CN115531309B - 一种肝靶向聚合物胶束递药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝靶向聚合物胶束递药系统及其制备方法和应用。所述递药系统是由丙烯酰碳酸酯与内酯开环聚合形成双键可修饰聚合物，然后分别经过两性离子材料和胆酸衍生物修饰，形成两种修饰后的聚合物，二者以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后进行紫外光交联，形成所述的肝靶向聚合物胶束递药系统。该聚合物胶束递药系统以胆酸衍生物作为靶向载体，盐酸小檗碱促进胰岛素诱导的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取。联合使用盐酸小檗碱与胰岛素，可以减少胰岛素用量，降低低血糖风险，增加胰岛素敏感性，协同提升降糖效果。经紫外光照射形成交联结构，提高了胰岛素和盐酸小檗碱的抗胃酸能力，增加聚合物胶束的稳定性以避免突释，实现长效降糖。

Description

一种肝靶向聚合物胶束递药系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种肝靶向聚合物胶束递药系统及其制备方法和应用，属于高分子材料学和药物制剂领域。
背景技术
糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性疾病，属于代谢障碍型内分泌疾病，2型糖尿病占我国糖尿病患者的大多数，病程长的2型糖尿病患者常伴有严重并发症(Nutr Metab(Lond),2017,14:60.)。目前临床主要通过注射外源胰岛素治疗糖尿病，但皮下注射剂量稍有偏差就会造成低血糖，而且糖尿病患者需要多次注射，会造成患者疼痛和局部皮肤组织坏死。口服胰岛素是一种便捷的胰岛素制剂，然而胃肠道作为最为主要的口服药物吸收部位，存在复杂的生理屏障严重阻碍了胰岛素的吸收。聚合物纳米载体递送蛋白质药物稳定可靠，聚合物载体可以使嵌入的胰岛素抵抗pH变化和酶消化，并调节胰岛素的释放曲线，在改善胰岛素的口服吸收效果方面成果显著(Biomaterials,2011,32(36):9826-9838)。CN113230232公开了一种pH敏感可降解的两性离子微胶囊及其制备方法和应用，其制备的包载蛋白质药物的两性离子微胶囊口服后在抗胃部酸性环境和肠道跨膜转运方面的有一定的优势，但由于制备的微囊缺乏肝靶向能力，以及微囊跨膜效率不够高，制备的微囊生物利用度较低。
蛋白药物克服胃肠道屏障后进入血液，大部分药物进入血液循环后经过门静脉进入肝脏。肝脏是胰岛素的主要作用器官，其作用于肝脏上的胰岛素受体，促进肝脏对葡萄糖的摄取并将其转化为肝糖原。药物需要在靶器官达到有效蓄积，才能精准发挥治疗作用。胆酸是一种内源性肝细胞特异性天然配体，具有较好的生物兼容性。在肝肠循环的过程中，仅有少量胆酸进入血液，因此胆酸具有高度的器官特异性。以胆酸衍生物为靶向载体，不仅能够实现药物的肝靶向，还能减少毒副作用，提高药物的口服生物利用度。Bao等人制备了具有葡聚糖和胆酸表面的胰岛素纳米颗粒，该纳米颗粒实现了靶向运送胰岛素至肝脏的目的，增强了胰岛素在肠道和肝脏中的口服吸收，并将纳米颗粒口服生物利用度提高至20.5％(J Mater Chem B.2021,31(7):6234-6245)。
常用的降血糖药物除了胰岛素以外，盐酸小檗碱(BBR)已被证实在体内外具有明确的降血糖疗效，其发挥作用的主要部位是肝脏。在胰岛素存在下，盐酸小檗碱对胰岛素诱导的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取具有协同作用，盐酸小檗碱通过抑制线粒体的功能，刺激糖酵解和激活AMPK通路来降低血糖，它在治疗糖尿病的同时还能治疗相关的一些并发症(中国中药杂志,2014,39(08):1374-1378)。BBR可降低STZ诱导的小鼠的血糖水平，改善了胰岛素和葡萄糖耐量，BBR同时减弱了胰高血糖素诱导的肝细胞中葡萄糖的产生和糖异生基因的表达，可能是通过减少cAMP导致CREB的磷酸化，抑制了乳酸和胰高血糖素诱导的肝糖异生(Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2020:6210526)。
上述研究虽然能在一定程度上起到降低高血糖的效果，但对同时具有高效肠道跨膜转运能力、克服胃肠道屏障能力、肝靶向能力和更高效降糖效果的口服药物载体研究较少，使降糖药物生物利用度大打折扣，这可能是限制药物发挥降糖作用的主要原因。
发明内容
发明目的：本发明第一目的是提供一种肝靶向聚合物胶束递药系统，本发的第二目的是提供一种肝靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，本发明的第三目的是提供该肝靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗糖尿病药物中的应用。
技术方案：本发明所述一种肝靶向聚合物胶束递药系统，所述递药系统是由丙烯酰碳酸酯(AC)与内酯开环聚合形成双键可修饰聚合物，然后分别经过两性离子材料和胆酸衍生物修饰，形成两种修饰后的聚合物，二者以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后进行紫外光交联，形成所述的肝靶向聚合物胶束递药系统。
