CN107929261B - 一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法 - Google Patents

一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法。所述纳米粒采用叶酸修饰明胶使其等电点与肿瘤部位pH值接近，并使其与在正常生理环境下带相反电荷的材料通过静电结合组成纳米粒，同时包裹药物制成载药纳米制剂，当到达肿瘤组织后，弱酸性的微环境使明胶发生电荷反转，与内核材料由静电结合变为静电排斥，纳米粒分解，药物释放。从而实现pH敏感药物释放。再结合叶酸的靶向作用，实现抗肿瘤药物靶向性给药，实现高效低毒的给药方式。

Description

一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率不断上升，对人类的健康造成了极大的威胁。对于抗肿瘤药物的研究也是学术工作者的热点，近年来也发现了一系列具有良好抗肿瘤活性的化合物，如紫杉醇，阿霉素等。然而，其严重的毒副作用却限制了它们的使用。抗癌药物毒副作用发生的一个重要原因就是其靶向性低，除了对肿瘤组织产生效应外，对非肿瘤组织也会产生类似抗肿瘤作用。因此，增加抗肿瘤药物靶向性将是解决目前抗肿瘤药物使用限制的可靠方法。
目前，提高靶向性的方法主要包括被动靶向、主动靶向和物理化学靶向。
被动靶向制剂主要是指实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，指的是由于肿瘤组织中血管内皮细胞的间隙较大，能够使大分子颗粒和脂质物质在肿瘤组织中具有选择性高通透性和滞留。一般而言，粒径在20-200nm的粒子能够实现在实体瘤部位的被动靶向的药物释放。因此利用生物相容性的大分子材料制备该粒径范围的载药纳米载体可实现药物在肿瘤部位的富集。但由于肿瘤细胞存在异质性，某些肿块可能并不存在EPR效应，此情况下单一的被动靶向手段便无法实现药物靶向释放目的。
肿瘤主动靶向则是利用肿瘤部位的特性来对药物载体系统进行改造从而达到药物在肿瘤部位的富集。科学家们通过对肿瘤组织和正常组织进行比较研究发现两者在pH、受体表达等方面存在显著差异。一方面，在体内生理环境下，不同组织及细胞间的pH值是有明显区别的。正常血液pH约为7.4，而肿瘤细胞附近缺氧环境导致糖酵解速度加快，产生大量乳酸且不易被清除导致肿瘤组织附近的pH值(约6.8左右)要低于正常血液组织。而肿瘤细胞的内吞体和溶酶体内的pH值要更低(pH≈4.5-6.5)。另一方面，由于肿瘤组织与正常组织的代谢差异，在肿瘤细胞表面往往会高表达一些受体或者抗原比如叶酸受体、TFR、EGFR、VEGFR等。利用肿瘤的这些特性，设计酸性敏感和/或受体修饰的递药系统也是提高抗肿瘤药物靶向性的一种重要的研究方向和研究方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂及其制备方法。本发明制备得到的靶向纳米粒采用叶酸修饰明胶使其等电点与肿瘤部位pH值接近，并使其与在正常生理环境下带相反电荷的材料通过静电结合组成纳米粒，同时包裹药物制成载药纳米制剂，当到达肿瘤组织后，弱酸性的微环境使明胶发生电荷反转，与内核材料由静电结合变为静电排斥，纳米粒分解，药物释放。从而实现pH敏感药物释放。再结合叶酸的靶向作用，实现抗肿瘤药物靶向性给药，实现高效低毒的给药方式。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂；其外壳由叶酸修饰的明胶制成，其内核为载药聚离子复合物纳米胶束，所述载药聚离子复合物纳米胶束由带负电荷的水难溶性药物的羧基化的小分子前药和带正电荷的水溶性材料通过静电作用形成。
其中，所述明胶为A型明胶，其等电点在pH＝6.0-6.5；
所述A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100(优选为3:100)；
所述水难溶性药物的羧基化的小分子前药为紫杉醇或阿霉素与酸酐结合而成的小分子化合物；
其中，所述酸酐为琥珀酸酐、顺式环己烯二酸酐、乌头酸酐与顺式二甲基丁烯二酸酐中的任一种；
进一步优选的，所述水难溶性药物的羧基化的小分子前药为阿霉素与乌头酸酐结合而成的化合物；所述阿霉素与乌头酸酐的投料摩尔比为1:1～3(最优选为1:1.1)；
