CN115969992A - 一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物及其应用，该苯硼酸共聚物由苯硼酸(PBA)、聚合CXCR4拮抗剂AMD3100和胆固醇共聚形成，先通过迈克尔加成反应将AMD3100基元进行聚合，并进一步修饰PBA和胆固醇后得到。本发明的苯硼酸共聚物可以自组装形成ATP超敏感的纳米凝胶，在其内部可以负载化疗药物，外部还可以通过静电吸附协同递送白蛋白纳米粒，实现ATP敏感的分级递送，能够显著抑制肿瘤微环境中TAMs数量与活性、减少Tregs募集、放大微环境中免疫信号，在多个维度重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫应答的效果。

Description

一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的一大类疾病，已经成为全世界人口死亡的主要原因之一。近年来，以细胞过继免疫治疗(CAR-T)、免疫检查点阻断(PD-L1)、肿瘤疫苗等方法为代表的肿瘤免疫治疗的成功应用，为人类攻克癌症带来了新的曙光。为了进一步提高免疫治疗的效果，研究者们提出从单药治疗转向联合治疗的临床发展策略，如免疫疗法联合化疗、放疗等。化疗药物与免疫治疗联合应用时，表现出显著的肿瘤特异性免疫反应增强。目前，FDA已经批准了11款化疗免疫联合治疗方案，展现出了令人瞩目的前景。

肿瘤微环境的免疫抑制往往导致现有免疫治疗方案在不同患者中的疗效差异较大。肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的“土壤”，有利于肿瘤的发生和发展。抑制性微环境会阻碍效应T细胞向肿瘤的聚集，促进肿瘤的免疫逃逸，导致T细胞介导的免疫治疗效果不佳。趋化因子系统在肿瘤生长和转移的各个环节中处于关键地位。研究表明，CXCR4在肿瘤细胞中的表达显著高于正常组织，通过与其配体CXCL12的相互作用可诱导调节性T细胞(Tregs)向肿瘤微环境迁移，减少效应T细胞的肿瘤浸润，促使肿瘤细胞免疫耐受。因此，CXCR4成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。CXCR4拮抗剂如AMD3100已被证明能有效阻断CXCR4/CXCL12轴的生理功能，恢复T细胞的肿瘤趋向性和效应功能，抑制肿瘤细胞的生长和转移。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境的重要组成部分，参与肿瘤的免疫逃逸和促进肿瘤的恶性进展。通过调控集落刺激因子-1(CSF-1)抑制TAMs的募集和活性是阻碍肿瘤进展的潜在治疗途径。BLZ-945是一种有效的选择性CSF-1R抑制剂，可抑制CSF-1R磷酸化，显著减少TAMs数目，激活细胞毒性T细胞的特异性杀伤作用，从而增强化疗药物的抗肿瘤效果。因此，将免疫治疗药物BLZ-945和AMD3100联合化疗药物进行抗肿瘤治疗，不仅可以在多个维度重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫应答，还可以弥补化疗药物毒性大和容易产生耐药性的缺点，起到协同增效的治疗作用。

苯硼酸(phenylboronic acid，PBA)是一类优良的二醇单元识别体，在水溶液中可以与具有邻二醇或间二醇结构的多羟基化合物可逆反应形成共价复合物。基于此种特性，PBA对三磷酸腺苷(ATP)戊糖环上的二醇单元有较高的亲和力，通过对肿瘤微环境内高浓度的ATP的响应实现药物的呈递，为刺激响应性体系的设计及肿瘤治疗拓展新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物，通过迈克尔加成反应将CXCR4拮抗剂AMD3100基元进行聚合，并进一步修饰苯硼酸(PBA)和胆固醇，得到苯硼酸-聚合AMD3100-胆固醇阳离子聚合物，其中，聚合AMD3100可构成阳离子“治疗性载体”，PBA和胆固醇用于负载药物和实现ATP敏感释药。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物，其结构式如式(Ⅰ)所示：

