CN109303768B - 一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法 - Google Patents

一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法。首先将一定量mPEG、疏水胺单体、5‑氨基‑1‑戊醇和1，4‑丁二醇二丙烯酸酯溶于DMSO配成一定浓度的反应液，聚合反应20～48h，然后加入一定量1，3‑戊二胺，继续反应24h，合成得到聚乙二醇‑聚β‑氨基酯两亲共聚物(mPEG‑PBAE)。然后取一定量mPEG‑PBAE和漆酚溶于DMF中，超声混合均匀后，经过透析、离心、过滤后，即得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。该载药胶束平均粒径为140～160nm，稳定性好，具有明显的pH响应性释药特性，生物相容性好，具有很好的靶向抗肿瘤活性，可应用于临床靶向抗肿瘤药物中，附加值极高，可以成为临床上开发漆酚靶向抗肿瘤药物的一种新技术。

Description

一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种负载漆酚药物的pH响应性两亲嵌段共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)胶束的制备方法。
背景技术
漆酚是漆树(Toxicodendron verniciflum(Stokes)F.A.Barkl.)分泌物生漆中的一种天然活性成分，是我国重要的林特产品，世界上85％的生漆产自中国。漆酚是一种邻苯二酚结构的烷基酚类化合物，其侧链为不同饱和度的C15的烷烃。漆酚具有很好的抗肿瘤生物活性，其对人体9种器官29种肿瘤细胞均有抑制作用，作用机理包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、核转录因子抑制、毒杀肿瘤细胞等。干漆作为中药辅助治疗肿瘤在我国已有数千年的历史。因此漆酚非常有希望开发成抗癌药物，然而，漆酚的水溶性非常差，生物相容性和对肿瘤组织的选择性也很差，严重降低其抗肿瘤疗效，限制了漆酚的抗肿瘤药物开发及临床应用。
近年来针对传统肿瘤药物存在的水溶性差、非特异性分布、毒副作用大、生物利用度低以及肿瘤细胞的多重耐药性等问题，纳米靶向药物传递系统的发展为解决这些问题提供了新的途径，其中，两亲聚合物胶束具有载药范围广、结构稳定性好、体内滞留时间长、生物相容性及组织渗透性均良好等优点而成为靶向给药体系中备受青睐的一类。聚合物胶束是由亲水性和疏水性的单体组成的嵌段共聚物，两亲性嵌段共聚物可在水性介质中自组装形成稳定的壳-核结构的纳米递送系统，其疏水性内核可作为水难溶性药物的贮库，亲水性外壳赋予胶束良好的水溶性和空间稳定性。聚合物胶束作为靶向药物传递系统虽然具有很多优势，但也存在无法将药物定向输送到肿瘤细胞内并完成快速药物释放，不能控制药物的释放量为靶向位点提供有效的药物浓度等问题。刺激响应性胶束可根据内部刺激(如pH、氧化还原电位、溶酶体酶)或外部刺激(如温度、磁场、光)快速响应，从而达到在靶位或在合适时间释放药物的目的，提高治疗疗效。其中具有pH响应性胶束是近年来研究热点之一。与正常组织pH 7.4相比，肿瘤组织内部呈弱酸性环境，其pH介于6.8～7.2内，此外，肿瘤细胞内的酸性细胞器(内涵体与溶酶体)具有更低的pH，其pH介于4.5～6.5内。基于这种pH差异，pH响应性胶束可控制药物在肿瘤间质或酸性细胞器内释放，从而有效提高药物对肿瘤组织或细胞的靶向性。
研究表明将天然活性药物负载在纳米聚合物胶束载体上，不仅可明显提高药物的稳定性，而且可提高药物在体内的生物利用度及靶向释药性能等。但是目前国内外还没有将漆酚负载在共聚物胶束载体应用的相关研究报道，另外关于负载漆酚的pH响应性两亲嵌段共聚物胶束的制备与应用国内外也未见报道。
针对以上不足，本发明提出合成具有pH响应性的两亲性嵌段共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)作为载体材料，制备负载漆酚药物的PH响应性两亲共聚物胶束。该技术首先采用一锅法合成无规共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)，用于抗肿瘤活性物漆酚的包载和输送，然后采用透析法制备了负载漆酚药物的pH响应性两亲共聚物胶束。制得的载药胶束外观圆整，具有规则的球形结构，大小均一，分散性良好，平均粒径为140～160nm，Zeta电位值为32～35mV，具有很好的稳定性；其对漆酚药物的包封率EE％为85～90％，载药量DLC％为23～28％；该载药胶束具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的酸性环境中，累计释放率为98％以上；对人体生物相容性好，具有很好的靶向抗肿瘤活性，可应用于临床靶向抗肿瘤药物中，附加值极高，可以成为临床上开发漆酚靶向抗肿瘤药物的一种新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备负载漆酚的pH响应性两亲嵌段共聚物胶束的方法，该方法制备得到的负载漆酚的共聚物胶束，平均粒径为140～160nm，且大小均一，分散均匀，稳定性好，生物相容性好，不仅具有很好的pH响应性和释药性，且具有很好的靶向抗肿瘤活性，可应用于临床靶向抗肿瘤药物中，附加值极高。
本发明是通过以下技术方案实现的。
1.一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法，具体步骤如下：
(1)两亲共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取一定量的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应20～48h，然后加入一定量1，3-戊二胺，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷15～30mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥20～48小时，即得到目标两亲嵌段共聚物。