进一步地，所述内酯为ε-己内酯(ε-CL)、δ-戊内酯(δ-CL)或聚氨基甲酸酯(PU)。
进一步地，所述两性离子材料为羧酸甜菜碱(CB)或磺基甜菜碱(SB)等。
进一步地，所述胆酸衍生物为熊去氧胆酸或脱氧胆酸。
进一步地，所述两性离子材料修饰，是由两性离子材料与含巯基结构的化合物反应后，再通过迈克尔加成反应在双键可修饰聚合物的AC端的碳碳双键上部分连接。
进一步地，所述含巯基结构的化合物为3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇(2S)。
进一步地，所述胆酸衍生物修饰，是先通过迈克尔加成反应于双键可修饰聚合物的AC端的碳碳双键上连接含有酰胺结构的化合物，再催化其发生水解反应得到含氨基结构的化合物，最后通过酰胺反应连接胆酸衍生物。
进一步地，所述二者以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后进行紫外光交联，是将两种修饰后的聚合物溶解后，按照两性离子修饰聚合物与胆酸衍生物修饰聚合物物质的量比为1:(1-4)混合，再与胰岛素和盐酸小檗碱混合自组装，最后加入交联剂和光引发剂，经紫外光照射，得到聚合物胶束溶液
本发明所述肝靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)双键可修饰聚合物的制备：
提前蒸馏制备无水内酯，在氮气保护下，将丙烯酰碳酸酯AC溶解于有机溶剂中，加入引发剂与无水内脂，再加入催化剂，油浴加热反应。加入终止剂终止反应后，沉淀，干燥，得到双键可修饰聚合物；
(2)两性离子修饰聚合物的制备：
先用有机溶剂溶解两性离子材料和含有巯基结构的化合物，在氮气保护下，加入催化剂催化反应，得到含有巯基结构的两性离子材料。将步骤(1)中制备的双键可修饰聚合物与含巯基结构的两性离子材料混合，在氮气保护下，加入催化剂催化反应，得到两性离子修饰的聚合物；
(3)胆酸衍生物修饰聚合物的制备：
将步骤(1)中制备的双键可修饰聚合物溶于有机溶剂中，加入含有酰胺结构的化合物，再加入催化剂，在氮气保护下反应，得到连接酰胺修饰部分的聚合物，再次加入催化剂，使其中的酰胺结构水解，得到氨基结构修饰的聚合物，该氨基结构修饰的聚合物与胆酸衍生物溶于有机溶剂中，加入活化剂进行活化，通过酰胺反应连接胆酸衍生物，得到胆酸衍生物修饰的聚合物；
(4)聚合物胶束制备：
将步骤(2)得到的两性离子修饰的聚合物和(3)得到的胆酸衍生物修饰的聚合物溶于有机溶剂中，与溶剂分别溶解的胰岛素和盐酸小檗碱混匀，加入交联剂和光引发剂，紫外照射得到光交联的聚合物胶束溶液。
进一步地，步骤(1)中，所述有机溶剂为甲苯或无水二氯甲烷。
进一步地，步骤(1)中，所述催化剂为Zinc或辛酸亚锡。
进一步地，步骤(1)中，所述引发剂为异丙醇或巯基乙醇。
进一步地，步骤(1)中，所述终止剂为冰醋酸。
进一步地，步骤(2)中，步骤(3)以及步骤(4)中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)，所述催化剂为三乙胺(TEA)。
进一步地，步骤(2)中，所述含有巯基结构的化合物为3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇(2S)。
进一步地，步骤(2)中，制备两性离子修饰的化合物时，双键可修饰聚合物中双键的数量与含巯基的两性离子材料中巯基的数量比为1:(1.1-10)。
进一步地，步骤(3)中，所述含有酰胺结构的化合物为N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸Cys(Boc)。
进一步地，步骤(3)中，所述酰胺结构水解时氨基保护剂为用三氟乙酸。
进一步地，步骤(3)中，所述活化剂为碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。
进一步地，步骤(3)中，制备胆酸衍生物修饰聚合物时，双键可修饰聚合物中双键的数量与含有酰胺结构的化合物中巯基的数量比为1:(1.1-10)。
进一步地，步骤(4)中，所述两性离子修饰的聚合物与胆酸衍生物修饰的聚合物的物质的量比为1:(1-4)。
进一步地，步骤(4)中，所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2929)。
进一步地，步骤(4)中，所述交联剂为羧酸甜菜碱(CB)。
进一步地，步骤(4)中，溶解胰岛素的溶剂为盐酸溶液和DMSO。
进一步地，步骤(4)中，溶解盐酸小檗碱的溶剂为DMF。
其制备过程作为优选地，
(1)双键可修饰聚合物的制备：
提前蒸馏制备无水ε-己内酯，将AC溶于适量的甲苯中，加入二氯甲烷溶解的异丙醇作为引发剂，再加入无水ε-己内酯，混匀后加入二氯甲烷和催化剂辛酸亚锡，油浴加热反应。最后加入终止剂终止反应，沉淀，干燥，得到双键可修饰聚合物PAC-PCL；
(2)两性离子修饰聚合物的制备：