所述带正电荷的水溶性材料为普朗尼克F127或聚乙二醇(PEG)与壳聚糖或聚酰胺-胺(PAMAM)结合而成；
进一步优选的，所述带正电荷的水溶性材料为普朗尼克F127与壳聚糖结合而成；所述普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35；
本发明的第二个方面，提供一种所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂的制备方法，包括：
(1)将含有水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的有机溶剂进行旋蒸得水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药薄膜；
(2)将带正电荷的水溶性材料溶液加入到步骤(1)中带负电荷的羧基化小分子前药薄膜中超声水化，然后加入叶酸修饰的明胶溶液继续超声水化后，将所得溶液离心，取上清液即得所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂；
其中，所述带正电荷的水溶性材料和叶酸修饰的明胶溶液的pH为7.5-8；
所述超声水化条件为：超声温度为30～50℃(优选为40℃)，超声水化时间为1～10min(优选为3min)，超声频率为80Hz；更进一步的，将带正电荷的水溶性材料或其修饰物溶液加入到薄膜中于40℃超声(80Hz)水化3min，接着加入叶酸修饰的明胶溶液继续40℃超声(80Hz)水化3min；
所述有机溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇；
所述水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的制备方法为：将紫杉醇或阿霉素与酸酐溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入三乙胺(TEA)，反应液在避光和惰性气体保护下搅拌反应，反应结束后，向反应液中加入乙酸乙酯稀释，然后用pH＝3的饱和氯化钠水溶液和pH＝7.4的饱和氯化钠洗涤，收集有机相，旋蒸去除乙酸乙酯，真空干燥得所述羧基化小分子前药。
其中，所述酸酐为琥珀酸酐、顺式环己烯二酸酐、乌头酸酐与顺式二甲基丁烯二酸酐中的任一种，优选为乌头酸酐；
所述带正电荷的水溶性材料的制备方法为：
(1)将纯化后的普朗尼克F127或聚乙二醇(PEG)，丁二酸酐，4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺(TEA)溶于1,4-二氧六环中，避光搅拌反应，反应结束后，除去有机溶剂，沉淀物洗涤干燥得单羧基化的普朗尼克F127或聚乙二醇；
(2)将步骤(1)中单羧基化的普朗尼克F127或聚乙二醇溶于PBS溶液中，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后依次加入N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，壳聚糖或聚酰胺-胺(PAMAM)，避光搅拌反应，反应结束后，将反应溶液透析干燥即得带正电荷的水溶性材料。
其中，步骤(1)中优选为普朗尼克F127；
步骤(2)中优选为壳聚糖；
普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35；
所述叶酸修饰的明胶制备方法为：
(1)将叶酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，避光搅拌，活化叶酸的羧基得溶液A；
(2)取A型明胶于50℃条件下溶解于pH＝8.5的蒸馏水中，得溶液B；
(3)将溶液A缓慢加入溶液B中，并调节pH＝8.5，避光搅拌反应，反应结束后，用pH＝8.0的纯水透析，冷冻干燥即得；
其中，A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100(优选为3:100)；
