CN109925297A - 含乌头碱的经皮给药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含乌头碱的经皮给药系统，该系统包含乌头碱、脂质纳米粒和可溶性微针，所述乌头碱包载于脂质纳米粒中，该载有乌头碱的脂质纳米粒包载于可溶性微针中。本发明还公开了该经皮给药系统的制备方法和应用。本发明含乌头碱的经皮给药系统，能将乌头碱有效递送到皮肤中，并作为药物贮库缓慢释放乌头碱进入体循环，不仅降低了乌头碱的心脏毒性，而且提高了乌头碱治疗类风湿性关节炎等疾病的疗效，应用前景非常广阔。

Description

含乌头碱的经皮给药系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种含乌头碱的经皮给药系统及其制备方法和应用。

背景技术

乌头碱(Aconitine，ACO)是存在于毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeliDebx.)块根中的有效成分，具有“回阳救逆”，“散寒止痛”等功效，在抗炎镇痛、强心等方面显示了良好的疗效，此外还具有抗肿瘤和调节免疫等作用。但是，ACO具有强烈的中枢和心脏毒性，服用过量极易中毒死亡。因此，研究安全、有效的载ACO药物制剂对于促进乌头碱在临床上广泛使用具有重要的意义。

经皮给药系统(transdermal drug delivery system，TDDS)是指药物以一定的速率透过皮肤，经毛细血管吸收进人血液循环并达到有效浓度的一类给药系统。与其他剂型相比，经皮给药具有许多优点：可避免肝脏首过效应和胃肠道降解；可维持长时间释药；维持平稳血药浓度；且应用方便，在发生问题时能简单迅速地停止给药等。但由于角质层强大的屏障作用，药物透过皮肤的剂量有限，目前可用于经皮给药的主要是剂量小、活性强的小分子脂溶性药物。迄今为止仅有40几种经皮给药制剂获准上市销售。因此，如何有效促进药物进入角质层，并最终穿透皮肤进入血液循环系统，一直是限制经皮给药系统的瓶颈问题。此外，对于像ACO这类治疗窗很窄的药物，不仅需要有效进入角质层，还需要在角质层中形成贮库、缓慢释放，才有可能达到“减毒、增效”的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含乌头碱的经皮给药系统，该系统能将乌头碱(ACO)有效递送到皮肤中，并作为药物贮库缓慢释放ACO进入体循环，不仅降低了ACO的心脏毒性，而且提高了ACO治疗类风湿性关节炎的疗效。

此外，还需要提供一种上述经皮给药系统的制备方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种含乌头碱的经皮给药系统，该系统包含乌头碱、脂质纳米粒和可溶性微针，所述乌头碱包载于脂质纳米粒中，该载有乌头碱的脂质纳米粒包载于可溶性微针中。

本发明中的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles)，与聚合物纳米粒(Polymericnanoparticles)相比，具有制备工艺简单，易于放大生产和灭菌，生物相容性好，包载的药物不易泄露等优点，该脂质纳米粒可应用在局部给药系统，使药物在皮肤里保持较长的释药时间，同时维持所需的药物浓度。

所述脂质纳米粒包括纳米结构脂质载体、或固体脂质纳米粒。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是以天然或合成的固态脂质为载体，将药物吸附或包裹于脂质核中形成的固体纳米给药体系。纳米结构脂质载体(nanostructured lipidcarriers，NLC)是新一代脂质纳米粒，与固体脂质纳米粒(SLN)不同之处在于，它是采用混合类脂为载体材料，将液体脂质混合到固体脂质中制备而得。液体脂质的加入，可扰乱固体脂质规则的晶格结构，增加纳米粒结构中不规则晶型的比例，使承载脂溶性药物的空间容量增加，从而提高载体的载药能力。因此，纳米结构脂质载体既具备固体脂质纳米粒生物相容性好的优点，同时也改善了固体脂质纳米粒在载药量方面的不足。

所述脂质纳米粒由脂质材料和乳化剂制成。其中，固体脂质材料包括山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油脂、甘油棕榈酸硬脂酸酯等；液体脂质包括单亚油酸甘油酯、油酸聚乙二醇甘油酯、中链甘油三酯等；乳化剂包括磷脂及其加氢衍生物或其混合物、鞘脂类及其甘油酯类、生物胆盐、乙氧基化脂肪酸或脂肪醇及其酯或醚类、合成的生物降解聚合物如聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、乙酰化或羟乙基化的单酸或二酸甘油酯等表面活性剂。本发明优选以山嵛酸甘油酯、中链甘油三酯和聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物为固态脂质、液态脂质和表面活性剂制成纳米结构脂质载体。

