CN107349175A - 一种负载脂肪褐变剂的微针贴片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载脂肪褐变剂的微针贴片及其制备方法，属于透皮给药技术领域。所述微针贴片，包括基底和立于基底上的微针阵列，微针为由聚合物材料制成的锥形结构，所述聚合物材料为透明质酸、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物或两者的混合物，所述脂肪褐变剂通过与聚合物材料共浇注的方式负载在微针的针体内。本发明提供的微针贴片可直接皮下给药至皮下脂肪，经短暂的拇指按压，载药微针即可嵌入皮肤给药，操作简便，避免了皮肤不适和刺激。本发明优选了聚合物种类，未改变药物本身的化学结构和药效，结合制备过程中离心操作，微针阵列中药物均匀分布，提高微针制剂的载药量；此外，通过调整聚合物材料组成可以实现对释放动力学的调控。

Description

一种负载脂肪褐变剂的微针贴片及其制备方法
技术领域
本发明涉及透皮微针阵列给药设备技术领域，具体涉及一种负载脂肪褐变剂的微针贴片及其制备方法。
背景技术
久坐的生活方式和过多摄入的高热量食物助长了肥胖的日益流行。人类脂肪组织分为白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪组织(brown adiposetissue，BAT)。WAT由几乎没有线粒体的大单房细胞组成，通过甘油三酯储存能量；而BAT则是由小多房细胞组成，细胞内含有大量线粒体，并线粒体内膜上的解偶联蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)产热来消耗能量。简单而言，BAT富含线粒体，可以自我“燃烧”脂肪，被称为“好脂肪”；而WAT缺乏线粒体，无法自主动用脂肪，被称为“坏脂肪”。
脂肪细胞增生和脂肪细胞过度肥大产生的大量WAT，过量的白色脂肪组织是导致如II型糖尿病、高血压、冠心病、中风和某些类型的癌症(例如，结直肠癌)等疾病的重要因素。世界卫生组织的统计数据显示，每年全球至少有280万人死于肥胖引起的并发症，全球约3580万人因超重或肥胖引起健康问题。因此，预防和治疗肥胖的需求日益增大。
研究者为寻求有效的抗肥胖药物而付出了巨大的努力。截至目前，仅有少数药物被FDA批准可作为饮食和运动减肥外的辅助疗法而进行销售。目前治疗肥胖药物的作用机理主要为抑制食欲(lorcaserin，Naltrexone和安非他酮)或减少脂肪的胃肠道吸收。一些化合物(如β3-adrenergic agonist,bone morphogenetic protein 7,fibroblast growthfactor 21,apelin等)已被证明可实现WAT褐变，具有良好的预防和治疗肥胖的效果。
然而，利用口服或静脉注射等传统给药方式存在吸收差、易被血液稀释及被血液中一些酶降解等问题。此外，这些常规给药方式由于为全身给药，所需剂量大，往往会产生全身性副作用或在非靶向器官产生积累。即便是FDA批准使用的药物依靠口服摄入也无可避免的会产生副作用。例如，Lorcaserin可能会引起头痛和抑郁；Orlistat具有显著的GI副作用。这导致一些曾允许销售的治疗肥胖药物由于具有严重副作用而被撤回。例如，fen-phen药物作为组合食欲抑制剂可能引起肺压升高、产生心脏瓣膜问题。抑制食欲的药物Sibutramine可能会引发严重的心血管问题。
促进白色脂肪自我重塑使其转变成棕色脂肪是治疗肥胖的有效手段。以前人们仅仅将脂肪组织认为是存贮多余能量的仓库，但现在科学家们已经公认脂肪是最大的内分泌器官，通过分泌多种信号分子(脂肪因子)和应对其他组织产生的各种代谢因素(如胰岛素)在人体代谢中起着核心作用。肥胖不仅表现出异常的细胞因子，也是游离脂肪酸、炎症细胞因子和活性氧等许多有害物质的主要来源。与白色脂肪组织不同的棕色脂肪组织可促进能量消耗，燃烧脂肪。虽然BAT在成人中含量较低，但已证明WAT中存在类棕色脂肪细胞(褐色细胞)，尤其是在占全身脂肪含量85％的皮下WAT中这一现象尤其明显。研究表明，白色脂肪细胞转化为褐色细胞，可提高身体能量消耗。因此，促进白色脂肪自我重塑使其转变成棕色脂肪(褐变，减少巨噬细胞浸润，平衡脂肪细胞分化，增强血管化等)是治疗肥胖的有效手段和新思路。
然而，由于缺乏脂肪细胞特异性表面标志物，使用常规的路线将药物输送到脂肪组织十分困难。尽管使用传统的注射针可对皮下脂肪组织(例如人体主要的WAT在腹部)直接进行注射是可能的，但长期注射过程痛苦、容易引起感染。因此，寻求安全有效的肥胖治疗策略势在必行。对白色脂肪密集部位进行靶向、精准、直接给药进而实现低剂量给药、降低药物在非脂肪器官的副作用，并实现简单便捷、易操作的家庭长期肥胖控制目前仍存在巨大的挑战。
微针(含微针阵列)透皮给药作为一种新型透皮给药方式，集皮下注射给药方式和透皮贴给药的优点于一体。微针凭借其微米尺度锋利的针尖在皮肤上首先刺破角质层，形成一个到达表皮层甚至上部真皮层的通道，使药物到达表皮层或上部真皮层，进而被相关组织吸收，不仅无痛微创，而且减少人体血药浓度出现峰谷的变化、降低给药误差、避免胃肠道的毒副作用和肝脏的首过效应、提高了生物利用度。此外，微针给药时患者可自行给药，方便安全。因此，微针透皮给药技术从开始出现就获得了广泛的关注。
伴随着当前微加工技术的快速发展，微针透皮给药技术越来越受到关注和重视。目前已经出现了以硅、氮化硅、玻璃、金属、高分子聚合物等为基质材料的微针。硅微针制作工艺成熟、应用广泛，但与人体的生物相容性差、价格昂贵、质地较脆、工艺复杂；金属材料机械强度好，不易折断，但存在生物相容性一般，工艺复杂，加工成本高等缺点。此外，在插入皮肤过程中金属、硅和剥离微针存在自身发生断裂的可能性。基于以上原因，当前对微针基质的研究热点为生物相容性良好的生物可降解的聚合物材料。微针针尖插入皮肤后，微针可自行降解而无残留物，解决了微针一旦断裂于皮肤内难以处理的问题。
