CN111110630B - 跨血脑屏障药物递送体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物传递体系领域，具体涉及一种新型跨血脑屏障药物递送体系及其制备方法和应用。新型跨血脑屏障药物递送体系包括双亲肽包封聚多巴胺纳米颗粒的胶束。所述的胶束直径为160～270纳米，电位为10～30毫伏。聚多巴胺纳米颗粒的直径为120～200纳米，电位为‑60～40毫伏。本申请的新型跨血脑屏障药物递送体系具有：(1)良好的生物相容性和生物降解性。(2)易操作和合成可控，使纳米颗粒可以大规模生产。(3)强大的功能化能力，使得纳米颗粒易于被某些靶向分子修饰，并具有良好的药物传递效果。(4)具有较高的诊断和治疗效率。
Description
技术领域
本发明属于药物传递体系领域，具体涉及一种跨血脑屏障药物递送体系及其制备方法和应用。
背景技术
最常见和最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤之一是由胶质细胞引起的胶质瘤，而这些恶性胶质瘤的治疗是肿瘤学中最艰巨的挑战之一。虽然放疗、化疗和手术相结合，恶性胶质瘤患者的预后仍然很差，平均生存期为15～22个月。由于胶质瘤的浸润生长，在保留重要脑功能的情况下，很难完全切除肿瘤。无创治疗是改善胶质瘤生存条件的一个有希望的方向。然而，在神经胶质瘤治疗中，令人失望的结果背后的一个最显著的障碍是血脑屏障(BBB)和血肿瘤屏障 (BTB)的存在，它们作为一种要塞来阻止潜在的活性治疗化合物的传递。此外，肿瘤对药物的固有敏感性、肿瘤细胞对药物的吸收受限、细胞内药物代谢和细胞耐药机制等都是导致胶质瘤化疗疗效不佳的重要原因。研究人员发现，在晚期胶质瘤中，BBB的完整性可能受到损害，而肿瘤细胞仍可能受到BTB的保护，不受化疗的影响。因此，如何在降低对正常组织细胞的副作用的同时，有效地将活性药物传递给脑肿瘤细胞，提高治疗效果和患者生存，是目前研究的重点。因此，很明显，迫切需要具有高血脑屏障/血肿瘤屏障通透性的有效药物递送体系。
近红外光响应纳米粒子可将吸收的近红外光能转化为热能，为肿瘤的光声成像引导光热治疗提供了理想的平台。然而，开发该平台的关键问题是如何在单个纳米颗粒中实现光声成像和光热治疗的最佳结合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种跨血脑屏障药物递送体系。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种跨血脑屏障药物递送体系，包括双亲肽包封聚多巴胺纳米颗粒的胶束。
所述的胶束直径为160～270纳米，电位为10～30毫伏。
所述的胶束直径为198纳米，电位为22.3毫伏。
聚多巴胺纳米颗粒的直径为120～200纳米，电位为-60～40毫伏。
聚多巴胺纳米颗粒的直径为135～176纳米，电位为-51～22.8毫伏。
双亲肽的主体为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列 C18-GRRRRRRRRGDS。
本申请还包括一种所述的跨血脑屏障药物递送体系的制备方法，包括下述步骤：
1)将双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液混合后放置于超声波清洗仪中，在温度5-25摄氏度、功率15-30千赫兹条件下，充分混合20-40分钟；得到复合双亲肽纳米胶束产物；
2)将步骤1)得到的上述复合双亲肽纳米胶束转移至截留分子量为800-1500 道尔顿的透析袋，透析36-72小时即得。
其中，所述的聚多巴胺的合成方法为，称取75重量份盐酸多巴胺溶于55 重量份超纯水中，逐滴加入1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为8.5。将该混合物在温度为45摄氏度，磁力搅拌器转速为500转/分钟的条件下，反应5 小时。反应结束后，用高速离心机离心(13800转/分钟)并水洗，重复三次。
所述的聚多巴胺纳米颗粒直径为135.34纳米，电位为-30.9毫伏。
所述的双亲肽超纯水溶液的浓度为5-15毫克/毫升；所述的聚多巴胺超纯水溶液的浓度为0.5-2.5毫克/毫升的溶液；双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液的体积比为2:1-1:1。
本申请还包括一种所述的跨血脑屏障药物递送体系的应用，其特征在于，应用于脑胶质瘤的化疗与光动力协同治疗领域。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
