CN104162169A - 一种药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种药物组合物及其制备方法，该药物组合物包括载体和负载在该载体上的活性成分，所述载体为结构式如下式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子，式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数。本发明的药物组合物能够实现定向输送，使药物在细胞内快速释放，提高药效。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及一种药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
小分子药物(如阿霉素、环巴胺等)没有靶向性，不能识别肿瘤组织和细胞，这就降低了它们的药效，也增加了副作用。同时，某些药物有很好的疗效，但由于水溶性差(如环巴胺)，很难被人体有效吸收，导致药效难以充分发挥，对它们在临床上的应用造成一定影响。
环巴胺(Cyclopamine，简称Cyc)是一种异甾体类生物碱，对Hedgehog通路有抑制作用，对多种肿瘤有治疗作用，尤其对肿瘤干细胞抑制作用很明显，但是对其他肿瘤细胞基本没有抑制现象，其水溶性很差。阿霉素(doxorubicin，简称Dox)是一种广谱抗癌的化学药物，其盐酸盐形式水溶性很好，在临床上用于治疗多种癌症，乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌等。但是这两种小分子药物不能同时使用而发挥药效，在生物体内都不能靶向聚集到病灶，应用时不仅用量大，而且会产生多种不良免疫反应，给病人带来极大的痛苦。
为了解决以上问题，研究能够靶向癌细胞，联合用药，同时在癌细胞内快速释放发挥药效的载药体系成为人们关心的热点。理想的剂型应具有剂量小、毒性小、副作用小、靶向缓释等特点，而两亲性聚合物纳米粒子恰好能满足这样的要求。给聚合物接上具有靶向能力的分子，同时，两亲性聚合物在水包油包水双乳化溶剂蒸发法(W/O/W)中能形成水包油包水的双层纳米结构，在其最里层的亲水内核中可以包载亲水性药物，在中间疏水层可以包载疏水性药物，最外的亲水层可以保证纳米粒子在水相中的溶解度和稳定性。纳米粒子通过内吞作用进入癌细胞后，可以通过设计载体对周围环境的改变，在细胞内快速释放药物，如氧化还原响应。
发明内容
本发明的目的之一在于针对肿瘤细胞的特点，提供一种联合用药，靶向输送，氧化还原响应的药物组合物。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种药物组合物，其包括载体和负载在该载体上的活性成分，所述载体为结构式如下式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物：
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸之间用小分子(2)胱氨链接，
本发明提供的载体透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物解决了活性成分如环巴胺等某些药物水溶性差的问题，也解决了药物载体不具有主动靶向，无法对细胞内外环境响应的问题，可以将传统的化疗药物(如阿霉素)和治疗肿瘤干细胞的新药(如环巴胺)联合使用，并且由于本发明中的纳米粒子具有主动靶向作用、良好的生物相容性和溶解性、对细胞内外的氧化还原环境进行响应的特点，所以能够实现定向输送，使药物在细胞内快速释放，提高药效。
根据本发明的药物组合物，所述透明质酸重均分子量为6600-12000Da，例如为7000Da、8500Da、10000Da、11500Da等。
根据本发明的药物组合物，所述聚乳酸-羟基乙酸重均分子量为20000-50000Da，例如为22000Da、35000Da、43000Da等。
根据本发明的药物组合物，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400-370000Da。
优选地，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物能够形成粒径为180-280nm的纳米粒子。
根据本发明的药物组合物，所述活性成分为阿霉素和/或环巴胺。
优选地，所述活性成分与透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的质量比为1-20:100，优选为3-10:100。
本发明的目的之一还在于提供本发明所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸-羟基乙酸接触，得到式(3)所示的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物；
式(3)中Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；由于聚乳酸-羟基乙酸的端羧基在碳二亚胺缩合剂如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或N,N-二环己基碳二亚胺活化下生成不稳定的活性中间体，若不用酰化活化剂转化为相应的活性酯或活性酰胺，其自身易成脲；所以在反应体系中加入一定比例的酰化活化剂如N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑，可生成稳定的活性酯或活性酰胺；
(b)在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到由式(4)所示的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸；
式(3)中Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(c)在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；
(d)在有机胺的存在下，将步骤(b)所得产物与步骤(c)所得活化的透明质酸溶液接触，得到式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物；
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸之间用小分子(2)胱氨链接。
(e)当活性成分均为脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使活性成分、步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入水制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；
当活性成分均为非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入活性组分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；
当活性成分同时含有脂溶性和非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使脂溶性活性成分、步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入非脂溶性活性成分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物。
根据本发明的制备方法，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸一端为羧基，另一端酯封。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为20000-50000Da。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比1-3:1。
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
优选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为1-5:1。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为2-6:1。
优选地，相对于1g聚乳酸-羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为2-10ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为2-4小时。