其中：n为1～100中的任一自然数；优选地，n为30～60中的任一自然数。

在本发明的一个实施例中，上述苯硼酸共聚物采用以下步骤制备：

步骤1，将1,6-己二胺和丙烯酰氯进行取代反应，得到六亚甲基双丙烯酰胺(HMBA)，所述1,6-己二胺与丙烯酰氯的摩尔比为1.0：(1.5～3.0)，取代反应温度为-5～10℃，反应时间为2～6h；优选地，1,6-己二胺与丙烯酰氯的摩尔比为1.0：2.1，取代反应温度为0～5℃，反应时间为4h。

具体地，将1,6-己二胺溶解在水中，然后向其中同时滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液和饱和氢氧化钠溶液，滴加完后搅拌反应。

步骤2，将HMBA和AMD3100进行迈克尔加成反应，制备聚合AMD3100(poly-AMD，以下简称pAMD)，并对聚合物进行封端，HMBA与AMD3100的摩尔比为1.0：(0.5～2.0)，迈克尔加成反应的条件为避光和氮气保护，反应温度为20～50℃，反应时间为1～5d，封端反应时间为4～24h；优选地，HMBA与AMD3100的摩尔比为1.0：1.0，迈克尔加成反应温度为37℃，反应时间为3d，封端反应时间为12h。

具体地，分别称取HMBA和AMD3100溶解在甲醇和水的混合溶剂中，在氮气保护下避光反应，之后加入AMD3100，在氮气保护下避光反应对聚合物进行封端，将封端后聚合物进行透析，制得pAMD。

步骤3，将pAMD和胆固醇甲酰氯(Cholesteryl chloroformate)进行酰化反应，制备pAMD-胆固醇(pAMD-Ch，以下简称PC)阳离子聚合物，pAMD与胆固醇甲酰氯的摩尔比为1.0：(5.0～20.0)；所述酰化反应包括两个阶段，第一阶段温度为-5～10℃，第二阶段温度为15～35℃，第一阶段时间为0～4h，第二阶段时间为12～48h；优选地，pAMD与胆固醇甲酰氯的摩尔比为1.0：11.1，酰化反应第一阶段温度为0～5℃，第二阶段温度为25℃，第一阶段时间为1h，第二阶段时间为24h。

具体地，称取pAMD溶解于无水二氯甲烷中，加入缚酸剂DIPEA溶液，然后滴加胆固醇甲酰氯溶的无水二氯甲烷溶液，先在冰浴下进行反应，之后再常温反应，得到产物pAMD-Ch(PC)。

步骤4，将4-羧基苯硼酸频那醇酯和N-boc-乙二胺(EDA-boc)进行脱水缩合反应，随后用强酸除去boc保护基团，制备苯硼酸-乙二胺(PBA-EDA)，4-羧基苯硼酸频那醇酯与EDA-boc的摩尔比为1.0：(1.0～2.0)，脱水缩合反应温度为15～35℃，反应时间为12～48h；优选地，所述4-羧基苯硼酸频那醇酯与EDA-boc的摩尔比为1.0：1.2；所述脱水缩合反应温度为25℃，反应时间为24h。

具体地，分别取4-羧基苯硼酸频那醇酯、EDC·HCl、HOBt和DIEA各自溶解于无水DMF中，将上述溶液混合，常温反应活化苯硼酸的羧基。之后加入N-boc-乙二胺进行反应。将反应液转移至分液漏斗中，加入乙酸乙酯溶解产物，然后分别用HCl溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，取有机相加入无水硫酸钠除水，经硅胶柱处理得PBA-EDA-boc产物。取PBA-EDA-boc加入HCl-乙酸乙酯溶液，除去boc保护基团，得到PBA-EDA产物。

步骤5，将PBA-EDA接枝修饰到pAMD-Ch上，制备苯硼酸-pAMD-Ch(PBA-pAMD-Ch，以下简称PPC)阳离子聚合物，PBA-EDA与pAMD-Ch的摩尔比为(100～200)：1，反应温度为15～35℃，反应时间为1～6d；优选地，PBA-EDA与pAMD-Ch的摩尔比为155：1；所述反应温度为25℃，反应时间为4d。