用甲醇溶解羧酸甜菜碱，加入少量2S，补加少量甲醇后加入几滴三乙胺，在氮气保护下反应过夜，浓缩后在冰乙醚中沉淀出巯基化的羧酸甜菜碱(TCB)固体。将聚合物PAC-PCL溶于DMF中，按照PAC-PCL：TCB物质的量比为1:(2-4)加入TCB固体，加入几滴三乙胺催化，在氮气保护下反应过夜。在冰乙醚中沉淀出固体，得到羧酸甜菜碱修饰的聚合物PAC-PCL-TCB。
(3)胆酸衍生物修饰聚合物的制备：
将聚合物PAC-PCL溶于DMF中，加入用甲醇溶解的Cys(Boc)，滴加三乙胺，在氮气保护下反应过夜，用冰乙醚沉淀得到PAC-PCL-Cys(Boc)。用二氯甲烷溶解少量PAC-PCL-Cys(Boc)，加入三氟乙酸作为催化剂，使之发生水解反应脱羧基，得到PAC-PCL-NH2。将PAC-PCL-NH2用DMF溶解并活化，用DMF溶解熊去氧胆酸，并加入碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化，将活化后的溶液混合，反应过夜。在二氯甲烷中透析，于冰乙醚中沉淀，得到熊去氧胆酸修饰的聚合物固体(PAC-PCL-UDCA)。
(4)聚合物胶束及载胰岛素、盐酸小檗碱聚合物胶束制备：
将步骤(2)得到的两性离子修饰的聚合物和(3)得到胆酸衍生物修饰的聚合物溶于有机溶剂中，与有机溶剂分别溶解的胰岛素和盐酸小檗碱混匀，加入交联剂和光引发剂，紫外照射，得到光交联的聚合物胶束溶液。
进一步地，按照物质的量比为1:(1.5-2.5)称取得到的聚合物PAC-PCL-TCB与PAC-PCL-UDCA并用分别用DMF溶解，用pH 2.0的盐酸溶液和DMSO分别溶解胰岛素，用DMF溶解盐酸小檗碱(BBR)，将上述四种溶液混合，加入用DMF溶解的CB作为交联剂，加入适量光引发剂，紫外照射得到光交联的聚合物胶束溶液。
本发明所述肝靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗糖尿病药物中的应用。
进一步地，应用时，将两性离子材料和胆酸衍生物修饰的两种聚合物材料混合，加入胰岛素和盐酸小檗碱两种降糖药物，与紫外光交联技术有机结合，以自组装的方式制备载药聚合物胶束。在混合自组装的过程中，加入胰岛素与盐酸小檗碱，与两性离子修饰的聚合物和胆酸衍生物修饰的聚合物共同组装成载胰岛素和盐酸小檗碱的混合聚合物胶束溶液。
本发明所述的肝靶向聚合物胶束递药系统是先由丙烯酰碳酸酯(AC)与内酯聚合形成双键可修饰聚合物，然后分别经过两性离子材料和胆酸衍生物修饰，得到两种修饰后的聚合物，两种载体材料以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后进行紫外光交联，形成所述的肝靶向聚合物胶束递药系统。
本发明首次合成并同时使用两性离子修饰的聚合物与胆酸衍生物修饰的聚合物两种聚合物材料，两性离子修饰的聚合物可以增加胶束跨上皮细胞的能力，促进肠道对蛋白质药物的吸收；胆酸衍生物修饰的聚合物通过ASBT介导跨膜，再利用其本身的正电荷效应逃逸溶酶体内含体，经IBABP通道出胞，最终通过肠肝循环携带药物进入靶器官肝脏，并直接作用于肝脏上的胰岛素受体。胆酸衍生物修饰的聚合物可以增加降糖药物在肝脏中的蓄积，促进肝脏对葡萄糖的摄取并将其转化为肝糖原，使药物的生物利用度得到大幅提高。而且胆酸衍生物作为内源性的天然配基，具有较好的生物兼容性，有效降低药物的毒副作用。紫外光交联可以有效提高载体稳定性，实现药物长效循环，在糖尿病的治疗方面有潜在的应用前景。
有益效果：相对于现有技术，具有如下优势：
(1)本发明设计的聚合物胶束递药系统使用了胆酸衍生物，具有肝靶向能力，可以携带药物进入靶器官肝脏。肝靶向技术的应用能够增加药物在肝脏中的蓄积，发挥精准治疗作用，提高口服给药的生物利用度，实现药物较长效循环。胰岛素直接作用于肝脏上的胰岛素受体，促进肝脏对葡萄糖的摄取并将其转化为肝糖原。盐酸小檗碱发挥作用的主要部位是肝脏，对胰岛素诱导的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取具有协同作用。有效提高胰岛素的生物利用度。
(2)本发明选用的环状碳酸酯类化合物丙烯酰碳酸酯(AC)和内酯，容易通过开环聚合反应得到高分子聚合物，开环反应操作简便、可控，聚碳酸酯类化合物已被证明毒性低，在体内可被降解，安全有效。
(3)本发明利用碳碳双键与巯基的迈克尔加成反应，在聚合物上修饰目标分子，操作简便，条件简单。
(4)本发明利用PAC上的双键实现紫外光交联固化，用CB作为交联剂增加胶束的稳定性，在血浆pH环境中交联结构被破坏，释放降糖药物降低血糖。光交联固化确保释放时胰岛素载体稳定，避免因载体不稳定导致突然释放过量的胰岛素，引起低血糖风险，实现长效循环效果。
(5)本发明设计的肝靶向聚合物胶束递药系统制备的纳米载体同时包裹胰岛素和盐酸小檗碱两种降糖药物，胰岛素是常用的降糖药物，盐酸小檗碱能够增加机体对胰岛素的敏感性，对胰岛素诱导的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取具有协同作用。两种药物联合使用，可以减少胰岛素的用量，降低低血糖风险，有效提高药物生物利用度。
附图说明
图1为实施例1中PAC-PCL-TCB的氢核磁图谱；
图2为实施例2中PAC-PCL-NH2的氢核磁图谱；
图3为实施例3中PAC-PCL-UDCA的氢核磁图谱；