所述载有乌头碱的脂质纳米粒的粒径为20-5000nm。

所述可溶性微针的基质材料是具有生物相容性的水溶性高分子材料，包括聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、聚乳酸麦芽糖糊精、和/或纤维素衍生物。

所述微针的长度为100-500μm，相邻微针之间的距离为50-500μm。

所述微针中乌头碱的含量为2.5-62.5μg/cm²。

在本发明中，微针(Micorneedle，MN)是一种有能力穿透皮肤角质层(SC)、在皮肤上创建细微管道，并将药物输送至更深层皮肤吸收或直接进入全身循环的给药系统。MN系统由微米级MN阵列组成，多数是由硅或金属制成。但是硅和金属材料制成MN，除了制备材料的生物相容性不佳、微针可能会带来被不恰当重复使用等问题，还极易发生针体在皮肤内断裂从而带来一系列安全性问题。生物可降解MN是将药物活性成分包裹于用可生物降解材料如聚乳酸麦芽糖糊精、纤维素衍生物等制成的MN中，聚合物MN缓控释给药使药物进入皮肤，除具有一般MN的优点，其具有的生物可降解特性解决了MN一旦断裂于皮肤内难以处理这一难题，本发明采用水溶性高分子材料制成的生物可降解MN，是经皮给药的理想载体，其成本相对低廉，更易于商业化生产，而且由于高分子聚合物的粘弹性特点，可提供高韧性，降低剪切应力造成的微针针头折断的风险。此外，本发明可溶性生物降解MN也能彻底杜绝被不恰当重复使用的问题。

在本发明的另一方面，提供了一种含乌头碱的经皮给药系统的制备方法，包括以下步骤：

将乌头碱和脂质材料溶于有机溶剂形成有机相，把乳化剂溶于水制成水相，再将该有机相和水相加热至相同温度，在搅拌条件下，将有机相倾入水相中，待有机溶剂挥发干，将初乳分散于冷水中，即得载乌头碱的脂质纳米粒；

将载乌头碱的脂质纳米粒冻干粉末加入水溶性高分子材料中，然后注入微针模具，即得包载乌头碱脂质纳米粒的微针给药系统。

在本发明的另一方面，还提供了上述含乌头碱的经皮给药系统在制备治疗炎症的药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了上述含乌头碱的经皮给药系统在制备治疗癌症的药物中的应用。

本发明含乌头碱的经皮给药系统，是将乌头碱(ACO)先包载于纳米结构脂质载体中，再将载有乌头碱的纳米结构脂质载体载入可溶性微针列阵(MN)中形成的经皮给药系统，该给药系统能将乌头碱(ACO)有效递送到皮肤中，并作为药物贮库缓慢释放ACO进入人体血液循环系统，不仅降低了ACO的心脏毒性，而且提高了ACO治疗类风湿性关节炎的疗效，具有很好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明的含乌头碱的经皮给药系统结构示意图；

图2是本发明实施例1的ACO-NLC的透射电镜图；

图3是本发明实施例2的PDMS模具、可溶性微针实物图和针尖、针体形状显微图；

图4是本发明实施例3的ACO-NLC-MN和ACO-NLC在大鼠皮肤微透析接收液中药物浓度-时间变化曲线图；

图5是本发明实施例4的不同剂型对大鼠AA模型足趾容积的影响图；

图6是本发明实施例4的不同剂型对大鼠AA模型血浆中促炎症因子含量的影响图；

图7是本发明实施例5的ACO-NLC-MN及ACO甲醇溶液经皮给药后对大鼠心电图的影响图。

具体实施方式

为了增加乌头碱的药效、并降低乌头碱的心脏毒性，本发明研制了一种含乌头碱的经皮给药系统，该系统包含乌头碱、脂质纳米粒和可溶性微针，所述乌头碱包载于脂质纳米粒中，该载有乌头碱的脂质纳米粒包载于可溶性微针中。

可溶性微针需要有足够的机械强度刺入皮肤，然后快速溶解或膨胀，将药物递送到皮肤内。本发明采用生物相容性良好的水溶性高分子材料制备可溶性微针，得到的微针具有适宜的硬度和机械强度，通过部分材料的快速溶解使微针解体，从而将药物乌头碱递送到皮肤内；同时，利用部分材料溶解速度相对比较缓慢的特点，降低可溶性微针的吸湿性。

