CN110483756B - 末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法及聚合物纳米粒子的制备方法 - Google Patents

末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法及聚合物纳米粒子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法及聚合物纳米粒子的制备方法。侧链含硫辛酰基的星型聚合物通过酯化反应得到，LA取代度可控具有优异的生物相容性，可用于控制药物释放体系，制备的癌症靶向的还原敏感可逆交联的聚合物纳米粒子纳米药物支持体内稳定长循环，但在癌组织高富集并高效进入细胞，在细胞内快速解交联、释放出药物，高效特异性地杀死癌细胞，有效抑制了癌症的生长而不造成毒副作用。

Description

末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法及聚合物纳米粒子 的制备方法
本发明为发明名称为末端含硫辛酰基的星型聚合物、其制备方法及由其制备的聚合物纳米粒子与应用、申请日为2018年3月1日、申请号为201810172208X发明申请的分案申请，属于产品制备方法部分。
技术领域
本发明涉及一种生物相容性聚合物材料及其应用，具体涉及一种末端含硫辛酰基的星型生物相容性聚合物、其制备方法及由其制备的聚合物纳米粒子以及在靶向纳米药物中的应用，属于医药材料领域。
背景技术
具有良好的生物相容性和生物可降解性的高分子材料已被广泛应用于生物医学领域包括组织工程和药物控制释放领域，基于此的纳米药物展现出了良好的应用前景，但由现有技术制备的聚合物纳米药物存在体内循环不稳定、肿瘤细胞摄取低、细胞内药物浓度低、细胞内释药速度缓慢的问题，导致纳米药物的药效不高，还存在药物泄漏引发的毒副作用；比如BIND-014在临床二期中的结果并没有达到预期，由于该纳米药物在体内的稳定性不足引起的。
癌症是威胁人类健康的主要杀手，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。纳米药物的出现为治疗癌症带来了新的希，但是现有技术中，尚缺乏在体内循环稳定、癌症特异性靶向、细胞内快速响应释放药物、毒副作用小的高效纳米药物，尤其是缺少在体内循环过程能够保持稳定和在细胞内快速释放药物的聚合物纳米载体。基于此，开发一种能够延长药物在体内的循环时间并且能够在肿瘤细胞内快速释药物的纳米载体迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种末端含硫辛酰基的星型聚合物、由其制备的聚合物纳米粒子、及其作为抗癌药物的载体在制备癌症靶向治疗药物中的应用。
为达到上述目的，本发明具体的技术方案为：一种末端含硫辛酰基的星型聚合物，结构式如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
其中，x:y为(1～3)∶1。
本发明公开的末端含硫辛酰基的星型聚合物可以称为sP-LA；所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的分子量为10000～75000。
上述末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时；得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时；得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天；得到末端含硫辛酰基的星型聚合物。
具体的，所述制备方法可如下：
（1）在氮气环境下，硫辛酸溶在有机溶剂中，配制硫辛酸溶液；将N,N-二环己基碳二亚胺于有机溶剂中，配制N,N-二环己基碳二亚胺溶液；然后冰水浴下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时；反应结束后，过滤反应液，得到硫辛酸酐溶液；
（2）在N2环境下，将多羟基葡萄糖、丙交酯和乙交酯加入到密闭反应瓶中，随后将催化剂辛酸亚锡加反应瓶中并且将所有物料混合均匀；随后将反应瓶抽真空-置换N2 三次，最后将反应瓶抽真空30分钟，密封反应瓶；聚合反应在真空箱中160℃条件下反应8小时；反应结束后，产物溶解在二氯甲烷中，随后在冰甲醇中沉淀，抽滤并且真空干燥得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天；然后将反应物在冰乙醚中沉淀，再经抽滤并真空干燥滤饼得到末端含硫辛酰基的星型聚合物(sP-LA)。
本发明公开了一种可逆交联具有还原响应性的聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时，得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时，得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天，得到末端含硫辛酰基的星型聚合物；
（4）将末端含硫辛酰基的星型聚合物与第二聚合物在溶剂中共组装得到可逆交联具有还原响应性的聚合物纳米粒子。
本发明公开了一种纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时；得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时；得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天；得到末端含硫辛酰基的星型聚合物；
（4）将末端含硫辛酰基的星型聚合物与第二聚合物、小分子药物在溶剂中组装得到纳米药物。
本发明中，N,N-二环己基碳二亚胺溶液中溶剂为二氯甲烷；硫辛酸溶液中溶剂为二氯甲烷；含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中有机溶剂为二氯甲烷。
本发明中，多羟基葡萄糖、丙交酯、乙交酯的摩尔比为1∶（50～55）∶（60～65）；制备的星型聚合物结构式如下：
Figure 302495DEST_PATH_IMAGE002
本发明中，N,N-二环己基碳二亚胺、硫辛酸的摩尔比为2∶1；硫辛酸酐、4-二甲基氨基吡啶、星型聚合物的摩尔比为7.5∶10∶1。
本发明的末端含硫辛酰基的星型聚合物可以和具有不同靶向功能的多肽或者多糖分子修饰的两亲性聚合物如cRGD-PEG-PDLLA、GE11-PEG-PDLLA、TAT-PEG-PDLLA、HA-b-PDLLA 共同组装从而制备具备不同的靶向分子如cRGD、GE11、TAT或者HA等多肽以及多糖修饰的纳米粒子，来得到不同的癌症细胞特异靶向的聚合物纳米粒子，具备靶向性、生物相容性。这样的聚合物形成的纳米粒子具有很好的稳定性，较高的装载效率，同时可以特异性地靶向到癌细胞。