图4为实施例4对照组中Blank ACT、ACT@insulin、ACT@BBR、ACT@(insulin+BBR)粒径图；
图5为实施例4实验组中Blank ACT、ACT@insulin、ACT@BBR、ACT@(insulin+BBR)粒径图
图6为载药聚合物胶束体外酸响应释放图；
图7为Caco-2，HT-29和AML12细胞毒性试验的细胞存活率示意图；
图8为聚合物胶束Papp水平图；
图9为聚合物胶束TEER图；
图10为载药聚合物胶束体内降糖血糖水平图；
图11为载药聚合物胶束体内降糖图；
图12为细胞C-肽浓度示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
PAC-PCL-TCB的合成，合成路线及过程如下：
(1)首先合成PAC-PCL：提前蒸馏制备无水ε-己内酯。在充满N2的手套箱内称取1.5g AC(0.75mmol)固体，用12mL甲苯溶解。另取70滴二氯甲烷溶解70mg异丙醇，滴入聚合瓶18滴作为引发剂。加入7.5g(65.79mmol)己内酯，补加20mL二氯甲烷及4滴辛酸亚锡催化剂。密封并移至实验操作台，100℃油浴加热24小时，反应结束时滴加3滴冰醋酸终止反应。将反应后得到的溶液滴到420mL冰乙醚(体积为反应液的10-15倍)中沉淀，生成絮状沉淀后离心取沉淀。真空干燥后，称重得产物7.133g，PAC-PCL产率为79.26％。
(2)再合成羧酸甜菜碱修饰的聚合物PAC-PCL-TCB：精密称取CB 0.3g(1.32mmol)并用2-3mL甲醇溶解，称取0.719g 2S加入单颈瓶，补加4mL甲醇和2-3滴三乙胺，反应过夜。反应后所得溶液浓缩到1mL，然后用12mL冰乙醚(体积为反应液的10-15倍)沉淀后离心取沉淀，得到白色TCB固体。
精密称取PAC-PCL 0.5g，用5mL DMF溶解，精密称取TCB 0.064g(0.015mmol)并用2-3mL甲醇溶解，然后把PAC-PCL溶液加入反应瓶中并加入转子，通N2。将溶解好的TCB缓慢倒入反应瓶中，滴加2-3滴三乙胺，反应过夜。用100mL冰乙醚沉淀后离心取沉淀，经真空干燥后，计算产物PAC-PCL-TCB产率约为71.22％。
将本实施例制备的PAC-PCL-TCB进行氢核磁共振分析，结果如图1所示。PAC-PCL-TCB的氢核磁表征见附图1所示，图1为实施例1中PAC-PCL-TCB的氢核磁图谱，由图1可见，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.84-6.44(t,3H),4.05(s,2H),2.30(t,2H),1.64(q,2H),1.29(s,1H),1.05(s,3H)。
实施例2
PAC-PCL-NH2的合成，合成路线及过程如下：
精密称取实施例1制备的PAC-PCL 0.5g，用5mL DMF溶解，然后把PAC-PCL加入反应瓶中并加入转子，通N2。将溶解好的Cys(Boc)缓慢倒入反应瓶中，滴加2-3滴三乙胺，反应过夜。反应结束后用60mL冰乙醚沉淀并离心，真空干燥后得到PAC-PCL-Cys(Boc)固体。
称取100mg PAC-PCL-Cys(Boc)于圆底烧瓶中，加入2mL二氯甲烷，超声使其溶解，再加入1mL三氟乙酸并反应24h。最终得到产物PAC-PCL-NH2，产率约为67.13％。
将本实施例制备的PAC-PCL-NH2进行氢核磁共振分析，结果如图2所示。PAC-PCL-NH2的氢核磁表征如附图2所示，图2为实施例2中PAC-PCL-NH2的氢核磁图谱，由图2可见，1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.84-6.44(t,3H),4.05(s,2H),1.64(t,2H),1.27(d,3H)。
实施例3
PAC-PCL-UDCA的合成，合成路线及过程如下：
取100mg实施例2制备的PAC-PCL-NH2(0.013mmol)于圆底烧瓶中，加入500μLDMF溶解，搅拌30分钟进行活化。另取一个圆底烧瓶，加入15.31mg UDCA(0.013mmol)，再加入7.48mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(0.039mmol)和4.5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)(0.039mmol)活化溶剂，用500μL DMF溶解，搅拌30分钟进行活化。活化完毕后将两个圆底烧瓶中的溶液混合，反应24h。反应结束后倒入3500Da透析袋中，在二氯甲烷中透析4h。透析后旋蒸浓缩，倒入冰乙醚中析出沉淀，干燥后产物PAC-PCL-UDCA产率约为72.74％。
将本实施例制备的PAC-PCL-UDCA进行氢核磁共振分析，结果如图3所示。PAC-PCL-UDCA的氢核磁表征如附图3所示，图3为实施例3中PAC-PCL-UDCA的氢核磁图谱，由图3可见，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.84-6.44(t,3H),4.05(s,2H),2.30(d,2H),1.27(d,2H)。
实施例4