药物乌头碱具有强毒性，直接包载在可溶性微针中可能由于释放速度过快引发毒性和刺激性，因此，本发明通过先采用纳米结构脂质载体、固体脂质纳米粒等脂质纳米粒包载药物乌头碱，再将载乌头碱脂质纳米粒以冻干粉末的形式加入制备可溶性微针的水溶性高分子材料的溶液中，增加可溶性微针系统的载药量，同时利用脂质纳米粒和可溶性微针的双重包敷作用，使药物在皮肤内形成药物贮库，延缓乌头碱的释放，大大降低乌头碱的毒副作用。

如图1所示，本发明含乌头碱的经皮给药系统的可溶性微针1由基底4和微针阵列组成，微针阵列中的每一个微针包括针体2和针尖5，在可溶性微针1中含有包载乌头碱的脂质纳米粒3。

下面通过具体实施例阐述本发明。

实施例1载乌头碱纳米结构脂质载体(ACO-NLC)的制备

将乌头碱(ACO)包载于纳米结构脂质载体(Nanostructured lipid carriers，NLC)中。山嵛酸甘油酯(Compritol 888ATO)、中链甘油三酯(Labrafac CC)和聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物(Poloxamer188)作为载乌头碱纳米结构脂质载体(ACO-NLC)的固态脂质、液态脂质和表面活性剂，其中，脂质的用量为6％，固态(Compritol 888ATO)和液态脂质(Labrafac CC)的比例为1:1，表面活性剂(Poloxamer188)用量为7％，药脂比为1∶20。按照处方，将所需量的固态及液态混合脂质和药物ACO溶于少量二氯甲烷中构成有机相，水相则通过将表面活性剂溶于水中而制得，将两者加热至相同温度，在高速搅拌条件下，将有机相倾入水相中，继续搅拌至有机溶剂挥干，并浓缩至一定体积。在搅拌条件下将初乳分散于冷水中，即得载乌头碱纳米结构脂质载体(ACO-NLC)。

检测：制备的ACO-NLC平均粒径为152.1±5.6nm，Zeta电位为-19.9±0.2mV，透射电镜结果如图2所示，其外观为近球形，粒径大小较为均匀。

实施例2载乌头碱固体脂质纳米粒(ACO-SLN)的制备

将乌头碱(ACO)包载于固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)中。与ACO-NLC处方其余组分相同，仅以固态脂质替代液态脂质，采用低温固化-乳化蒸发法通过同样的制备工艺制备ACO-SLN。Compritol 888ATO和Poloxamer188作为载乌头碱固体脂质纳米粒(ACO-SLN)的脂质和表面活性剂，其中，脂质(Compritol 888ATO)的用量为6％，表面活性剂(Poloxamer188)用量为7％，药脂比为1∶20。按照处方，将所需量的脂质和药物ACO溶于少量二氯甲烷中构成有机相，水相则通过将表面活性剂溶于水中而制得，将两者加热至相同温度，在高速搅拌条件下，将有机相倾入水相中，继续搅拌至有机溶剂挥干，并浓缩至一定体积。在搅拌条件下将初乳分散于冷水中，即得载乌头碱固体脂质纳米粒(ACO-SLN)。

实施例3载药微针ACO-NLC-MN/ACO-SLN-MN的制备

向1mL的1-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP，99％)中加入约15mg的偶氮二异丁腈，再加入ACO-NLC或ACO-SLN冻干粉末(ACO的含量为50μg)，涡旋混合均匀，注入聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具。将PDMS模具在真空干燥箱中(0.4倍大气压)放置1min，使VP充分填充到模具的微孔中。将PDMS模具取出，置于紫外灯下(40W，365nm)照射4h，待微针完全固化成型后剥离PDMS模具，得载药微针ACO-NLC-MN/ACO-SLN-MN(面积为2×2cm²)，即为本发明含乌头碱的经皮给药系统，将其置干燥器中保存。

如图3所示，本发明使用的PDMS微针模具呈无色透明状，表面有很多针孔(见图3A和3B)。制备得到的可溶性微针由基底和近百个尖端呈四棱锥型的四棱柱构成(见图3C和3D)，排列整齐，可溶性微针阵列的长度为100-500μm，微针之间的距离为50-500μm。

实施例4载药微针ACO-NLC-MN的大鼠在体微透析实验

将SD大鼠随机分成ACO-NLC组和ACO-NLC-MN组，每组5只。各组大鼠以20％乌拉坦腹腔注射，待进入麻醉状态后剃除大鼠腹部毛发，在穿刺针引导下植入微透析探针。

ACO-NLC-MN组大鼠在植入探针的皮肤上方刺入ACO-NLC-MN(ACO的含量为25μg)，按压3min，之后用医药胶带将MN固定在裸鼠皮肤上；ACO-NLC组大鼠在植入探针的皮肤上方固定给药池(2×2cm²)，给予0.5mLACO-NLC混悬液(ACO的含量为25μg)。在探针中通入灌流液(20％聚乙二醇400的生理盐水溶液)，预平衡30min后开始计时，每小时收集一份微透析收集液样品，持续收集10小时。