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯两亲共聚物和漆酚各40～100mg，将它们溶于4～10mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.0～2.0L的去离子水透析20～30h，每1～2h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离10～20min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥24h～36h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。
所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇，其数均分子量Mn为2000或5000。
所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯和1，3-戊二胺的摩尔比为0.08∶0.7∶0.3∶1.2∶1.4。
所述的疏水胺单体为十二胺或十四胺。
本发明采用一锅法合成了无规共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)；分别取一定量的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2)、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应20～48h，然后加入一定量1，3-戊二胺，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷15～30mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥20～48小时，即得到目标两亲共聚物(mPEG-PBAE)。所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇，其数均分子量Mn为2000或5000；所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯和1，3-戊二胺的摩尔比为0.08∶0.7∶0.3∶1.2∶1.4；所述的疏水胺单体为十二胺或十四胺。
本发明通过选用不同分子量的mPEG-NH2(Mn＝2000或5000)和不同疏水碳链长度的胺单体(十二胺或十四胺)，分别合成了四种不同分子量的聚乙二醇-聚β-氨基酯共聚物，分别命名为mPEG2000-PBAE-C12、mPEG2000-PBAE-C14、mPEG5000-PBAE-C12和mPEG5000-PBAE-C14；采用凝胶色谱仪(GPC)测定了四种聚合物的分子量和分子量分布，结果表明四种共聚物分子量分别为7115，8245，10315，11445，分子量相对较为均一，与设计的理论分子量相差不大；采用芘探针荧光法测定四种共聚物的临界胶束浓度(CMC)，四种共聚物的CMC值为18～30mg/L，均显示较低的CMC值，说明均可形成结构稳定的胶束。
本发明采用透析法制备了负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯两亲共聚物和漆酚各40～100mg，将它们溶于4～10mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.0～2.0L的去离子水透析20～30h，每1～2h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离10～20min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥24h～36h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。
本发明考察了负载漆酚的共聚物胶束的制备工艺中漆酚和共聚物投料量、N，N’-二甲基甲酰胺溶剂用量等因素对负载漆酚共聚物胶束的载药量(DLC％)和包封率(EE％)的影响，结果表明当漆酚和共聚物投料量各为45～50mg，N，N’-二甲基甲酰胺溶剂体积为4.5～5.0mL时，可达到最为理想的包封率EE％为85～90％和载药量DLC％为23～28％。因此优选的负载漆酚的共聚物胶束的制备工艺配方为漆酚和共聚物投料量各为45～50mg，N，N’-二甲基甲酰胺溶剂用量为4.5～5.0mL。
载药共聚物胶束的粒径是影响其体内分布的重要因素，研究表明，小于200nm的共聚物胶束可以更加有效的透过肿瘤组织渗透能力并通过EPR效应实现肿瘤部位的靶向聚集。Zeta电位与胶束分散度密切相关，并且是胶束稳定性的重要参数，其绝对值较高时，体系较为稳定。
本发明采用透射电镜(TEM)以及马尔文粒度和Zeta电位仪对负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的形貌、粒径分布及Zeta电位大小进行了测定。结果表明载药胶束外观较为圆整，具有规则的球形结构，大小均一，分散性良好，平均粒径为140～160nm，Zeta电位值为32～35mV，表明很好的稳定性。
本发明考察了负载漆酚的共聚物胶束的pH响应性，通过测定负载漆酚共聚物胶束在不同pH值(pH5.0，6.5，7.4)的缓冲溶液中粒径变化情况，来考察负载漆酚共聚物胶束的pH敏感性。结果表明其在pH＝5.0和6.5时，载药胶束粒径都呈现增大趋势，pH＝7.4时，胶束粒径几乎没有任何改变，且pH＝5.0时的粒径增大明显高于pH 6.5，表明负载漆酚共聚物胶束具有明显的pH响应性。