本发明还公开了一种可逆交联具有还原响应性的聚合物纳米粒子，由上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物与第二聚合物共组装制备得到；所述第二聚合物为两亲性聚合物和/或靶向两亲性聚合物；优选的，所述第二聚合物用量为上述末端含硫辛酰基的星型聚合物质量的10%～60%；当第二聚合物为两亲性聚合物和靶向两亲性聚合物时，靶向两亲性聚合物的质量百分数小于70%；本发明中两亲性聚合物不带靶向分子，靶向两亲性聚合物带有靶向分子如cRGD、GE11、TAT或者HA等多肽以及多糖；优选第二聚合物为两亲性聚合物和靶向两亲性聚合物。即本发明的聚合物纳米粒子由上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物与两亲性聚合物共同组装制备得到；或者由上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物与接枝靶向分子的两亲性聚合物共同组装制备得到；或者由上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物与接枝靶向分子的两亲性聚合物和两亲性聚合物共同组装制备得到，比如上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物和接枝靶向分子的两亲性聚合物与两亲性聚合物按照不同比例混合，可制备具有不同靶向密度的聚合物纳米粒子，即得到具有癌细胞主动靶向功能的聚合物纳米粒子，可以增加载药聚合物纳米粒子在癌细胞中的摄取量。
本发明公开的侧链含硫辛酰基的星型聚合物具有优异的生物相容性和生物可降解性，通过与第二聚合物共同组装形成聚合物纳米粒子，可在催化量的还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）或谷胱甘肽（GSH）存在的条件下，制备得到交联聚合物纳米粒子或者对癌细胞具有主动靶向功能的交联聚合物纳米粒子，粒径70～180纳米，可以作为治疗癌症的药物的载体；可以在聚合物纳米粒子中装载疏水性小分子抗肺癌药物阿霉素(DOX) 、紫杉醇（PTX）、多西紫杉醇（DTX）等，提高疏水药物在体内的生物利用度，延长药物的循环时间，提高药物在肿瘤部位的富集量。因此，本发明公开的纳米药物，由交联聚合物纳米粒子装载小分子药物得到。本发明公开的侧链含硫辛酰基的星型聚合物制备的交联聚合物纳米粒子在内核形成了稳定的化学交联，从而可在体内稳定长循环；但内吞进入癌细胞后可在细胞内还原性环境下，快速解交联，快速释放出药物，高效杀死癌细胞。所以本发明请求保护上述侧链含硫辛酰基的星型聚合物、聚合物纳米粒子、交联聚合物纳米粒子、纳米药物在制备治疗肿瘤比如黑色素瘤、肺癌以及三阴乳腺癌纳米药物中的应用。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1. 本发明利用星型聚合物与硫辛酸酐发生反应得到取代度可控的侧链含硫辛酰基的星型聚合物，赋予星型聚合物新的功能，丰富了星型聚合物的种类。
2. 本发明公开的侧链含硫辛酰基的星型聚合物具有优异的生物相容性和生物可降解性，可以制备聚合物纳米粒子和具有癌细胞主动靶向功能的聚合物纳米粒子，装载不同的药物，并可以形成二硫键交联，得到稳定的交联聚合物纳米药物，从而克服了现有技术中纳米药物体内循环不稳定、药物易早释、造成毒副作用的缺陷。
3. 本发明公开的交联聚合物纳米药物，其交联可逆，即支持体内长循环，可在癌细胞高富集；但是进入癌细胞内后却可以快速解交联，释放出药物，实现高效特异性地杀死癌细胞而不具有毒副作用；克服了现有技术中化学交联的纳米药物过于稳定、而在细胞内药物释放缓慢、造成耐药性的缺陷。
4. 本发明公开的生物相容性聚合物纳米粒子和具有癌细胞主动靶向功能的聚合物纳米粒子可在制备过程中形成还原敏感的二硫键交联，制备方法简便，从而克服了现有技术中制备交联纳米药物时需要复杂的操作和提纯过程等缺陷。
5. 本发明公开的侧链含硫辛酰基的星型聚合物与两亲性聚合物共同组装制备的交联聚合物纳米粒子可用于疏水抗癌药物的控制释放体系，从而克服了现有技术中没有能高效装载、并稳定体内循环的疏水性抗癌药物的缺陷；进一步地，可键合靶向分子，在癌症的高效靶向治疗方面具有更广泛的应用价值。
附图说明
图1为实施例一侧链含硫辛酰基的星型聚合物sP-LA的氢核磁谱图；
图2为实施例二、三、四、五中两亲性聚合物PEG-PDLLA (A), cRGD-PEG-PDLLA(B), GE11-PEG-PDLLA (C) 和TAT-PEG-PDLLA (D)的核磁谱图；
图3为实施例六中两亲性聚合物HA-b-PDLLA的核磁谱图；
图4为实施例七中交联纳米粒子sPLy XNPs的粒径分布及透射电子显微镜图（A），交联纳米粒子稳定性（B），还原响应性测试（C）及体外释放图（D）；
图5为实施例八中以cRGD为靶向分子的交联纳米粒子cRGD-XNPs的粒径分布（A）及透射电子显微镜图（B），还原响应性测试图（C）及体外释放图（D）；
图6为实施例十一中以HA为靶向分子的交联纳米粒子HA-sPLy XNPs的粒径分布（A）及透射电子显微镜图（B），还原响应性测试图（C）及体外释放图（D）；
图7 为实施例十七中不同纳米粒子sPLy XNPs在B16F10细胞(A)，cRGD-XNPs在B16F10细胞(B)，GE11/TAT-XNPs对MDA-MB-231 细胞(C)以及HA-sPLy XNPs在A549细胞(D)的摄取量的图；
图8为实施例十八中空白纳米粒子sPLy XNPs 对B16F10细胞(A)， cRGD-XNPs对B16F10细胞(B)，GE11/TAT-XNPs对MDA-MB-231 细胞(C)以及HA-sPLy XNPs对A549细胞(D)毒性结果图；
图9为实施例十九中载药纳米粒子DOX-sPLy XNPs 对B16F10细胞(A)，DOX-cRGDXNPs对B16F10细胞(B)，DTX-GE11/TAT XNPs对MDA-MB-231 细胞以及DTX-HA-sPLy XNPs对A549细胞的毒性结果图；
图10为实施例二十、二十一、二十三中载药纳米粒子DOX-sPLy XNPs(A), DOX-cRGD XNPs(B), DTX-HA-sPLy XNPs(C)在小鼠体内的血液循环研究结果图；
图 11 为实施例二十四和二十五中载药纳米粒子DOX-cRGD XNPs在荷B16F10黑色素瘤(A)和DTX-HA-sPLy XNPs在A549肺癌皮下瘤(B)小鼠体内的生物分布图；
图 12 为实施例二十六中以cRGD为靶向分子的载DOX靶向交联纳米粒子DOX-cRGDXNPs在荷B16F10黑色素瘤小鼠体内抑瘤情况图，其中A为肿瘤生长曲线，B为小鼠体重变化，C为生存曲线；
图 13 为实施例二十七中以GE11和TAT为靶向分子的载DTX靶向交联纳米粒子DTX-GE11/TAT XNPs在在荷三阴乳腺癌MDA-MB-231皮下瘤裸鼠体内的抑瘤情况图，其中A为肿瘤生长曲线，B为小鼠治疗后肿瘤图片，C为体重变化，D为生存曲线；
图 14 为实施例二十八中以HA为靶向分子的载DTX靶向交联纳米粒子DTX-HA-sPLy XNPs在荷A549肺癌皮下瘤裸鼠体内的肿瘤抑制情况图，其中A为肿瘤生长曲线，B为体重变化，C为抑瘤率，D为小鼠治疗后肿瘤图片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一 合成侧链含硫辛酰基的星型聚合物