取各时间点微透析接收液样品，加入乙醚1mL，涡旋2min，12,000rpm离心5min，取上清液，常温下使用氮气吹干，冰箱保存。测定前精密加入流动相200μL复溶，涡旋2min，12,000rpm离心5min，取上清液UPLC-MS/MS法测定微透析接收液中ACO含量。采用PhoenixWinNonlin(Pharsight Corporation,Version 2.0)软件对药物质量浓度-时间数据进行非房室模型拟合，计算药动学参数。ACO-NLC和ACO-NLC-MN经皮给药后，大鼠在体微透析接收液中ACO浓度-时间曲线见图4。通过大鼠在体微透析实验，发现ACO-NLC混悬液与ACO-NLC-MN经皮给药透皮组中微透析接收液ACO的达峰浓度(C_max)分别为2570.58±1630.45ng/mL和5357.83±624.81ng/mL，药物浓度-时间曲线下面积(AUC)分别为15596.60±7711.47ng·h/mL和30560.83±4126.83ng·h/mL。与ACO-NLC混悬液相比，ACO-NLC-MN经皮给药后，ACO在大鼠在体微透析接收液中的C_max和AUC分别提高1.08和0.96倍(P<0.05)，提示可溶性MN可将ACO-NLC有效递送到皮肤中，从而提高ACO经皮吸收的程度。

实施例5载药微针ACO-NLC-MN在大鼠体内药效学

1.模型建立

建立佐剂性关节炎(AA)的大鼠模型来评价ACO-NLC-MN治疗类风湿性关节炎的疗效。取体重为200g左右的SD雄性大鼠，以20％乌拉坦腹腔注射，待进入麻醉状态后，对大鼠的足部体积进行测量。将大鼠左后肢拉直并进行常规消毒，于左后肢足趾皮下注射0.2mL弗氏完全佐剂(FCA)对其进行致炎，注射后适当按压防止过多FCA渗出。造模大鼠出现继发侧左后足肿胀，通过肉眼可观察到大鼠左后足出现红肿溃烂，并且有行走困难的现象，活动量大幅度减少，精神状态逐渐开始萎靡，饮食减少，并伴随轻微的皮肤溃烂，耳朵有少量红斑，尾部出现结节等现象，证明成功建立大鼠佐剂型关节炎模型。

2.动物分组与给药方案

SD大鼠随机分为正常组，AA模型组，ACO-NLC组和ACO-NLC-MN组(n＝8只/组)。正常组大鼠不做任何处理；AA模型组大鼠仅造模不给药；ACO-NLC组和ACO-NLC-MN组大鼠从造模后第8天开始分别给予ACO-NLC混悬液(ACO含量为25μg，将医用纱布用医用胶带固定在大鼠腹部，滴加ACO-NLC混悬液0.5mL)和ACO-NLC-MN(ACO含量为25μg，按压3min后用医用胶带固定)，每两天给药1次，治疗周期为14天，期间自由饮食，饮水。

3.足趾容积

各组大鼠自造模成功并开始给药第一天起，用记号笔在大鼠左后肢关节周围做上记号并拉直后，放入足趾容积测量仪测量杯中，测量出每只大鼠的足趾容积并记录，然后再进行给药操作。AA模型组，ACO-NLC组和ACO-NLC-MN组从造模后第7天和每次给药之前测定大鼠的足趾容积，直到治疗周期结束；空白组大鼠在相对应的时间测定大鼠足趾容积，直到治疗周期结束。

结果如图5所示，与正常组相比，AA模型组大鼠足趾容积有较大程度的增长，且呈现出一定波动，符合类风湿关节炎病情反复的临床表现特点。与模型组相比，ACO-NLC和ACO-NLC-MN组大鼠的足趾容积均有所下降，其中ACO-NLC-MN组大鼠足趾容积下降更为明显，提示ACO-NLC-MN治疗类风湿性关节炎的疗效优于ACO-NLC。

4.血清中促炎症因子水平

末次给药后第2天，将各组大鼠麻醉，从腹主动脉收集血液1mL，5000rpm离心15min，分离血清，采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-1β水平。

结果如图6所示，与AA模型组相比，ACO-NLC组大鼠血清IL-6和TNF-α水平有所下降(p<0.05)，ACO-NLC-MN组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均显著下降(p<0.05)；并且ACO-NLC-MN组大鼠血清IL-6和IL-1β水平低于ACO-NLC组(p<0.05)，提示ACO-NLC-MN治疗类风湿性关节炎的疗效优于ACO-NLC。图6中，“*”指p<0.05vs.AA模型组；“#”指p<0.05vs.NLC。