本发明的发明原理：明胶是一种天然生物高分子材料，是动物胶原经过酸水解或是碱水解提炼到的一类变性蛋白。因其拥有价格低廉、易于获取、良好的生物相容性和生物可降解能力等优点，明胶已被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为基本安全的生物材料，已广泛应用于医药食品和化妆品等领域。常用的明胶分为两类，A型明胶是通过酸解法得到的等电点在7-9之间的一类，而B型明胶是通过碱解法得到的一类，等电点为4.8-5。则基于此理论，明胶能够与带相反电荷的生物分子通过静电相互作用形成聚离子络合物。同时通过对明胶的结构进行修饰改变其等电点，使其等电点接近肿瘤生理环境下的pH值，从而实现在肿瘤部位的电荷反转，实现pH敏感的药物靶向释放。
本发明采用叶酸修饰明胶使其等电点与肿瘤部位pH值接近，并使其与在正常生理环境下带相反电荷的材料通过静电结合组成纳米粒，同时包裹药物制成载药纳米制剂，当到达肿瘤组织后，弱酸性的微环境使明胶发生电荷反转，与内核材料由静电结合变为静电排斥，纳米粒分解，药物释放，从而实现pH敏感药物释放；同时结合叶酸的靶向作用，实现抗肿瘤药物靶向性给药，从而最终实现高效低毒的给药方式。
本发明有益效果：本发明提供一种有效提高水难溶性药物溶解性，提高抗肿瘤药物靶向性的载药的pH敏感的以明胶为外壳的纳米粒制剂，其制备方法简单，选用原料的毒副作用很低，同时靶向作用明显，高效安全，具有广阔的应用价值。
附图说明
图1为叶酸修饰的明胶合成方法路线图；
图2为CAD的核磁图谱；
图3为F127-CS的合成路线图；
图4为F127-CS的核磁图谱；
图5为制备纳米粒电镜照片，其中图5(A)为CAD/F127-CS/Gel-FA NPs，pH＝7.89；图5(B)是CAD/F127-CS NPs,pH＝7.85；图5(C)是CAD/F127-CS/Gel-FA NPs,pH＝6.36；图5(D)是CAD/F127-CS/Gel-FA NPs，pH＝5.69；
图6为空白纳米粒的溶血毒性实验结果照片；
图7为空白纳米粒对Hela细胞的细胞毒性实验结果；
图8为不同载药体对Hela细胞的细胞毒性实验结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，设计酸性敏感和/或受体修饰的递药系统也是提高抗肿瘤药物靶向性的一种重要的研究方向和研究方法。
有鉴于此，本发明的一种具体实施方式中，提供了一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂；其外壳由叶酸修饰的明胶制成，其内核为载药聚离子复合物纳米胶束，所述载药聚离子复合物纳米胶束由带负电荷的水难溶性药物的羧基化的小分子前药和带正电荷的水溶性材料通过静电作用形成。
其中，所述明胶为A型明胶，其等电点在pH＝6.0-6.5之间；
所述A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100(优选为3:100)；
所述水难溶性药物的羧基化的小分子前药为紫杉醇或阿霉素与酸酐结合而成的小分子化合物；
其中，所述酸酐为琥珀酸酐、顺式环己烯二酸酐、乌头酸酐与顺式二甲基丁烯二酸酐中的任一种；
本发明的又一具体实施方式中，所述水难溶性药物的羧基化的小分子前药为阿霉素与乌头酸酐结合而成的化合物；所述阿霉素与乌头酸酐的投料摩尔比为1:1～3(最优选为1:1.1)；
所述带正电荷的水溶性材料为普朗尼克F127或聚乙二醇(PEG)与壳聚糖或聚酰胺-胺(PAMAM)结合而成；
本发明的又一具体实施方式中，所述带正电荷的水溶性材料为普朗尼克F127与壳聚糖结合而成；所述普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35；
本发明的又一具体实施方式中，提供一种所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂的制备方法，包括：
(1)将含有水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的有机溶剂进行旋蒸得水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药薄膜；
(2)将带正电荷的水溶性材料溶液加入到步骤(1)中带负电荷的羧基化小分子前药薄膜中超声水化，然后加入叶酸修饰的明胶溶液继续超声水化后，将所得溶液离心，取上清液即得所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂；
