CN110123785B - 一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法 - Google Patents

一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法，纳米粒制剂包括两亲性聚合物，该两亲性聚合物包括明胶、至少一个化疗药物的分子，每个化疗药物的分子通过第一化学基团与明胶进行化学键连接，所述第一化学基团的主链含有二硫键。其中二硫键具有氧化还原敏感性，在肿瘤组织周围谷胱甘肽浓度较高的时候可断裂释放药物。同时明胶作为MMP‑2酶的底物，可在肿瘤组织周围被过表达的MMP‑2酶降解为小粒子，增加肿瘤组织内的穿透性，从而实现双敏感的药物释放。

Description

一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法
技术领域
本公开涉及属于药物制剂领域，具体涉及一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
癌症作为一种具有较高的致死率慢性病，对人类的健康有着较大威胁。化疗作为治疗癌症的主要手段，其高毒性与较强的副反应是治疗过程中的主要障碍之一，限制了药物给药剂量的同时，可能对正常的组织器官产生毒副作用。因此，纳米靶向技术作为一种提高药物体内分布并降低毒性的方法，在最近十年内得到了广泛的关注与研究。将化疗药物包裹于纳米粒中，不仅可以控制药物释放，还可影响药物的体内分布与清除率，提高疗效的同时降低副作用。
常见的纳米制剂可通过被动靶向、主动靶向与物理化学靶向到达肿瘤靶部位。被动靶向主要通过纳米载体的粒径与肿瘤组织特有的高渗透性长滞留效应(enhancedpermeability and retention effect,EPR effect)使药物富集于靶部位。而主动靶向主要是通过载体与靶组织产生的分子特异性相互作用结合的方式。通常，粒径在20nm到200nm之间的纳米粒子能够通过EPR效应实现药物在肿瘤组织蓄积。然而，本公开发明人研究了解，当纳米制剂粒径较大时，颗粒穿透能力弱，血液半衰期较长，使得治疗效果较差；而当纳米制剂粒径较小时，颗粒穿透能力强，容易损伤正常的组织器官。
发明内容
理想的纳米制剂应具有相对大的初始尺寸，以实现长循环和选择性外渗，一旦从血管泄漏进入肿瘤间质，粒径应适当减小收缩，以增强穿透的均匀性。为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法，提高治疗作用的同时，降低化疗药物对正常组织器官的毒性。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种两亲性聚合物，包括明胶、至少一个化疗药物的分子，每个化疗药物的分子通过第一化学基团与明胶进行化学键连接，所述第一化学基团的主链含有二硫键。
首先，本公开中的两亲性聚合物中含有明胶，明胶作为MMP-2的底物，可在肿瘤微环境中被降解成小粒径的纳米粒子，增强制剂在肿瘤组织中的穿透力。其次，本公开选择巯基化明胶作为亲水性聚合物，能够保证纳米粒制剂能够在体液中稳定存在。第三，本公开将化疗药物与巯基化明胶通过第一化学基团进行化学键连接，形成两亲性聚合物，当该两亲性聚合物处于水溶液中时，能够通过分子间作用力特别是疏水作用力聚集形成纳米粒。该纳米粒制剂处于水溶液中时，能够通过疏水作用力将难溶性化疗药物物理包埋入纳米粒中，从而提高载药量。第四，第一化学基团的主链含有二硫键，在正常生理条件下，谷胱甘肽较少，二硫键难以断裂，从而无法释放化疗药物；在肿瘤组织周围时，谷胱甘肽较多，二硫键可以断裂并释放药物，从而实现纳米粒的氧化还原敏感性释放。
另一方面，一种上述两亲性聚合物的制备方法，将含有二硫键化疗药物前药与明胶进行酰胺化反应或酯化反应获得，所述含有二硫键化疗药物前药为二硫键的两端分别连接化疗药物分子和第二化学基团的化合物，第二化学基团为能够与氨基、羟基或羧基进行取代反应的基团，例如氨基、羟基、羧基、酰卤(酰氯、酰溴等)等。
明胶的主要组成为氨基酸组成相同而分子量分布很宽的多肽分子混合物，分子量一般在几万至十几万。明胶既具有羧基，又具有氨基，是一种两性物质，明胶的胶团是带电的，在电场作用下，它将向两极中的某一极移动。明胶分子结构上有大量的羟基，另外还有许多羧基和氨基，这使得明胶具有极强的亲水性。当第二化学基团为氨基时，能与明胶的羧基进行酰胺化反应。当第二化学基团为羟基时，能与明胶的羧基进行酯化反应。当第二化学基团为羧基或酰卤(酰氯、酰溴等)时，能与氨基进行酰胺化反应，也能与羟基进行酯化反应。
