62(s,3H),1.47(s,5H),1.32(s,1H),1.17(s,3H),1.12(s,3H).
实施例2
PVA-VEMA(MPD)的合成，合成路线及过程如下：
称量100mg上述得到的PVA-VEMA(含6个VEMA)(0.00628mmol)于双颈瓶中，加入6mL左右DMSO使之溶解，然后加入9μL 1-硫代甘油(0.0376mmol)以及3-4滴三乙胺，反应24h。注意此反应全程在氮气条件下进行。反应后的溶液用甲醇透析，旋蒸浓缩后缓慢滴入乙醚中，最后将得到的白色沉淀用水溶解后冻干。产率为77％。
PVA-VEMA(MPD)的氢核磁表征见图2，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.93(s,1H),4.79(s,0H),4.66(s,1H),4.52-4.44(m,1H),4.20(s,0H),4.14(s,0H),3.92(s,0H),3.77(s,3H),2.01-1.86(m,2H),1.77(s,0H),1.62(s,3H),1.46(s,4H),1.33(s,1H),1.14(dd,J＝22.1,5.1Hz,4H).
实施例3
PVA-VEMA-COOH(PBA)的合成，合成路线及过程如下：
称量1g上述得到的PVA-VEMA(含4个VEMA)(0.064mmol)，加入8mL左右DMSO使之溶解，然后加入120mg丁二酸酐(1.20mmol)以及100μL三乙胺，反应24h。反应后的溶液用甲醇透析，旋蒸浓缩后用缓慢滴入乙醚中，得到黄绿色沉淀，最后将沉淀用水溶解后，冻干得到PVA-VEMA-COOH，产率为83％。称量100mg(0.00609mmol)上述得到的PVA-VEMA-COOH(含15个-COOH)于圆底烧瓶中，加入10mL左右DMSO使之溶解。加入35mg EDC(0.183mmol)、21.02mgNHS(0.183mmol)后活化一段时间，然后加入21.23mg PBA(0.137mmol)，反应24h。反应后的溶液用甲醇透析，旋蒸浓缩后缓慢滴入乙醚中，最后将得到的黄绿色沉淀用水溶解后冻干。产率为81％。
PVA-VEMA-COOH(PBA)的氢核磁表征见图3，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.93(s,3H),4.74(s,1H),4.66(s,2H),4.48(s,1H),4.19(s,1H),4.14(s,1H),3.93(s,2H),3.76(s,9H),2.55(s,1H),2.14(s,1H),2.00–1.91(m,5H),1.90(d,J＝12.4Hz,1H),1.75(s,1H),1.61(s,18H),1.48(s,11H),1.17(s,8H),1.11(s,8H).
实施例4
双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针的制备
用0.01mol/L的盐酸溶液为溶剂，配制15mg/mL的胰岛素溶液。将胰岛素溶液调至pH值为4-5，加入GOx进行混合。取PVA-VEMA-COOH(PBA)、PVA-VEMA(MPD)分别溶解于水中，分别吸取一定量混合，加入上述配制的胰岛素GOx混合溶液、3％光交联剂混合交联作为针尖溶液。
配制质量含量为20％的PVA-1788溶液，作为背衬层溶液。将针尖溶液加入PDMS模具中，-0.1MPa下抽真空一段时间后，补加针尖溶液，离心后放入37℃烘箱固化。然后加入背衬层溶液，离心并抽真空后，固化脱模。脱模后，将微针放在紫外灯下照射，进行第二次交联。由此制得双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，微针的光学显微镜图见图4。
实施例5
微针性能研究
(1)微针载药量测定
用pH值为2.0的盐酸溶液为溶剂配制含胰岛素2mg/mL的溶液，分别配制胰岛素含量为0μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、9μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、24μg/mL、180μg/mL、240μg/mL的浓度梯度溶液。选定测量波长为562nm，在ABS模式下利用酶标仪测量其吸光度，并绘制标准曲线。