(1)对照组纳米粒子的制备
取实施例1制备的PAC-PCL-TCB溶解在DMF中，制备浓度为10mg/mL的PAC-PCL-TCB溶液，再用1mL pH 2.0的盐酸溶液和10μL DMSO为溶剂溶解胰岛素，制备浓度为15mg/mL的胰岛素溶液，用DMF为溶剂溶解BBR，配制浓度为5mg/mL的BBR溶液，用乙醇配制浓度为20mg/mL的光引发剂I2959溶液，用DMF配制浓度为10mg/mL的CB溶液备用。设置四组对照组，A组只取100μL的PAC-PCL-TCB溶液，记为Blank ACT；C组取100μL的PAC-PCL-TCB溶液与30μL胰岛素溶液混合，记为ACT@insulin，载insulin量为30wt％；E组取100μL的PAC-PCL-TCB溶液与50μLBBR溶液混合，记为ACT@BBR，载BBR量为20wt％；G组取100μL的PAC-PCL-TCB溶液与30μL胰岛素溶液、50μL BBR溶液混合，记为ACT@(insulin+BBR)，载insulin量为30wt％，载BBR量为20wt％。在搅拌条件下，分别滴加到900μL纯净水中，加入30μL光引发剂I2929和10μL交联剂CB，超声搅拌使之混合均匀，在紫外光下照射10min后得到光交联的浓度为1mg/mL泛蓝白光的聚合物胶束溶液。以透析袋(15kDa)为透析介质，在纯净水中边透析边用磁子搅拌1小时以上时间以除去DMF与DMSO。
将本实施例制备的聚合物胶束溶液中纳米粒子进行粒径分析，结果如图4所示。
图4为实施例4对照组纳米粒子中Blank ACT、ACT@insulin、ACT@BBR、ACT@(insulin+BBR)粒径图，由图4可以看出，平均粒径在100-200nm左右，PDI为0.2左右。
(2)实验组纳米粒子的制备
按本实施例步骤(1)中方法，配制浓度为10mg/mL的PAC-PCL-UDCA溶液，15mg/mL的胰岛素溶液，5mg/mL的BBR溶液。设置四组实验组，B组只取50μL的PAC-PCL-TCB溶液和100μLPAC-PCL-UDCA溶液混匀，记为Blank ACU；D组取50μL的PAC-PCL-TCB溶液和100μL PAC-PCL-UDCA溶液，加入30μL胰岛素溶液后充分混匀，记为ACU@insulin，载insulin量为30wt％；F组取50μL的PAC-PCL-TCB溶液和100μL PAC-PCL-UDCA溶液，加入50μL BBR溶液后充分混匀，记为ACU@BBR，载BBR量为20wt％；G组取50μL的PAC-PCL-TCB溶液和100μL PAC-PCL-UDCA溶液，与30μL胰岛素溶液、50μL BBR溶液充分混匀，记为ACU@(insulin+BBR)，载insulin量为30wt％，载BBR量为20wt％。在搅拌条件下，分别滴加到900μL纯净水中，加入30μL光引发剂I2929和10μL交联剂CB，超声搅拌使之混合均匀，在紫外光下照射10min后得到光交联的浓度为1mg/mL泛蓝白光的聚合物胶束溶液。以透析袋(15kDa)为透析介质，在纯净水中边透析边用磁子搅拌1小时以上时间以除去DMF与DMSO。
将本实施例制备的聚合物胶束溶液中纳米粒子进行粒径分析，结果如图5所示。
图5为实施例4实验组纳米粒子中Blank ACU、ACU@insulin、ACU@BBR、ACU@(insulin+BBR)粒径图，由图5可以看出，平均粒径在100-200nm左右，PDI为0.2左右。
(3)纳米粒子的包封率和载药量
质量包封率(LE)和载药量(LC)通常用来表示纳米粒子的载药能力。本发明采用间接法，用BCA法来测量未被包载在纳米粒子中的游离胰岛素的含量，利用高效液相色谱来测定游离盐酸小檗碱的含量。通过测得的游离胰岛素和盐酸小檗碱的质量，利用考马斯亮蓝染色法进一步计算载药量和包封率。其中载药量是包载在纳米粒子的药量和总质量(载体和包载的药量)的百分数，质量包封率是指包载在纳米粒子的药量和投药量的质量百分数，计算公式分别如下：
其中，m总为投入降糖药物(insulin、BBR或insulin+BBR)的质量(mg)，m游为游离降糖药物的质量(mg)；m药为包载在纳米粒子内降糖药物的质量(mg)，m载体为最终制备的纳米粒子的质量(mg)。
另取DMF溶解的浓度为10mg/mL的PAC-PCL-TCB和10mg/mL的PAC-PCL-UDCA溶液，DMSO溶解的浓度为15mg/mL的胰岛素溶液和5mg/mL的BBR溶液。按胰岛素照载药量为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、35wt％，分别将对应体积的胰岛素溶液与PAC-PCL-UDCA溶液混合，记为ACU@insulin-5、ACU@insulin-10、ACU@insulin-15、ACU@insulin-20、ACU@insulin-30、ACU@insulin-35；按胰岛素照载药量为30wt％，将对应体积的胰岛素溶液与PAC-PCL-TCB溶液混合，记为ACT@insulin-30；按BBR照载药量为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％，分别将对应体积的BBR溶液与PAC-PCL-UDCA溶液混合，记为ACU@BBR-5、ACU@BBR-10、ACU@BBR-15、ACU@BBR-20、ACU@BBR-30；按BBR照载药量为20wt％，将对应体积的BBR溶液与PAC-PCL-TCB溶液混合，记为ACT@BBR-20。在搅拌条件下，分别滴加到900μL纯净水中，加入30μL光引发剂I2929和10μL交联剂CB，超声搅拌使之混合均匀，在紫外光下照射10min后得到光交联的浓度为1mg/mL泛蓝白光的聚合物胶束溶液。以透析袋(15kDa)为透析介质，在纯净水中边透析边用磁子搅拌1小时以上时间以除去DMF与DMSO。