第三方面，一种上述两亲性聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
第四方面，一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂，有效成分为上述两亲性聚合物。
第五方面，一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂，包括上述两亲性聚合物和化疗药物，化疗药物负载在两亲性聚合物内，以两亲性聚合物作为载体，使得纳米粒制剂在到达肿瘤周围环境时，能够更快的释放化疗药物，同时两亲性聚合物中通过化学键连接的化疗药物能够达到缓释的效果，从而提高疗效。
第六方面，一种上述纳米粒制剂的制备方法，将化疗药物溶解于第一有机溶剂中获得的化疗药物溶液，将两亲性聚合物溶解于混合溶剂中获得聚合物溶液，将化疗药物溶液与聚合物溶液混合，在惰性气氛下进行反应，制备载药纳米粒，所述混合溶剂为水与第二有机溶剂的混合物，所述第一有机溶剂、第二有机溶剂均为能与水互溶的有机物。
本公开的原理为：明胶是一种胶原蛋白的衍生物，具有较好的生物相容性与生物降解性，是一种很有前途的生物材料，可用于构建先进的药物传递系统。另外，明胶是一种从丰富的可再生资源中获得的材料，其应用是可行且经济的，可以考虑用于制药工业中的大规模生产。明胶作为MMP-2的底物之一可在肿瘤组织微环境中被过表达的MMP-2酶降解，因而，明胶纳米粒可在肿瘤组织周围降解为小颗粒，增加在肿瘤部位的渗透能力并释放药物。
本公开在化疗药物中引入二硫键，在正常的生理条件下，由于谷胱甘肽浓度较低，二硫键难以断裂释放药物；而在肿瘤组织周围，由于谷胱甘肽浓度较高，二硫键可以断裂并释放药物，从而实现纳米粒的氧化还原敏感性释放。
本公开的有益效果为：
本公开提供了了一种提高难溶性化疗药物溶解度、提高化疗药物靶向性的双敏感型纳米制剂，其原料价廉易得，生物相容性与生物降解性好，制备方法简单，靶向作用明显，高效低毒，具有较好的应用前景。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例1的PTX-SS-COOH的合成路线图；
图2为本公开实施例1制备的PTX-SS-COOH核磁共振氢谱图；
图3为本公开实施例2制备的Gel-SH的核磁图谱图；
图4为本公开实施例3制备的Gel-SS-PTX的核磁图谱图；
图5为本公开实施例5制备的纳米粒电镜照片，A为空白纳米粒，B为Gel-SH/PTX-SS-COOH纳米粒，C为Gel-SS-PTX纳米粒，D为BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH共载药纳米粒，A、B、C、D的比例尺均为100nm；
图6为本公开实施例6的空白纳米粒对MCF-7细胞的细胞毒性实验结果表征图；
图7为本公开实施例6的不同载药体对MCF-7细胞的细胞毒性实验结果表征图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本公开提出了一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂及制备方法，该纳米制剂具有相对大的初始尺寸，能够实现长循环和选择性外渗，当需要从血管进入肿瘤间质时，粒径应适当减小收缩，从而增强穿透的均匀性。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种两亲性聚合物，包括明胶、至少一个化疗药物的分子，每个化疗药物的分子通过第一化学基团与明胶进行化学键连接，所述第一化学基团的主链含有二硫键。
肿瘤微环境中的谷胱甘肽(Glutathione，GSH)浓度约为1～10mmol，远高于血液与正常细胞外环境中GSH浓度(2～20μmol)。并且，肿瘤组织中过表达的金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)，尤其是以明胶为底物的MMP-2。首先，本公开中的两亲性聚合物中含有明胶，明胶作为MMP-2的底物，可在肿瘤微环境中被降解成小粒径的纳米粒子，增强制剂在肿瘤组织中的穿透力。其次，本公开选择巯基化明胶作为亲水性聚合物，能够保证纳米粒制剂能够在体液中稳定存在。第三，本公开将化疗药物与巯基化明胶通过第一化学基团进行化学键连接，形成两亲性聚合物，当该纳米粒制剂处于水溶液中时，能够通过疏水作用力将化疗药物物理包埋入纳米粒中，从而提高载药量。