优选地，步骤(a)还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯化聚乳酸-羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥。
优选地，所述沉淀使用乙醚进行，优选使用冷却的乙醚。
优选地，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行，乙醚和甲醇的体积比没有特别的限定，但是优选使用体积比为1-9:1的乙醚/甲醇混合溶液。
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
根据本发明的制备方法，步骤(b)中所述有机胺为N,N-二异丙基乙胺和/或三乙胺。
优选地，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述胱氨和所述酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物的摩尔比2-10:1。
优选地，相对于1g步骤(a)得到的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.05-1.5ml，所述第二有机溶剂的用量为5-10ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
优选地，步骤(b)中还包括将所得胱氨-聚乳酸-羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥。
优选地，所述沉淀剂洗涤使用水进行，优选使用蒸馏水。
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
根据本发明的制备方法，步骤(c)中所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da。
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
优选地，所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为5:5:1-40:40:1。
优选地，相对于1g所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为5-30ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触时间为2-4小时。
根据本发明的制备方法，步骤(d)中所述胱氨-聚乳酸-羟基乙酸和所述酯化透明质酸的质量比4-8:1。
优选地，相对于1g胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.02-1.5ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
优选地，步骤(d)中还包括将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析。
优选地，所述透析在20-35℃的蒸馏水中透析24-72小时。透析后的产物可在烘箱如真空箱中进行干燥，如在20-40℃的真空箱中干燥10小时以上，如12-48小时。
制得的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子可以冻干保存。
根据本发明的制备方法，步骤(e)中所述第四有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。
优选地，所述表面活性剂为聚乙烯醇和/或聚乙二醇-聚丙二醇嵌段聚合物。
优选地，所述活性成分与透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的质量比为1-20:100，优选为3-10:100。其中，所述的活性成分指的是用于本发明的药物组合物的所有的活性成分。
优选地，所述表面活性剂的水溶液中的表面活性剂浓度为0.2-4％wt。
优选地，相对于1mg所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物，所述表面活性剂的水溶液或非脂溶性活性组分的水溶液或水的用量为0.25-5ml，所述第四有机溶剂的用量为0.5-1ml。
优选地，所述初乳或复乳的制备通过超声进行。
以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为碳二亚胺缩合剂，N-羟基琥珀酰亚胺为酰化活化剂合成透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物为例，步骤(a)到步骤(d)的反应路线如下所示：
本发明的目的之一还在于提供所述药物组合物用于抗肿瘤药物的制备中的用途。
本发明的药物组合物采用水包油包水双乳化溶剂蒸发法(W/O/W)制备，可直接使用透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物作为载体形成水包油包水的双层结构。因此其所形成纳米粒子的亲水内核可以负载亲水性的药物，中间疏水层可负载水溶性差的药物，避免了繁琐和复杂的修饰步骤，操作过程方便，降低生产成本，利于推广。且制备的载药纳米粒子为单分散的规则球体，粒径控制在100-300nm，无团聚现象。
另外，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物在水介质中自组装形成纳米粒子，具有核壳结构，粒径分布很窄。初乳时，亲水链段由于亲疏水作用力而聚集形成内核，疏水链段则形成外壳，复乳时，正好相反，疏水链段在疏水作用力下相聚成中间层，亲水链段则形成最外层的外壳。这些亲水链段如透明质酸通常具有良好的生物相容性，对粒子在水中的分散起到立体稳定的作用，因此可使药物在细胞中持续释放，延长药物血液半衰期。
同时，透明质酸具有靶向作用，在很多肿瘤细胞的表面都有它的受体CD44，LYVE-1等，例如人乳腺癌细胞MCF-7，可使载体定向输送药物。透明质酸-胱胺-聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物具有良好的生物相容性和可降解性，可增强穿透作用，因此被研制成为生物大分子药物的运送载体，以增强药物在体内的有效浓度，提高疗效。而与其它种类的高分子药物载体相比，透明质酸-胱胺-聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物不仅原料丰富，而且具有低成本，可生物降解，良好生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点。
本发明中，载体纳米粒子对活性成分阿霉素的包封率为30-91％，载药量为0.5-4.1wt％，对活性成分环巴胺的包封率为35-94％，载药量为0.6-4.2wt％。利用本发明载有活性成分如阿霉素和/或环巴胺等的透明质酸-胱胺-聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、肺癌细胞A542、肝癌细胞HepG2进行细胞毒性实验，结果表明所制备的载药纳米粒子能够识别细胞MCF-7、A549、HepG2表面的受体，并对该肿瘤细胞有显著的生长抑制作用。
附图说明
图1(a)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的红外谱图；
图1(b)为实施例1中的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸的红外谱图；
图1(c)为实施例1中的透明质酸的红外谱图；
图1(d)为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的红外谱图；
图2(a)为实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱图；
图2(b)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图；
图2(c)为实施例1中的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图；
图2(d)为实施例1中的透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图；
图4为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子光散射示意图的粒径分布图；
图5为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子光散射示意图的Zeta电位分布图；