合成星型聚合物和线型聚合物
星型聚合物可以通过多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，引发丙交酯和乙交酯的开环聚合反应合成。在N2环境下，将0.18 g（1 mmol）多羟基葡萄糖(厂家：Sigma-Aldrich)，7.5 g（52 mmol）丙交酯和7.5 g（65 mmol） 乙交酯加入到密闭反应瓶中，随后将4.73 mg催化剂辛酸亚锡加反应瓶中并且将所有物料混合均匀。随后将反应瓶抽真空-置换N2 三次，最后将反应瓶抽真空30分钟，密封反应瓶。聚合反应在真空箱中160℃条件下反应8小时。粗产物溶解在二氯甲烷中，随后在冰甲醇中沉淀，抽滤并且真空干燥得到星型聚合物。1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 5.22 (-OOCCH 2O-), 4.83 (-OOCCH(CH3)O-), 2.45 (, -OCCH 2-), 1.6 (-CH(CH 3)O-)。
线型聚合物以1,4-丁二醇为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，引发丙交酯和乙交酯的开环聚合反应合成。在N2环境下，将0.9 g（1 mmol）1，4-丁二醇，7.5 g（52 mmol）丙交酯和7.5 g（65 mmol） 乙交酯加入到密闭反应瓶中，随后将4.73 mg催化剂辛酸亚锡加反应瓶中并且将所有物料混合均匀。随后将反应瓶抽真空-置换N2 三次，最后将反应瓶抽真空30分钟，密封反应瓶。聚合反应在真空箱中200℃条件下反应5小时。粗产物溶解在二氯甲烷中，随后在冰甲醇中沉淀，抽滤并且真空干燥得到线型聚合物。
合成硫辛酸酐LAA：在氮气环境下，在氮气环境下，60 mg （0.3 mmol）硫辛酸（LA）溶在1 mL二氯甲烷中，加入两颈瓶内搅拌至溶解，120 mg（0.6 mmol）N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）于0.5 mL二氯甲烷中，冰水浴下，将其逐滴加入LA溶液中。继续通5分钟氮气，将两颈瓶密封好，室温下，反应12小时；反应结束后，过滤掉反应产生的沉淀得到硫辛酸酐溶液，将硫辛酸酐（LAA）溶液浓缩至0.5 ml。
合成侧链含硫辛酰基的星型聚合物(sP-LA)：氮气环境下，将硫辛酸酐（LAA）30mg（0.075 mmol）溶液加入到150 mg（0.01 mmol）星型聚合物及12 mg（0.1 mmol）DMAP的2 mL二氯甲烷溶液中，继续通5分钟氮气，密封烧瓶，置于30℃油浴中反应48 h；而后将产物在冰乙醚中沉淀，抽滤并真空干燥得到侧链含硫辛酰基的星型聚合物sP-LA，产率为86.7%。1HNMR (600 MHz, CDCl3): δ 5.22 (-OOCCH 2O-), 4.83 (-OOCCH(CH3)O-), 3.57 (-CH2CHCH2CH2S2), 3.17 (-CH2CHCH2CH 2S2), 2.45 (-OCCH 2-), 1.6 (-CH(CH 3)O-)。核磁计算LA的接枝率为90%，见图1。
实施例二 合成两亲性聚合物PEG-PDLLA
两亲性聚合物PEG-PDLLA可以通过大分子引发剂PEG引发D,L-丙交酯开环聚合制备。在N2环境下，向2.5 mL PEG (M n=5.0 kg/mol, 0.5 g, 0.1 mmol) 和 D,L-丙交酯(0.4g, 2.8 mmol) 的无水甲苯溶液中，快速加入0.5 mL (0.2 mol/L) 辛酸亚锡的甲苯储备液。在110℃恒温油浴中反应48 h后，加入冰醋酸终止反应。随后将产物在冰乙醚中沉淀，抽滤并真空干燥得到PEG-PDLLA，产率为：88.9 %。1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 5.16 (-CH(CH3)O- ), 3.65 (-CH 2CH 2O-), 3.38 (CH 3O-), 1.56 (-CH(CH 3)O-)，见图2 (A)。 M n (1HNMR) = 8.9 kg/mol，M n (GPC) = 15.9 kg/mol，M w/M n (GPC) = 1.3。
实施例三 合成两亲性靶向聚合物cRGD-PEG-PDLLA
靶向聚合物cRGD-PEG-PDLLA通过两步反应得到。首先合成马来酰亚胺功能化的两亲性聚合物MAL-PEG-PDLLA，然后通过MAL 和巯基化的多肽cRGD-SH迈克尔加成进一步合成cRGD多肽修饰的两亲性聚合物cRGD-PEG-PDLLA。马来酰亚胺功能化的MAL-PEG-PDLLA 通过MAL-PEG引发D,L-丙交酯开环聚合制备。在N2环境下，向2.5 mL MAL-PEG (M n=5.0 kg/mol,0.5 g, 0.1 mmol) 和 D,L-丙交酯(0.4 g, 2.8 mmol) 的无水甲苯溶液中，快速加入0.5mL (0.2 mol/L) 辛酸亚锡的甲苯储备液。在110℃恒温油浴中反应48 h后，加入冰醋酸终止反应。随后将产物在冰乙醚中沉淀，抽滤并真空干燥得到MAL-PEG-PDLLA。然后将MAL-PEG-PDLLA 与 cRGD-SH 溶解于DMF 中，在室温下反应24 h。将产物在DMF 中透析48 h，然后再在去离子水中透析24 h，最后将产物冷冻干燥。产率：85.4%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6): δ 7.0-7.4 cRGD, 5.16 (-CH(CH3)O- ), 3.65 (-CH 2CH 2O-), 1.56 (-CH(CH 3)O-) ，见图2（B）。M n (1H NMR) = 8.8 kg/mol。 M n (GPC) = 13.9 kg/mol。M w/M n (GPC) = 1.3。cRGD的接枝率通过BCA 测试得到为94%。
实施例四 合成两亲性靶向聚合物GE11-PEG-PDLLA
GE11多肽修饰的靶向聚合物 GE11-PEG-PDLLA的合成与实施例三中的cRGD修饰的cRGD-PEG-PDLLA的合成过程方法相似。将MAL-PEG-PDLLA与 GE11-SH 溶解于DMF中，在室温下反应24 h。将产物在DMF 中透析48 h，然后再在去离子水中透析24 h，最后将产物冷冻干燥。产率：89.6%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6): δ 6.5-7.1 GE11, 5.16 (-CH(CH3)O- ),3.65 (-CH 2CH 2O-), 1.56 (-CH(CH 3)O-)，见图2（C）。 M n (1H NMR) = 8.8 kg/mol。 M n(GPC) = 13.9 kg/mol。M w/M n (GPC) = 1.3。 cRGD的接枝率通过BCA 测试得到为96%。
实施例五 合成两亲性靶向聚合物TAT-PEG-PDLLA