第四，第一化学基团的主链含有二硫键，在正常生理条件下，谷胱甘肽较少，二硫键难以断裂，从而无法释放化疗药物；在肿瘤组织周围时，谷胱甘肽较多，二硫键可以断裂并释放药物，从而实现纳米粒的氧化还原敏感性释放。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述明胶为巯基化明胶。巯基化明胶表面含有巯基，能够形成二硫键，使该聚合物能够自发交联，使其形成的纳米制剂形貌更好，从而增加治疗效果。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述明胶为A型明胶。等电点为pH＝7～9。
本公开中所述化疗药物为紫杉醇或阿霉素，本公开以紫杉醇为实施例进行实验，效果较好。
该实施方式的一种或多种实施例中，截留分子量不低于8000。
该实施方案的一种或多种实施例中，明胶与化疗药物的摩尔比为1:0.5～2。
本公开的另一种实施方式，提供了一种上述两亲性聚合物的制备方法，将含有二硫键化疗药物前药与明胶进行酰胺化反应或酯化反应获得，所述含有二硫键化疗药物前药为二硫键的两端分别连接化疗药物分子和第二化学基团的化合物，第二化学基团为能够与氨基、羟基或羧基进行取代反应的基团，例如氨基、羟基、羧基、酰卤(酰氯、酰溴等)等。
明胶的主要组成为氨基酸组成相同而分子量分布很宽的多肽分子混合物，分子量一般在几万至十几万。明胶既具有羧基，又具有氨基，是一种两性物质，明胶的胶团是带电的，在电场作用下，它将向两极中的某一极移动。明胶分子结构上有大量的羟基，另外还有许多羧基和氨基，这使得明胶具有极强的亲水性。当第二化学基团为氨基时，能与明胶的羧基进行酰胺化反应。当第二化学基团为羟基时，能与明胶的羧基进行酯化反应。当第二化学基团为羧基或酰卤(酰氯、酰溴等)时，能与氨基进行酰胺化反应，也能与羟基进行酯化反应。
该实施方式的一种或多种实施例中，含有二硫键化疗药物前药的制备方法为：将化疗药物与含二硫键的化疗药物前药溶于第三有机溶剂中，加入DMAP，惰性气氛下进行反应。
本公开的所述含二硫键的化疗药物前药为二硫代二丙酸酐、二硫二乙醇、胱胺、二硫代二乙酸中的任一种。当选择二硫代二丙酸酐时，效果更好。
以紫杉醇与二硫代二丙酸酐合成为例，将紫杉醇与二硫代二丙酸酐溶于吡啶中，加入DMAP，反应液在氮气保护下反应24h。反应结束后，旋蒸除去吡啶，并在反应液中加入稀盐酸除去未蒸干的吡啶，洗涤液用二氯甲烷萃取，共重复三次，用0.22μm的滤膜除去未反应的DTDPA。将二氯甲烷蒸干，放入真空干燥箱中干燥过夜既得紫杉醇前药(PTX-SS-COOH)。
所述酰胺化反应或酯化反应均为常规化学反应，该实施方式的一种或多种实施例中，以PTX-SS-COOH与明胶进行酰胺化反应为例，其过程为：采用EDC与NHS将化疗药物前药活化，然后加入明胶在惰性气氛下进行反应。
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。NHS：N-羟基琥珀酰亚胺。DMAP：4-二甲胺基吡啶。
该系列实施例中，化疗药物与EDC的摩尔比为1:0.5～2。当摩尔比为1:2时，效果更好。
该系列实施例中，反应温度为40℃。
为了获得更为纯净的两亲性聚合物，该实施方式的一种或多种实施例中，将反应后的反应液转移至透析袋中，分别用DMSO与去离子水透析，然后冷冻干燥。
该系列实施例中，所用透析袋截留分子量为8000～14000。
该实施方式的一种或多种实施例中，采用的明胶为巯基化明胶。
该系列实施例中，巯基化明胶的制备方法为：采用EDC与NHS将对巯基苯甲酸活化，然后加入明胶在惰性气氛下进行反应。
该系列实施例中，巯基苯甲酸、EDC与NHS的摩尔比为1:2:4。
该系列实施例中，反应温度为40℃。
为了获得更为纯净的巯基化明胶，该实施方式的一种或多种实施例中，将反应后的反应液转移至透析袋中，分别用DMSO与去离子水透析，然后冷冻干燥。
该系列实施例中，所用透析袋截留分子量为8000～14000。
本公开的第三种实施方式，提供了一种上述两亲性聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本公开的第四种实施方式，提供了一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂，有效成分为上述两亲性聚合物。
该实施方式的一种或多种实施例中，包括牛血清白蛋白。利用牛血清白蛋白可主动靶向肿瘤细胞表面过表达的SPARC蛋白，实现化疗药物的靶向给药，能够进一步提高抗癌效率的同时降低副作用。