图6(a)为暴露在不同DOX(阿霉素)浓度下，MCF-7细胞的活力；
图6(b)为暴露在不同DOX浓度下MDA-MB-231细胞的活力
图6(c)为暴露在不同DOX浓度下A549细胞的活力
图6(d)为暴露在不同DOX浓度下HepG2细胞的活力
图7(a)为暴露在不同CYC(环巴胺)浓度下MCF-7细胞的活力
图7(b)为暴露在不同CYC浓度下MDA-MB-231细胞的活力
图7(c)为暴露在不同CYC浓度下A549细胞的活力
图7(d)为暴露在不同CYC浓度下HepG2细胞的活力
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中的重均分子量是通过美国沃特斯515+2410的凝胶渗透色谱(GPC)测得的，溶剂为四氢呋喃。
对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸、胱氨-聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物进行红外光谱检测，检测条件包括：样品与KBr质量比为1:50，混匀后，研磨成透明薄片，通过红外光谱仪(美国珀金-埃尔默公司，型号为Spectrum one)进行检测。
对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸、胱氨-聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物进行核磁共振氢谱(瑞士，布鲁克公司，型号为AV400)检测，透明质酸的核磁共振氢谱的检测条件包括：水为内标，所用溶剂为重水；聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，胱氨-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜。
对以下实施例中所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子进行动态光散射(Zetasizer NanoZS)、透射电镜(美国FEI,Tecnai G220S-TWIN，200kV)。
实施例1
载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的制备
(a)将5g的聚乳酸-羟基乙酸(75/25，分子量：5万，济南岱罡)、0.115g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.081g的1-羟基苯并三唑(阿拉丁试剂上海有限公司，99％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入10mL的氯仿溶解，温度为40℃，氮气保护下反应4小时，得到1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸粗产品。将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去氯仿，然后用200mL乙醚进行沉淀，甲醇/乙醚(5：5)混合溶液清洗(100mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到固体产物1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸4.461g。
(b)将1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸4.461g加入到30mLN,N-二甲基甲酰胺中，制备1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸N,N-二甲基甲酰胺溶液；将0.101g的胱胺二盐酸盐(Fluka公司，98％)和0.5mL的N,N-二异丙基乙胺(国药集团化学试剂有限公司，99％)用5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，制备胱胺和N,N-二异丙基乙胺混合的N,N-二甲基甲酰胺溶液；将5mL的胱胺和三乙胺混合的N,N-二甲基甲酰胺溶液滴加到1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸N,N-二甲基甲酰胺溶液中，温度为40℃，在氮气的保护下反应12h，得到透明的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液加入到200mL的蒸馏水中沉淀，然后用9500rmp转数离心20分钟得到胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物产物在25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物4.213g。
(c)将0.5g透明质酸(华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量：12000Da)、0.319g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.225g的1-羟基苯并三唑(阿拉丁试剂上海有限公司，99％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入15mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，常温下，氮气保护下反应4小时，得到1-羟基苯并三唑活化的透明质酸溶液。
(d)将4g纯化后的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物加入到上述步骤(3)中的1-羟基苯并三唑化透明质酸溶液中，抽真空，加入0.5mL N,N-二异丙基乙胺溶液，在氮气氛围下反应12h，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液。将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液加入到透析袋(12000-14000Da)中,在蒸馏水中透析72h，去除杂质，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浊液，用9500rmp转数离心20分钟，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物4.021g。
(e)10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物和0.5mg环巴胺溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL，1.25mg/mL阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％wt)和嵌段式聚醚F-68(1％wt)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为370000Da，经计算阿霉素的载药量为2.7％，包封率为73％，环巴胺的载药量为3.2％，包封率为87％。
其它各项检测图谱见图1至图5。其中，图1(a)表示实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的红外光谱图。图1(b)表示实施例1中的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物的红外光谱图。图1(c)表示实施例1中的透明质酸的红外光谱图。图1(d)表示实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的红外光谱图。
与图1(a)相比，图1(b)在1625和1576cm-1附近出现两个新的吸收峰，这是聚乳酸-羟基乙酸端羧基与胱胺端氨基反应生成的酰胺键特征峰，1625cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1576cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这说明胱胺和聚乳酸-羟基乙酸端羧基发生了反应；与图1(a)和1(c)相比较，图1(d)的3458cm-1为透明质酸羟基(-OH)的伸缩振动峰，1631和1570cm-1为胱胺端氨基与聚乳酸-羟基乙酸端羧基反应生成的酰胺键、胱胺端氨基与透明质酸羧基反应生成酰胺键的特征峰，其中1631cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1570cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这些都说明胱胺将聚乳酸-羟基乙酸和透明质酸链接上生成透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备可以得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。