聚多巴胺具有良好的生物相容性，在光学和电学上显示出黑色素的主要特性。聚多巴胺的另一个优点是它的化学结构中含有各种官能团，包括儿茶酚、胺和亚胺。这些官能团使聚多巴胺能够紧密地附着在纳米材料的表面，并作为桥梁或涂层，以促进进一步的修饰。另外，聚多巴胺还是一种理想的光热剂，因为它在近红外区域有吸收。由于这些特性，各种各样的基于聚多巴胺的纳米颗粒被制造出来用于药物传递和癌症治疗。
而多肽具有良好的生物可降解性和生物相容性，能够赋予材料独特的生物学功能，易于合成和化学修饰也是多肽分子的突出优势。其中，双亲肽既含有疏水基团，又含有亲水基团，脂肪族疏水基团通过疏水作用形成疏水性内核，可包裹疏水性材料，在水中自组装成稳定的胶束。其次，自组装形成的纳米药物既可以通过瘤内注射的方法，也可以通过静脉注射的方法送入患者体内，治疗方式灵活，避免了其他治疗方式给患者带来的痛苦。
本申请中以主体为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列的C18-GRRRRRRRRGDS的双亲肽自组装成纳米胶束，内部包裹聚多巴胺；结果表明：制备的聚多巴胺纳米颗粒、双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束的粒径均在250纳米以内，在血脑屏障允许穿过的载药颗粒的粒径范围之内。并且，这种复合纳米胶束具有很好的光热效应，随着激光辐照时间的推移温度逐渐升高。随着复合胶束浓度的增加细胞存活率有所降低。
总之，本申请的跨血脑屏障药物递送体系具有：(1)良好的生物相容性和生物降解性。(2)易操作和合成可控，使纳米颗粒可以大规模生产。(3)强大的功能化能力，使得纳米颗粒易于被某些靶向分子修饰，并具有良好的药物传递效果。(4)具有较高的诊断和治疗效率。
附图说明
图1为实验通过三种不同方法制备的聚多巴胺纳米颗粒的粒径图；
图2为不同纳米颗粒及纳米胶束的粒径和zeta电位图，n＝3；
图3为实验制得的双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束的粒径图；
图4为实验制得的聚多巴胺纳米颗粒在激光辐照下的温度变化曲线图；
图5为双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束在激光辐照下的温度变化曲线图；
图6为激光辐照后将复合纳米胶束与U87MG细胞共孵育24小时后的细胞毒性图；
图7为激光辐照后将复合纳米胶束与U87MG细胞共孵育72小时后的细胞毒性图；
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：聚多巴胺纳米颗粒的制备，将3毫升氨水、40毫升乙醇、90毫升蒸馏水混合，在温度为30摄氏度，磁力搅拌器转速为500转/分钟的条件下，搅拌30分钟。搅拌结束后，称取0.5克盐酸多巴胺溶于10毫升超纯水中，并将其加入步骤1)所述的溶液中，在温度为30摄氏度，磁力搅拌器转速为500 转/分钟的条件下，反应24小时。反应结束后，用高速离心机离心(13800转/ 分钟)并水洗，重复三次。
所述的聚多巴胺纳米颗粒直径为176.24纳米，电位为-51.5毫伏。
实施例2：聚多巴胺纳米颗粒的制备，称取75毫克盐酸多巴胺溶于55毫升超纯水中，逐滴加入350微升的1摩尔每升的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为8.5。将该混合物在温度为45摄氏度，磁力搅拌器转速为500转/分钟的条件下，反应5小时。反应结束后，用高速离心机离心(13800转/分钟)并水洗，重复三次。
所述的聚多巴胺纳米颗粒直径为135.34纳米，电位为-30.9毫伏。
实施例3：聚多巴胺纳米颗粒的制备，称取10毫克盐酸多巴胺溶于30毫升 100毫摩尔每升的三羟甲基-氨基甲烷缓冲液中，控制溶液的pH为8.5，反应6 小时。反应结束后，离心(13000-20000转每分钟)并水洗，重复三次。
所述的聚多巴胺纳米颗粒直径为160.83纳米，电位为22.8毫伏。
图1示出实验实施例1-3制备的聚多巴胺纳米颗粒的粒径图；实施例1-3 分别对应方法一、二、三。
实施例2为最优实施例，以实施例2为聚多巴胺纳米颗粒制备方法，进行用于脑胶质瘤的可高效载药复合纳米胶束的制备：
实施例4：用于脑胶质瘤的可高效载药复合纳米胶束的制备：
1)将双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液混合后放置于超声波清洗仪中；在温度20摄氏度、功率28千赫兹条件下，充分混合20-40分钟、得到复合双亲肽纳米胶束产物；其中，所述的双亲肽超纯水溶液的浓度为10毫克/毫升；所述的聚多巴胺超纯水溶液的浓度为2毫克/毫升的溶液。所述的双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液的体积比为2:1。