本公开的第五种实施方式，提供了一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂，包括上述两亲性聚合物和化疗药物，化疗药物负载在两亲性聚合物内。
以两亲性聚合物作为载体，使得纳米粒制剂在到达肿瘤周围环境时，能够更快的释放化疗药物，同时两亲性聚合物中通过化学键连接的化疗药物能够达到缓释的效果，从而提高疗效。
该实施方式的一种或多种实施例中，包括牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白通过静电作用力包覆在两亲性聚合物外。
该实施方式的一种或多种实施例中，化疗药物为含有二硫键化疗药物前药，所述含有二硫键化疗药物前药为二硫键的两端分别连接化疗药物分子和第二化学基团的化合物，第二化学基团为氨基、羟基或羧基。能够与两亲性聚合物更好的结合，从而提高治疗效果。
本公开的第六种实施方式，提供了一种上述纳米粒制剂的制备方法，将化疗药物溶解于第一有机溶剂中获得的化疗药物溶液，将两亲性聚合物溶解于混合溶剂中获得聚合物溶液，将化疗药物溶液与聚合物溶液混合，在惰性气氛下进行反应，所述混合溶剂为水与第二有机溶剂的混合物，所述第一有机溶剂、第二有机溶剂均为能与水互溶的有机物。
该实施方式的一种或多种实施例中，第一有机溶剂为甲醇或乙腈。当第一有机溶剂为乙腈时，溶解效果更好。
该实施方式的一种或多种实施例中，混合溶剂中，水与第二有机溶剂的体积比为0.5～2:1。当水与第二有机溶剂的体积比为1:1时，效果更好。
该实施方式的一种或多种实施例中，第二有机溶剂为甲醇或乙腈。当第二有机溶剂为乙腈时，溶解效果更好。
该实施方式的一种或多种实施例中，化疗药物溶液与聚合物溶液混合后，调节pH为5.5～7.4。当pH为6.8时，治疗效果更好。
该系列实施例中，调节pH后添加牛血清白蛋白水溶液，然后在惰性气氛下进行反应。
该实施方式的一种或多种实施例中，在惰性气氛下进行反应的时间为45～50h。
本公开中所述的惰性气氛是指在防止发生氧化反应的气氛，例如氮气、氩气等形成的气氛。
该实施方式的一种或多种实施例中，在惰性气氛下进行反应的温度为25～50℃。
为了去除游离的化疗药物，该实施方式的一种或多种实施例中，反应后将溶液置于透析袋中用去离子水透析，透析后的溶液进行离心获得的上清液即为纳米粒制剂。
该系列实施例中，透析袋的截留分子量为8000～14000。
该系列实施例中，透析时间为45～50h。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1紫杉醇-二硫代二丙酸结合物(PTX-SS-COOH)的合成
合成路线如图1所示。分别称取紫杉醇(PTX，0.020g，0.023mmol)，二硫代二丙酸酐(DTDPA，0.044g，0.023mmol)和DMAP(0.014g，0.11mmol)(PTX、DTDPA与DMAP的摩尔比为1:1:5)，置于25mL圆底烧瓶中，加入2mL吡啶，在35℃的氮气保护下反应24h。反应液在80℃下旋转蒸发除去大部分吡啶，并加入稀盐酸除去未蒸干的吡啶，洗涤液用二氯甲烷萃取，共重复三次，用0.22μm的滤膜除去未反应的DTDPA。将二氯甲烷蒸干，放入真空干燥箱中干燥过夜。PTX-SS-COOH的核磁共振氢谱图如图2所示，产物具有PTX与DTDPA的特征吸收峰，其中8.04ppm处为PTX苯环上的质子吸收峰。并且，产物在12.4ppm处出现了一单峰，为-COOH吸收峰，而PTX在此处无吸收峰，证明PTX-SS-COOH成功合成。
实施例2巯基化明胶(Gel-SH)的合成
称取对巯基苯甲酸(0.008g，0.05mmol)、EDC(0.010g，0.05mmol)于25mL圆底烧瓶中(对巯基苯甲酸与EDC的摩尔比为1:1)，加入400μL无水乙醇，超声使其溶解。再加入800μL氢氧化钠溶液(0.1M)和800μL去离子水，超声使溶液均匀，室温并在氮气保护下下活化1h。在反应液中加入NHS(0.012g，0.10mmol)(NHS与EDC的摩尔比为2:1)，室温并在氮气保护下继续活化1h。称取0.1g A型明胶，加入10mL去离子水溶胀并溶解，在超声条件下将上述活化液缓缓滴入明胶溶液，40℃下氮气保护反应4h。反应液放入透析袋(MWCO＝8000-14000)中，DMSO透析24h，再用去离子水透析24h，冻干后得到产物Gel-SH。