图2(a)表示实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱；图2(b)表示实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱；图2(c)表示实施例1中的胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物的核磁共振氢谱；图2(d)表示实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱。
同图2(b)相比较，图2(c)中在～1.43ppm、～4.87ppm和～5.20ppm处的信号分别对应于胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中聚乳酸-羟基乙酸链段中–CH3、–CH–和–CH2–上的质子吸收峰，在～2.73ppm和～2.88ppm处的信号分别对应于胱胺-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中胱胺链段中–CH2–S–和–CH2–N–上的质子吸收峰，这些说明了胱胺与聚乳酸-羟基乙酸反应生成了胱胺-聚乳酸-羟基乙酸。
同图2(a)、2(b)和2(c)相比较，图2(d)中在～1.43ppm、～4.87ppm和～5.20ppm处的信号分别对应于透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物中聚乳酸-羟基乙酸链段中–CH3、–CH–和–CH2–上的质子吸收峰，在～2.64ppm和～2.77ppm处的信号分别对应于透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中胱胺链段中–CH2–S–和–CH2–N–上的质子吸收峰，在～1.93ppm和～3.26-4.53ppm分别对应于透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物中透明质酸链段的–COCH3和–CH2O–，葡萄糖骨架上的质子吸收峰，这些说明了活化透明质酸与胱胺-聚乳酸-羟基乙酸反应生成了透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备得到了目标化合物透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。
图3表示实施例1中的载药透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。从该图可以看出，载药透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球形结构，粒径在200nm左右；同时可以看出典型的核壳结构，内核是疏水的聚乳酸-羟基乙酸，外壳为亲水的透明质酸。
图4表示实施例1中的载药透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的粒径分布图，其中平均粒径184nm，分散系数0.073。与图1相比，粒径较电镜图中的粒径大，这是由于透射电子显微镜样品制备过程中胶束壳层的塌陷收缩，在真空环境下使得胶束缩小，而动态光散射测定的是具有核壳结构的胶束在溶液中完全舒展时的水合力学直径，在水中存在亲水性外壳溶胀。
图5表示实施例1中的载药透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的电位分布图，从图5可以看出，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子表面带一定的负电荷，平均Zeta电位为-28.9mV。纳米粒子表面带一定的电荷有利于粒子的稳定性，防止粒子之间相互团聚。
实施例2
按照实施例1的方法进行步骤(a)至(d)，方法中所涉及的各物质的用量、条件以及得到的结果见表1至表4。
(e)10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物和0.2mg环巴胺溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL，0.5mg/mL阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(2％wt)溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400Da。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在223±8nm，分散系数为0.125±0.023，平均Zeta电位为-26.1±3.1mV；经计算阿霉素的载药量为1.2％，包封率为81％，环巴胺的载药量为2.3％，包封率为89％。
实施例3
按照实施例1的方法进行步骤(a)至(d)，方法中所涉及的各物质的用量、条件以及得到的结果分别见表1至表4。
(e)10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物和1mg环巴胺溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL，2.5mg/mL阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(4％wt)溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为87000Da。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在249±2nm，分散系数为0.210±0.053，平均Zeta电位为-22.3±2.9mV。经计算阿霉素的载药量为3.7％，包封率为71％，环巴胺的载药量为2.7％，包封率为79％。
表1
表2
表3
表4
实施例4
药液1的制备：将实施例1制得的载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(HA-PLGA-DOX-CYC)用相应的培养基进行稀释，得到以阿霉素计，浓度分别为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM的不同浓度的药液1。
药液2的制备：除了不加阿霉素和环巴胺以外，其它按照实施例1的步骤(5)的方法制备透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(HA-PLGA)，并按照药液1的制备方法，将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子用相应的培养基进行稀释，使所得的不同浓度药液2中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度与相应浓度药液1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度相同。
药液3的制备：按照实施例1的步骤(5)的方法制备载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(PLGA-DOX-CYC)，并按照药液1的制备方法，得到以阿霉素计，浓度分别为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM的不同浓度的药液3。
药液4的制备：除了不加阿霉素和环巴胺以外，其它按照实施例1的步骤(5)的方法制备聚乳酸-羟基乙酸聚合物的纳米粒子(PLGA)，并按照药液1的制备方法，将所得聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子用相应的培养基进行稀释，使所得的不同浓度药液4中的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度与相应浓度药液1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度相同。
药液5的制备：将阿霉素(DOX)用PBS溶为1mg/mL的溶液，然后用相应的培养基稀释，得到浓度分别为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM的不同浓度的药液5。