其中，所述带正电荷的水溶性材料和叶酸修饰的明胶溶液的pH为7.5-8；
所述超声水化条件为：超声温度为30～50℃(优选为40℃)，超声水化时间为1～10min(优选为3min)，超声频率为80Hz；
所述有机溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇；
所述水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的制备方法为：将紫杉醇或阿霉素与酸酐按照溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入三乙胺(TEA)，反应液在避光和惰性气体保护下搅拌反应，反应结束后，向反应液中加入乙酸乙酯稀释，然后用pH＝3的饱和氯化钠水溶液和pH＝7.4的饱和氯化钠洗涤，收集有机相，旋蒸去除乙酸乙酯，真空干燥得所述羧基化小分子前药。
其中，所述酸酐为琥珀酸酐、顺式环己烯二酸酐、乌头酸酐与顺式二甲基丁烯二酸酐中的任一种，优选为乌头酸酐；
所述带正电荷的水溶性材料的制备方法为：
(1)将纯化后的普朗尼克F127或聚乙二醇(PEG)，丁二酸酐，4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺(TEA)溶于1,4-二氧六环中，避光搅拌反应，反应结束后，除去有机溶剂，沉淀物洗涤干燥得单羧基化的普朗尼克F127或聚乙二醇；
(2)将步骤(1)中单羧基化的普朗尼克F127或聚乙二醇溶于PBS溶液中，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后依次加入N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，壳聚糖或聚酰胺-胺(PAMAM)，避光搅拌反应，反应结束后，将反应溶液透析干燥即得带正电荷的水溶性材料。
其中，步骤(1)中优选为普朗尼克F127；
步骤(2)中优选为壳聚糖；
普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35；
所述叶酸修饰的明胶制备方法为：
(1)将叶酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，避光搅拌，活化叶酸的羧基得溶液A；
(2)取A型明胶于50℃条件下溶解于pH＝8.5的蒸馏水中，得溶液B；
(3)将溶液A缓慢加入溶液B中，并调节pH＝8.5，避光搅拌反应，反应结束后，用pH＝8.0的纯水透析，冷冻干燥即得；
其中，A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100(优选为3:100)，需要说明的是，超出该投料质量比范围，则叶酸修饰后的明胶其等电点则与肿瘤生理环境下的pH值偏差较大，无法实现在肿瘤部位的电荷反转。
下面通过实施例和实验例，对本发明的操作，作进一步具体的说明。
实施例1阿霉素-乌头酸酐结合物(CAD)的合成
盐酸阿霉素25mg(DOX，43.1mmol)和7.4mg乌头酸酐(CA，47.4mmol)溶于3ml DMF中(DOX与CA摩尔比为1:1.1)。然后加入6.50μl的三乙胺(TEA)(TEA与DOX的摩尔比为1:1)。反应液在25℃条件下,遮光,氮气保护下磁力揽拌反应24h。反应结束后,将反应液倒入10ml冰的乙酸乙酯中稀释，分别用pH＝3的饱和氯化钠水溶液(每次10ml，连续洗涤2次)和pH＝7.4的饱和氯化钠水溶液(每次10ml，连续洗涤2次)洗涤，收集有机相，室温下旋蒸除去乙酸乙酯，真空干燥。CAD核磁图谱如图2所示，峰1(约8.0ppm)属于DOX的蒽质子。峰2(6.24ppm)和峰3(6.06ppm)对应于-COCH＝的质子分别是CAD的顺式和反式形式；峰4处于4.22ppm属于-CH2COOH的质子。
实施例2普朗尼克F127-壳聚糖聚合物(F127-CS)的合成
1,4-二氧六环干燥：首先，将分子筛加入到事先量好的525mL 1,4-二氧六环中，放置脱水12h(25℃下)，进而把上步所得的1,4-二氧六环置于圆底烧瓶(1000mL)中，然后，将2g二苯甲酮和过量钠加入上述圆底烧瓶，回流至液体变成蓝色。
普朗尼克F127纯化：精密称量2g普朗尼克F127加入到量取好的丙酮(20mL)中完全溶解，进一步将其置于200mL的冷己烷中进行沉淀，过滤出沉淀，25℃下真空干燥箱干燥12h。