实施例6载药微针ACO-NLC-MN对大鼠心脏毒性实验

SD大鼠随机分成实验组和对照组(n＝5只/组)，以20％乌拉坦腹腔注射，待进入麻醉状态后剃除腹部毛发，连接到多通道生物记录仪。

实验组大鼠给予ACO-NLC-MN(ACO含量为25μg)按压3分钟，用医用胶带将其固定在大鼠腹部；对照组先用金属微针处理大鼠皮肤，再用医用胶带将医用纱布固定在金属微针处理过的大鼠皮肤上，滴加ACO甲醇溶液(ACO含量为25μg)。

1.心电图测定

通过多通道生物记录仪的配套软件记录分别给药30min后对照组及实验组大鼠的心电图变化。比较心电图中P-R间期，T波、R波及ST段等的变化。结果如图7所示，ACO甲醇溶液组和ACO-NLC-MN组大鼠的心电图都出现了心率下降、心房颤动、和轻度传导阻滞。其中ACO-NLC-MN组大鼠心电图仅出现T波的振幅逐渐增加，而ACO甲醇溶液组大鼠出现了ST段的弓背向上型抬高。高耸T波是心内膜下心肌缺血的心电图表现，而ST段的抬高是透壁性心肌缺血的反映，只有当心内膜和心外膜的心肌都有严重损伤甚至坏死时才会出现ST段的抬高。与T波高尖比较，心电图ST段的抬高往往提示着更严重、范围更大的心肌损伤。上述实验结果提示，与ACO甲醇溶液相比，ACO-NLC-MN经皮给药后对大鼠心脏的毒性减弱。

2.血清生化指标

记录心电图之后，从腹主动脉收集血液1mL，5000rpm离心15min，分离血清，-20℃保存备用。采用比色试剂盒法测定血清中CK和LDH含量。

乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的水平是衡量心肌损伤的重要指标。由表1可见，ACO甲醇溶液和ACO-NLC-MN经皮给药后大鼠血清中CK和LDH水平均有所升高(p<0.05)，提示ACO甲醇溶液和ACO-NLC-MN均具有一定程度的心脏毒性；但ACO-NLC-MN组大鼠血清中CK和LDH水平均低于ACO甲醇溶液(p<0.05)，提示ACO-NLC-MN对心脏的毒性较弱。

表1 ACO-NLC-MN及ACO甲醇溶液单次给药前后大鼠血清中CK和LDH水平

注：^▲与0min相比，P<0.05；^■代表与ACO甲醇溶液相比P<0.05

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种含乌头碱的经皮给药系统，该系统包含乌头碱、脂质纳米粒和可溶性微针，所述乌头碱包载于脂质纳米粒中，该载有乌头碱的脂质纳米粒包载于可溶性微针中。

2.根据权利要求1所述的经皮给药系统，其特征在于，所述脂质纳米粒包括纳米结构脂质载体、或固体脂质纳米粒。

3.根据权利要求1所述的经皮给药系统，其特征在于，所述可溶性微针的基质材料是具有生物相容性的水溶性高分子材料。

4.根据权利要求3所述的经皮给药系统，其特征在于，所述水溶性高分子材料包括聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、聚乳酸麦芽糖糊精、和/或纤维素衍生物。

5.根据权利要求1所述的经皮给药系统，其特征在于，所述微针的长度为100-500μm，相邻微针之间的距离为50-500μm。

6.根据权利要求1所述的经皮给药系统，其特征在于，所述微针中乌头碱的含量为2.5-62.5μg/cm²。

7.根据权利要求1所述的经皮给药系统，其特征在于，所述载有乌头碱的脂质纳米粒的粒径为20-5000nm。

8.一种含乌头碱的经皮给药系统的制备方法，包括以下步骤：

将乌头碱和脂质材料溶于有机溶剂形成有机相，把乳化剂溶于水制成水相，再将该有机相和水相加热至相同温度，在搅拌条件下，将有机相倾入水相中，待有机溶剂挥发干，将初乳分散于冷水中，即得载乌头碱的脂质纳米粒；

将载乌头碱的脂质纳米粒冻干粉末加入水溶性高分子材料中，然后注入微针模具，即得包载乌头碱脂质纳米粒的微针给药系统。

9.权利要求1所述含乌头碱的经皮给药系统在制备治疗炎症的药物中的应用。

10.权利要求1所述含乌头碱的经皮给药系统在制备治疗癌症的药物中的应用。