生物可降解聚合物微针的基质材料应同时具备以下几个条件:①加工成型后应有足够的机械强度可以穿透角质层，保证所携药物的顺利渗入。②生物可降解，无长期残留物。③具有良好的生物相容性，不能破坏皮肤内蛋白质的固有结构。④具有维持药物缓慢释放，在一定时间内维持药物治疗的有效浓度。⑤不影响药物的生物活性。⑥使用简单安全，即使在无医疗训练情况下使用也无针尖或生物有害物质残留，不会给患者带来危害。
麦芽糖、葡聚糖、糊精、羧甲基纤维素、支链淀粉、半乳糖、聚乳酸、聚乙醇酸、硫酸软骨素、聚对二氧环己酮、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)等都可用作生物可降解微针的基质，但是糖类的机械强度不高，在高湿度条件下不稳定，易变黏潮解。聚乳糖和聚乙醇酸具有较高的熔融温度，其在制备微针时需要较高的温度，因此不适用于高温敏感的药物负载，并且具有明显的酸催化特性，微针降解过程中会产生酸性物质，不利于保持敏感药物活性，因而限制了其在控释制剂领域中的应用。硫酸软骨素不但生物相容性良好，而且其降解产物是人体关节腔等部位的润滑液，更适合关节部位或眼部的局部治疗。聚对二氧环己酮的结晶度较高，可使材料钢化，力学性能良好，适用于骨固定装置骨钉。透明质酸(HA)又称玻璃酸，是体内重要的生理活性物质，降解速度快，半衰期为1-2天。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由两种单体-乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，且可通过改变聚合物中乳酸及羟基乙酸比例、聚合物枝状或者星型、聚合物分子量等改变溶解和降解性能。PLGA已在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。但需少量有机溶剂溶解。
然而，尽管已经对聚合物载药微针开展了一定研究，但载药聚合物微针(含微针阵列)透皮给药方法不具有部位和药物普适性，必须针对给药的部位、给药的药剂特点等方面对聚合物微针结构、组成进行适应性的设计，并实现药物释放速度与药物半衰期等相匹配的释放，才可在指定组织保持药物活性并进一步实现药物药效。此外，目前尚无用于肥胖预防和治疗的微针透皮给药研究。
发明内容
针对当前肥胖预防和治疗中的紧迫需求，本发明提供了一种负载脂肪褐变剂的微针贴片，通过集成到一次性贴片上的聚合物微针阵列中负载脂肪褐变剂，透皮给药实现皮下WAT的直接、局部给药，有效促进白色脂肪棕化，在无需日常饮食控制的情况下抑制脂肪和体重增加。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种负载脂肪褐变剂的微针贴片，包括基底和立于基底上的微针阵列，微针为由聚合物材料制成的锥形结构，所述聚合物材料为透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或两者的混合物，所述脂肪褐变剂通过与聚合物材料共浇注的方式负载在微针的针体内。
人体白色脂肪组织主要分布于腹部及腹股沟，本发明结合该给药部位的特点选择匹配的可降解聚合物。透明质酸(HA)是广泛分布在软结缔组织细胞外基质中的一种线性大分子酸性粘多糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成，是构成皮肤、玻璃体、软骨组织的重要组分，因此透明质酸用于制备本发明的微针。作为优选，所述透明质酸的分子量为<10kDa。但透明质酸溶解速度快、降解速度快，不适于需缓慢释放的应用情况，因此，透明质酸可以与半衰期短的药物组成，达到快速释药的目的。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的降解产物是乳酸和羟基乙酸，是人体代谢途径的副产物，因此，对人体不会有毒副作用，适合应用到本发明。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。PLGA溶解速度慢，可以与半衰期长的药物组合。
所用PLGA原料包括长链聚乳酸-羟基乙酸(分子量76,000-116,000Da)、短链聚乳酸-羟基乙酸(分子量7000-17000Da)或葡萄糖核的星型聚乳酸-羟基乙酸(分子量不高于15000Da)。
长链及短链聚乳酸-羟基乙酸的结构式如式(Ⅰ)所示：
其中短链聚乳酸-羟基乙酸x＝97-236，y＝122-298；长链聚乳酸-羟基乙酸x＝1055-1611，y＝1461-2230；
葡萄糖核的星型聚乳酸-羟基乙酸结构式如式(Ⅱ)所示：
其中m＝10-125，x＝1-211，y＝1-268。
作为优选，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物为长链聚乳酸-羟基乙酸、短链聚乳酸-羟基乙酸或星型聚乳酸-羟基乙酸中任意两种以质量比1:1复配的混合物。
此外，结合透明质酸和PLGA溶解速度不同的特点，将两者进行复合，控制溶解和药物释放速度，满足本专利预防或治疗肥胖应用的各种要求。
作为优选，所述聚合物材料为透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物以质量比1:99～99:1的混合物。
目前预防或治疗肥胖的药物分为食欲抑制剂、消化吸收阻滞剂、降糖药物(双胍类、α-糖苷酶抑制剂、GLP-1和DPP-4抑制剂)和脂肪褐变剂。脂肪褐变剂是一类代谢刺激剂，可促进白色脂肪褐变，促进褐色脂肪组织的产热过程，促进体内的脂肪和糖原的分解和氧化。与其他几类药物相比，可以在不影响摄食量的情况下，降低体重和体脂。