产物的核磁共振氢谱图如图3所示。合成的产物中既存在明胶的特征峰(1.0ppm，三重峰；3.5ppm，四重峰)，又在2.6ppm处出现了新的单峰，归属于芳香族巯基质子的吸收峰，即对巯基苯甲酸的吸收峰。另外，在明胶的1H-NMR谱图中，δ7.5-8.0ppm处无吸收，而Gel-SH的1H-NMR谱图出现了相应的吸收峰，归属于苯环上的质子峰，进一步证明了对巯基苯甲酸与明胶反应成功。
实施例3两亲性聚合物(Gel-SS-PTX)的合成
称取Gel-SH(0.008g)，用去离子水溶胀并溶解。另称取PTX-SS-COOH(0.008g)与EDC(0.003g)置于25mL的圆底烧瓶中，PTX-SS-COOH:EDC＝1:2(mol/mol)，乙腈溶解，室温并在氮气保护下反应1h。再加入NHS(0.004g)，室温并在氮气保护下活化1h。将反应液缓慢滴入Gel-SH水溶液中，调节水-乙腈的比例，使反应液澄清(乙腈与水的体积比为1:1)，40℃下氮气保护反应24h。反应液转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000)，在DMSO和水中各透析24h。
Gel-SS-PTX的核磁图谱见图4。产物的1H-NMR谱图中既存在明胶的特征峰(1.0ppm，三重峰；3.5ppm，四重峰)，又具有紫杉醇苯环上氢的特征峰(8.1ppm左右)，另外，PTX-SS-COOH分子-COOH的特征峰(12.35ppm，单峰)消失，说明PTX-SS-COOH中的羧基与明胶上的氨基反应，成功合成了Gel-SS-PTX。
实施例4 BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒的处方筛选
表1处方筛选结果
Figure BDA0002077437670000081
的载药量和包封率测定方法：水解PTX-SS-COOH后得到PTX。在冻干的纳米粒中加入1mL HCl(3M)，85℃下孵育2h，使PTX水解下来，最后加入0.85mL 0.5％的碳酸铵(v/v)终止反应。加入二氯甲烷萃取水解下来的PTX，并洗涤水相三次，使PTX萃取完全。将萃取后的PTX二氯甲烷溶液旋蒸后蒸干溶剂，并加入适量乙腈溶解，用0.22μm的滤膜过滤。用紫外分光光度计于227nm处测定吸光度值，计算PTX的含量。
DL(％)＝纳米粒中药物质量/(纳米粒中药物质量+载体材料质量)×100％
EE(％)＝纳米粒中药物质量/投入的药物质量×100％
根据单因素考察实验结果，确定了最终的BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒的制备方法。首先，取0.010g PTX-SS-COOH溶于乙腈溶液，加入0.004g EDC(PTX-SS-COOH:EDC＝1:2,mol/mol)，氮气保护下活化1h。再加入NHS(0.005g，EDC:NHS＝1:2，mol/mol)，室温条件下活化1h(氮气保护)。取0.010g Gel-SH溶于去离子水，并将活化后的反应液缓慢滴入Gel-SH水溶液中，调节水-乙腈的比例，使反应液澄清(乙腈与水的体积比约为1:1)，40℃下氮气保护反应24h。反应结束后，取0.0026g牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)溶于少量去离子水中，调整pH值为6.8左右，用0.22μm的水系滤膜过滤，将BSA水溶液在搅拌条件下缓慢滴入反应液中，氮气保护下反应24h。最后将反应液转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000)，去离子水透析24h，期间换透析液3-4次。取袋中溶液，8000rpm下离心10min，上清液即为BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒。
实施例5 BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒理化性质的考察
A.采用透射电镜法观察纳米粒形态
采用透射电镜法(TEM)观察空白纳米粒、Gel-SH/PTX-SS-COOH纳米粒、Gel-SS-PTX纳米粒与BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH共载药纳米粒的表面形态。将纳米粒溶液稀释至合适的浓度，并用电镜铜网打捞。利用磷钨酸进行负染色并用滤纸吸干多余的磷钨酸后，置于TEM下观察并拍摄电镜照片。结果如图5所示。由结果可以看出，四种不同的纳米粒均为球形，表面较光滑，无粘连，呈现出较好的外观形态。