具体地，取pAMD-Ch溶解于DMF中，加入CDI进行反应，然后加入PBA-EDA的DMF溶液进行反应。将反应液加至无水乙醚中，离心后收集沉淀，用乙醇和水的混合溶剂溶解，将溶液经透析后通过冷冻干燥获得PBA-pAMD-Ch(PPC)阳离子聚合物。

上述用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

一种肿瘤治疗药物，包括上述苯硼酸共聚物制成的纳米凝胶。

进一步地，所述纳米凝胶内包载有化疗药物。所述化疗药物为顺铂、奥沙利铂、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星或其他抗肿瘤药物中的一种或几种。

在本发明的一个实施例中，纳米凝胶的制备方法如下：

步骤1，将苯硼酸共聚物(PPC聚合物)和化疗药物溶解在有机溶剂中，通过减压旋转蒸发形成薄膜；

步骤2，加入去离子水溶液，使薄膜分散，经探头超声获得粒径分散均匀的载药纳米凝胶。

进一步地，所述肿瘤治疗药物还包括白蛋白纳米粒，白蛋白纳米粒吸附在纳米凝胶表面。

在本发明的一个实施例中，所述白蛋白纳米粒为修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白纳米粒。苯硼酸共聚物制成的纳米凝胶与该白蛋白纳米粒形成的复合纳米凝胶能够实现CXCR4拮抗剂AMD3100、CSF-1R抑制剂BLZ-945和化疗药物紫杉醇的三药负载和ATP敏感的分级递送。

具体地，所述复合纳米凝胶的制备包括以下步骤：

步骤1，将苯硼酸共聚物(PPC聚合物)和化疗药物溶解在有机溶剂中，通过减压旋转蒸发形成薄膜；

步骤2，加入去离子水溶液，使薄膜分散，经探头超声获得粒径分散均匀的载药纳米凝胶内核；

步骤3，将步骤2中所述纳米凝胶内核和修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白纳米粒溶液按照一定的体积比混合，涡旋一段时间后静置，得到复合纳米凝胶；

步骤1中所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇中的一种或几种；优选地，所述有机溶剂为甲醇；

步骤3中所述白蛋白为人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、鼠血清白蛋白(RSA或者MSA)或其他白蛋白中的一种或几种；优选地，所述白蛋白为BSA。

步骤3中所述复合纳米凝胶的粒径为10～500nm；优选地，所述复合纳米凝胶的粒径为100～200nm。

本发明的有益效果：

(1)本发明中所提供的用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物，可以自组装形成ATP超敏感的复合纳米凝胶，用以实现CXCR4拮抗剂AMD3100、CSF-1R抑制剂BLZ-945和化疗药物紫杉醇的三药负载和分级递送，能够在多个维度重塑肿瘤免疫微环境，起到放大微环境中免疫信号，增强抗肿瘤免疫应答的效果，为临床抗肿瘤治疗提供了一种新型高效的化疗免疫联合治疗方案。

(2)本发明中所提供的用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物，其采用温和、易行的高分子化学反应制备，对环境友好，且用料简单，产率较高，之后采用薄膜分散法和静电吸附的方式制备复合纳米凝胶，无需复杂的设备和操作方法，具有较好的工业化生产价值。

(3)本发明中所提供的用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物显示出良好的生物相容性，能够制备安全低毒的复合纳米凝胶，提高了其在肿瘤组织的深层渗透和细胞摄取，具有潜在的临床应用前景。

附图说明

图1为HMBA的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。

图2为PBA-EDA-boc和PBA-EDA的核磁共振氢谱(¹H NMR)和质谱(MS)图。

图3为pAMD、pAMD-Ch(PC)和PBA-pAMD-Ch(PPC)的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。