本发明考察了负载漆酚共聚物胶束的体外释药性，结果表明，72h内，载药胶束在pH＝5.0的缓冲液中累计释放率为98％以上，在pH＝6.5的缓冲液中累计释放率为61～65％，在pH＝7.4的缓冲液中累计释放率为30～34％；漆酚药物在释放介质为pH 5.0的缓冲液中释放速度和释放量明显高于在pH 6.5和7.4的缓冲液中的释放速度和释放量，可预测漆酚药物在体内正常pH下缓慢释放，而到达pH较低的肿瘤部位时，可快速释放，具有明显的环境响应性释药特性。
本发明以人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549的细胞为模型，采用MTT法考察了负载漆酚共聚物胶束对肿瘤细胞生长的抑制作用，结果表明，空白胶束对HepG2和A549细胞的生长基本没有影响，细胞存活率均在95％以上，说明了聚合物几乎没有毒性，具有较好的生物相容性和安全性。负载漆酚共聚物胶束对HepG2和A549细胞的增殖均起到了良好的抑制作用，呈现出明显的浓度依赖性，负载漆酚共聚物胶束溶液对HepG2和A549细胞的半数抑制浓度IC50分别为0.5～0.7μg/mL和0.3～0.5μg/mL，且负载漆酚共聚物胶束对肿瘤细胞毒性要大于游离漆酚，因此所制备的负载漆酚共聚物胶束可提高肿瘤药物靶向性，增强漆酚对肿瘤细胞的毒性，有望成为具有良好应用前景的靶向抗肿瘤药物。
本发明的有益效果：
(1)创新采用一锅法合成无规共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)，该合成方法操作简单，不需要复杂的分离纯化过程。该共聚物中聚乙二醇(PEG)为亲水基团，聚β-氨基酯(PBAE)为兼具疏水性和pH响应性基团，因此合成的共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯为pH响应性两亲性共聚物，该共聚物具有较低的CMC值，可形成结构稳定的胶束，其可作为药物载体用于抗肿瘤活性物的包载和体内输送，不仅可提高药物的稳定性和生物相容性，而且可实现在肿瘤细胞的靶向给药，因此合成的pH响应性两亲性共聚物(mPEG-PBAE)作为靶向抗肿瘤药物载体具有很好的应用前景。
(2)本发明首次以合成的聚乙二醇-聚β-氨基酯作为药物载体，负载抗肿瘤活性物漆酚，采用透析法制备负载漆酚药物的pH响应性两亲共聚物胶束，该载药胶束可明显改善漆酚药物的水溶性、体内结构稳定性、生物相容性和生物利用度。
(3)本发明制备的负载漆酚药物的pH响应性两亲共聚物胶束，其平均粒径为140～160nm，Zeta电位值为32～35mV，具有很好的稳定性；该载药胶束具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的肿瘤细胞酸性环境中，累计释放率为98％以上；负载漆酚共聚物胶束的靶向抗肿瘤活性明显高于游离漆酚，因此该载药胶束可显著提高漆酚药物的靶向抗肿瘤活性，达到减毒增效目的，有望成为具有良好应用前景的靶向抗肿瘤药物。
(4)该发明首次以合成的聚乙二醇-聚β-氨基酯为载体，制备负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束，该载药胶束可应用于靶向抗肿瘤药物中，产品附加值极高，该产品的开发对提高生漆资源的利用率及经济价值具有重要意义；另外产品制备工艺简单、反应条件温和，生产成本低，对环境污染小，非常适合工业化开发生产。
附图说明
图1 聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成路线
图2 负载漆酚pH响应性两亲共聚物胶束的形貌图
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。
实施例1
两亲共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取一定量的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应20～48h，然后加入一定量1，3-戊二胺，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷15～30mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥20～48小时，即得到目标两亲共聚物。
所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇，其数均分子量Mn为2000或5000。
所述的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯和1，3-戊二胺的摩尔比为0.08∶0.7∶0.3∶1.2∶1.4。
所述的疏水胺单体为十二胺或十四胺。
本发明采用一锅法合成了无规共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)(见图1)。通过选用不同分子量的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2)(Mn＝2000或5000)和不同疏水碳链长度的胺单体(十二胺或十四胺)，分别合成了四种mPEG-PBAE聚合物，分别命名为mPEG2000-PBAE-C12、mPEG2000-PBAE-C14、mPEG5000-PBAE-C12和mPEG5000-PBAE-C14。