TAT多肽修饰的靶向聚合物 TAT-PEG-PDLLA的合成与实施例三中的cRGD修饰的cRGD-PEG-PDLLA的合成过程方法相似。将MAL-PEG-PDLLA与 TAT-SH 溶解于DMF中，在室温下反应24 h。将产物在DMF 中透析48 h，然后再在去离子水中透析24 h，最后将产物冷冻干燥。产率：84.3%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6): δ 7.0-7.4 TAT, 5.16 (-CH(CH3)O- ),3.65 (-CH 2CH 2O-), 1.56 (-CH(CH 3)O-) ，见图2（D）。M n (1H NMR) = 8.8 kg/mol。M n (GPC)= 13.9 kg/mol。 M w/M n (GPC) = 1.3。TAT的接枝率通过BCA 测试得到为98%。
实施例六 合成靶向聚合物HA-b-PDLLA
HA-b-PDLLA通过炔基化的HA与叠氮封端的PDLLA(N3-PDLLA) 的点击化学反应得到。首先，透明质酸上的醛基和丙炔胺上的氨基发生醛胺缩合反应生成席夫碱，随后被氰基硼氢化钠还原为亚胺而制得产物Alkyn-HA；具体步骤为：氮气保护下，寡聚透明质酸（HA,1360 mg，0.17 mmol），丙炔胺（37.4 mg，0.68 mmol），氰基硼氢化钠（42.8 mg，0.68 mmol）加入去离子水（15 mL）中，密闭条件下60 ℃搅拌反应两天，随后调节温度至40 ℃继续反应两天。反应液透析、冻干得白色固体即为中间产物Alkyn-HA。产率：89%。1H NMR (600 MHz,D2O)：1.94 (s, -OCH3), 2.91 (t, -CH2CH2N-), 4.38-4.48 (m, HA)。
手套箱氮气保护下，D,L-丙交酯置于密闭反应器中，加入1.2 mL 二氯甲烷使其充分溶解。随后依次加入叠氮基乙醇（4.35 mg，0.05 mmol）和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯（TBD，6.95 mg，0.05 mmol）作为引发剂和催化剂。充分搅拌体系，密闭后转移出手套箱。30 ℃下反应4 h，随后加两滴冰乙酸终止反应。在体积15~20倍过量于反应液体积的冰冻无水乙醚中沉淀产物。过滤后真空干燥，最终得到黏稠淡黄色固体，即为中间产物N3-PDLLA）。产率：91%。1H NMR (600 MHz, CDCl3): 5.16 (-CH(CH3)O- ), 1.56 (-CH(CH 3)O-)。核磁计算得出分子量：5.9 kDa。GPC测分子量：11.0 kDa，分子量分布：1.2。
通过炔基和叠氮的点击化学（Click chemistry）制备两亲性聚合物。取上述实验合成的修饰有炔基的透明质酸衍生物Alkyn-HA（500mg，0.06mmol）和N3-PDLLA (416 mg,76 μmol) 分别溶于DMSO中，待其充分溶解后转移至两颈烧瓶。保持DMSO总体积为15 mL。随后通氮气，排除溶液中的氧气。将五水合硫酸铜（1.5 mg，0.006 mmol）抗坏血酸钠（2.4 mg, 0.012 mmol）分别溶于10 μL去离子水中，待溶解后依次加入反应体系。设置反应温度为50 ℃，反应过程中氮气保护，反应时间24 h。反应结束后得到黄色透明液体。用截留分子量为15000的透析袋先在DMSO中透析除去未反应的N3-PDLLA，随后依次在EDTA盐溶液和去离子水中透析2天。透析结束后浓缩冷冻干燥，最后得到白色固体即为最终产物HA-b-PDLLA 。干燥后取样测核磁。产率：86%. 1H NMR (600 MHz, D2O/DMSO-d 6 = 1/9) δ (ppm): 1.79,3.03-3.67, and 4.41-4.49 (HA); 1.56 and 5.16 (PDLLA)，见图3。
实施例七 制备交联聚合物纳米粒子和非交联纳米粒子
将10 mg sP-LA和10 mg PEG-PDLLA分别溶在1mL DMSO中，配成10 mg/mL的溶液，取 100 mL sP-LA溶液和30 mLPEG-PDLLA混合均匀，滴加到 870mL磷酸盐缓冲溶液（PB，10mM，pH 7.4）中，室温搅拌0.5 h，氮气条件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小瓶子，在37℃，100 rpm恒温摇床中孵育10 h。然后将该溶液置于透析袋（MWCO3500）内，将其在大量透析介质（PB，10 mM，pH 7.4）中透析24小时，换五次水，得到交联聚合物纳米粒子sPLy XNPs。得到的交联聚合物纳米粒子的尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测的形成的纳米粒子为 73nm，粒径分布很窄，见图4A，由图4A可知，TEM测得纳米粒子为实心球型结构，交联纳米粒子在高倍稀释和胎牛血清存在下仍然保持不变的粒径和粒径分布（图4B），但在模拟肿瘤细胞还原环境下快速溶胀，解交联（图4C）。由此可知，得到的交联纳米粒子具有还原敏感的解交联的性质，适用于药物载体。
非交联纳米粒子制备与交联纳米粒子类似，但不需要加DTT 交联。非交联纳米粒子设置两组对照，分别为由实施例一的星型聚合物与线性聚合物与PEG-PDLLA 共同组装制备。具体为：取100 mL星型聚合物或线性聚合物溶液(10 mg/mL in DMSO) 和30 mL PEG-PDLLA溶液(10 mg/mL in DMSO)混合均匀，滴加到 870mL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH7.4）中，室温搅拌0.5 h，然后将该溶液置于透析袋（MWCO3500）内，将其在大量透析介质（PB，10 mM，pH 7.4）中透析24小时，换五次水，得到非交联聚合物纳米粒子sPLy NPs、lPLyNPs。得到的聚合物纳米粒子的尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测的形成的纳米粒子为85 nm，粒径分布很窄。
实施例八 制备cRGD为靶向分子的靶向交联纳米粒子和非交联纳米粒子
cRGD为靶向分子的靶向交联纳米粒子的制备：在30 mL DMSO中按一定质量比将PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA溶解，以PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA为第二聚合物，参照实施例七的方法制备靶向交联纳米粒子，为实心球型结构。PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA按不同比例混合可制备表面具有不同质量比靶向分子的交联纳米粒子，当cRGD-PEG-PDLLA在第二聚合物中的含量为50 wt.%时，DLS测定靶向交联囊泡尺寸为 85 nm左右，粒径分布较窄。以cRGD为靶向分子的靶向交联纳米粒子简称为cRGD XNPs。