图4为羧基化的BLZ945(BLZ-COOH)的核磁共振氢谱(1H NMR)和质谱(MS)图。

图5为修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白纳米粒(BB)、包载紫杉醇的PPC(PPC-PTX)纳米凝胶、同时包载紫杉醇和静电吸附负载白蛋白纳米粒的PPC(BB@PPC-PTX)复合纳米凝胶及与0.1mM ATP共孵育的复合纳米凝胶(BB@PPC-PTX+0.1mM ATP)溶液的透射电镜平面(TEM)图(A)和TEM图中所显示的上述制剂的直径(B)。比例尺为100nm。

图6为不同浓度ATP处理的各个纳米凝胶组中罗丹明B标记的BSA(RhB-BSA)的体外释放图。

图7为包载紫杉醇的PPC(PPC-PTX)纳米凝胶在pH 5.0、6.8和7.4的PBS中的紫杉醇(PTX)时间依赖性释放。

图8为利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测双染试剂盒评价PBS、PPC(20μg/mL)、修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白纳米粒(BB，20μg/mL)、紫杉醇(PTX，5μg/mL)、包载紫杉醇的PPC(PPC-PTX)纳米凝胶和同时包载紫杉醇和静电吸附负载白蛋白纳米粒的PPC(BB@PPC-PTX)复合纳米凝胶(PTX浓度等于5μg/mL)诱导的细胞凋亡情况。

图9为各个制剂组的CXCR4拮抗作用及定量分析图。比例尺为20μm。

图10为通过蛋白质印迹分析测定各个制剂组对pCSF-1R蛋白表达的影响(n＝3，***P<0.001，**P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明的实施例中所得聚合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)和质谱(MS)由中国药科大学分析测试中心检测，溶剂为D₂O。所得聚合物的分子量由美国内布拉斯加大学医学中心进行检测，利用凝胶渗透色谱法(GPC)检测，样品为5mg/mL，流动相为0.3M的醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，流速为0.3mL/min，GPC结果采用Astra 6.1software进行分析。

实施例1

1、六亚甲基双丙烯酰胺(HMBA)的制备

称取2.90g 1,6-己二胺溶解于20mL去离子水中，将溶液转移至三颈瓶中。称取4.62g丙烯酰氯溶解于5mL二氯甲烷中，转移至一滴液漏斗中。另制备饱和氢氧化钠(NaOH)溶液10mL，转移至另一滴液漏斗。两漏斗同时向三颈瓶中滴加溶液，并保持反应液温度在0～5℃，2h内滴加完毕。继续在室温下搅拌2h，抽滤反应物，得白色固体，用去离子水洗涤滤饼3次，得到产物HMBA。

图1为HMBA的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。由图可知，HMBA在约δ＝5.6及6.1ppm处出现了双键峰，δ＝3.4及1.3-1.6ppm峰为HMBA的亚甲基结构(-CH2-)上的H特征峰，δ＝6.3ppm的多峰为HMBA上靠近双键的H特征峰，这表明己二胺和丙烯酰氯已经成功发生共价结合。

2、聚合AMD3100(pAMD)的制备

分别称取112mg HMBA(0.5mmol)和250mg AMD3100(0.5mmol)溶解在4mL甲醇-水(7:3v/v)混合溶剂中，在37℃氮气保护下避光反应3d。之后加入25mg AMD3100(0.05mmol)，在37℃氮气保护下避光反应12h，对聚合物进行封端。将封端后聚合物直接置于甲醇中透析2d，减压旋转蒸发后制得pAMD，用于进行下一步反应。

3、pAMD-Ch(PC)阳离子聚合物的制备。

称取200mg pAMD溶解于3mL无水二氯甲烷中，加入100μL DIPEA溶液，搅拌5min。称取40mg胆固醇甲酰氯溶解于2mL无水二氯甲烷中，逐滴加入到pAMD溶液中，在冰浴下反应1h，之后再常温反应24h。通过减压旋转蒸发得到产物pAMD-Ch(PC)，无水乙醚洗涤3次来去除未反应的胆固醇甲酰氯。