将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌HepG2浓度分别调成1×103个/孔，并接种于96孔培养板，在5％CO2和温度37℃下培养24小时后，向细胞中分别加入上述不同浓度的药液1、药液2、药液3、药液4、药液5，每组的每种浓度平行设置6孔，空白对照组给予100μL/孔的含有10％牛血清和0.5％双抗的RPMI1640培养液，其中HepG2细胞用DMEM培养基。在5％CO2和温度37℃下继续分别培养72h后，通过CCK法检测阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子对肿瘤细胞的生长抑制作用。实验结果如图6(a)至6(d)所示。
从图6(a)至图6(d)可以看出，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物和聚乳酸-羟基乙酸对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2均没有生长抑制作用，而载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒随着阿霉素浓度的增加，对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2的生长抑制作用也逐渐增强，且较单独阿霉素对细胞的生长抑制作用好。从图6(a)中可以看出，载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒和载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用相当，这是由于人乳腺癌细胞MCF-7不是CD44高表达的细胞，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的靶向作用不明显。从图6(b)至图6(d)可以看出，载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒较载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用好，这是由于MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2是CD44高表达的细胞，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物与CD44相互作用，靶向载体进入细胞，从而使目标药物载体组合物对细胞生长抑制作用增强。
实施例5
药液1的制备：将实施例1制得的载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(HA-PLGA-DOX-CYC)用相应的培养基进行稀释，得到以环巴胺计，浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM的不同浓度的药液1。
药液2的制备：除了不加阿霉素和环巴胺以外，其它按照实施例1的步骤(5)的方法制备透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(HA-Cys-PLGA)，并按照药液1的制备方法，将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子用相应的培养基进行稀释，使所得的不同浓度药液2中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度与相应浓度药液1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度相同。
药液3的制备：按照实施例1的步骤(5)的方法制备载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子(PLGA-DOX-CYC)，并按照药液1的制备方法，得到以环巴胺计，浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM的不同浓度的药液3。
药液4的制备：除了不加阿霉素和环巴胺以外，其它按照实施例1的步骤(5)的方法制备聚乳酸-羟基乙酸聚合物的纳米粒子(PLGA)，并按照药液1的制备方法，将所得聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子用相应的培养基进行稀释，使所得的不同浓度药液4中的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度与相应浓度药液1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浓度相同。
药液5的制备：将环巴胺(CYC)用含0.1％吐温的PBS进行分散为2mg/mL，然后用相应的培养基稀释得到浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM的不同浓度的药液5。
将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌HepG2浓度分别调成1×103个/孔，并接种于96孔培养板，在5％CO2和温度37℃下培养24小时后，向细胞中分别加入上述不同浓度的药液1、药液2、药液3、药液4、药液5、，每组的每种浓度平行设置6孔，空白对照组给予100μL/孔的含有10％牛血清和0.5％双抗的RPMI1640培养液，其中HepG2细胞用DMEM培养基。在5％CO2和温度37℃下继续分别培养72h后，通过MTT法检测阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子对肿瘤细胞的生长抑制作用。实验结果如图7(a)至7(d)所示。
从图7(a)至图7(d)可以看出，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物和聚乳酸-羟基乙酸对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2均没有生长抑制作用，而载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒随着环巴胺浓度的增加，对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2的生长抑制作用也逐渐增强，且较单独环巴胺对细胞的生长抑制作用好。
从图7(a)中可以看出，载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒和载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用相当，这是由于人乳腺癌细胞MCF-7不是CD44高表达的细胞，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的靶向作用不明显。从图7(b)至图7(d)可以看出，载有阿霉素和环巴胺的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒较载有阿霉素和环巴胺的聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米颗粒对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用好，这是由于MDA-MB-231、肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2是CD44高表达的细胞，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物与CD44相互作用，靶向载体进入细胞，从而使目标药物载体组合物对细胞生长抑制作用增强。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种药物组合物，其包括载体和负载在该载体上的活性成分，其特征在于，所述载体为结构式如下式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物：
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da；
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为20000-50000Da。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400-370000Da；
优选地，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的粒径为190-280nm；
