CN114767655B

CN114767655B - 一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统及应用

Info

Publication number: CN114767655B
Application number: CN202210408793.5A
Authority: CN
Inventors: 钱红亮; 李财华; 杨静如; 陈维; 黄德春; 钟伊南
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-04-19
Also published as: CN114767655A

Abstract

本发明公开了一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统及应用。由丙烯酸酯环碳酸酯和巯基乙醇通过开环聚合得到超支化的聚碳酸酯，然后与巯基化的两性离子进行Michael加成反应，得到两性离子化超支化聚碳酸酯。两性离子化的材料通过自组装技术包载蛋白质药物后，进行紫外光交联使其在口服到胃后具有抵抗酸性环境的能力。同时，表面的两性离子化合物可实现较理想的黏液穿透效果。基于两性离子化合物的纳米递送系统，有利于上皮细胞的摄取，避免了肠漏引起的细菌感染等风险。该系统克服了蛋白质药物口服递送过程中存在的易失活、易降解、吸收差的障碍，提高了其生物利用度。

Description

一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统及应用

技术领域

本发明涉及高分子材料学和药物制剂及制备方法和用途，特别涉及一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统及应用。

背景技术

近些年，生物技术和基因工程得到了不断发展，活性多肽、蛋白质类药物不断涌现，其生理活性强、药效高、作用专一，逐步用于预防和治疗肿瘤、糖尿病和心脑血管病等重大疾病。然而，多肽、蛋白质类药物在体内易降解，稳定性差，因此，临床上常用的剂型为注射用溶液剂和注射用灭菌粉末。但是，长期用药后注射部位可能会出现炎症、硬结等副作用，甚至产生耐药性，给病人身体以及精神带来不适，严重影响病人的生活质量。

口服蛋白质或肽可以改善注射这些治疗性大分子的患者的生活质量。然而，几乎没有任何蛋白质药物制剂被批准用于口服给药，主要是由于生物利用度低。要使口服蛋白质药物发挥作用，必须克服三个主要的生理障碍。一是在胃中，蛋白质药物需要在胃环境中超酸性pH(pH＝1-3)和各种蛋白水解酶存在的条件下中存活下来，保持生理活性。二是在肠道中，蛋白质药物需要穿透保护上皮表面的粘液层，三是需要穿过肠道的上皮细胞层进入血液。目前，已经开发出多种策略(如酶抑制剂和药物包埋等)来克服第一个障碍。然而，后两个障碍构成了巨大的挑战，导致当前口服蛋白质药物的生物利用度低和治疗功能差。

两性离子化合物是一类同时带有阴、阳离子基团且整体为电中性的聚合物，同时具有极强的亲水性、优良的热和化学稳定性、生物相容性，包括磷酰胆碱型、磺基甜菜碱型、羧基甜菜碱型以及混合型。用两性离子化合物进行表面修饰制备得到的黏液穿透纳米递送系统具有良好的亲水性、电中性表面，可实现较理想的黏液穿透效果。肠上皮细胞上具有PAT1受体蛋白，可介导两性离子的跨膜转运，有利于上皮细胞的摄取。同时存在不打开紧密连接的优势，因紧密连接的打开通常会导致肠泄露，增加自身免疫性疾病、细菌感染和炎症性肠病等的风险。高亦鲲等(CN111450258A)以介孔二氧化硅载体，吸附装载蛋白药物后，以十八酸或胆酸将载药二氧化硅表面进行疏水化修饰，进一步利用疏水作用力与两性离子表面活性剂十二烷基甜菜碱或二月桂酰基卵磷脂形成自组装纳米粒，促进了蛋白药物在胃肠道黏液层中渗透。基于两性离子的黏液穿透纳米递送系统研发得到了高度重视，各种两性离子化合物不断出现并被应用到剂型的设计中。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统。

本发明另一目的是提供所述两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统的制备方法和在制备治疗糖尿病药物中应用。