本发明选用的脂肪褐变剂包括肾上腺激素(adrenergic hormones)、甲状腺激素(thyroid hormones)、β3肾上腺素能受体激动剂(β3-adrenergic receptor agonist)、PPAR激动剂(PPARγagonist)，E2前列腺素及其类似物(prostaglandin E2and itsanalogues)，二硝基苯酚(dinitrophenol)，成纤维细胞生长因子21(fibroblast growthfactor 21)，骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7)，Apelin、脂联素、microRNAs。
上述脂肪褐变剂目前已被证明具有脂肪褐变能力，腹腔注射可抑制肥胖。截至目前，尚无透皮给药的研究。
由于微针阵列是对皮下WAT直接、局部给药，因此所需药物浓度低但生物利用度高，在保证药效的基础上降低成本及可能有的副反应，药物浓度应尽可能低。作为优选，每个微针中脂肪褐变剂的质量百分比含量为0.1～50％。
微针阵列中药物均匀分布，与空心微针及涂覆型微针相比，本发明药物均匀分布的聚合物微针载药量高。
人体的皮肤有三层组织，角质层、活性表皮层和真皮层。其中，最外层的角质层厚度为10～40μm，由致密的角质细胞组成，是药物输送的主要障碍；表皮层厚度为50～100μm，含有活性细胞和少量的神经组织，但不含血管；真皮层是皮肤的主要组成部分，含有大量的活细胞、神经组织和血管组织，厚度约为2000μm。为了保证高的渗透性且在微针刺入时不产生疼痛感，微针应刺透皮肤角质层到达表皮层，进入部分真皮层。因此，微针阵列的微针总数、针高、间隔、底宽需综合考虑，以实现拇指按压刺入皮肤及尽量少产生痛感。
作为优选，所述微针呈四角锥形，针体高度为100～900μm，高度与底边宽度之比为2～2.5，相邻微针之间间隔100～900μm。通过优选发现基于金字塔式的锥形微针阵列、高与底比例为2、间距为700μm适于最佳的透皮效果。进一步优选，采用10×10锥形阵列，微针针高600μm，底宽300μm。
基底贴片的作用是为微针阵列提供支撑，使得通过拇指按压的方式，即可实现刺入皮肤。治疗的药物分子只加载在微针针体内，无需大面积的支持基底，这有效降低了昂贵药物的浪费。所述基底为由透明质酸制得的薄片，厚度为1～1.5mm。透明质酸生物相容性好、价格低廉。
本发明微针贴片的使用方法：将负载脂肪褐变剂的一次性载药聚合物微针阵列贴片贴于皮肤上，通过拇指挤压将聚合物微针刺入皮肤，聚合物微针溶解后，释放药物实现预防或治疗肥胖的作用。微针刺入后，可直接去除外留贴片。
本发明提供了所述的微针贴片的制备方法，包括：
(1)将脂肪褐变剂和聚合物材料溶于溶剂中，制得模液；
(2)将所述模液注入具有微孔阵列的模腔内，离心让模液填满微孔，除去多余的溶液，干燥除去溶剂，形成微针；
(3)将不含脂肪褐变剂的聚合物材料溶液填满模腔，离心后干燥，形成基底。
本发明利用聚甲基硅氧烷(PDMS)微孔模具制备载药聚合物微针，PDMS微孔模具通过将PDMS与固化剂甲基二甲基硅氧烷以质量比10:1混合倾倒到不锈钢模具中，注塑后真空脱气下于70℃固化2-5小时制得，所述不锈钢模具内含1个或多个锥形微针阵列阴模。制备微针时，在PDMS微模具中加入含药物的透明质酸或聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)或HA-PLGA混合物后离心，室温干燥一定时间。
本发明采用的聚合物均有良好的成膜性，因此制备过程无紫外线照射和加热等易于破坏微针结构、药物组成及活性的过程。
步骤(1)中，本发明依据聚合物材料的特点采用相应的溶剂、药剂以及配比关系，如透明质酸的配制介质为蒸馏水，透明质酸的浓度为0.05～2.0g/mL，透明质酸成膜性好，但过低浓度时所得微针机械强度低，过高浓度时易于吸潮，优选0.5g/mL，研究表明：这一浓度条件下制备的微针机械力为每针0.06N，足以刺破皮肤，同时具有抗压缩能力。药物与透明质酸的质量比为0.001-0.5:1，优选0.005:1(2.5mg:0.5g)。
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的配制介质为二甲基甲酰胺。PLGA的浓度为0.05～1.0g/mL，优选0.2g/mL；药物与PLGA的质量比为0.01-0.5:1，优选0.05：1(10mg:200mg)。
所述HA-PLGA混合物的复配方案中，首先保证HA、PLGA及药物溶解，配制介质为水-二甲基甲酰胺混合液，二甲基甲酰胺百分含量为1％-99％，药物与HA-PLGA混合物的质量比为0.001-0.05:1。
上述两种聚合物材料不仅成膜性好，而且与脂肪褐变剂的相容性好，同时不影响脂肪褐变剂发挥正常药效。本发明微针透皮给药与直接腹腔注射相对比，透皮给药的药物使用量仅需腹腔注射给药五分之一，即可起到相同的抗肥胖效果。证明两种聚合物与脂肪褐变剂的相容性好，同时不影响脂肪褐变剂发挥正常药效。
本发明采用离心的方式将聚合物溶液快速充满PDMS模具，且药物均匀分布，离心转速和时间主要从能耗和易于操作角度考虑。所述离心转速为1000-20000rpm，优选4000rpm；离心时间为1-20min，优选3min。室温下干燥4-18小时，优选12小时。