单羧基化F127制备：取3.810g纯化后的Pluronic F127，0.045g丁二酸酐，0.055gDMAP及0.060g三乙胺，量取30mL干燥1,4-二氧六环溶解上述各试剂，25℃持续搅拌，避光反应一天，圆底烧瓶收集反应后溶液，旋转蒸发除去有机溶剂，沉淀物用过量乙醚洗涤(重复三次)，25℃下真空干燥12h，即得。
F127-CS共聚物的制备：取所制得的单羧基化F127，溶于配好的PBS溶液(30mL，调节pH为5)中，先加入0.087g EDC，然后按照顺序加入0.052g NHS，1.35g壳聚糖，25℃下搅拌条件下避光反应24h。收集反应所得溶液并装入煮过的透析袋(Mw＝8000-14000)中，25℃下用重蒸水透析3天(每天更换三次透析用重蒸水)，冻干，即得，合成步骤如图3所示。
其NMR测试的结果如图4所示。该核磁共振图谱既显示出5.0和3.1ppm左右CS典型特征峰，又显示出3.6和1.1ppm左右Pluronic F127特征峰，因此可以说明成功合成了F127-CS共聚物。
实施例3 Gel-FA的合成
将6mg叶酸和11mgEDC溶于3mlDMSO，室温下避光搅拌1h活化羧基(溶液A)。同时取200mg明胶溶于50℃，pH＝8.5的蒸馏水中(溶液B)。活化完成后，将A滴加至B中，用1M NaOH溶液调节反应液pH至8.5,50℃下避光搅拌反应5h，反应结束后，用pH＝8.0的蒸馏水透析48h后冷冻干燥即得。
实施例4 CAD/F127-CS/Gel-FA纳米粒的处方筛选
表1处方筛选结果
Figure BDA0001476450440000091
所述的载药量和包封率测定方法：精确量取载药纳米粒溶液0.2mL于2mL EP管中，先加入0.8mLDMSO超声混匀后，用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度值，计算CAD的含量。
DL(％)＝纳米粒中药物质量/(纳米粒中药物质量+载体材料质量)×100％
EE(％)＝纳米粒中药物质量/投入的药物质量×100％
根据处方筛选结果，确定所述明胶纳米粒的制备方法为:量取4mg水难溶性药物的带负电荷的小分子前药的甲醇储备液于25mL圆底烧瓶中混匀后，于旋转蒸发仪上旋干，置于真空干燥箱中干燥过夜制得薄膜。另称取10mg带正电荷的水溶性材料或其修饰物和10mgGel-FA分别溶解于3mL去离子水中，并用1％NaOH调节pH至7.5-8。首先将带正电荷的水溶性材料或其修饰物溶液加入到薄膜中于40℃超声(80Hz)水化3min，接着倒入Gel-FA溶液继续40℃超声(80Hz)3min后，将所得溶液10000r/min离心10min，取上清液即得。
实施例5 CAD/F127-CS/Gel-FA纳米粒理化性质的考察
A.采用透射电镜法观察纳米粒形态
将待观察纳米粒溶液稀释至合适倍数后沾于电镜铜网上，用磷钨酸溶液负染干燥后，置于透射电镜下观察其形态并拍摄照片。结果如图5所示。由图可知，所述纳米粒的粒径在100nm左右。此外，对比不同pH条件下的纳米粒形态，可知该pH敏感纳米粒在pH＝6.36附近发生电荷翻转
B.采用马尔文粒径分析仪对纳米粒的粒径及Zeta电位进行分析，结果如表2所示。
表2各种类型纳米粒的粒径及Zeta电位测定结果
实施例6安全性评价
A.材料溶血毒性试验
颈静脉窦取大鼠新鲜血液5mL，3000rpm/min离心10min弃去上清液，沉积红细胞用生理盐水洗涤三次直至上清液无红色。取洗涤过压积红细胞1mL用生理盐水配置成2％(v/v)的混悬液。按下表3配置1-5mg/mL的空白纳米粒溶液于离心管中，另设置0％和100％溶血组作为阳性和阴性对照。将所有离心管置于37℃水浴孵育1h后，各实验管3000rpm/min离心10min，取上清液用于紫外分光光度计测定吸光度值(检测波长选用540nm)，按下列公式计算溶血率。材料溶血毒性试验结果如图6和表4所示。
表3溶血实验设计表
Figure BDA0001476450440000112
表4空白纳米粒溶血毒性结果
Figure BDA0001476450440000113
从图6中可看出基本都无溶血现象发生，从表4中的溶血毒性结果可以看出当材料浓度<3mg/mL基本无溶血毒性，当材料浓度>3mg/mL时，随着浓度的增加溶血毒性也开始增加，但在最大的实验浓度内，空白纳米粒的溶血率均小于5％，基本可认定该材料无溶血毒性。