技术方案：本发明所述的两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统，所述载药系统由丙烯酸酯环碳酸酯(AC)和巯基乙醇通过开环聚合得到超支化的聚碳酸酯(HP-AC)，然后与巯基化的两性离子进行Michael加成反应，得到两性离子化超支化聚碳酸酯(HP-CB)。

进一步地，所述丙烯酸酯环碳酸酯(AC)和巯基乙醇的摩尔比为3-10∶1。

进一步地，所述的巯基化两性离子和超支化聚碳酸酯(HP-AC)的摩尔比为3-9∶10。

一种两性离子化载药纳米粒子，所述纳米载药系统与蛋白质药物混合自组装，加入光引发剂，经紫外灯照射，得到光交联的两性离子化载药纳米粒子。

进一步地，所述的两性离子化载药纳米粒子，具有电中性表面性质以及良好的亲水性，可实现黏液穿透效果。

进一步地，该两性离子化载药纳米粒子是通过肠上皮细胞PAT1受体蛋白介导跨膜转运，同时不打开紧密连接，避免肠漏导致的细菌感染、炎症性肠病。

进一步地，所述蛋白质药物包括牛血清蛋白、胰岛素、葡萄糖氧化酶或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。

所述的两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)巯基化两性离子的合成：

将两性离子溶于有机试剂，加入含有二巯基结构的分子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有巯基分子修饰的两性离子；

(2)超支化聚碳酸酯(HP-AC)的合成：

含有双键的丙烯酸酯环碳酸酯与巯基乙醇溶于有机溶剂中，加入催化剂，在氮气保护的环境中反应一段时间，然后移入到一定温度的油浴锅中反应一段时间得到聚合物；

(3)两性离子化超支化聚碳酸酯(HP-CB)的合成：

将步骤(2)中制备的聚合物溶于有机试剂中，加入步骤(1)中制备巯基化的两性离子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有两性离子结构修饰的聚合物。

所述的两性离子化载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)巯基化两性离子的合成：

(2)超支化聚碳酸酯(HP-AC)的合成：

(3)两性离子化超支化聚碳酸酯(HP-CB)的合成：

将步骤(2)中制备的聚合物溶于有机试剂中，加入步骤(1)中制备巯基化的两性离子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有两性离子结构修饰的聚合物；

(4)两性离子化载药纳米粒子的制备：

将步骤(3)得到的聚合物溶于有机溶剂中，与蛋白质药物混合自组装，加入光引发剂，紫外照射得到光交联的两性离子化载药纳米粒子。

所述的两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统在制备治疗糖尿病药物中应用。

作为优选，将聚合物HP-CB溶解于甲醇中，与胰岛素溶液充分溶解后逐滴滴加到高纯水中，搅拌、超声后，加入光引发剂，经紫外光照射得到光交联的两性离子化载药纳米粒子。

本发明首次将两性离子化纳米粒子与紫外光交联技术结合起来，通过自组装技术制备的载药纳米粒子可以保护蛋白质药物不被消化酶降解，同时，经过紫外光交联后，纳米粒子具有一定的抵抗胃酸的能力。在肠道中，两性离子纳米粒子具有电中性表面以及良好的亲水性，可实现较理想的黏液穿透效果。含有两性离子化合物的纳米递送系统可通过PAT1受体蛋白介导跨膜转运，同时不打开紧密连接，有利于上皮细胞的摄取。因此，上述纳米载药系统在口服蛋白质药物治疗糖尿病等疾病方面有潜在的应用前景。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有如下优势：

(1)本发明选用的环状碳酸脂类化合物，丙烯酸酯环碳酸酯(AC)和巯基乙醇容易通过开环聚合反应得到超支化聚碳酸酯，在合成过程中即可引入多个碳碳双键官能团，操作简便、可控。同时，聚碳酸酯类化合物已被证明毒性低，在体内可被降解，安全有效。