步骤(3)中，为有利于快速形成稳定、机械强度好的柔性基底贴片，在微针阵列底部加入浓度为0.05～2.0g/mL的聚合物材料溶液，成膜形成基底。作为优选，加入透明质酸溶液(0.5g/ml)，二次离心(4000rpm，3min)，室温下干燥12小时后，将微针从模具中剥离下来后于4℃储存。为了实现拇指按压透皮的便利性，微针与基底贴片垂直，优选的基底贴片尺寸约为6×6mm。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的微针贴片负载有脂肪褐变剂的微针阵列可直接皮下给药至皮下脂肪，经短暂的拇指按压，载药微针即可嵌入皮肤给药。由于微针不用拔出，避免了皮肤不适和刺激，与服用药片、痛苦的静脉注射，或频繁就诊相比，患者可以方便、有效地使用微针贴片，在家中即可实现肥胖控制或其他代谢性疾病治疗。
(2)本发明优选了聚合物种类，透明质酸和PLGA与脂肪褐变剂相容性好，结合制备过程中离心操作，微针阵列中药物均匀分布，提高微针制剂的载药量；此外，通过调整聚合物材料组分可以实现对释放动力学的调控。
(3)本发明微针透皮给药未改变药物本身的化学结构和药效，与传统注射给药方式相比，本发明提供的微针贴片具有低剂量给药和局部靶向给药的显著优势，避免常规全身给药导致的药物失效或严重的副作用等问题，利用本发明微针阵列贴片，无需日常饮食控制即可抑制白色脂肪组织和体重的增加，可预防或治疗肥胖。
附图说明
图1可溶性聚合物载药贴片透皮给药皮下脂肪组织的示意图。
图2透明质酸微针贴片的表征。[A]负载Cy5或药物的微针贴片的制备过程示意图。[B]透明质酸微针贴片图片。[C1-C3]不同角度下拍摄的负载Cy5微针的亮场及共聚焦显微镜照片。标尺为100μm。[D]未负载药物和药物负载微针贴片作用力与位移关系图。[E1][E2]分别为机械负荷前、后透明质酸微针的SEM照片，标尺为100μm。
图3药物负载透明质酸微针的体外和体内溶解释放。[A]负载Cy5的透明质酸微针贴片在磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4)和在小鼠血清中的体外释放曲线。[B]负载CL316,243的透明质酸微针贴片在猪皮上的释放曲线。
图4为药物负载透明质酸微针的体内溶解释放。[C1][C2]分别为猪皮上负载CL316,243的透明质酸微针贴片及去除透明质酸贴片后的照片，标尺为2mm。[D][E]分别为负载CL316,243的透明质酸微针及微针插入皮肤后支持贴片的SEM照片，标尺为200μm。[F1][F2]分别为微针贴片给药前后的皮肤切片染色显微镜照片。
图5为药物负载透明质酸微针的体内分布情况。[G][H]分别为对照组及负载CL316,243的微针给药2小时和18小时Cy5的体内荧光照片。[I]为负载Cy5的微针贴片处理2小时的18小时的内脏及皮下脂肪荧光成像照片。[J1][J2]分别为腹腔注射和微针给药Cy5后小鼠内脏及皮下脂肪的荧光强度。
图6[A1]为小鼠给药部位示意图，[A2-A4]为给药方式图片。
图7为载药透明质酸微针贴片抗肥胖的体内实验。小鼠进行连续5天处理。对照组采用未载药微针贴片，实验组采用载药微针贴片。[E]为不同处理方法小鼠的总腹股沟WAT，附睾WAT和肩胛间BAT的图片。[F][G]为不同处理方法器官及脂肪组织占体重的分数。
图8为不同处理的小鼠腹股沟WAT褐变标记物表达情况。[H]为Western印记结果。[J1-J4]为UCP1,COX1,PGC1α,aP2的免疫印迹结果。
图9为透皮给药和注射给药CL316,243的抗肥胖效果。[A]小鼠进行5天2.5μgCL316,243或 0.5μg T3的注射后，总腹股沟WAT，附睾WAT和肩胛间BAT的照片。[B1]体重及[B2]器官与体重的比值。
图10为小鼠连续5天注射磷酸缓冲液或高剂量的CL316,243(12.5μg)或利用负载CL316,243微针贴片透皮给药(共100微针，～2.5μg药物)的比较图。[C]为给药部位示意图。[D1-D2]为器官与体重的比值。[E]为总腹股沟WAT，附睾WAT和肩胛间BAT的照片。
图11为体表温度变化图。[F]为红外热成像分析结果。[G]为未用药的对照组、高剂量注射及低剂量微针贴片组的温度比较图。
图12为不同给药处理小鼠的腹股沟WAT染色后照片。[H1]为对照组，[H2]为高剂量注射，[H3]为低剂量微针给药。
图13为不同处理的小鼠中腹股沟WAT棕变效应。[I]为Western印记结果。[J1-J4]为UCP1,COX1,PGC1α,aP2的免疫印迹结果。
图14为PLGA微针贴片的表征。[A]基于长链、具有葡萄糖核的枝状PLGA的药物传递系统示意图。[B]负载Cy5的PLGA微针贴片的亮场和共聚焦显微镜。[C]负载Cy5的PLGA微针贴片在磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4)中的体外释放。[D]负载Cy5的PLGA微针贴片的机械性能。[E][F]分别为负载CL316,243的PLGA微针贴片插入猪皮前后的SEM照片。[G][H]猪皮中插入单根微针及留有插入痕迹的染色猪皮亮场照片。
图15为负载CL316,243的PLGA微针贴片抗肥胖的体内实验，小鼠进行25天观察，每周给药2次。[A]脱毛部位进行微针处理0天及5天的照片。[B]小鼠经微针贴片处理0天及5天的荧光照片。[C]不同给药处理的小鼠平均体重增长图。[D]小鼠的日均进食量。[E][F]总腹股沟WAT，附睾WAT和肩胛间白色脂肪组织的照片及器官占体重的比值。[G]为红外热成像分析结果。[H]为体表温度变化图。
图16为负载CL316,243的PLGA微针贴片致饮食诱胖小鼠白脂肪棕化的结果。[A1][A2]不同给药处理小鼠的腹股沟WAT染色后照片。[B1-B5]UCP1,COX1,PGC1α,aP2的免疫印迹结果。[C-G]不同给药处理小鼠血清中胆固醇、游离脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、胰岛素的定量结果。