取胰岛素微针贴片3片编号，分别用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释后，在ABS模式下利用酶标仪分别测量其562nm下的吸光度，取平均值，根据标准曲线计算微针中的胰岛素含量。
标准胰岛素溶液浓度与吸光度的线性方程:y＝0.0038x+0.1533，R2＝0.999。三片微针贴片的INS吸光度分别为0.220、0.220、0.217，其平均值为0.219，根据上述得到的线性回归方程计算得：微针贴片中胰岛素的实际含量约为17.3μg/mL。微针中的胰岛素理论含量为50μg/mL，因此，制得的微针的实际胰岛素含量为胰岛素理论含量的34.6％。
(2)微针力学性能
良好的机械性能对于微针克服皮肤屏障，实现有效透皮给药至关重要。利用万能材料试验机进行微针的机械强度测试。首先将MNs贴片(1cm×1cm)固定在万能材料试验机下方铝板上。设置微针针头与铝板之间的初始距离为0.5cm，使万能试验机上方的铝板以0.5mm/min的速度向下进行移动，仪器每0.1s记录位移和瞬时力的大小，从而得到相关的力-位移曲线，见图5。结果显示在固定压缩位移0.7mm的条件下，微针的力学性能非常明显，发生形变，表明此微针具有良好的力学性能。
(3)微针溶解性
为了验证微针在体内具有良好的溶解性，将制备好的微针贴在小鼠背部皮肤，不同时间间隔时取下，通过体式显微镜观察记录微针在体内的溶解情况。微针针尖部分不同时间的溶解情况见图6，微针刺入皮肤5min时尖端开始溶解，45分钟时已经溶解大半，证明该微针在体内具有良好的溶解性。
(4)检测“开关式”葡萄糖响应实验
采用下述公式计算胰岛素在不同时间的累积释放百分率：
其中，V为释放介质体积(模拟高血糖环境，mL)，C为游离的胰岛素浓度(mg/mL)，W为载胰岛素聚合物胶束的质量(mg)，LC为载胰岛素聚合物胶束的载药量(％)。
将MNs@(GOx+insulin)溶于PBS溶液(pH 7.4)中，置于透析袋(12kD)内，分别依次置于葡萄糖含量为0mg/ml、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，37℃、80r/min摇床保温箱释放2h，取样检测，反复测试3次，计算在相同时间不同葡萄糖浓度的释放速率并绘制成曲线，见图7(A)。该图表明胰岛素的释放速率随着受试溶液中葡萄糖浓度从正常血糖逐渐增加到高血糖状态而稳步增加，说明胰岛素的释放具有葡萄糖响应性。
取MNs@(insulin+GOx)溶于PBS溶液(pH 7.4)中，置于透析袋(12kD)内，依次间歇置于葡萄糖含量为1mg/mL、4mg/mL的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，37℃、80r/min摇床保温箱释放2h，取样检测。反复测试5次，计算在相同时间不同葡萄糖浓度的释放速率并绘制成曲线，见图7(B)。该图中观察到脉冲释放模式，表明在高浓度葡萄糖溶液中胰岛素释放速率比正常浓度大，在连续交替的高低浓度葡萄糖环境转换下呈现胰岛素释放“开关”模式。
(5)体内降糖实验
对链脲佐菌素(STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠应用MN-阵列贴片，以评估其治疗Ⅰ型糖尿病的体内表现。将高血糖模型小鼠随机分为五组，每组3只老鼠，分别应用MNs@(GOx+insulin)(胰岛素剂量为80U/kg)、MNs@insulin(胰岛素剂量为80U/kg)、Blank MNs、皮下注射胰岛素(胰岛素剂量为5U/kg)于STZ诱导的成年糖尿病小鼠上，以健康小鼠为对照，进行体内实验。通过尾静脉采集血样(～3μL)，用血糖仪连续监测血糖变化并记录。每隔一段时间取小鼠尾静脉血(～25μL)，用ELISA测定体内胰岛素浓度。血糖变化曲线见图8(A)所示。皮下注射胰岛素在1h内迅速下降到正常值，在接下来的1h内迅速失去控制，用MNs@(GOx+insulin)和MNs@insulin处理的小鼠血糖在1h内迅速降至10mmol/L左右。MNs@insulin组可以维持在正常血糖水平4h左右。MNs@(insulin)组在10h内维持在正常血糖范围(<11.6mmol/L)，随后血糖水平逐渐升高。空白微针组动物血糖无明显下降。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定治疗组小鼠血浆中胰岛素的含量。血浆中胰岛素水平变化曲线见图8(B)所示，应用MNs@(GOx+insulin)治疗的小鼠血浆胰岛素水平持续高于应用MNs@insulin治疗的小鼠至少8h，再次表明负载的GOx在MNs解离和胰岛素释放中的作用。