(2)本发明利用超支化聚碳酸酯中的碳碳双键与两性离子分子上的巯基的进行迈克尔加成反应，操作简便、条件简单。

(3)本发明通过超支化聚碳酸酯部分双键紫外光交联，在口服递送蛋白质药物时，在胃环境中起到一定程度的抗酸抗酶作用。

(4)两性离子纳米粒子具有良好的亲水性、电中性表面，可实现较理想的黏液穿透效果。

(5)含有两性离子化合物的纳米递送系统与细胞磷脂膜具有相似的表面性质，同时，肠上皮细胞具有PAT1受体蛋白，可介导两性离子纳米粒子跨膜转运，促进经皮吸收，同时不打开紧密连接，避免肠漏引起的细菌感染、炎症性肠病的风险，克服蛋白质药物在胃肠道中吸收差的问题。

(6)所得递药系统性质稳定，能够有效保护蛋白质药物在胃中不被降解失活并且能够跨过肠上皮细胞进入血液。

(7)该系统克服了蛋白质药物口服递送过程中存在的易失活、易降解、吸收差的障碍，提高了其生物利用度。

附图说明

图1为实施例1中HP-AC的氢核磁图谱；

图2为实施例2中TCB的氢核磁图谱；

图3为实施例3中HP-CB的氢核磁图谱；

图4为实施例4中两性离子化载药纳米粒子的粒径图；

图5为实施例5中两性离子化纳米粒子进行Caco-2和HT-29细胞的细胞毒性试验的细胞存活率示意图；

图6为实施例6中两性离子化纳米粒子进行Caco-2和HT-29细胞的细胞摄取试验图；

图7为实施例7中两性离子化纳米粒子进行Caco-2细胞摄取抑制试验图；

图8为实施例8中两性离子化载药纳米粒子的体内降糖曲线图。

具体实施方式

实施例1

HP-AC的合成，其合成路线及过程如下：

精确称取AC 2.0g(10mmol)置于密封瓶中，真空干燥数小时，置于无水无氧手套箱环境内，向其中加入10mL二氯甲烷溶解，搅拌状态下加入巯基乙醇78mg(1.0mmol)和三乙胺10mg(0.1mmol)，将反应密封反应4h。然后加入催化剂1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，将反应器密封，转移出手套箱，在50℃油浴中反应40h，反应结束后滴加2滴冰醋酸终止反应，将反应液逐滴滴加到冰乙醚中沉淀析出、离心收集、真空干燥得到粘稠油状聚合物HP-AC。

HP-AC的氢核磁表征(400MHz，CDCl3)见附图1，¹H NMR分别显示出AC单元中的甲基峰(δ0.9-1.1，-CH₃)，AC单元中的亚甲基峰(δ4.1，-OCH₂-)，巯基乙醇中的亚甲基(δ4.3，-OCH₂-)，巯基乙醇中的亚甲基(δ2.7，-SCH₂-)，双键峰(δ5.8-6.5，-CH＝CH₂)的明显特征峰信号。

实施例2

巯基化两性离子TCB的合成，其合成路线及过程如下：

精确称取CB 0.3g(1.316mmol)置于反应瓶中，加入4mL的甲醇溶解，在氮气保护下加入3，6-二氧杂-1，8-辛烷二硫醇0.7g(3.9mmol)充分溶解于10mL的甲醇中，加入2-3滴三乙胺反应过夜，然后在冰乙醚中沉淀出油状固体，产率90.6％。

TCB氢核磁共振谱图(400MHz，CD₃OD)见附图2：¹H NMR CB上的两个甲基峰(δ2.9-3，-CH₃)，氧附近的亚甲基峰(δ3.2-3.8，-OCH₂CH₂)，硫附近的亚甲基峰(δ2.5-2.8，-CH₂)，季胺上的甲基(δ2.82，-CH₃)，羧基(δ4.00，COO-)。

实施例3

HP-CB的合成，其合成路线及过程如下：

氮气保护下，称取聚合物HP-AC 1.0g(4.81mmol AC单元)和三乙胺0.16g(1.57mmol)溶于10mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌逐滴滴加溶于15mL甲醇的TCB(1.29g，3.14mmol)，常温下反应过夜。反应结束后，反应液用透析袋(Spectra/Pore，MWCO 3500)收集在高纯水中透析以除去多余的TCB和有机溶剂。透析结束后，冻干得到产物两性离子化的聚合物HP-CB。