图17[A]为负载T3的微针贴片及注射T3的体内药动力学曲线。[B]不同处理小鼠的平均体重。[C][D]T3处理及对照组小鼠血清中T3和TSH水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实验材料：所用小鼠为C57BL/6J小鼠。透明质酸、CL316,243、T3、长链PLGA(PLGARG756S,Poly(D,L-乳酸-共-羟基乙酸)75:25,分子量76,000-116,000)、短链PLGA(PLGARG502,Poly(D,L-乳酸-共-羟基乙酸)50:50,分子量7000-17000)、葡萄糖核的星型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA 5arm star)15000购自Sigma-Aldrich。
预防或治疗肥胖的应用通过小鼠实验得以证实。所有数据采用t检验进行验证分析，结果以平均值表示。所有的实验结果均使用至少四个不同的样品所得平均数据。置信区间设为P值<0.05。对脂肪组织的评价为总腹股沟白色脂肪组织(lgWAT)、附睾白色脂肪组织(EpiWAT)和肩胛间棕色脂肪(BAT)。
PDMS微模具通过将PDMS(PDMS与固化剂甲基二甲基硅氧烷质量比为10:1)倾倒到不锈钢磨具中(10×10锥形阵列，共100微针，高600μm，间隔700μm，底宽300μm)，真空脱气下于70℃固化2小时制得。
实施例1选用的聚合物为透明质酸(HA)，选用的脂肪褐变剂活性药物为β3肾上腺素能受体激动剂CL316,243。微针贴片给药模式如图1所示。
1、一种负载脂肪褐变剂的一次性载药聚合物微针阵列贴片的制备
微针制备如图2A所示。在PDMS微模具中加入含药物的透明质酸溶液(0.5g透明质酸溶于1ml蒸馏水，加入2.5mg CL316,243)后，离心(4000rpm,3min)，室温下干燥12小时。
基底贴片通过在微针阵列底部进一步制备透明质酸层制得。在微针阵列底部加入透明质酸溶液(0.5g/ml)，二次离心(4000rpm,3min)后，室温下干燥12小时后，将微针从模具中剥离下来后于4℃储存。制备好的微针照片如图2B所示。
图2(C1-C3)为同时负载药物和荧光染料Cy5微针贴片的荧光显微镜照片，可以看出Cy5均匀分布在微针中。图2D中微针力学性能表征表明，每根微针可承受的力均超过刺破皮肤所需力。这一结果保证了通过拇指按压可以实现微针的刺皮效果。图2(E1)为微针进行力学性质测定前的扫描电镜图，可以看出微针阵列具有锥状结构，图2(E1)为插入后并去基底贴片剥离后微针的扫描电镜图，可以看到微针根部的断裂。微针的力学性质可保证刺入皮肤350um而不断裂。
2、预防或治疗肥胖的应用
将一次性载药聚合物微针阵列贴片贴于小鼠皮肤上，聚合物微针溶解后，释放药物实现预防或治疗肥胖的作用。
3、微针阵列贴片的性能参数分析
β3肾上腺素能受体激动剂CL-316243能促进白色脂肪组织的脂解，也能刺激棕色脂肪组织的非颤栗性产热，抑制脂肪细胞的分化，并能诱导白色脂肪组织中出现棕色脂肪细胞，从而消耗储脂，起到抗肥胖作用。预防或治疗肥胖的作用通过饮食诱导肥胖的小鼠实验模型证明，与对照组相比，皮下给药组小鼠脂肪组织质量减小，血清学相关参数变化作为辅助评价手段。
3.1微针中负载药物的有效释放是实现治疗的前提，通过体外和体内实验分析药物释放。
3.1.1体外药物释放：在上述制备方法中，在加入药物的聚合物溶液中同时加入绿色荧光染料Cy5，通过荧光染料Cy5信号考察体外药物释放。
具体分析方法：将负载Cy5的微针贴片放入磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4)或小鼠血清(37℃)中。在37℃进行测定。每隔0～2分钟取样，利用荧光光谱分析。激发波长为633nm，发射波长为660nm。
结果如图3A所示。由于透明质酸可以快速溶解，Cy5染料分子可在磷酸缓冲液中快速释放，半衰期τ约为3.5秒。在鼠血清中也可快速释放，半衰期τ约为5.6秒。
3.1.2体内药物释放：将负载CL316,243的微针贴片插入猪皮肤内，在不同时间(0-4min)，测定微针释放进入皮肤的药物量，绘制体内释放曲线。
进入皮肤的药物量通过初始药物量减掉微针内残留药物量得出，微针内残留药物量通过将微针拔出然后溶于PBS缓冲液(pH 7.4)得出；皮肤中残留的药物量还可通过将刺破部分皮肤用磷酸缓冲液浸泡提取得到。
抽提出的CL316,243利用反相液相色谱分析。色谱柱为Agilent Poroshell120EC-C18，流动相为水:甲醇体积比80:20,流速为0.5mL/min，于230nm处进行紫外检测，外标法定量。
结果如图3B所示，当一个微针贴片通过拇指按压(～1.9N)刺破猪表皮时，微针负载的CL316,243也可以迅速释放，此过程半衰期约为～8.6秒。
由于表皮和真皮组织比较厚，且皮下脂肪丰富，猪皮与人体皮肤结构接近，因而被广泛用作皮肤模型。小鼠的处理部位为腹股沟位置，这一位置是啮齿类动物的主要皮下脂肪库，脂肪松弛附着在皮肤下面。图4(C1-C2)刺皮实验结果，证实透明质酸微针可以在2分钟内快速溶解而没有无明显皮肤红斑、肿胀及感染。
图4DE分别为透皮前后微针的扫描电镜图。负载CL316-243的透明质酸基微针贴皮2分钟后，皮肤穿刺效果良好，微针完全溶解。显然，利用本发明微针，治疗药物可快速、充分传递进入皮肤。
利用皮肤冷空切片成像分析微针插入情况。皮肤标本用4％的多聚甲醛固定过夜后利用PBS洗涤，随后浸泡在30％的蔗糖溶液冷冻保存的组织24小时。嵌入FSC22冷冻介质后，得到10μm厚的冰冻切片。所得皮肤切片最后用苏木精和曙红染色，并用配备了数码相机的倒置显微镜采集图像。图4(F1-F2)皮肤组织检查显示～300微米的深度已经插入真皮层。