4、PBA-EDA的制备。

分别称取1g 4-羧基苯硼酸频那醇酯、845mg EDC·HCl、594mg HOBt和1.55gDIEA，各自溶解于2mL无水DMF中。将上述溶液混合，常温反应1h，以活化苯硼酸的羧基。之后加入768mg N-boc-乙二胺(EDA-boc)，继续反应24h。将反应液转移至分液漏斗中，加入20mL乙酸乙酯溶解产物，然后用1M HCl溶液洗涤2次，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，取有机相加入无水硫酸钠过夜除水。旋转蒸发浓缩有机溶剂至1～2mL，加入硅胶柱，用二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:2的展开剂展开，处理得PBA-EDA-boc产物。称取500mg PBA-EDA-boc加入10mLHCl-乙酸乙酯溶液，反应12h以除去boc保护基团，旋转蒸发得到PBA-EDA产物。

图2为PBA-EDA-boc和PBA-EDA的核磁共振氢谱(¹H NMR)和质谱(MS)图。由图2A可知，δ＝1.2ppm单键峰(峰a)为PBA-EDA-boc的苯硼酸频那醇酯上的甲基峰；δ＝1.4ppm峰(峰b)为PBA-EDA-boc的单boc上的甲基H特征峰；在δ＝3.4-3.6ppm的多峰(峰c)为乙二胺上的亚甲基特征峰；在δ＝7.8ppm的多峰(峰d)为苯硼酸上苯环的特征峰。这表明PBA和EDA-boc已经成功发生共价结合。由图2C可知，通过强酸处理后，δ＝1.4ppm的单boc上的甲基H特征峰消失，证明活性氨基的暴露和PBA-EDA的成功制备。由图2B、2D可知，413.3和291.2分别为PBA-EDA-boc和PBA-EDA加H的分子量，也进一步证明两个小分子化合物的成功制备。

5、PBA-pAMD-Ch(PPC)阳离子聚合物的制备。

称取90mg pAMD-Ch溶解于2mL DMF中，加入90mg CDI室温反应4h。称取67.5mgPBA-EDA溶解于2mL DMF中，加入上述反应液中，室温反应4d。将反应液加入10倍量的无水乙醚中，并于5000rpm离心10min，收集离心管底部的白色沉淀，用乙醇-水(1:1，v/v)混合溶剂溶解，将溶液放置于透析袋(MWCO 12kDa)中，在pH 4.0的去离子水中透析2d，之后换纯水透析1～2次，最终通过冷冻干燥获得PPC阳离子聚合物。

图3为pAMD、pAMD-Ch(PC)和PBA-pAMD-Ch(PPC)的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。图中峰1(7.3ppm)为AMD3100苯环上的质子，峰2(0.65ppm)为新引入的胆固醇甲基峰，峰3(7.7ppm)为新引入的PBA上的苯环H特征峰。根据NMR结果，聚合物中的胆固醇含量为47.2％，PBA的含量为51.6％。根据凝胶渗透色谱法实验结果分析可知，pAMD聚合物的平均分子质量(Mw)为25kDa，PC聚合物的Mw为70kDa，而PPC聚合物的Mw为95kDa。

实施例2

载药复合纳米凝胶的制备

1、修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白小粒(BLZ-BSA，BB)的制备

取50mg BLZ945、50mg EDC·HCl、30mg DMAP及60mg丁二酸酐(SA)溶解于5mL DMF中，37℃反应24h。将溶液转移至分液漏斗，加入20mL二氯甲烷溶解产物，然后用1MHCl溶液洗涤2遍，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2遍，取有机相无水硫酸钠除水过夜。旋转蒸发浓缩有机溶剂至1mL，加入硅胶柱，用二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1的展开剂展开，处理得羧基化的BLZ945(BLZ-COOH)产物。取10mg BLZ-COOH溶解于200μL DMSO中，加入15mg EDC·HCl和9mgNHS活化1h。取100mg BSA溶于5mL pH 7.4的PBS缓冲液中，将活化液缓慢滴加至BSA溶液中，保持反应液澄清，继续反应24h。将溶液放置于截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析2d，最终通过冷冻干燥获得BLZ-BSA纳米小粒。BLZ的接枝率通过C、N、O的元素分析结果计算。