B.空白纳米粒、Gel-SH/PTX-SS-COOH纳米粒、Gel-SS-PTX纳米粒与BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH共载药纳米粒的粒径分布及Zeta电位通过马尔文粒径与Zeta电位分析仪进行测定。结果如表2所示，所述载药纳米粒的粒径均在100nm左右，且粒径分布较均匀。
表2各种类型纳米粒的粒径及Zeta电位结果
Figure BDA0002077437670000091
实施例6安全性评价
A.材料溶血毒性试验
取家兔心脏新鲜血液5mL，2500rpm下离心10min，弃去上层血浆，加入适量生理盐水洗涤后再次离心，重复三次直至上清液无色，得到压积红细胞。用移液枪吸取压积红细胞0.5mL至25mL容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，得到2％的血细胞混悬液。
按照表3配制不同终浓度的Gel-SH空白纳米粒溶液，其中样品6与7分别为阴性对照(0％溶血)与阳性对照(100％溶血)。将样品置于37℃水浴中孵育1h，3000rpm下离心10min，取上清液，用紫外分光光度计于540nm处测吸光度A，并按照公式计算溶血率(Hemolysis，％)：
溶血率(％)＝(Abssample–Abs0)/(Abs100–Abs0)×100％.
Abssample,Abs0and Abs100分别代表样品的吸光度、0％溶血率的吸光度及100％溶血率的吸光度。
表3溶血实验样品制备表
Figure BDA0002077437670000101
Gel-SH空白纳米粒溶血毒性实验结果见表4。由结果可知，随着材料浓度的增加，溶血率呈上升趋势，当空白纳米粒浓度＜3mg/mL时，溶血率＜1％，几乎无溶血毒性；而当空白纳米粒浓度为5mg/mL，溶血率为3.795％，仍＜5％。因此，当浓度为1-5mg/mL时，可认定该材料基本无溶血毒性，静脉注射时血液安全性较好。
表4空白纳米粒溶血毒性结果
Figure BDA0002077437670000102
B.材料细胞毒性实验
贴壁细胞的培养：人乳腺癌细胞(MCF-7)在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于恒温培养箱(37℃，5％CO2)中常规培养。
空白纳米粒的细胞毒性实验：以MCF-7为细胞模型，通过MTT法考察空白纳米粒的细胞毒性。取生长对数期的MCF-7细胞，用RPMI 1640培养基重悬细胞并吹打均匀后，以5000个细胞/孔的密度将细胞接种至96孔板上，在培养箱中孵育过夜。配制不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL)的明胶(Gel)、Gel-SH NPs、BSA/Gel-SH NPs与聚氧乙烯蓖麻油-乙醇(Cremophor EL and ethanol)溶液，为了模仿紫杉醇上市制剂
Figure BDA0002077437670000111
的配方，聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的体积比为1:1。各组溶液均用RPMI 1640培养基配制并稀释。将配制好的溶液加入96孔板中，每组制剂设置五个复孔，并设置阴性对照组(仅有培养基，无细胞与制剂)和阳性对照组(仅有培养基和细胞，无制剂)。将96孔板放入培养箱中继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。在培养箱中继续培养4h后，2500rpm下平板离心25min，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，避光摇匀，用酶标仪在570/630nm波长下检测吸光度OD，并按照公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝(ODsample-ODnegative)/(ODpositive-ODnegative)×100％
其中，ODsample、ODnegative、ODpositive分别代表样品、阴性对照与阳性对照的吸光度值。
结果如图6所示。空白纳米粒对MCF-7细胞的细胞毒性呈剂量依赖性，即随着纳米粒浓度的增加，细胞毒性增大。然而，空白纳米粒的细胞毒性明显低于聚氧乙烯蓖麻油-乙醇(p＜0.05)，且在最高实验浓度0.5mg/mL下，空白纳米粒的细胞存活率仍大于80％，而无PTX的
Figure BDA0002077437670000112