3.2利用活体成像系统研究微针贴片溶解后Cy5的生物分布
对经未负载和负载Cy5的透明质酸基微针贴片处理5分钟的小鼠进行荧光成像处理。
微针贴片贴在小鼠左侧或右侧腹股沟位置，5分钟后去除贴片并将小鼠进行安乐死后解剖，考察皮下插针处WAT及其他内脏中的Cy5分布。为研究皮下给药与腹腔注射的药效区别，实验组采用微针给药，对照实验中，对老鼠进行腹腔注射Cy5(1μg溶于50μl PBS)。实验组和对照组老鼠解剖得到的皮下WAT及主要内脏肝、心、肾、肺用于荧光成像。
结果如图5G所示，微针给药1小时时荧光强度在给药皮肤区域强，且大多数的Cy5由于局部扩散仅积累在插入位点(腹股沟WAT)附近，并通过循环到达肝。如图5H所示，在微针给药6小时内皮下WAT插入点附近的Cy5分子会持续累积。如图5I、5(J1-J2)所示，微针给药2小时和18小时时，在心脏，头部和颈部等器官除没有检测到荧光信号，胃和肠仅具有食物等产生的本底荧光。然而，注射Cy5小鼠的体内分布与本发明的皮下给药形成鲜明对比，注射2小时和18小时时，大部分Cy5分布在肝脏和肾脏，导致肝脏代谢和肾脏清除。因此，局部扩散和经皮递送的药物分子积累可视为靶向皮下WAT治疗肥胖的有效方法。
3.3采用小鼠实验考察载药微针的抗肥胖效果
(1)对正常饮食饲养的小鼠给予微针给药
将C57BL/6J小鼠(7–8周龄的雄性)进行正常饲养(光照12小时/黑暗12小时，21℃下生长)，饲养过程中水和饮食采用正常标准。
利用4–5只小鼠进行平行测定得出每次测定的平均数据。随机分为三组：第一组，所用微针贴片为药物负载的微针贴片(贴片中的微针里分别负载～2.5μg CL316,243)；微针贴片给药的每日剂量为2.5μg CL316,243(～0.1毫克/公斤/天)。药物均溶于100μl PBS中，微针中负载CL316,243的量通过HPLC或酶联免疫分析法(ELISA)进行准确测定；第二组，为考察药物的影响，以未负载药物的贴片作为对照。第三组，为比较经皮给药或腹腔注射两种不同给药方法对药物的输送效率，对小鼠进行每日大剂量腹腔注射cl316243(0.5毫克/公斤/天)。
将小鼠分组后连续5天每天进行皮下给药。微针给药方式如图6(A1-A4)所示，仔细剃掉腹股沟区的鼠毛(左下或右背外侧区，靠近后肢处)，将微针贴片贴在暴露区域的左侧或右侧，保留5分钟让微针完全溶解。利用红外热像仪测定经不同处理老鼠的体表温度用于反映小鼠体温。
5天后，通入致命剂量的二氧化碳对小鼠进行安乐死。测量体重后，将腹股沟WAT(IgWAT)、附睾WAT和肩胛间BAT脂肪组织分别切出并称重。
图7E和F显示，用药组(0.1毫克/千克/天)小鼠的腹股沟左右侧的白色脂肪显著减少。尽管微针给药仅在腹股沟左侧或右侧一侧给药，与未给药的对照组老鼠对比，两侧腹股沟处的白色脂肪的体积均减小。此外，CL316,243处理的小鼠表现出显着降低的附睾WAT(腹腔内脏脂肪)，提示经皮释放CL316,243具有全身抗肥胖作用(图7，E和F)。与负载CL316,243的微针贴片相比，负载T3的药物贴片仅能使作用方向的白色脂肪减少，而不能使未作用位置的白色脂肪减少(图7，E-G)。
众所周知，β3-肾上腺素能受体激动剂和T3激素能促进白色脂肪棕化，表达UCP1(产热，棕色脂肪细胞特异性蛋白)、COX1(线粒体生物合成标记)、PGC1α(转录因子必不可少的产热的棕色特异基因的表达)及aP2蛋白质。免疫免疫印迹分析脂肪组织中UCP1,COX1,PGC1α,aP2，操作如下：在4℃下经涡流分散后离心收集组织上清液，利用二辛可宁酸测定蛋白质浓度。每个样品经12％SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上。膜用封闭缓冲液在室温下封闭2小时后与一抗(1:200-400稀释，室温结合12小时)特异性结合后，用含吐温的Tris缓冲液(TBST)清洗3×15分钟，随后与辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000–4000稀释；室温反应6小时)。随后用TBST清洗3×15分钟。蛋白条带用成像系统检测。所用抗体为UCP1(sc-6529),aP2(sc-18661),PGC-1α(sc-13067),COX1(sc-23982),及actin(sc-1616)。抗UCP1抗体为PA1-24894。
图8H、J1-J4的结果表明，CL316,243的微针贴片处理过的小鼠腹股沟左右两侧脂肪组织中上述活性蛋白表达至均增加，而T3微针贴片处理过的小鼠仅用药部分白色脂肪组织中活性蛋白的表达增加。
图9A和B1、B2所示，与微针给药方法相反，采用相同剂量的CL316,243(0.1毫克/公斤/天)经腹腔注射不会显著改变脂肪组织的重量。只有当腹腔注射剂量5倍提升后，才能达到类与低剂量微针皮下给药相同的效果。
与微针经皮给药相比，相同剂量的CL316,243腹腔注射(0.1毫克/千克/天)对脂肪组织重量的改变可以忽略不计。
如图10C、10(D1-D2)和10E所示，只有当注射剂量提高5倍是，才可以有类似的效果。
图11F和G结果表明，腹腔注射和低剂量的微针透皮给药均导致体表温度升高，其中至少部分是由于脂肪组织转化为能量消耗状态(褐变)(如图12所示)。
图13I和J1-J4两种给药方式均使褐变标志物UCP1,COX1和PGC1a含量增加。这一结果证明，微针给药可以在更低的剂量下，实现更好的效果，从而降低或排除了高剂量时β肾上腺素能激动剂对心脏、血压等的副作用。
实施例2选用的聚合物为PLGA，选用的脂肪褐变剂活性药物为β3肾上腺素能受体激动剂CL-316243。
1、一种负载脂肪褐变剂的一次性载药聚合物微针阵列贴片的制备