图4为BLZ-COOH的核磁共振氢谱(1H NMR)和质谱(MS)图。结果显示，在约δ＝2.7ppm处新引入了单峰，该峰为丁二酸酐的亚甲基(-CH2-)特征峰，表明BLZ945和丁二酸酐已经成功发生共价结合。MS图谱中499.1为BLZ-COOH加H的分子量，也进一步证明该小分子化合物的成功制备。紧接着，将BLZ-COOH通过EDC/NHS反应接枝到BSA上，通过N的元素分析来计算其接枝率。接枝前N元素含量为14.23％，接枝后为15.05％，说明BLZ接枝率为9.8％。

2、载药复合纳米凝胶的制备

称取5mg PPC聚合物和1mg紫杉醇(PTX)溶解在1mL甲醇溶液中，将溶液旋转蒸发45min以除去多余的甲醇，形成薄膜。加入5mL去离子水，超声15min使薄膜分散至水中，之后探头超声20min(超声1s，停止2s)以获得粒径分散均匀的PPC-PTX纳米凝胶。将纳米溶液置于超滤管中(MWCO 3000)，于4000rpm离心15min以去除游离的PTX。另取5mL去离子水重悬超滤管上液，得到最终的PPC-PTX纳米凝胶。称取5mg修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白小粒(BLZ-BSA，BB)溶于5mL pH 7.4的HEPES(10mM)缓冲液中，将PPC-PTX纳米凝胶和BB溶液按照1:1(v:v)混合，涡旋30s，之后静置30min，制得最终的BB@PPC-PTX复合纳米凝胶。

图5为BB、PPC-PTX、BB@PPC-PTX纳米凝胶及与0.1mM ATP共孵育的BB@PPC-PTX(BB@PPC-PTX+0.1mM ATP)纳米凝胶溶液的透射电镜平面(TEM)图(A)和动态光散射测定TEM图中所显示的上述制剂的直径(B)。比例尺为100nm。结果显示，BB纳米粒的粒径在11.2nm，呈较小的圆形，而PPC-PTX、BB@PPC-PTX纳米凝胶呈现规整的圆形，其粒径为98.9nm。加入0.1mMATP后观察到纳米粒形态明显受到干扰，并有较小的粒子游离，其粒径为10nm左右，猜测为因电荷扭转而释放出来的BB蛋白小粒。TEM结果进一步证明了，ATP可以有效竞争BB蛋白小粒，使其在肿瘤微环境中释放。

实施例3

复合纳米凝胶于不同ATP条件中的蛋白释放。

制备罗丹明B(RhB)标记的BSA(RB)替代BB用于观察体外释放行为。称取10mg RhB溶解于200μL DMSO中，加入32mg EDC·HCl和20mg NHS活化1h。称取100mg BSA溶解于5mLpH 7.4的PBS缓冲液中，将活化液缓慢滴加至BSA溶液中，保持反应液澄清，继续反应24h。将溶液放置于透析袋(MWCO 12kDa)中，在去离子水中透析2d，最终通过冷冻干燥获得RhB-BSA纳米小粒。使用RhB-BSA制备RB@PPC-PTX纳米凝胶，测定其RhB的荧光强度。并测定同等量的RhB-BSA水溶液的荧光强度，加入不同浓度的ATP，孵育后再次测定加入不同浓度ATP后的荧光强度，根据公式(1-1)计算RB蛋白小粒的释放情况：

I＝I_f+I_n＝I_f0×X/100+I_n0×(100-X)/100  (1-1)