cRGD为靶向分子的靶向非交联纳米粒子的制备：在30 mL DMSO中按一定质量比将PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA溶解，以PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA为第二聚合物，分别与实施例一的星型聚合物与线性聚合物组装，参考实施例七的方法制备靶向非交联纳米粒子。PEG-PDLLA和cRGD-PEG-PDLLA按不同比例混合可制备表面具有不同质量比靶向分子的交联纳米粒子，当cRGD-PEG-PDLLA在第二聚合物中的含量为50 wt.%时，DLS测定靶向交联囊泡尺寸为 90 nm左右，粒径分布较窄。以cRGD为靶向分子的靶向非交联纳米粒子简称为cRGD NPs。
实施例九 制备GE11多肽为靶向分子的靶向交联纳米粒子
以PEG-PDLLA和GE11-PEG-PDLLA为第二聚合物与sP-LA组装，如实施例七的方法制备靶向交联纳米粒子。当GE11-PEG-PDLLA在第二聚合物中的含量为20 wt.%，DLS测定靶向交联囊泡尺寸为 87 nm左右，粒径分布较窄。
实施例十 制备GE11/TAT双靶向交联聚合物纳米粒子
以PEG-PDLLA、GE11-PEG-PDLLA和TAT-PEG-PDLLA为第二聚合物与sP-LA组装，如实施例七的方法制备交联纳米粒子。第二聚合物中，GE11-PEG-PDLLA的含量为20 wt.%，TAT-PEG-PDLLA的含量为20 wt.%，DLS测定靶向交联囊泡尺寸为 104 nm左右，粒径分布较窄。
实施例十一 制备HA为靶向分子的靶向交联纳米粒子和非交联纳米粒子
参照实施例七的方法，将PEG-PDLLA替换为HA-b-PDLLA与sP-LA共组装，得到交联聚合物纳米粒子HA-sPLy XNPs，DLS测的形成的纳米粒子为 90 nm，粒径分布很窄，见图6A；由图6B可知，TEM测得纳米粒子为实心球型结构，交联纳米粒子在高倍稀释和胎牛血清存在下仍然保持不变的粒径和粒径分布（图6C），但在模拟肿瘤细胞还原环境下快速释放，解交联（图6D）。由此可知，得到的交联纳米粒子具有还原敏感的解交联的性质，适用于药物载体。
参照实施例七的方法，将PEG-PDLLA替换为HA-b-PDLLA分别与实施例一的星型聚合物与线性聚合物自组装，得到非交联聚合物纳米粒子HA-sPLy NPs、HA-lPLy NPs，形成的纳米粒子分别为105 nm、110 nm，粒径分布很窄。
实施例十二 交联纳米粒子以及非交联纳米粒子装载阿霉素及体外释放
用溶剂置换法制备靶向交联纳米粒子、载药交联纳米粒子制备、空纳米粒子的制备方法类似。具体为，取100 mL sP-LA溶液和30 mL PEG-PDLLA，加入15 mL DOX 的DMSO 溶液(10 mg/mL) 混合均匀，将混合液滴加到850mL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH 7.4）中，室温搅拌0.5 h。氮气条件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小瓶子，在37℃， 100 rpm恒温摇床中孵育10 h。然后将该溶液置于透析袋（MWCO3500）内，将其在大量透析介质（PB，10 mM，pH7.4）中透析24小时，换五次水，得到载药（DOX）交联纳米粒子，尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测为 85 nm，粒径分布很窄。此外，还制备了非交联的纳米粒子作为对照组，制备方法与交联纳米粒子相同，但不需要加DTT交联。得到的载药纳米粒子命名为DOX-sPLy XNPs、DOX-sPLy NPs、DOX-lPLy NPs，表示载的药物为DOX，XNPs表示交联纳米粒子，NPs表示非交联纳米粒子，其他命名以此类推。
采用不同浓度的DOX DMSO 溶液得到的载不同比例药（10%-30wt.%）的交联聚合物纳米粒子的粒径在130-150 nm，粒径分布在0.15-0.19；荧光光谱仪测定本发明聚合物纳米粒子对DOX的包裹效率为85%-98%。
载药交联纳米粒子 (DOX-sPLy XNPs) 对DOX的体外释放实验在37 ℃恒温摇床中震荡（200 rpm）进行，每组各有三个平行样。第一组，载DOX的交联纳米粒子在加入10 mMGSH模拟细胞内还原环境PB (10 mM, pH 7.4) 中；第二组，载DOX的交联纳米粒子在PB (10mM, pH 7.4)中；载药交联纳米粒子的浓度为100 mg/L，取0.5 mL 放入透析袋（MWCO: 12,000）中，每个试管中加入相应的透析溶剂25 mL，在预定的时间间隔，取出5.0 mL透析袋外部介质用作测试，同时向试管中补加5.0 mL 相应介质。使用荧光仪测定溶液中药物浓度。附图4D为DOX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明载药交联纳米粒子在10 mM的GSH的存在下，能有效释放药物。
载药非交联纳米粒子对DOX 的体外释放实验与交联纳米粒子在同样条件设置下进行。附图4D为DOX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，DOX-sPLy NPs，DOX-lPLy NPs对DOX 的释放量没有明显的增强作用，与在正常生理条件下的释放量相似，呈现缓慢的持续释放行为。
实施例十三 cRGD靶向交联/非交联纳米粒子对DOX 的体外释放
参考实施例八与实施例十二的方法制备cRGD靶向的交联载药（DOX）纳米粒子(DOX-cRGD XNPs) 、cRGD靶向非交联载药纳米粒子(DOX-cRGD NPs)，根据实施例十二的方法进行DOX的体外释放实验。
附图5D为DOX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，对于DOX-cRGD XNPs，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明载药交联纳米粒子在10mM的GSH的存在下，能有效释放药物。cRGD的引入并没有影响纳米粒子对DOX 的释放行为。
附图5D为DOX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，DOX-cRGD NPs对DOX 的释放量没有明显的增强作用，与在正常生理条件下的释放量相似，呈现缓慢的持续释放行为，而且其释放行为并没有被cRGD的引入而改变。
实施例十四 交联纳米粒子对多西他赛(DTX)的体外释放
参考实施例十二的方法制备交联载药(DTX)纳米粒子 (DTX-XNPs) ，根据实施例十二的方法进行DTX的体外释放实验，使用高效液相色谱仪测定溶液中DTX药物浓度。从DTX累积释放量与时间的关系中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明载药交联纳米粒子在10 mM的GSH的存在下，能有效释放药物。
实施例十五 多肽靶向交联纳米粒子对多西他赛(DTX) 的释放