B.材料细胞毒性实验
贴壁细胞的培养：人肝癌细胞(HepG2)和人宫颈癌细胞(Hela)均在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于恒温培养箱(37℃，5％CO2)中常规培养。
空白纳米粒的细胞毒性实验：以Hela为细胞模型，以MTT法[56]考察空白纳米粒的细胞毒性。取处于对数生长期的Hela细胞，胰蛋白酶消化，以RPMI1640培养液(含10％胎牛血清)稀释至一定浓度的细胞混悬液，以2000cells/well的接种密度接种至96孔培养板中，培养箱中培养过夜。每孔加入含有0.05-1mg/mL系列浓度的空白纳米粒培养基溶液，并设阴性对照组和阳性对照组，每组设置5个复孔。继培养48h后，每孔加入20μL MTT溶液(c＝5mg/mL)，于恒温培养箱中继续培养4h后，弃去上清液，加入150μLDMSO，避光振荡1min，于570nm检测波长下，酶标仪检测吸光度值。按下列公式计算细胞存活率：
Figure BDA0001476450440000121
结果如图7所示，空白纳米粒对Hela细胞的毒性随着纳米粒浓度的增加而增加，当空白纳米粒浓度<0.25mg/mL时，空白纳米粒的细胞存活率在90％以上，生物相容性良好，无明显毒性，本研究中体外细胞实验考察中所有的载药纳米粒的浓度均在此范围内，确保了材料对载药纳米粒抗肿瘤活性研究的最小影响。而当空白纳米粒浓度达到1mg/mL时，空白纳米粒的细胞存活率呈现明显下降，但仍在80％以上，有较好的生物相容性。因此，针对这两种材料进行细胞实验研究时应注意材料浓度的控制。
C.载药纳米粒(CAD/F127-CS/Gel-FA)的细胞毒性考察
取处于对数生长期的Hela细胞，胰蛋白酶消化，以RPMI1640培养液(含10％胎牛血清)稀释至一定浓度的细胞混悬液，以2000cells/well的接种密度接种至96孔培养板中，培养箱中培养过夜。每孔加入含有不同浓度(0.1、1、5、10、20μg/mL)的DOX、CAD和CAD/F127-CS/Gel-FA纳米粒的培养基溶液，并设阴性对照组和阳性对照组，每组设置5个复孔。培养48h后，每孔加入20μL MTT溶液(c＝5mg/mL)，于恒温培养箱中继续培养4h后，弃去上清液，加入150μLDMSO，避光振荡1min，于570nm检测波长下，酶标仪检测吸光度值。按上述公式计算细胞存活率。CAD/F127-CS/Gel-FA纳米粒的细胞毒性考察结果如图8所示，由图可看出，当DOX接上乌头酸酐形成CAD后对两种细胞的抑制率明显下降，但通过包裹F127-CS/Gel-FA形成纳米粒后，细胞抑制率要比单独的小分子前药增大。这可能是由于DOX分子含有氨基结构，表面有丰富正电荷，可以与细胞膜发生结合，通过细胞内吞作用更容易进入细胞从而导致细胞凋亡。而合成的小分子前药CAD和纳米粒表面均带负电荷，较DOX而言，进入细胞速度更慢，因此细胞抑制作用要明显弱于DOX。而由于EPR效应的存在，大分子类物质和脂质颗粒在实体瘤组织中具有选择性高通透性和滞留性，因此大分子生物材料制备得到的CAD/F127-CS/Gel-FA纳米粒相对于小分子CAD更容易被细胞所摄取，实现抑制作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，外壳由叶酸修饰的明胶制成，内核为载药聚离子复合物纳米胶束，所述载药聚离子复合物纳米胶束由带负电荷的水难溶性药物的羧基化的小分子前药和带正电荷的水溶性材料通过静电作用形成；
所述明胶为A型明胶；所述带负电荷的水难溶性药物的羧基化的小分子前药为阿霉素-乌头酸酐结合物；所述带正电荷的水溶性材料为普朗尼克F127与壳聚糖结合而成的材料。
2.如权利要求1所述的一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，所述A型明胶等电点在pH＝6.0-6.5；所述A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100。
3.如权利要求2所述的一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，所述A型明胶与叶酸的投料质量比为3:100。