将本实施例制备的聚合物胶束溶液中纳米粒子进行表征分析，结果如表1所示，在理论载药量(即胰岛素或BBR质量/最终制备的纳米粒子质量)为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、35wt％时，聚合物胶束对降糖药物的包封率呈上升趋势，最终可达90％左右。
表1载药聚合物胶束的表征
(4)载药纳米粒子的体外酸响应释放试验
按本实施例步骤(1)中方法制备载insulin量为30wt％的光交联ACT@insulin、ACU@insulin胶束溶液各1mL，置于透析袋(12kD)中，分别放置在pH＝1.2、pH＝6.8的100mM磷酸缓冲液中，得到的缓冲液记作ACT@insulin pH 1.2、ACU@insulin pH 1.2、ACT@insulin pH 6.8、ACU@insulin pH 6.8。分别放入37℃，80r/min摇床保温箱中，在1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h、36h和48h的时间点，分别取出50μL样品溶液，于1mL EP管中存放，每个样品要平行测定三次。(每次取完样品，都要加入150μL相应pH的缓冲液，保证缓冲液的体积不发生变化。)
按本实施例步骤(1)中方法制备载BBR量为20wt％的光交联ACT@BBR、ACU@BBR胶束溶液各1mL，置于透析袋(12kD)中，分别放置在pH＝1.2、pH＝6.8的100mM磷酸缓冲液中，得到的缓冲液记作ACT@BBR pH 1.2、ACU@BBR pH 1.2、ACT@BBR pH 6.8、ACT@BBR pH 6.8。同上述insulin组做相同处理。
将样品分别加入96孔板中，再加入考马斯亮蓝试剂，选定测量波长为562nm，在ABS模式下利用酶标仪测量其吸光度，并绘制吸光度与insulin或BBR浓度的标准曲线测定胰岛素浓度和盐酸小檗碱浓度。利用下述公式计算胰岛素和盐酸小檗碱分别在不同时间的累积释放百分率：
式中V——100mM磷酸缓冲液的体积，mL；
C——缓冲液中胰岛素或BBR的浓度，mg/mL；
W——最终制备的胶束溶液的质量，mg；
LC——载药纳米颗粒的载药量，％。
载药纳米粒子的体外酸响应累积释放结果见附图6。图6为载药聚合物胶束体外酸响应释放图，由图6可见，在pH 1.2的缓冲溶液中，胰岛素和盐酸小檗碱释放缓慢表现出延迟效应，而在pH 6.8的缓冲溶液中，胰岛素和盐酸小檗碱释放速率增加，累计释放量也增加，其中ACU载体的释放速率较ACT快，说明ACU载体有较好的酸响应能力。
(5)聚合物胶束的细胞毒性实验(MTT)
按本实施例步骤(1)和步骤(2)中方法制备ACT@insulin，ACU@insulin，ACT@BBR，ACU@BBR，Balnk ACT和Blank ACU胶束溶液，各取50μL进行人克隆结肠腺癌(Caco-2)，人结肠腺癌(HT-29)细胞毒性(MTT)实验，根据实验的细胞种类和加入的胶束种类不同，分为三组：A组记为Balnk ACT(Caco-2)、Blank ACU(Caco-2)、Balnk ACT(HT-29)、Blank ACU(HT-29)；B组记为ACT@insulin(Caco-2)、ACU@insulin(Caco-2)、ACT@insulin(HT-29)、ACU@insulin(HT-29)；C组记为ACT@BBR(Caco-2)、ACU@BBR(Caco-2)、ACT@BBR(HT-29)、ACU@BBR(HT-29)，结果见附图7。图7为Caco-2，HT-29和AML12细胞毒性试验的细胞存活率示意图，由图7可知，随着ACT@insulin，ACU@insulin，ACT@BBR，ACU@BBR，Balnk ACT和Blank ACU胶束溶液中聚合物胶束浓度的增加，与空白细胞培养液中细胞活性相比，加入聚合物胶束的细胞培养液中细胞活性没有明显降低，并且存活率在80％以上。因此，证明该聚合物胶束对生物细胞毒性较小。
(6)聚合物胶束上皮细胞转运研究
按本实施例步骤(1)和步骤(2)中方法制备insulin、BBR溶液，ACT@insulin、ACT@BBR、ACU@insulin或ACU@BBR胶束溶液，各取100μL处理体外Caco-2细胞单层模型，评估聚合物胶束的跨上皮运输活性。Caco-2细胞以1×105个细胞/孔的密度播种，在小室中培养21天，直到其跨上皮电阻(TEER)值高于600平方厘米。细胞单层用pH 7.4浓度为100mM的200μL灭菌PBS溶液洗三次，然后加入预热的pH 7.4的Hank's平衡盐溶液(HBSS)至没过细胞单层，在37℃的5％CO2培养箱中培养30分钟。在有或没有HT-29细胞的情况下，顶端的HBSS介质会被含有insulin、BBR、ACT@insulin、ACT@BBR、ACU@insulin或ACU@BBR纳米粒子的HBSS溶液取代，其中胰岛素的最终浓度为45μg/mL。在预定的时间间隔内，从基底侧收集200μL的样品，在基底侧加入相同体积的新鲜HBSS溶液。使用胰岛素ELISA试剂盒检测样品中的胰岛素浓度，通过液相色谱检测样品中盐酸小檗碱的浓度。盐酸小檗碱和胰岛素的表观渗透系数(Papp)通过以下公式计算：