本发明采用红外光谱、核磁共振等手段对合成的系列mPEG-PBAE共聚物结构进行了表征，红外光谱结果显示，四种共聚物在1104、1106、1109cm-1处的吸收峰为醚键(O-C-O)的特征吸收峰，在1730、1731和1732cm-1处的吸收峰为酯键(C＝O)的伸缩振动吸收峰，表明形成了含酯键结构的嵌段共聚物。1H-NMR表征结果显示，四种共聚物中δ＝3.98，3.99ppm处的吸收峰归属于PBAE嵌段中与酯基相连的亚甲基质子峰(-COOCH2-)，δ＝3.50ppm处的吸收峰归属于mPEG嵌段中与醚基相连的亚甲基质子峰(-OCH2CH2-)，δ＝3.30ppm处的吸收峰归属于甲氧基质子峰(-OCH3)，δ＝2.30-2.63ppm处的吸收峰归属于与胺基、亚胺基和季胺基相连的亚甲基、次甲基质子峰(-NHCH2CH2-，-NCH2CH2COO-和NH2CH-(CH2)2-)，δ＝1.59，1.60，1.17-1.22ppm处的吸收峰归属于亚甲基质子峰(-COOCH2CH2CH2CH2OOC-，-NCH2CH2CH2-)，δ＝0.78-0.84ppm处的吸收峰归属于聚合物末端甲基质子峰(-CH2CH3)，没有观察到化学位移为5.5-6.0的峰，表明丙烯酸酯完全反应，1，3-戊二胺偶联到聚合物的末端。以上结果证明四种mPEG-PBAE共聚物成功合成。
本发明采用凝胶色谱仪(GPC)对四种共聚物分子量和分子量分布进行分析，四种共聚物的理论数均分子量分别是6820，7950，9820和10950；GPC测定的四种共聚物分子量分别为7115，8245，10315，11445，与设计的理论分子量相差不大，从PDI上看，共聚物分子量相对较为均一。
本发明采用芘探针荧光法测定了mPEG-PBAE共聚物的临界胶束浓度(CMC)，结果表明共聚物的CMC值为18～30mg/L，均显示较低的CMC值，说明均可形成结构稳定的胶束。
实施例2
负载漆酚的PH响应性两亲共聚物胶束的制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯两亲共聚物和漆酚各40～100mg，将它们溶于4～10mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.0～2.0L的去离子水透析20～30h，每1～2h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离10～20min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥24h～36h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。
本发明采用星点设计-效应面优化法研究了负载漆酚的共聚物胶束的制备工艺中漆酚和共聚物投料量(A)、N，N’-二甲基甲酰胺溶剂用量(B)等因素对负载漆酚共聚物胶束的载药量(DLC％)和包封率(EE％)的影响，试验设计及结果见表1。
表1星点试验设计与结果
Figure BSA0000171543200000071
经Design-Expert.V.10.0.3软件优化数值，结果表明当漆酚和共聚物投料量各为45～50mg，N，N’-二甲基甲酰胺溶剂体积为4.5～5.0mL时，可达到最为理想的包封率EE％为85～90％和载药量DLC％为23～28％。因此优选的负载漆酚的共聚物胶束的制备工艺配方为漆酚和共聚物投料量各为45～50mg，N，N’-二甲基甲酰胺溶剂用量为4.5～5.0mL。
实施例3：
负载漆酚共聚物胶束的形貌、粒径、Zeta电位的测定
本发明采用透射电镜(TEM)对负载漆酚共聚物胶束的形貌进行了表征；采用动态光散射方法(DLS)测定了负载漆酚共聚物胶束的粒径及Zeta电位，透射电镜结果显示，载药胶束外观较为圆整，具有规则的球形结构，大小均一，分散性良好。DLS测定结果显示，负载漆酚的共聚物胶束平均粒径为140～160nm，该粒径大小可以更加有效的透过肿瘤组织，提高渗透能力并通过EPR效应实现肿瘤部位的靶向聚集。Zeta电位值为32～35mV，表明具有很好的稳定性，其所带的正电荷有助于其通过静电吸附作用与荷负电的细胞膜表面结合，有助于载药胶束体系的细胞摄取。
实施例4：
负载漆酚共聚物胶束的pH响应性和体外释药性的测定
pH响应性测定：通过在不同的pH缓冲液(pH＝5.0，6.5，7.4)中观察共聚物胶束粒径的变化，考察了负载漆酚共聚物胶束的pH敏感性。结果表明，在pH＝5.0和6.5时，胶束粒径都呈现增大趋势。pH＝5.0时，胶束粒径在4h内从起初的140～160nm增加到350～360nm，24h后粒径达到700nm以上；pH＝6.5时，胶束粒径在24h内可从140～160nm增加到290～300nm。pH＝5.0时的粒径增大明显高于pH 6.5，充分说明了胶束在较酸性条件下更易被触发膨胀和聚集。此外pH＝5.0时，胶束粒径在1h内有略下降趋势，这可能是由于在较酸条件下，共聚物结构中的部分酯键被水解，聚合物的主链断裂，胶束结构被破坏，使粒径减小，但是它还可以在水溶液中进一步聚集，原位自组装形成新的二级核-壳共聚物胶束。而当pH＝7.4时，24h内，胶束粒径几乎没有任何改变，由此证明，载药共聚物胶束具有明显的pH响应性，同时也表明了制备的胶束具有良好的稳定性。
体外释药性测定：采用动态透析法考察了负载漆酚共聚物胶束在pH 5.0、pH 6.5和pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的漆酚药物释放行为。结果表明，漆酚的释放呈现依赖pH的性质，pH越低漆酚药物释放的就越快。当pH＝5.0时，起初2h内漆酚的累计释放率为20％左右，出现明显的突释现象，10h后累积释放率高达91～92％，其后逐渐变缓，72h后累计释放率达98％以上。当pH＝6.5时，24h后累积释放率达58～60％，72h后累计释放率达61～65％。而pH＝7.4时，漆酚的累积释放率较缓慢，72h后累计释放率仅为30～34％。漆酚药物在释放介质为pH 5.0的缓冲液中释放速度和释放量明显高于在pH 6.5和7.4的缓冲液中的释放速度和释放量。由此，我们可预测漆酚药物在体内正常pH下缓慢释放，而到达pH较低的肿瘤部位时，因为微酸环境的存在使其快速释放，具有明显的环境响应性释药特性。不仅可增加肿瘤部位的局部药物浓度、降低毒副作用，还可增加疗效。
实施例5：
负载漆酚共聚物胶束的体外抗肿瘤活性的测定