Claims (9)

1.一种双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，所述微针包括背衬层部分和针尖部分，其特征在于，所述背衬层部分由可溶性聚合物溶液制成，所述针尖部分的内部为胰岛素递药系统；所述胰岛素递药系统由苯硼酸酯复合物装载胰岛素和GOx后再经紫外光聚合后获得；苯硼酸酯复合物包括第一聚合物和第二聚合物；其中，羟基可修饰的高分子聚合物接枝含碳碳双键的小分子化合物得到接枝聚合物，所述接枝聚合物经带巯基的双羟基分子修饰后得到第一聚合物，所述接枝聚合物经带苯硼酸衍生物修饰后得到第二聚合物，其中，羟基可修饰的聚合物为聚乙烯醇。
2.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，背衬层部分的可溶性聚合物溶液为聚乙烯醇溶液或聚乙烯吡咯烷酮溶液，其中聚乙烯醇的分子量为8200 Da-15000 Da，聚乙烯吡咯烷酮的分子量为8000 Da-16000 Da。
3.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，苯硼酸酯复合物为第一聚合物和第二聚合物按照双羟基分子与苯硼酸衍生物小分子的物质的量比为1-3：1混合所得。
4.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，胰岛素递药系统中胰岛素的载药量为0-34.6%。
5.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，碳碳双键的小分子化合物选自2-(乙烯氧基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(乙烯氧基)乙基丙烯酸酯、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧-5-基)丙烯酸甲酯中任一一种。
6.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，带羟基的双羟基分子选自巯基甘油或1，4-二巯基-2，3-丁二醇。
7.根据权利要求1所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针，其特征在于，苯硼酸衍生物选自对氨基苯硼酸或间氨基苯硼酸。
8.权利要求1-7任一所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在干燥氮气气氛中，将羟基可修饰的高分子聚合物溶解在有机溶剂中，保持真空状态一段时间后，加入催化剂，继续保持真空状态一段时间，加入含碳碳双键的小分子化合物，真空反应一段时间后加入终止剂终止反应，得到接枝聚合物；
（2）将步骤（1）中制备的接枝聚合物溶于有机溶剂中，加入含巯基的双羟基结构的分子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含巯基的双羟基结构修饰的第一聚合物；
（3）将步骤（1）中制备的接枝聚合物溶于有机溶剂中，加入含羧基结构的分子，反应得到含羧基结构修饰的聚合物，该聚合物溶于有机溶剂中，加入催化剂与苯硼酸衍生物，通过酰胺反应修饰苯硼酸衍生物，得到苯硼酸衍生物修饰的第二聚合物；
（4）将第一聚合物和第二聚合物溶解于有机溶剂中混合，加入光交联剂溶液混合，以此为针尖溶液；可溶性聚合物溶液为背衬层溶液；将上述溶液加入微针模具中，除去模具中的空气，固化后脱模，取下的微针进行紫外光交联，得到双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针。
9.根据权利要求8所述的双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针的制备方法，其特征在于，步骤（1）所用有机溶剂选用无水二甲亚砜或无水N,N-二甲基甲酰胺，催化剂选用对甲苯磺酸一水合物或苯甲酸或硫酸；步骤（2）和步骤（3）所用有机溶剂选用无水二甲亚砜或无水N,N-二甲基甲酰胺，催化剂选用三乙胺、六氢吡啶及四级铵碱。
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