将含药物的PLGA溶液(200mg PLGA溶于1ml二甲基甲酰胺，10mg CL316,243)加入到PDMS微模具中后离心(4000rpm,3min)，室温下干燥12小时。
基底贴片通过在微针阵列底部进一步制备透明质酸层制得。在微针阵列底部加入透明质酸溶液(0.5g/ml)，二次离心(4000rpm,3min)后，室温下干燥12小时后，将微针从模具中剥离下来后于4℃储存。
2、预防或治疗肥胖的应用
将一次性载药聚合物微针阵列贴片贴于小鼠皮肤上，聚合物微针溶解后，释放药物实现预防或治疗肥胖的作用。微针贴片插入后，立刻将透明质酸基底分离去除，以防止快速溶解产生透明质酸溶液。
3、微针阵列贴片的性能参数分析
3.1聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种生物相容性好、可生物降解的高分子材料，已在药物和生物大分子载体中广泛采用(如DNA、RNA、蛋白质)。可以通过选择不同的PLGA结构实现力学性能和药物释放动力学的调控。
如图14A所示，在HA衬底上制备了不同的PLGA微针。为表征微针形貌和药物释放性质，Cy5分子仅负载在PLGA微针处。
长链PLGA制备的微针具有尖锐的锥形结构，而短链或星型PLGA形貌较差。然而长链PLGA的溶解及Cy5分子的释放，十分缓慢，在磷酸缓冲液中浸泡7天后，仍能保持较好的锥状结构，且在PBS溶液中浸泡4天或2周后，仅有8.6％或37.3％的Cy5分子被释放出来。相比之下，短链PLGA微针浸泡7天之后缩小成一个小球而星形微针基本坍塌，2周后均释放了超过>70％的Cy5分子(图14B)。
为了保证良好的形态和适中的释放动力学，可将长链短链或星型PLGA进行混合复配。我们发现长链和短链PLGA按1:1混合最可取。如图14C-D所示，PLGA756s+502制备的微针非常尖锐，4天可释放31.8％的Cy5分子，与纯短链或星型PLGA微针释放效果类似。纯的长链PLGA微针的机械强度最大，但PLGA756s+502制备所得微针的机械强度已经超出了刺破猪皮的压力。因此优选PLGA756s+502制备微针。
如图14E所示，SEM表征显示微针的基部宽度为250μm和高度为570μm。如图14F所示，用PBS溶液进行快速(～1min)润湿后，将微针从透明质酸基底上剥离下来。如图14G、14H所示，这些微针可以通过拇指按压刺入猪皮，破皮深度约为300μm。缓慢的溶解性能和适当的机械强度，使得载药PLGA微针可作为可持续释放药物的皮下给药系统。
3.2负载CL316,243并缓慢溶解的PLGA微针贴片经皮给药的抗肥胖作用
药物快速释放的例子中，需要日常多次用药，这可能带来一定的痛苦。因此，也可以通过聚合物的缓慢溶解，实现药物缓慢释放，进而降低用药次数及用药不适。
PLGA微针制备材料为(756s+502)。用类似于使用透明质酸微针贴片的实验方法，PLGA微针贴片也被应用于小鼠的腹股沟位置。微针穿透皮肤后留下微阵列的痕迹，但没有造成明显皮肤红斑、肿胀和感染等皮肤异常情况，如图15A所示。
图15B显示，使用负载CY5的PLGA微针贴片5天后，插入位点附近观察到明显的荧光信号。这进一步证明了PLGA的缓慢溶解。且这一保留时间与小鼠的表皮代谢更新时间(8-10天)匹配。显然，植入的PLGA微针可作为长效的药物缓释库。
为了测试载药微针对饮食诱导的肥胖(DIO)模型的抗肥胖作用，利用高脂饮食诱导和维持小鼠肥胖-即给予老鼠高脂高热的食物，促使其肥胖。所用小鼠为C57BL/6J型，9-10周雄性鼠，体重约30克。将小鼠随机分为3组并每周进行药物处理2次。对照组采用未负载药物的微针贴片处理，样品组采用CL316,243负载的微针贴片(每只老鼠用1片贴片处理,每片贴片的微针载药10μg)或腹腔注射CL316,243(10μg每鼠；～0.3mg/kg)。
图15C、D显示，微针贴片每周使用2次。与采用未负载药物微针处理的对照组小鼠相比，负载CL316,243微针可显著抑制～15％的体重增长。相比之下，腹腔注射相同剂量(～0.3mg/kg，每周两次)未明显防止体重增加。
图15E、15F显示，皮下给药的小鼠腹股沟WAT和附睾WAT减少。此外，图15G、15H显示，微针给药CL316,243也导致体表温度升高。
图16A显示，腹股沟WAT处棕色脂肪细胞增多，图16(B1-B5)显示，褐变标志物均显著增加。这一结果证实了脂肪褐变。持续的经皮药物释放优于全身给药。
与人类一样，肥胖小鼠表现出代谢综合征，包括高水平的总胆固醇、游离脂肪酸、胰岛素、葡萄糖和甘油三酯，这是一系列代谢性疾病如糖尿病的高危因素。因此，本发明的微针治疗能改善血清中上述代谢物水平(图16C-G)。
实施例3选用的聚合物为透明质酸，选用的脂肪褐变剂活性药物为甲状腺激素T3。
1、一种负载脂肪褐变剂的一次性载药聚合物微针阵列贴片的制备
在PDMS微模具中加入含药物的透明质酸溶液(0.5g透明质酸溶于1ml蒸馏水，加入0.5mg T3)后离心(4000rpm,3min)，室温下干燥12小时。
基底贴片通过在微针阵列底部进一步制备透明质酸层制得。在微针阵列底部加入透明质酸溶液(0.5g/ml)，二次离心(4000rpm,3min)后，室温下干燥12小时后，将微针从模具中剥离下来后于4℃储存。
2、预防或治疗肥胖的应用
将一次性载药聚合物微针阵列贴片贴于小鼠皮肤上，聚合物微针溶解后，释放药物实现预防或治疗肥胖的作用。
3、微针阵列贴片的性能参数分析
3,3,5–三碘甲状腺原氨酸(甲状腺激素T3)被用作模型的抗肥胖药物。它可以提高机体的代谢率，增加能量的消耗，是一种减肥药物。但口服和静脉途径的全身给药模式，易于对非靶向部位产生副作用(例如会引起心血管问题)，这限制了其在肥胖管理中的应用。这种副作用可以通过本发明微针的皮下给药而极大地克服。