本发明采用MTT法考察了负载漆酚共聚物胶束的体外肿瘤细胞毒性。选择人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549为模型，结果表明，空白胶束在实验浓度范围内对HepG2和A549细胞的生长基本没有影响，细胞存活率均在95％以上，说明了聚合物胶束几乎没有毒性，具有较好的生物相容性和安全性。通过测定不同浓度的负载漆酚共聚物胶束对肿瘤细胞存活率影响，可以看出，负载漆酚共聚物胶束对HepG2和A549细胞的增殖均起到了良好的抑制作用，细胞活性随着载药胶束溶液所含漆酚浓度的增加呈下降趋势，呈现出明显的浓度依赖性。负载漆酚共聚物胶束溶液对HepG2和A549细胞的半数抑制浓度IC50分别为0.5～0.7μg/mL和0.3～0.5μg/mL，且负载漆酚共聚物胶束对肿瘤细胞毒性要大于游离漆酚，说明所制备的载药胶束可达到用药更有效、抗肿瘤活性更强的目的。因此该负载漆酚共聚物胶束可提高肿瘤药物靶向性，增强漆酚对肿瘤细胞的毒性，有望成为具有良好应用前景的靶向抗肿瘤药物。
实施例6：
负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备
(1)两亲性共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn＝2000)0.08moL、十二胺单体0.7moL、5-氨基-1-戊醇0.3moL和1，4-丁二醇二丙烯酸酯1.2moL溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应24h，然后加入1，3-戊二胺1.4moL，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷20mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥24小时，即得到目标两亲嵌段共聚物。
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯共聚物和漆酚各50mg，将它们溶于5mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.5L的去离子水透析24h，每1h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离10min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥36h，即可得到负载漆酚的PH响应性两亲共聚物胶束。经检测其平均粒径为148nm，Zeta电位值为32.5mV；对漆酚药物的包封率EE％为86.8％，载药量DLC％为24.6％，具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的酸性环境中，累计释放率为98.6％；对人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549的半数抑制浓度IC50分别为0.56和0.37μg/mL。
实施例7：
负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备
(1)两亲性共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn＝2000)0.08moL、十四胺单体0.7moL、5-氨基-1-戊醇0.3moL和1，4-丁二醇二丙烯酸酯1.2moL溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应30h，然后加入1，3-戊二胺1.4moL，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷25mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥30小时，即得到目标两亲嵌段共聚物。
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯共聚物和漆酚各48mg，将它们溶于5mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.6L的去离子水透析25h，每1h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离15min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥28h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。经检测其平均粒径为152nm，Zeta电位值为33.4mV；对漆酚药物的包封率EE％为87.5％，载药量DLC％为26.4％，具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的酸性环境中，累计释放率为98.5％；对人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549的半数抑制浓度IC50分别为0.58和0.39μg/mL。
实施例8：
负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备
(1)两亲性共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn＝5000)0.08moL、十二胺单体0.7moL、5-氨基-1-戊醇0.3moL和1，4-丁二醇二丙烯酸酯1.2moL溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应24h，然后加入1，3-戊二胺1.4moL，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷25mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥40小时，即得到目标两亲嵌段共聚物。