4.如权利要求1所述的一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，所述阿霉素与乌头酸酐的投料摩尔比为1:1～3。
5.如权利要求1所述的一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，所述阿霉素与乌头酸酐的投料摩尔比为1:1.1。
6.如权利要求1所述的一种荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂，其特征在于，所述普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35。
7.权利要求1-6任一项所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将含有水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的有机溶剂进行旋蒸得水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药薄膜；
(2)将带正电荷的水溶性材料溶液加入到步骤(1)中带负电荷的羧基化小分子前药薄膜中超声水化，然后加入叶酸修饰的明胶溶液继续超声水化后，将所得溶液离心，取上清液即得所述荷载化疗药物的pH敏感的靶向纳米粒制剂。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述带正电荷的水溶性材料和叶酸修饰的明胶溶液的pH为7.5-8；
所述超声水化条件为：超声温度为30～50℃，超声水化时间为1～10min，超声频率为80Hz；
所述有机溶剂为甲醇或乙醇。
9.如权利要求8所述的一种制备方法，其特征在于，所述超声水化条件为：超声温度为40℃，超声水化时间为3min，所述有机溶剂为甲醇。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水难溶性药物的带负电荷的羧基化小分子前药的制备方法为：将阿霉素与乌头酸酐溶于二甲基甲酰胺中，然后加入三乙胺，反应液在避光和惰性气体保护下搅拌反应，反应结束后，向反应液中加入乙酸乙酯稀释，然后用pH＝3的饱和氯化钠水溶液和pH＝7.4的饱和氯化钠洗涤，收集有机相，旋蒸去除乙酸乙酯，真空干燥得所述羧基化小分子前药。
11.如权利要求7所述的一种制备方法，其特征在于，所述带正电荷的水溶性材料的制备方法为：
(1)将纯化后的普朗尼克F127，丁二酸酐，4-二甲氨基吡啶和三乙胺溶于1,4-二氧六环中，避光搅拌反应，反应结束后，除去有机溶剂，沉淀物洗涤干燥得单羧基化的普朗尼克F127；
(2)将步骤(1)中单羧基化的普朗尼克F127溶于PBS溶液中，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后依次加入N-N-羟基琥珀酰亚胺，壳聚糖，避光搅拌反应，反应结束后，将反应溶液透析干燥即得带正电荷的水溶性材料；
普朗尼克F127与壳聚糖的投料质量比为3.81：1.35。
12.如权利要求7所述的一种制备方法，其特征在于，所述叶酸修饰的明胶制备方法为：
(1)将叶酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶于二甲基亚砜DMSO中，避光搅拌，活化叶酸的羧基得溶液A；
(2)取A型明胶于50℃条件下溶解于pH＝8.5的蒸馏水中，得溶液B；
(3)将溶液A缓慢加入溶液B中，并调节pH＝8.5，避光搅拌反应，反应结束后，用pH＝8.0的纯水透析，冷冻干燥即得；其中，A型明胶与叶酸的投料质量比为1～5:100。
13.如权利要求12所述的一种制备方法，其特征在于，A型明胶与叶酸的投料质量比为3:100。
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Natural Gelatin Capped Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Acid-Triggered Drug Delivery;Zhen Z等;《Langmuir》;20130927;摘要，第12805页左栏第3段 *

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