其中是累计输送的胰岛素或者盐酸小檗碱量与时间的梯度关系，A是由Caco-2细胞分泌的膜面积(cm2)，C0是供体室的盐酸小檗碱或胰岛素初始浓度。
如附图8所示，图8为聚合物胶束Papp水平图，由图8可知，在培养或不培养HT-29细胞(分泌粘液)时，游离的胰岛素在单层中的渗透性较差，Papp值为2×10-7cm/s，ACT@BBR、ACU@BBR,、ACT@insulin和ACU@insulin的Papp值较高，这可能是因为胆汁酸涂层的近中性和亲水表面有效阻止了粘液成分与载体之间的粘合作用。
(7)聚合物胶束跨肠上皮细胞能力(TEER)
取实验(6)聚合物胶束上皮细胞转运研究的Caco-2细胞单层，然后与200μL本实施步骤(1)中制备的insulin、BBR溶液、ACT@insulin,ACT@BBR,ACU@insulin和ACU@BBR胶束溶液在顶端培养基中培养。孵育2小时后，取出细胞培养物，用新鲜的HBSS溶液替换。TEER值由Millicell-resistance系统(Millipore，美国)在预定的时间间隔内测定，结果如图9所述。图9为聚合物胶束TEER图；由图9可知，游离insulin、BBR、ACT@BBR,ACU@BBR,ACT@insulin和ACU@insulin对TEER值的影响不明显，这表明各组的制剂是通过经细胞途径运输的。
(8)体内降糖实验
对链脲佐菌素(STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠应用载药聚合物胶束，分别口服载药聚合物胶束，以评估其治疗高血糖的体内表现。将高血糖模型小鼠随机分为六组，每组3只老鼠，分别口服本实施例步骤(1)中制备的ACT@(insulin+BBR)(按胰岛素剂量为25U/kg给药)、ACT@insulin(胰岛素剂量为50U/kg)、ACT@BBR(BBR剂量为50U/kg)、ACU@(insulin+BBR)(按胰岛素剂量25U/kg给药)、ACU@insulin(胰岛素剂量为50U/kg)、ACU@BBR(BBR剂量为50U/kg)于STZ诱导的成年糖尿病小鼠上，进行体内实验。通过尾静脉采集血样(～3μL)，用血糖仪连续监测血糖变化并记录。血糖变化曲线见附图10所示，图10为载药聚合物胶束体内降糖血糖水平图，由图10可以看出，载药聚合物胶束均表现出一定的降糖效果，其中应用ACU@(BBR+insulin)纳米粒子治疗的小鼠血糖更快降至正常水平，相比其他组别药效持续时间更长，证明PAC-PCL-TCB与PAC-PCL-UDCA两种材料联合使用有较好的酸响应能力，可以使降糖药物更快进入体内并发挥长效降糖效果。
实验中每隔一段时间取小鼠尾静脉血(～25μL)，用ELISA试剂盒测定体内BBR浓度。用液相色谱测定治疗组小鼠血浆中BBR的含量。血浆中BBR水平变化曲线见图11所示，图11为载药聚合物胶束体内降糖BBR浓度图，由图11可以看出，应用ACU@(BBR+insulin)治疗的小鼠血浆BBR水平始终高于其他载药聚合物胶束治疗的小鼠，再次表明PAC-PCL-TCB与PAC-PCL-UDCA两种材料联合使用，有助于降糖药物进入体内发挥作用，可以有效提高胰岛素和BBR的生物利用度。
(9)细胞C-肽水平测试
众所周知，2型糖尿病患者胰岛β-细胞受损，盐酸小檗碱由β-细胞分泌的胰岛素前体产生，能够促进β-细胞的修复和增殖。因为胰岛素浓度因肝脏和外周的摄取和清除而变化，血液中C-肽浓度是评价β-细胞胰岛素分泌功能的一个指标。以正常老鼠(NM)和不给药的糖尿病老鼠(DM)为对照，将高血糖模型小鼠随机分为六组，每组3只老鼠，糖尿病小鼠口服本实施例步骤(8)中ACT@(insulin+BBR)(按胰岛素剂量为25U/kg给药)、ACT@insulin(胰岛素剂量为50U/kg)、ACT@BBR(BBR剂量为50U/kg)、ACU@(insulin+BBR)(按胰岛素剂量25U/kg给药)、ACU@insulin(胰岛素剂量为50U/kg)、ACU@BBR(BBR剂量为50U/kg)胶束溶液治疗6周后，眼眶静脉采血，使用C-肽试剂盒(Crystal Chem Inc.)分析样本血浆中的C-肽。如附图12所示，图12为细胞C-肽浓度示意图，由图12可以看出，相比于糖尿病小鼠，ACU@(insulin+BBR)联合治疗使C-肽的浓度显著升高。这个结果表明联合治疗组相对于单个试剂治疗组β细胞修复效果更强。

Claims (7)