优选地，所述活性成分为阿霉素和/或环巴胺；
优选地，所述活性成分与透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的质量比为1-20:100，优选为3-10:100。
4.一种权利要求1-3任一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸-羟基乙酸接触，得到式(3)所示的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物；
式(3)中Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(b)在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到由式(4)所示的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸；
式(3)中Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(c)在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；
(d)在有机胺的存在下，将步骤(b)所得产物与步骤(c)所得活化的透明质酸溶液接触，得到式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物；
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(e)当活性成分均为脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使活性成分、步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入水制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；
当活性成分均为非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入活性组分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；
当活性成分同时含有脂溶性和非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使脂溶性活性成分、步骤(d)所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入非脂溶性活性成分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸一端为羧基，另一端酯封；
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为20000-50000Da；
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比1-3:1；
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺；
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑；
优选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿；
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为1-5:1；
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为2-6:1；
优选地，相对于1g聚乳酸-羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为2-10ml；
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为2-4小时；
优选地，步骤(a)还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯化聚乳酸-羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥；
优选地，所述沉淀使用乙醚进行，优选使用冷却的乙醚；
优选地，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行，乙醚和甲醇的体积比没有特别的限定，但是优选使用体积比为1-9:1的乙醚/甲醇混合溶液；
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述有机胺为N,N-二异丙基乙胺和/或三乙胺；
优选地，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺；
优选地，所述胱氨和所述酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物的摩尔比2-10:1；
优选地，相对于1g步骤(a)得到的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.05-1.5ml，所述第二有机溶剂的用量为5-10ml；
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时；
优选地，步骤(b)中还包括将所得胱氨-聚乳酸-羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥；
优选地，所述沉淀剂洗涤使用水进行，优选使用蒸馏水；
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da；
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺；
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑；
优选地，所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺；
优选地，所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为5:5:1-40:40:1；
优选地，相对于1g所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为5-30ml；
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触时间为2-4小时。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述胱氨-聚乳酸-羟基乙酸和所述酯化透明质酸的质量比4-8:1；
优选地，相对于1g胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.02-1.5ml；
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时；
优选地，步骤(d)中还包括将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析；
优选地，所述透析在20-35℃的蒸馏水中透析24-72小时。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)中所述第四有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿；
优选地，所述表面活性剂为聚乙烯醇和/或聚乙二醇-聚丙二醇嵌段聚合物；
优选地，所述活性成分与透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的质量比为1-20:100，优选为3-10:100；
优选地，所述表面活性剂的水溶液中的表面活性剂浓度为0.2-4％wt；
优选地，相对于1mg所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物，所述表面活性剂的水溶液或非脂溶性活性成分的水溶液或水的用量为0.25-5ml，所述第四有机溶剂的用量为0.5-1ml；
优选地，所述初乳或复乳的制备通过超声进行。
10.权利要求1-3任一项所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述药物组合物用于抗肿瘤药物的制备。
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