HP-CB氢核磁共振谱图(400MHz，DMSO-d₆)见附图3：碳酸酯的氧旁边的亚甲基峰(δ3.8-4.2，-OCH₂-)，TCB结构中N原子上的甲基峰(δ3.0，-CH₃)，结构中的双键峰(δ5.9-6.4，-CH＝CH₂)。

实施例4

(1)两性离子化载药纳米粒子制备

取10mgHP-CB加入到1mL甲醇中，充分搅拌使聚合物溶解，得到10mg/mL的聚合物溶液。取100μL HP-CB溶液与一定量胰岛素酸性水溶液(15mg/mL)充分混合后，逐滴滴加到1mL高纯水中，搅拌、超声数次，得到未交联的两性离子化载药纳米粒子。接着，向其中加入0.05mg的光引发剂I2959，搅拌均匀后，紫外灯照射15min，最后高纯水中透析除去光引发剂和甲醇，得到光交联的两性离子化载胰岛素纳米粒子(HP-CB@insulin NPs)。

附图4为包载总质量30％的胰岛素的纳米粒子粒径图，平均粒径在200nm左右，PDI为0.12。

(2)两性离子化载药纳米粒子的载药量和包封率测定

质量包封率和载药量通常用来表示聚合物包载药物的能力。本文采用间接法，利用BCA蛋白检测法测量未被包载在聚合物微胶囊中的游离胰岛素的含量，通过测得游离的胰岛素质量，进一步计算载药量和包封率。其中载药量是包载在胶束的药量和总质量(载体和包载的药量)的百分数，质量包封率是指包载在胶束的药量和投药量的质量百分数，计算公式分别如下：

其中，m_总为投入胰岛素质量(mg)，m_游为游离胰岛素质量(mg)；m_药为包载在胶束内胰岛素的质量(mg)，m_载体为聚合物的质量(mg)。

如表1，在理论载药量(即胰岛素/载药聚合物质量比例)为10、15、20和25wt％时，载药纳米粒子对胰岛素的包封率约为60-91％。

表1载胰岛素纳米粒子的表征

实施例5

两性离子化纳米粒子(HP-CB NPs)的细胞毒性实验(MTT)

HP-CB纳米粒子的细胞毒性实验采用MTT法。细胞毒性实验中采用了两种细胞，分别是人结肠癌细胞(Caco-2)和人结直肠癌细胞(HT-29)细胞。人结肠癌细胞(Caco-2)和人结直肠癌细胞(HT-29)细胞分别在5％二氧化碳条件下，含有10％血清的DMEM培养基中培养，细胞密度为5000个/孔。24小时后，加入10μL PBS和不同浓度的HP-CB纳米粒子(浓度分别为50、100、250、500、1000μg/mL)，共孵育24小时，接着加入10μLMTT(5mg/mL)，继续培养4小时。除去培养基，每孔加入100μL DMSO，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在570nm测定吸光度。结果见附图5。随着纳米粒子的浓度的增加，与空白细胞培养液中细胞活性相比，加入纳米粒子的细胞培养液中的细胞活性没有明显降低，并且存活率在90％以上，因此，该纳米粒子对生物细胞基本没有毒性。

实施例6

两性离子化纳米粒子(HP-CB NPs)Caco-2和HT-29细胞的细胞摄取实验

对HP-CB纳米粒子的细胞摄取能力进行了实验，细胞摄取实验中采用了两种细胞，分别是人结肠癌细胞(Caco-2)和人结直肠癌细胞(HT-29)细胞。人结肠癌细胞(Caco-2)和人结直肠癌细胞(HT-29)细胞分别在5％二氧化碳条件下，含有10％血清的DMEM培养基中培养，细胞密度为10000个/孔。24小时后，加入50μL荧光标记的HP-CB纳米粒子，共孵育3小时。之后吸出培养基，加入300μL4％多聚甲醛溶液固定20分钟，PBS溶液清洗3次。加入200μLDAPI染液(5μg/mL)，培养20分钟。吸出DAPI溶液，PBS溶液清洗3次。拍摄共聚焦显微图像。实验结果如附图6所示，结果显示人结肠癌细胞(Caco-2)和人结直肠癌细胞(HT-29)细胞对HP-CB纳米粒子具有良好的细胞摄取能力，表明两性离子化纳米粒子具有良好的粘液穿透和跨上皮细胞能力。