参考实施例九、实施例十与实施例十二的方法制备GE11靶向交联载药（DTX）纳米粒子 (DTX-GE11 XNPs) 、GE11/TAT靶向交联载药纳米粒子(DTX-GE11/TAT XNPs)，根据实施例十二的方法进行DTX的体外释放实验，使用高效液相色谱仪测定溶液中DTX药物浓度。从DTX累积释放量与时间的关系中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明载药交联纳米粒子在10 mM的GSH的存在下，能有效释放药物。GE11及TAT的引入并没有影响纳米粒子对DOX 的释放行为。
实施例十六HA靶向交联/非交联纳米粒子对多西他赛(DTX) 的释放
参考实施例九、实施例十与实施例十二的方法制备HA靶向交联载药纳米粒子(DTX-HA-sPLy XNPs) 、HA靶向非交联载药纳米粒子(DTX-HA-sPLy NPs、DTX-HA-lPLyNPs)，根据实施例十二的方法进行DTX的体外释放实验，使用高效液相色谱仪测定溶液中DTX药物浓度。
附图6D为DTX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，对于DTX-HA-sPLyXNPs，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明载药交联纳米粒子在10 mM的GSH的存在下，能有效释放药物。
附图6D为DTX累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，在正常生理条件下，DTX-HA-sPLy NPs, DTX-HA-lPLy NPs对DTX 的释放量明显多于交联纳米粒子在同样条件下的释放量，说明非交联纳米粒子的胶体稳定性较差。
实施例十七 纳米粒子表面多肽密度对细胞内吞纳米粒子的影响
以5×106个/孔，将细胞种于6孔板，每孔1mL，24小时后养至细胞贴壁70% 左右。然后，实验组各孔中分别加入含有不同多肽靶向密度的纳米粒子样品，孵育4 h后将各组细胞消化离心，用500μL PBS重新分散后放入专用的流式测定管中，通过流式细胞仪测定；其中实验组设置为Lipo-DOX（现有）、DOX-cRGD XNPs、DOX-sPLy XNPs、DOX-cRGD NPs、DOX-sPLyNPs，设定样品空白对照孔。
在B16F10细胞中测定以cRGD为靶向分子的靶向纳米粒子的内吞行为，图7（A）显示，交联纳米粒子由于快速的响应释放，显示出较强的荧光信号；cRGD修饰的交联纳米粒在细胞中具有最高的荧光强度，见图7（B）；
在MDA-MB-231乳腺癌细胞中测定以GE11和TAT为靶向分子的靶向、Cy5标记的纳米粒子的内吞量，实验组为Cy5标记的，具有不同TAT比例的双靶向交联纳米粒子（GE11/(10、15、20、25、30)%TAT XNPs）、Cy5标记的具有GE11靶向分子的交联纳米粒子（GE11 XNPs）、Cy5标记的交联纳米粒子(XNPs)，图7（C）显示具有GE11靶向分子的靶向交联纳米粒子的内吞量明显高于交联纳米粒子，此外，随着TAT量的增多，细胞内荧光强度随之增强；接下来的细胞实验和动物实验选定的实验组为GE11/20%TAT XNPs (后面简称为GE11/TAT XNPs)、GE11XNPs、XNPs。
在A549细胞中测定以HA为靶向分子的、Cy5标记的交联纳米粒子Cy5-HA-sPLyXNPs对A549细胞的特异性结合图7（D）。
实施例十七 MTT法测试空白聚合物的细胞毒性
MTT法使用小鼠黑色素瘤细胞（B16F10），人非小细胞肺癌细胞(A549)，三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231) 测试空白纳米粒子的细胞毒性。以4×103个/孔，将细胞种于96孔板，每孔100 μL，24小时后养至细胞贴壁70%左右。然后，实验组各孔中分别加入含有不同浓度（0.1-1 mg/mL)的纳米粒子样品，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔（复4孔）。培养24小时后，每孔加入MTT（5.0 mg/mL）10 μL，继续培养4小时后每孔加入150 μL DMSO溶解生成的结晶，用酶标仪于490 nm处测吸光度值（A），以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。
附图8（A）为sPLy XNPs、sPLy NPs、lPLy NPs对B16F10的细胞毒性结果，可看出，当交联聚合物纳米粒子的浓度从0.1增到0.5 mg/mL时，B16F10的存活率仍高于90%，说明侧链含硫辛酰基的星型聚合物具有良好的生物相容性；图8（B）显示cRGD-XNPs、cRGD-NPs孵育后的B16F10细胞存活率均高于95%；图8（C）显示除去表面全是TAT的纳米粒子，其他组纳米粒子（GE11/TAT XNPs、GE11 XNPs、XNPs）孵育的MDA-MB-231细胞存活率均高于90%；附图8（D）显示HA-sPLy XNPs和HA-sPLy NPs、HA-lPLy NPs在A549细胞孵育后，细胞存活率都高于90%。
以上空白纳米粒子对细胞的毒性均很小，说明这些载体均具有良好的生物相容性。
实施例十八 MTT法测载药聚合物纳米粒子对细胞的毒性
测试实施例十二制备的DOX-sPLy XNPs，DOX-sPLy NPs，DOX-lPLy NP（DOX 浓度为0.001到20μg/mL）对B16F10的细胞毒性。细胞的培养和实施例十四相同，共同培养4小时后，吸出样品换上新鲜培养基继续孵育44 h后，而后的MTT加入、处理和测定吸光度同实施例十七。
附图9(A)结果显示，载药交联纳米粒子DOX-sPLy XNPs具有最高的细胞增殖抑制作用，其对细胞的半致死浓度（IC50）为1.8 mg/mL，分别比非交联对照组DOX-sPLy NPs、DOX-lPLy NPs 的IC50 值低了2.4 和 4.2倍，说明该交联纳米粒子很好的将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌细胞。
同样的方法和条件测试DOX-cRGD XNPs和DOX-cRGD NPs对B16F10的细胞毒性。结果显示，靶向交联纳米粒子对B16F10 细胞具有较高的细胞毒性，其IC50为0.92 mg/mL，分别比DOX-XNPs、DOX-cRGD NPs和DOX-NPs低了1.95倍、3.48倍和4.70倍，见图9（B）；说明该靶向交联纳米粒子具有很好的靶向作用，能够有效地将药物传送到细胞内，并有效的释放，最终杀死癌细。
同样的方法和条件测试GE11和TAT双多肽为靶向分子的载DTX的交联纳米粒子对MDA-MB-231 细胞的杀伤能力。实验结果显示DTX-GE11/TAT XNPs 对MDA-MB-231 具有最强的抑制细胞增殖的能力，其IC50为0.05 mg/mL，分别DTX-GE11 XNPs，DTX-XNPs、自由DTX 低了4.6倍、9.8倍和16.2倍，见图9（C）；说明该双靶向交联纳米粒子具有对MDA-MB-231 细胞很好的靶向作用，能够高效地将药物传送到细胞内，并快速的释放，最终杀死癌细。