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯共聚物和漆酚各50mg，将它们溶于8mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用2.0L的去离子水透析24h，每1.5h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离15min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥36h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。经检测其平均粒径为154nm，Zeta电位值为34.2mV；对漆酚药物的包封率EE％为88.2％，载药量DLC％为27.3％，具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的酸性环境中，累计释放率为98.8％；对人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549的半数抑制浓度IC50分别为0.62和0.42μg/mL。
实施例9：
负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备
(1)两亲性共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯(mPEG-PBAE)的合成
分别取末端带氨基的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn＝5000)0.08moL、十四胺单体0.7moL、5-氨基-1-戊醇0.3moL和1，4-丁二醇二丙烯酸酯1.2moL溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应30h，然后加入1，3-戊二胺1.4moL，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷25mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥48小时，即得到目标两亲嵌段共聚物。
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量聚乙二醇-聚β-氨基酯共聚物和漆酚各46mg，将它们溶于5mLN，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.0L的去离子水透析24h，每1h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离20min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥36h，即可得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。经检测其平均粒径为155nm，Zeta电位值为34.6mV；对漆酚药物的包封率EE％为89.4％，载药量DLC％为27.5％，具有明显的pH响应性释药特性，72h内在pH＝5.0的酸性环境中，累计释放率为99.2％；对人肝癌细胞HepG2和人肺腺癌细胞A549的半数抑制浓度IC50分别为0.54和0.43μg/mL。

Claims (1)

1.一种负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)嵌段共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯的合成
分别取一定量的末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯溶于二甲基亚砜配成浓度为0.2mg/mL的反应液，置于聚合管中在60℃搅拌反应20～48h，然后加入一定量1，3-戊二胺，继续反应24h，反应结束后产物用二氯甲烷15～30mL稀释，去离子水洗涤三次，分离有机相，无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，40℃真空干燥20～48小时，即得到嵌段共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯；
所述末端带氨基的甲氧基聚乙二醇的数均分子量Mn为2000或5000；
所述疏水胺单体为十二胺或十四胺；
所述末端带氨基的甲氧基聚乙二醇、疏水胺单体、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯和1，3-戊二胺的摩尔比为0.08∶0.7∶0.3∶1.2∶1.4；
(2)负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束制备
准确称量嵌段共聚物聚乙二醇-聚β-氨基酯和漆酚各45～50mg溶于4.5～5.0mL N，N’-二甲基甲酰胺中，超声混合均匀后倒入分子量为3000的透析袋内，用1.0～2.0L的去离子水透析20～30h，每1～2h换一次水；透析结束后将透析袋中胶束溶液在1000rpm下离心分离10～20min，上清液用孔径为0.45μm的水膜过滤，除去未包封的漆酚；最后将滤液在-40℃～-45℃冷冻干燥24h～36h，即得到负载漆酚的pH响应性两亲共聚物胶束。
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生漆中漆酚单体分离、化学结构修饰及生物活性研究进展;周昊，等;《生物质化学工程》;20170131;第51卷(第1期);44-50 *

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