其中，I_f为游离荧光染料的强度，I_n为纳米凝胶中的荧光强度，X为游离荧光强度的百分比。

图6为不同浓度ATP处理的各个纳米凝胶组中RhB-BSA的体外释放图。结果显示，RB@PC纳米凝胶对0.1-0.4mM的ATP几乎不敏感，RB蛋白小粒的释放率仅为6.5％。相反，用低浓度的0.1mM ATP处理RB@PPC和RB@PPC-PTX的释放率约为55％和51％，而0.4mM ATP处理RB@PPC和RB@PPC-PTX的释放率可达到91.1％和93.4％。这表现出了PBA接枝聚合阳离子载体对ATP的超敏感特性。

实施例4

复合纳米凝胶于不同PBS条件中的PTX释放。

取1mL BB@PPC-PTX溶液(PTX浓度为500μg/mL)放置于扎紧的透析袋(MWCO8-12kDa)中，将透析袋放置于20mL的含0.1％吐温-80的pH 7.4、pH 6.8和pH 5.0PBS缓冲液中。37℃条件下以100rpm机械搅拌，于0、1、2、4、8、12、24、48和72h各取1mL溶液，并随后补充1mL相应缓冲液继续搅拌。通过高效液相色谱法(HPLC)测定各溶液中PTX的含量，以此计算各制剂在不同缓冲液中的累计释放含量。

图7为包载紫杉醇的PPC(PPC-PTX)纳米凝胶在pH 5.0、6.8和7.4的PBS中的紫杉醇(PTX)时间依赖性释放。结果显示，在pH 7.4和pH 6.8的生理条件下，PTX的释放量大体一致，于72h仅释放13.9％和17.1％，表明阳离子纳米凝胶内核在血液和肿瘤微环境中能保持其稳态。在较低的pH环境(pH 5.0)会干扰胆固醇和PTX疏水空腔的结构，使得大量的PTX从纳米凝胶中释放出来(72h累积释放45.1％)。证明纳米凝胶可以在溶酶体的酸性条件下解体，释放PTX作用于细胞核。

实施例5

AnnexinV-FITC/PI双染法评价纳米凝胶诱导的细胞凋亡。

取处于对数生长期生长的4T1细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后重悬，将细胞以每孔1×10⁵个接种于6孔培养板中。在培养箱培养24h后吸去培养液，加入配置各组制剂溶液2mL，孵育24h后，移除培养基并用冰PBS清洗两次，参考AnnexinV-FITC/PI染色试剂盒操作方法对各组细胞进行染色，并在流式细胞仪上进行样品分析。

图8为利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测双染试剂盒评价PBS、PPC(20μg/mL)、修饰CSF-1R抑制剂BLZ-945的白蛋白纳米粒(BB，20μg/mL)、紫杉醇(PTX，5μg/mL)、包载紫杉醇的PPC(PPC-PTX)纳米凝胶和同时包载紫杉醇和静电吸附负载白蛋白纳米粒的PPC(BB@PPC-PTX)复合纳米凝胶(PTX浓度等于5μg/mL)诱导的细胞凋亡情况。PBS和BB纳米小粒孵育组的细胞基本上都在左下象限，表明细胞状态良好，证明蛋白载体的安全性良好。PTX治疗组与细胞孵育后引起了3.76％的早期凋亡及22.4％的晚期凋亡。单独的PPC载体也表现出了一定的细胞毒性，总凋亡量约为12.8％。形成制剂后，PPC-PTX纳米凝胶组的细胞出现大量凋亡，总量达48.03％。同时，BB@PPC-PTX纳米凝胶组也诱导了约48.6％的总细胞凋亡，其诱发的凋亡量均大于单纯PTX及PPC载体的总量，也进一步验证了纳米凝胶可以有效促进疏水性药物PTX入胞并进一步杀伤肿瘤细胞，用于抗肿瘤治疗。