实施例7

两性离子化纳米粒子(HP-CB NPs)Caco-2细胞的细胞摄取抑制实验

对HP-CB纳米粒子细胞摄取机制进行了试验验证。本实验中采用了人结肠癌细胞(Caco-2)。将Caco-2细胞在5％二氧化碳条件下，含有10％血清的DMEM培养基中培养，分为3组，细胞密度为10000个/孔。24小时后，其中两组分别加入50μL甜菜碱溶液(5mg/mL)和L-色氨酸溶液(5mg/mL)，第三组作为对照组，加入等体积的PBS溶液。共孵育2小时后，用新鲜的培养基替换原有的培养基，接着三组都加入50μL荧光标记的HP-CB纳米粒子，共孵育3小时。最后，用PBS清洗细胞3次，进行细胞流式分析，实验结果如图7所示。结果显示，相比对照组，添加了甜菜碱和L-色氨酸两组的荧光强度显著减小，而甜菜碱和L-色氨酸是PAT1受体蛋白的作用底物，表明HP-CB纳米粒子是通过PAT1受体蛋白介导跨膜转运的。

实施例8

两性离子化载药纳米粒子体内降血糖实验

以链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠为动物模型，分别给药以评估其载药纳米粒子治疗I型糖尿病的体内表现。将高血糖模型小鼠随机分为3组，每组3只老鼠，分别口服给药HP-CB@insulin NPs、Blank HP-CB NPs以及皮下注射游离胰岛素(其中，游离胰岛素剂量为5U/kg，口服给药剂量为50U/kg)。以健康小鼠为对照，进行体内实验。通过尾静脉采集血样(～3μL)，用血糖仪连续监测血糖变化并记录。血糖变化曲线如附图7所示。结果显示，皮下注射胰岛素后，小鼠血糖迅速下降，持续不到2小时，血糖又恢复为高血糖。而实验组口服载有胰岛素的纳米粒子后，血糖持续时间显著增加，可以维持5小时的降糖时间，能够有效改善注射给药带来的伤口感染、患者依从性差等问题。

Claims

1.一种两性离子化载药纳米粒子，其特征在于，由两性离子化超支化聚碳酸酯与蛋白质药物胰岛素混合自组装，加入光引发剂，经紫外灯照射，得到光交联的两性离子化载药纳米粒子，所述两性离子化超支化聚碳酸酯如式1：

。

2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述两性离子化超支化聚碳酸酯，由丙烯酸酯环碳酸酯（AC）和巯基乙醇通过开环聚合得到超支化的聚碳酸酯（HP-AC），然后与巯基化的两性离子进行Michael加成反应，得到两性离子化超支化聚碳酸酯（HP-CB），具体包括如下步骤：

（1）巯基化两性离子的合成：

将两性离子溶于有机试剂，加入含有二巯基结构的分子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有巯基分子修饰的两性离子：

；

（2）超支化聚碳酸酯（HP-AC）的合成：

（3）两性离子化超支化聚碳酸酯（HP-CB）的合成：

将步骤（2）中制备的聚合物溶于有机试剂中，加入步骤（1）中制备巯基化的两性离子，再加入催化剂，在氮气保护下反应得到含有两性离子结构修饰的聚合物。

3.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述丙烯酸酯环碳酸酯（AC）和巯基乙醇的摩尔比为3-10：1。

4.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述的巯基化两性离子和超支化聚碳酸酯（HP-AC）的摩尔比为3-9：10。

5.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，具有电中性表面性质以及亲水性，可实现黏液穿透效果。

6.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，该两性离子化载药纳米粒子是通过肠上皮细胞PAT1受体蛋白介导跨膜转运，同时不打开紧密连接，避免肠漏导致的细菌感染、炎症性肠病。