1.一种肝靶向聚合物胶束递药系统，其特征在于，所述递药系统是由丙烯酰碳酸酯与内酯开环聚合形成双键可修饰聚合物，然后分别经过两性离子材料和胆酸衍生物修饰，形成两种修饰后的聚合物，二者以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后，加入交联剂和光引发剂，经紫外光照射进行紫外光交联，形成所述的肝靶向聚合物胶束递药系统，所述内酯为ε-己内酯、δ-戊内酯，所述两性离子材料为羧酸甜菜碱或磺基甜菜碱，所述胆酸衍生物为熊去氧胆酸或脱氧胆酸，所述两性离子材料修饰，是由两性离子材料与含巯基结构的化合物反应后，再通过迈克尔加成反应在双键可修饰聚合物的AC端的碳碳双键上部分连接，所述胆酸衍生物修饰，是先通过迈克尔加成反应于双键可修饰聚合物的AC端的碳碳双键上连接含有酰胺结构的化合物，再催化其发生水解反应得到含氨基结构的化合物，最后通过酰胺反应连接胆酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的肝靶向聚合物胶束递药系统，其特征在于，所述二者以自组装的方式装载胰岛素和盐酸小檗碱后进行紫外光交联，是将两种修饰后的聚合物溶解后，按照两性离子修饰聚合物与胆酸衍生物修饰聚合物物质的量比为1:1-4混合，再与胰岛素和盐酸小檗碱混合自组装，最后加入交联剂和光引发剂，经紫外光照射，得到聚合物胶束溶液。
3.权利要求1或2所述肝靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）双键可修饰聚合物的制备：
提前蒸馏制备无水内酯，在氮气保护下，将丙烯酰碳酸酯AC溶解于有机溶剂中，加入引发剂与无水内脂，再加入催化剂，油浴加热反应，加入终止剂终止反应，沉淀，干燥，得到双键可修饰聚合物；
（2）两性离子修饰聚合物的制备：
先用有机溶剂溶解两性离子材料和含有巯基结构的化合物，在氮气保护下，加入催化剂催化反应，得到含有巯基结构的两性离子材料；将步骤（1）中制备的双键可修饰聚合物与含巯基结构的两性离子材料混合，在氮气保护下，加入催化剂催化反应，得到两性离子修饰的聚合物；
（3）胆酸衍生物修饰聚合物的制备：
将步骤（1）中制备的双键可修饰聚合物溶于有机溶剂中，加入含有酰胺结构的化合物，再加入催化剂，在氮气保护下反应，得到连接酰胺修饰部分的聚合物，再次加入催化剂，使其中的酰胺结构水解，得到氨基结构修饰的聚合物，该氨基结构修饰的聚合物与胆酸衍生物溶于有机溶剂中，加入活化剂进行活化，通过酰胺反应连接胆酸衍生物，得到胆酸衍生物修饰的聚合物；
（4）聚合物胶束制备：
将步骤（2）得到的两性离子修饰的聚合物和（3）得到胆酸衍生物修饰的聚合物溶于有机溶剂中，与溶剂分别溶解的胰岛素和盐酸小檗碱混匀，加入交联剂和光引发剂，紫外照射得到光交联的聚合物胶束溶液。
4.根据权利要求3所述肝靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述有机溶剂为甲苯或无水二氯甲烷，所述催化剂为Zinc或辛酸亚锡，所述引发剂为异丙醇或巯基乙醇，所述终止剂为冰醋酸；步骤（2）中、步骤（3）以及步骤（4）中，所述有机溶剂为DMF或DMSO，所述催化剂为三乙胺，步骤（2）中，所述含有巯基结构的化合物为3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇，制备两性离子修饰的化合物时，双键可修饰聚合物中双键的数量与含巯基的两性离子材料中巯基的数量比为1: 1.1-10。
5.根据权利要求3所述肝靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述含有酰胺结构的化合物为N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸 ，所述酰胺结构水解时氨基保护剂为用三氟乙酸，所述活化剂为碳二亚胺盐酸盐 和N-羟基丁二酰亚胺 ，制备胆酸衍生物修饰聚合物时，双键可修饰聚合物中双键的数量与含有酰胺结构的化合物中巯基的数量比为1:1.1-10；步骤（4）中，所述两性离子修饰的聚合物与胆酸衍生物修饰的聚合物的物质的量比为1:1-4，所用光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮 ，所述交联剂为羧酸甜菜碱。
6.权利要求1或2所述肝靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗糖尿病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在混合自组装的过程中，加入胰岛素与盐酸小檗碱，与两性离子修饰的聚合物和胆酸衍生物修饰的聚合物共同组装成载胰岛素和盐酸小檗碱的混合聚合物胶束溶液。
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Title
"Berberine Attenuates Hyperglycemia by Inhibiting the Hepatic Glucagon Pathway in Diabetic Mice";Zhong Ying 等;《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》;第2020卷;第1-8页 *

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