实施例6

纳米凝胶对CXCR4拮抗功能的考察。

将表达EGFP-CXCR4偶联蛋白受体的人骨肉瘤细胞U2OS接种于96孔黑板中(8000个/孔)，随后细胞用100μL检测液(含有2mM L-谷氨酰胺，1％ FBS，1％青霉素-链霉素和10mM HEPES的DMEM培养基)清洗两次。将pAMD、PC、PPC聚合物载体(1μg/mL)用含有0.25％DMSO的检测液稀释并与细胞在37℃孵育30min，游离的AMD3100(300nM)作为阳性对照。随后将CXCL12加入每孔使最终浓度为10nM。U2OS细胞单纯孵育CXCL12作为阴性对照。在37℃共孵育1h后，U2OS细胞用4％多聚甲醛固定20min并用PBS洗涤4次。通过倒置荧光显微镜以20倍镜拍摄U2OS细胞的荧光分布。

图9为各个制剂组的CXCR4拮抗作用及定量分析图。比例尺为20μm。结果显示，当U2OS细胞与pAMD(1μg/mL)、PC(1μg/mL)、PPC(1μg/mL)和PPC-PTX(1μg/mL)纳米凝胶孵育，均未显示出明显的CXCR4受体偶联EGFP蛋白(EGFP-CXCR4)的内陷，其结果与加AMD3100的阳性对照组相同。然而，U2OS细胞仅与培养基孵育后，加入CXCL12后，显示出明显的绿色荧光分布，表明了受CXCL12刺激的EGFP-CXCR4的内陷。以上结果表明，AMD3100系列聚合物均能够显著拮抗CXCR4受体从而阻断CXCR4/CXCL12生物轴。

实施例7

BB蛋白小粒对M2型巨噬细胞的抑制作用评价

取M2型巨噬细胞以每孔5×10^5个接种于6孔板，完全培养基中培养24h，使细胞汇合度达到约80％后移去培养液。肿瘤细胞与BLZ945(0.25、0.5μM)及BB蛋白小粒(BLZ945浓度0.25、0.5μM)。孵育12h、24h后肿瘤细胞内pCSF-1R和总蛋白的蛋白水平通过蛋白质印迹法(Western Blot)测定。

图10为通过蛋白质印迹分析测定各个制剂组对pCSF-1R蛋白表达的影响(n＝3，***P<0.001，**P<0.01)。结果显示，PBS对照组不对TAMs产生pCSF-1R蛋白的下调。孵育0.5μM的CSF-1R抑制剂BLZ-945(阳性对照)达24h可以产生约75％的pCSF-1R蛋白表达水平的下调。孵育含相同浓度BLZ-945的修饰BLZ-945的白蛋白纳米粒(BLZ-BSA，BB)12h或者24h，观察到与阳性对照同等程度的pCSF-1R蛋白表达水平的下调。表明对BLZ-945进行BSA的修饰，并不影响其高效和特异性的CSF-1R的下调功能。证明BB蛋白小粒在肿瘤微环境中可以有效杀伤TAMs细胞，解除微环境的免疫抑制作用。

Claims (8)

1.一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物，其结构式如式(Ⅰ)所示：

其中：n为1～100中的任一自然数。

2.根据权利要求1所述的苯硼酸共聚物，其特征在于：n为30～60中的任一自然数。

3.权利要求1或2所述的苯硼酸共聚物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

4.一种肿瘤治疗药物，其特征在于：包括权利要求1或2所述的苯硼酸共聚物制成的纳米凝胶。

5.根据权利要求4所述的肿瘤治疗药物，其特征在于：所述纳米凝胶包载有化疗药物。

6.根据权利要求5所述的肿瘤治疗药物，其特征在于：所述化疗药物选自顺铂、奥沙利铂、紫杉醇、吉西他滨或多柔比星中的一种或几种。

7.根据权利要求4所述的肿瘤治疗药物，其特征在于：所述肿瘤药物还包括白蛋白纳米粒，白蛋白纳米粒吸附在纳米凝胶表面。

8.根据权利要求7所述的肿瘤治疗药物，其特征在于：所述白蛋白纳米粒由人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白或鼠血清白蛋白制成。

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