同样的方法和条件测试DTX-HA-sPLy XNPs、DTX-HA-sPLy NPs、DTX-HA-lPLy NPs对A549 细胞的体外抗肿瘤活性；MTT结果显示DTX-HA-sPLy XNPs对A549具有最强抗细胞增殖效果，其IC50为0.18 mg/mL，分别比DTX-HA-sPLy NPs，DTX-HA-lPLy NPs和自由DTX 低了2.1倍、6.6倍和4.6倍，见图9（D）；说明该靶向交联纳米粒子具有对A549 细胞很好的靶向作用，能够高效地将药物传送到细胞内，并快速的释放，最终杀死癌细。
实施例十九 载药粒子的血液循环
所有动物实验操作符合苏州大学动物实验中心规定。实验选用体重为18~20 克左右，4~6周龄的Balb/C裸鼠。DOX-sPLy XNPs、DOX-sPLy NPs，DOX-lPLy NPs均根据实施例十二制备。将各组载药交联纳米粒子通过尾静脉注射小鼠体内（DOX药量为10 mg/kg），在0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 小时定点取血，将血样离心（3000 rpm，6 min），取血清20 μL，再加100 μL、1%的曲拉通和500 μL 无水DMSO萃取（含有20 mM的DTT）；通过荧光光谱仪测每个时间点DOX的量。图10（A）中横坐标为时间，纵坐标为DOX的浓度。由图可知，DOX-sPLy XNPs具有较长的循环时间，约为4.94 h，高于非交联纳米粒子(DOX-sPLy NPs: 4.43h，DOX-lPLy NPs: 3.46 h)，所以载药交联聚合物囊泡在小鼠体内相对于非交联纳米粒子更稳定，有较长循环时间。
实施例二十 DOX-cRGD XNPs，DOX-cRGD NPs的血液循环
动物同实施例十七。DOX-cRGD XNPs，DOX-cRGD NPs的制备方法如实施例八，测试方法同实施例十九。图10（B）横坐标为时间，纵坐标为DOX的浓度。由图可知，DOX-cRGD XNPs具有较长的循环时间，约为5.16 h，高于非交联纳米粒子DOX-cRGD NPs，所以载药交联聚合物囊泡在小鼠体内相对于非交联纳米粒子更稳定，有较长循环时间，而且cRGD多肽的引入不会对纳米粒子的体内循环时间产生特别大的影响。
实施例二十一 载DTX粒子的血液循环
动物同实施例十七。DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX-XNPs的制备方法如实施例九，测试方法同实施例十九，通过高效液相色谱测每个时间点DTX的量。图10(C)中横坐标为时间，纵坐标为DTX的浓度。由图可知，DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX-XNPs 具有相似的循环时间，约为5 h都明显长于自由DTX（0.34 h）。 所以载药交联聚合物纳米粒子在小鼠体内有较长循环时间，而且多肽的引入尤其是TAT的引入没有对纳米粒子的循环时产生很大的影响。
实施例二十二 HA靶向载药粒子的血液循环
动物同实施例十七。DTX-HA-sPLy XNPs，DTX-HA-sPLy NPs，DTX-HA-lPLGA NPs的制备方法如实施例八，测试方法同实施例十九，通过高效液相色谱测每个时间点DTX的量。图10(D)中横坐标为时间，纵坐标为DTX的浓度。由图可知，DTX-HA-sPLy XNPs具有较长的循环时间，约为4.18 h，高于非交联纳米粒子DTX-HA-sPLy NPs (3.5)，DTX-HA-lPLGA NPs(2.97) 和自由DTX (0.23) ；所以载药交联聚合物纳米粒子在小鼠体内相对于非交联纳米粒子更稳定，有较长循环时间。
实施例二十三 DOX粒子在荷B16F10黑色瘤小鼠的体内生物分布
动物同实施例十七，在皮下注射1×105个B16F10人肺癌细胞，大约7天后，肿瘤大小为100~200 mm3时开始实验。根据实施例八制备DOX-cRGD XNPs，DOX-cRGD NPs，尾静脉注射小鼠体内（DOX：10 mg/kg），8 小时后处死老鼠，将肿瘤及心，肝，脾，肺和肾组织取出，清洗称重后加入500 μL 1% 的曲拉通通过匀浆机磨碎，再加入900 μL 无水DMSO萃取（其中含有20 mM的DTT）。离心（20000转/分钟，20分钟）后，取上层清液，通过荧光光谱测得每种组织里面DOX的量。图11(A)中横坐标为组织器官，纵坐标为每克肿瘤或组织中的DOX占总DOX注射量（ID%/g）。DOX-cRGD XNPs注射8小时在肿瘤积累的DOX量为10.96ID%/g 是DOX-cRGDNPs的2.1倍，说明载药DOX-cRGD XNPs通过主动靶向在肿瘤部位积累较多，具有较好的肿瘤特异性靶向作用。
实施例二十四 DTX粒子在荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠的体内生物分布
生物分布实验中肿瘤的接种以及尾静脉给药同实施例十八。首先根据实施例九制备DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX-XNPs。尾静脉注射小鼠体内（DTX：10 mg/kg），采用实施例二十三的方法，通过高效液相色谱测得每种组织里面DTX的量。图11(B)中横坐标为组织器官，纵坐标为每克肿瘤或组织中的DTX占总DOX注射量（ID%/g）。DTX-GE11/TATXNPs注射8小时在肿瘤积累的DTX量为9.72 ID%/g，分别是 DTX-GE11 XNPs，DTX- XNPs 和自由DTX的1.88，3.12，8.75 倍，说明DTX-GE11/TAT XNPs通过主动靶向在肿瘤部位积累较多，具有较好的肿瘤特异性靶向作用。
实施例二十五 HA靶向载DTX粒子在荷A549 肺癌小鼠的体内生物分布
生物分布实验中肿瘤的接种以及尾静脉给药同实施例十八。首先根据实施例九制备DTX-HA-sPLy XNPs，DTX-HA-sPLy NPs，DTX-HA-lPLGA NPs，采用实施例二十四的方法。图11(C)中横坐标为组织器官，纵坐标为每克肿瘤或组织中的DTX占总DOX注射量（ID%/g）。DTX-HA-sPLy XNPs注射8小时在肿瘤积累的DTX量为9.48ID%/g 分别是DTX-HA-sPLy NPs，DTX-HA-lPLGA NPs 和自由DTX的1.5,2.0,3.9倍，说明DTX-HA-sPLy XNPs通过主动靶向在肿瘤部位积累较多，具有较好的肿瘤特异性靶向作用。
实施例二十六 DOX粒子在荷B16F10黑色素瘤的小鼠中的治疗效果