制剂细胞存活率下降至66.67％。以上实验结果说明，纳米粒所使用的材料与聚氧乙烯蓖麻油-乙醇相比，具有较低的毒性、较高的安全性与较好的生物相容性。因此，在使用此材料进行研究时应注意材料的浓度。
C.载药纳米粒(BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH)的细胞毒性考察
取生长对数期的MCF-7细胞，胰蛋白酶消化后将细胞转移至离心管，100g/min离心5min，用RPMI 1640培养基重悬细胞并吹打均匀后，以5000个细胞/孔的密度将细胞接种至96孔板上，在培养箱中孵育过夜。配制不同浓度(0.1、1、5、10、20μg/mL)的PTX、PTX-SS-COOH、BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH共载药纳米粒(pH 6.5、pH 7.4)溶液，其中PTX与PTX-SS-COOH的溶剂与
Figure BDA0002077437670000113
配方相同。将配制好的溶液加入96孔板中，每组制剂设置五个复孔，并设置阴性对照组(仅有培养基，无细胞与制剂)和阳性对照组(仅有培养基和细胞，无制剂)。将96孔板放入培养箱中继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。在培养箱中继续培养4h后，2500rpm下平板离心25min，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，避光摇匀，用酶标仪在570/630nm波长下检测吸光度OD，并计算细胞存活率。
载药纳米粒的细胞毒性考察结果如图7所示，各组制剂对MCF-7细胞的细胞毒性均呈现剂量依赖性，即随着药物浓度的增加，细胞存活率下降。当药物浓度较低(＜5μg/mL)时，共载药纳米粒的细胞毒性大于原料药(PTX)与前药(PTX-SS-COOH)，而在高浓度(＞5μg/mL)时，原料药与前药的细胞毒性明显强于共载药纳米粒。根据空白纳米粒的细胞毒性实验结果，PTX与PTX-SS-COOH在较高浓度下的细胞存活率较低，这是由于聚氧乙烯蓖麻油-乙醇的毒性造成的。
对比不同pH值下的共载药纳米粒实验组结果可知，pH 6.5下的细胞毒性略强于pH7.4下的细胞毒性。当纳米粒内药物浓度为20μg/mL时，pH 6.5与pH 7.4下的细胞存活率分别是49.88％与64.39％，呈现显著性差异(p＜0.05)。这是由于pH值的降低导致了前药PTX-SS-COOH的电荷翻转(pH＜pKa)，使得PTX-SS-COOH与明胶同时带正电荷，产生的电荷斥力加速了纳米粒的分解与药物的释放。而由于pH值降低的幅度较小，这一效果并不明显。当纳米粒进入肿瘤细胞溶酶体内，由于溶酶体内的pH值更低(5.5左右)，PTX-SS-COOH与Gel-SH的电荷斥力增强，药物的释放速度也可随之加快。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒，其特征是，
所述荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒结构为BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH，其中BSA为牛血清白蛋白，Gel为明胶，PTX-SS-COOH为紫杉醇-二硫代二丙酸结合物，Gel-SS-PTX为PTX-SS-COOH中的羧基与明胶上氨基反应结合物，
所述明胶为巯基化明胶；
所述明胶与紫杉醇的摩尔比为1:0.5~2；
所述BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH制备方法为：取0.010 g PTX-SS-COOH溶于乙腈溶液，加入0.004 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，PTX-SS-COOH: 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐=1:2，摩尔比，氮气保护下活化1 h；再加入0.005 g N-羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐: N-羟基琥珀酰亚胺=1:2，摩尔比，室温条件下活化1 h，氮气保护；取0.010 g 巯基化明胶溶于去离子水，并将活化后的反应液缓慢滴入巯基化明胶水溶液中，调节水-乙腈的比例，使反应液澄清，乙腈与水的体积比为1:1，40 ℃下氮气保护反应24 h；反应结束后，取0.0026 g 牛血清白蛋白溶于少量去离子水中，调整pH值为6.8，用0.22 μm的水系滤膜过滤，将BSA水溶液在搅拌条件下缓慢滴入反应液中，氮气保护下反应24 h；最后将反应液转移至透析袋中，MWCO=8000-14000，去离子水透析24 h，期间换透析液3-4次；取袋中溶液，8000 rpm下离心10 min，上清液即为荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH。