除具体实施例1-2中实验方法外，本实施例还对微针贴片处理过的小鼠血清中甲状腺T3和促甲状腺激素(TSH)水平利用鼠甲状腺T3ELISA板分析(Biovision)。肥胖小鼠血清中游离脂肪酸、甘油三脂和葡萄糖水平通过标准测定板测定(Biovision)。胆固醇和胰岛素水平通过胆固醇定量板(Sigma-Aldrich)和鼠胰岛素ELISA板(ThermoScientific)测得。
如图17A所示，传统的注射给药可导致血清中甲状腺T3的迅速急剧增加，随后快速衰减。本实施例中的微针皮下给药，一个初始延迟(～1h)后显示更持续的低水平T3浓度。这可能是由于经皮排出的T3需要扩散通过皮下组织的细胞外基质，进而在腹股沟WAT积累并开始循环。与负载CL316,243透明质酸微针相反，负载T3的透明质酸微针处理过的小鼠与对照组相比，仅透皮给药一侧的皮下WAT变轻变小。同时，附睾WAT(内脏脂肪)也没有产生显著差异。
本发明中聚合物材料未改变药物本身的化学机构和药效，且微针制备过程中未加入其它辅料，避免了辅料通过静电作用、疏水作用、包结作用等对药物形状及药效产生影响。
图17B、C、D中的结果表明，对照组实验和微针给药组老鼠的体重、血清T3及血清促甲状腺激素(TSH)均没有显著差异，血清游离T3和正常表明经皮传递T3局限在附近的皮下白色脂肪细胞而T3分子进入循环则被绑定到T3结合蛋白(如球蛋白、白蛋白等)或在肝部降解。腹腔注射相同剂量T3对附睾WAT重量也无影响，进一步证实了透皮T3给药仅导致微针插入区附近皮下脂肪组织的减少。进一步验证了微针不会使负载药物药效和性状发生变化。负载T3的透明质酸微针处理区域附近的WAT中，UCP1表达量(产热和棕色脂肪细胞特异性蛋白)、COX1(线粒体生物合成标志物)和PGC1α(产热的棕色特异基因表达必不可少的转录因子)明显增加(图7-9)。
以上实施例充分说明，本发明优选了聚合物种类，透明质酸和PLGA与脂肪褐变剂相容性好，结合制备过程中离心操作，微针阵列中药物均匀分布，提高微针制剂的载药量；此外，通过调整聚合物材料组分可以实现对释放动力学的调控。本发明微针透皮给药未改变药物本身的化学结构和药效，通过微针透皮给药可直接给药到皮下脂肪组织，与传统注射给药方式相比，本发明提供的微针贴片具有低剂量给药和局部靶向给药的显著优势，避免常规全身给药导致的药物失效或严重的副作用等问题，利用本发明微针阵列贴片，无需日常饮食控制即可抑制白色脂肪组织和体重的增加，可预防或治疗肥胖。

Claims (10)

1.一种负载脂肪褐变剂的微针贴片，包括基底和立于基底上的微针阵列，其特征在于，微针为由聚合物材料制成的锥形结构，所述聚合物材料为透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或两者的混合物，所述脂肪褐变剂通过与聚合物材料共浇注的方式负载在微针的针体内。
2.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，所述透明质酸分子量<10kDa。
3.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸共聚物为分子量76,000-116,000Da的长链聚乳酸-羟基乙酸、分子量7000-17000Da的短链聚乳酸-羟基乙酸或分子量不高于15000Da的葡萄糖核的星型聚乳酸-羟基乙酸中任意两种以质量比1:1复配的混合物；
所述长链及短链聚乳酸-羟基乙酸的结构式如式(Ⅰ)所示：
其中短链聚乳酸-羟基乙酸x＝97-236，y＝122-298；长链聚乳酸-羟基乙酸x＝1055-1611，y＝1461-2230；
所述葡萄糖核的星型聚乳酸-羟基乙酸结构式如式(Ⅱ)所示：
其中m＝10-125，x＝1-211，y＝1-268。
4.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，所述聚合物材料为透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物以质量比1:99～99:1的混合物。
5.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，每个微针中脂肪褐变剂的质量百分比含量为0.1～50％。
6.如权利要求1或5所述的微针贴片，其特征在于，所述脂肪褐变剂为肾上腺激素、甲状腺激素、β3肾上腺素能受体激动剂、PPAR激动剂、E2前列腺素及其类似物、二硝基苯酚、成纤维细胞生长因子21，骨形态发生蛋白7，Apelin、脂联素或microRNAs。
7.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，所述微针呈四角锥形，针体高度为100～900μm，高度与底边宽度之比为2～2.5，相邻微针之间间隔100～900μm。
8.如权利要求1所述的微针贴片，其特征在于，所述基底为由透明质酸制得的薄片，厚度为1～1.5mm。
9.如权利要求1-8任一项所述的微针贴片的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将脂肪褐变剂和聚合物材料溶于溶剂中，制得模液；
(2)将所述模液注入具有微孔阵列的模腔内，离心让模液填满微孔，除去多余的溶液，干燥除去溶剂，形成微针；
(3)将不含脂肪褐变剂的聚合物材料溶液填满模腔，离心后干燥，形成基底。
10.如权利要求9所示的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中，溶液中聚合物材料的浓度为0.05～2.0g/mL。
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