肿瘤的接种以及尾静脉给药同实施例十八，在大约两周后，肿瘤大小为30~50 mm3时开始实验。将DOX-cRGD XNPs，DOX-sPLy XNPs， DOX-cRGD NPs，Lipo-DOX以及PBS分别在0、2、4、6和8天通过尾静脉注射小鼠体内（DOX药量为10 mg/kg），对于DOX-cRGD XNPs设置一个高剂量给药组（DOX药量为20 mg/kg）。在0~12天，每三天称量小鼠的体重，游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积计算方法为：V=（L×W×W）/2，（其中L、W、H分别为肿瘤的长度、宽度和厚度）。持续观察小鼠的生存到45天。由图12中可知，DOX-cRGD XNPs（DOX:20 mg/kg）治疗组在12天时，肿瘤得到明显抑制，其效果与Lipo-DOX组相当，并且小鼠体重没有明显的变化，值得注意的是Lipo-DOX组小鼠体重下降了约15%。而DOX-cRGD XNPs，DOX XNPs，DOX-cRGD NPs组肿瘤都有一定的增长，但是其增长速度和增长量都明显低于PBS组，而且也均未引起小鼠的体重变化，说明载药聚合物纳米粒子对小鼠没有毒副作用。DOX-cRGD XNPs（DOX:20 mg/kg）小鼠的中位生存期为43天，DOX-cRGD XNPs，DOX XNPs，DOX-cRGD NPs和Lipo-DOX和PBS组小鼠的中位生存期分别为30、26、25、21和14天。而且，所有治疗组除Lipo-DOX组外对小鼠主要脏器均没有引起明显的伤害，Lipo-DOX组小鼠的肝脏，脾脏和肾脏均有明显损伤。
实施例二十七 DTX粒子在荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠中的治疗效果
肿瘤的接种以及尾静脉给药同实施例十九。DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX XNPs 和自由DTX 及PBS分别在0、3、6和9天通过尾静脉注射小鼠体内（DTX药量为5 mg/kg）。在0~18天，每三天称量小鼠的体重，如实施例二十六测量肿瘤体积和观察小鼠到60天。由图13中可知，DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX XNPs 和自由DTX治疗组18天时，肿瘤均得到不同程度抑制，而PBS组肿瘤有明显的增长。值得注意的是DTX-GE11/TAT XNPs，DTX-GE11 XNPs，DTX XNPs均能明显有效抑制肿瘤的增长，并且小鼠体重未发生明显变化。对于自由DTX组，虽然肿瘤生长得到了一定的抑制，但是，小鼠体重下降明显，说明自由DTX对小鼠带来了严重的系统毒性。
实施例二十八 HA靶向载DTX粒子在荷A549 肺癌小鼠的治疗效果
A549皮下肿瘤的接种以及尾静脉给药同实施例十九。将DTX-HA-sPLy XNPs，DTX-HA-sPLy NPs，DTX-HA-lPLGA NPs 和自由DTX以及PBS分别在0、4、8和12天通过尾静脉注射小鼠体内（DTX药量为5 mg/kg）。如实施例二十在0~16天内称量小鼠的体重、量肿瘤体积和观察小鼠到60天。由图14可知，DTX-HA-sPLy XNPs、DTX-HA-sPLy NPs、DTX-HA-lPLGA NPs和自由DTX治疗16天时，肿瘤得到一定程度抑制，而PBS组肿瘤有明显的增长。值得注意的是，除自由DTX组之外，小鼠体重均没有明显变化，由于DTX强烈的毒副作用，小鼠体重下降严重，在16天时下降了约15%，以上结果说明载药纳米粒子具有较好的生物相容性，对小鼠没有毒副作用。除此之外，DTX-HA-sPLy XNPs治疗组相对于DTX-HA-sPLy NPs、DTX-HA-lPLGA NPs治疗组，具有显著性差异，表现出最优异的抑制肿瘤生长的效果。

Claims (5)

1.一种末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时，得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时，得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天，得到末端含硫辛酰基的星型聚合物；
所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，x:y为(1～3)∶1。
2.根据权利要求1所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）反应结束后，过滤反应液，得到硫辛酸酐溶液；步骤（2）反应完成后产物溶解在二氯甲烷中，随后在冰甲醇中沉淀、抽滤、真空干燥得到星型聚合物；步骤（3）反应结束后将反应物在冰乙醚中沉淀，再经抽滤并真空干燥滤得到末端含硫辛酰基的星型聚合物。
3.根据权利要求1所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的制备方法，其特征在于，N,N-二环己基碳二亚胺溶液中溶剂为二氯甲烷；硫辛酸溶液中溶剂为二氯甲烷；含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中有机溶剂为二氯甲烷；N,N-二环己基碳二亚胺、硫辛酸的摩尔比为2∶1；多羟基葡萄糖、丙交酯、乙交酯的摩尔比为1∶（50～55）∶（60～65）；硫辛酸酐、4-二甲基氨基吡啶、星型聚合物的摩尔比为7.5∶10∶1。
4.一种可逆交联具有还原响应性的聚合物纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时，得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时，得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天，得到末端含硫辛酰基的星型聚合物；
（4）将末端含硫辛酰基的星型聚合物与第二聚合物在溶剂中共组装得到可逆交联具有还原响应性的聚合物纳米粒子；
所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的化学结构式如下：
Figure 782437DEST_PATH_IMAGE001
其中，x:y为(1～3)∶1。
5.一种纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氮气环境下，冰水浴条件下，将N,N-二环己基碳二亚胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室温反应10～15小时；得到硫辛酸酐溶液；
（2）真空环境下，以多羟基葡萄糖作为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，丙交酯和乙交酯于160℃下反应8小时；得到星型聚合物；
（3）氮气环境下，将硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶和星型聚合物的有机溶剂中，密封条件下，于30℃反应1～3天；得到末端含硫辛酰基的星型聚合物；
（4）将末端含硫辛酰基的星型聚合物与第二聚合物、小分子药物在溶剂中组装得到纳米药物；
所述末端含硫辛酰基的星型聚合物的化学结构式如下：
Figure 534492DEST_PATH_IMAGE001
其中，x:y为(1～3)∶1。
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