2)将步骤1)得到的上述复合双亲肽纳米胶束转移至截留分子量为1000道尔顿的透析袋，透析48～72小时即得具有靶向整合素αvβ3的多模式治疗鼻咽癌的复合纳米胶束(以下简称纳米胶束),通过冻干法确定所制得的复合纳米胶束的浓度。所述的纳米胶束直径为198.17纳米，电位为22.3毫伏。
图2为不同纳米颗粒及纳米胶束的粒径和zeta电位图，n＝3；图3为实验制得的双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束的粒径图；
进行测试说明：
1、聚多巴胺纳米颗粒的光热实验：首先取实验制得的聚多巴胺溶液1毫升于样品池中，将其放置在升降台上，调整高度，使得808纳米半导体激光仪发射出来的光束正好辐照在样品池中溶液的正中央，控制样品池与808纳米半导体激光仪发射端口的距离为1厘米，调整808纳米半导体激光仪的功率，分别设置为1、2、3、4、5瓦，辐照时间为3分钟，观察样品池中溶液温度随时间的变化情况。
2、双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束的光热实验：
首先取实验制得的聚多巴胺溶液1毫升于样品池中，将其放置在升降台上，调整高度，使得808纳米半导体激光仪发射出来的光束正好辐照在样品池中溶液的正中央，控制样品池与808纳米半导体激光仪发射端口的距离为1厘米，调整808纳米半导体激光仪的功率设置为1瓦，辐照时间为3分钟，观察样品池中溶液温度随时间的变化情况。图4为实验制得的聚多巴胺纳米颗粒在激光辐照下的温度变化曲线图，图中1、2、3、4、5W分别为激光辐照功率，辐照时间为3分钟；图5为双亲肽包封聚多巴胺纳米胶束在激光辐照下的温度变化曲线图；
3、用于脑胶质瘤的复合纳米胶束对U87MG细胞的毒性(包含无激光照射组和激光照射组)：
1)无激光照射组铺5*7的96孔板，激光照射组铺12*7的96孔板，共3 组，六盘，除空白组只加培养基外，其他组每个孔加入U87MG细胞和100微升培养基，贴壁培养24小时。
2)取出吸除培养基，在空白组和对照组中加入100微升培养基，在实验组中分别加入浓度1，10，50，100，200微克/毫升的加药溶液100微升，培养24 小时，48小时，72小时。
3)激光照射组每一浓度为12孔，分为3组，每组4孔，分别照射30秒， 1分钟，2分钟的1瓦的激光。
4)取出每孔加入10微升cck-8，继续培养1小时。
5)酶标仪450纳米处检测吸光值。
根据公式计算细胞存活率，排除最大值和最小值：
细胞存活率＝(OD-ODblk)平均/(OD0-ODblk)平均×100％
图6为激光辐照后将复合纳米胶束与U87MG细胞共孵育24小时后的细胞毒性图；图7为激光辐照后将复合纳米胶束与U87MG细胞共孵育72小时后的细胞毒性图；从图中可以看出，我们合成的复合纳米胶束经激光辐照后对U87MG细胞的毒性较大，且随着浓度的增加，细胞存活率降低。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (1)
1.一种跨血脑屏障药物递送体系的制备方法：其特征在于，包括下述步骤：
1）将双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液混合后放置于超声波清洗仪中；在温度20摄氏度、功率28千赫兹条件下，充分混合20-40分钟、得到复合双亲肽纳米胶束产物；其中，所述的双亲肽超纯水溶液的浓度为10毫克/毫升；所述的聚多巴胺超纯水溶液的浓度为2毫克/毫升的溶液，所述的双亲肽超纯水溶液与聚多巴胺超纯水溶液的体积比为2:1；
其中所述的聚多巴胺采用下述方式制备：称取75毫克盐酸多巴胺溶于55毫升超纯水中，逐滴加入350微升的1摩尔每升的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为8.5，将该混合物在温度为45摄氏度，磁力搅拌器转速为500转/分钟的条件下，反应5小时；反应结束后，用高速离心机在13800转/分钟条件下离心并水洗，重复三次；得到的聚多巴胺纳米颗粒直径为135.34纳米，电位为-30.9毫伏；
2）将步骤1）得到的上述复合双亲肽纳米胶束转移至截留分子量为1000道尔顿的透析袋，透析48～72小时即得纳米胶束,通过冻干法确定所制得的复合纳米胶束的浓度；所述的纳米胶束直径为198.17纳米，电位为22.3毫伏。
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