2.如权利要求1所述的荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒，其特征是，所述荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒截留分子量不低于8000。
3.一种权利要求1或2所述的荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒的制备方法，其特征是，PTX-SS-COOH的合成：分别称取紫杉醇，二硫代二丙酸酐和4-二甲胺基吡啶，紫杉醇、二硫代二丙酸酐与4-二甲胺基吡啶的摩尔比为1:1:5，置于25 mL圆底烧瓶中，加入2 mL吡啶，在35 ℃的氮气保护下反应24 h；反应液在80 ℃下旋转蒸发除去大部分吡啶，并加入稀盐酸除去未蒸干的吡啶，洗涤液用二氯甲烷萃取，共重复三次，用0.22 μm的滤膜除去未反应的4-二甲胺基吡啶；将二氯甲烷蒸干，放入真空干燥箱中干燥过夜；
巯基化明胶的合成：称取对巯基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于25 mL圆底烧瓶中，对巯基苯甲酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1，加入400 μL无水乙醇，超声使其溶解；再加入800 μL 0.1 M氢氧化钠溶液和800 μL去离子水，超声使溶液均匀，室温并在氮气保护下下活化1 h；在反应液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1，室温并在氮气保护下继续活化1 h；称取0.1 g A型明胶，加入10 mL去离子水溶胀并溶解，在超声条件下将上述活化液缓缓滴入明胶溶液，40 ℃下氮气保护反应4 h；反应液放入透析袋中，MWCO=8000-14000，DMSO透析24 h，再用去离子水透析24 h，冻干后得到产物巯基化明胶；
BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH的合成：取0.010 g PTX-SS-COOH溶于乙腈溶液，加入0.004 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，PTX-SS-COOH: 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐=1:2，摩尔比，氮气保护下活化1 h；再加入0.005 g N-羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐: N-羟基琥珀酰亚胺=1:2，摩尔比，室温条件下活化1 h，氮气保护；取0.010 g 巯基化明胶溶于去离子水，并将活化后的反应液缓慢滴入巯基化明胶水溶液中，调节水-乙腈的比例，使反应液澄清，乙腈与水的体积比为1:1，40 ℃下氮气保护反应24 h；反应结束后，取0.0026 g 牛血清白蛋白溶于少量去离子水中，调整pH值为6.8，用0.22 μm的水系滤膜过滤，将BSA水溶液在搅拌条件下缓慢滴入反应液中，氮气保护下反应24 h；最后将反应液转移至透析袋中，MWCO=8000-14000，去离子水透析24 h，期间换透析液3-4次；取袋中溶液，8000 rpm下离心10 min，上清液即为荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH。
4.一种权利要求1或2所述的荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒制剂，其特征是，有效成分为权利要求1或2所述的荷载化疗药物的双敏感型靶向纳米粒。
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