CN111419805B - 一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备方法 - Google Patents

一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备方法。其中，一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其包括，用将叶酸‑壳聚糖偶联物与氨基封端的聚(N‑异丙基丙烯酰胺)，制备叶酸‑壳聚糖‑聚(N‑异丙基丙烯酰胺)；制备藤黄酸与所述叶酸‑壳聚糖‑聚(N‑异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物；将所述接枝聚合物溶解于二甲基亚砜中，缓慢滴入水中，透析后冷冻干燥得到胶束。以壳聚糖为主体，分别通过化学结合法链接叶酸与温敏高分子材料聚(N‑异丙基丙烯酰胺)，通过酯键链接抗肿瘤药物藤黄酸，形成的聚合物前药具有pH、温度与酯酶多重环境响应性。

Description

一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备 方法
技术领域
本发明属于药物制剂及高分子材料技术领域，具体涉及一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备方法。
背景技术
藤黄酸(分子量628.75)是一种从来自藤黄树拉丁裂口处分泌的干燥树脂中提取得到的有效成分。研究表明藤黄酸对肺癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌以及白血病等多种肿瘤具有抑制作用，其涉及的抗肿瘤作用机制广泛，包括促使细胞周期停滞，下调端粒酶活性，诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、防止肿瘤细胞转移、抑制通道蛋白的表达和抗血管生成等，可通过不同机制来同时发挥抗肿瘤作用，具有巨大的应用潜力。然而在药物递送过程中，藤黄酸具有广泛的药物分布，易造成严重毒副作用，包括过敏、肾毒性、肝毒性、心脏毒性和神经毒性等。此外，藤黄酸的溶解度极低(小于0.5μg/mL)，限制了其临床应用。
为了减小毒副作用、提高药物疗效，设计能够负载抗肿瘤药物到达肿瘤部位并有效释放的纳米递药系统是抗肿瘤药物研究的重要目标，已有研究人员研发出一系列藤黄酸载药系统，但这些载药系统虽然能够不同程度上提高藤黄酸的抗肿瘤活性和生物利用度，但是以物理包封形式载药的纳米给药系统存在载药量低，储存及给药进入体循环过程中药物易泄漏等缺点。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
本发明提供了一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束及其制备方法。所制备的聚合物前药胶束具有高载药量，可有效提高疏水性药物藤黄酸的溶解性，更重要的是能够解决药物在储存和血液循环的泄漏问题。为了提高靶向性，还在原有载药系统中引入刺激响应单元，从而提高药物在肿瘤部位的蓄积量，最终提高肿瘤治疗效果。
本发明的具体技术方案为：一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其包括，用将叶酸-壳聚糖偶联物与氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)，制备叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)；制备藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物；将所述接枝聚合物溶解于二甲基亚砜中，缓慢滴入水中，透析后冷冻干燥得到胶束。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法的优选方案，其中：所述制备叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其使用的表面活性剂包括聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆188中的一种或几种；所述将所述接枝聚合物溶解于二甲基亚砜中，其为，每10mg所述接枝聚合物溶解于2～6mL所述二甲基亚砜。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法的优选方案，其中：所述叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:(1～2)，反应温度为25～60℃，反应时间为0.5～2h；所述叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物与藤黄酸的质量比例为3:2。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法的优选方案，其中：所述制备叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其为，将叶酸-壳聚糖偶联物与氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)溶于含有表面活性剂的乙酸溶液中，加入戊二醛溶液，进行反应，用水透析，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法的优选方案，其中：所述制备藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物，其为，将藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入得到的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物，避光反应后，置于透析袋中分别用N,N-二甲基甲酰胺和水透析，然后冷冻干燥，制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法的优选方案，其中：所述藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物，其结构式如下，
Figure BDA0002504425850000031
作为本发明的另一方面，本发明提供一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的应用，其中：所述基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的释放介质包括含有聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆188、酯酶中的一种的磷酸盐缓冲液和/或醋酸盐缓冲液中的一种或几种；所述缓冲液的pH为4.5～7.5。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的应用的优选方案，其中：所述基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束进行释放的温度为35～45℃，振动速率为60～100rpm。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束，其中：由壳聚糖、叶酸、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和抗肿瘤药物藤黄酸构成。
作为本发明所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的优选方案，其中：所述胶束为类球形粒子，粒径在60～100nm之间，具有pH、酯酶及温度多重环境响应性和明显的肿瘤靶向性。
本发明的有益效果：
1.以壳聚糖为主体，分别通过化学结合法链接叶酸与温敏高分子材料聚(N-异丙基丙烯酰胺)，通过酯键链接抗肿瘤药物藤黄酸，形成的聚合物前药具有pH、温度与酯酶多重环境响应性。
2.藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物在水中依靠疏水作用力自组装形成胶束，常规条件下胶束稳定性强，不易解聚；依靠叶酸受体介导作用靶向于肿瘤细胞后，在肿瘤酸性微环境下，壳聚糖外壳由于质子化作用发生溶胀，升温后胶束稳定结构被破坏，胶束发生解聚，暴露连接药物的酯键，在肿瘤的酸性环境以及酯酶作用下被触发，快速释放出藤黄酸，有效抑制肿瘤细胞的生长繁殖，从而增强藤黄酸对肿瘤的治疗作用，并降低毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束的红外光谱图，其中，1为壳聚糖、2为叶酸-壳聚糖偶联物、3为叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物、4为藤黄酸、5为藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物)；
图2为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束的透射电镜(TEM)图；
图3为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束的粒径分布图；
图4为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束的HPLC图；
图5为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束的体外释放图；
图6为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束及藤黄酸原药给药后2h在H22荷瘤小鼠的药物组织分布图；
图7为本发明中实施例1制备的环境多重响应型聚合物前药胶束给药后各组H22荷瘤小鼠的肿瘤生长趋势图；
图8为叶酸-壳聚糖偶联物的核磁共振氢谱；
图9为叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的核磁共振氢谱；
图10为藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物的核磁共振氢谱；
图11为胶束储存稳定性的图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
叶酸-壳聚糖偶联物的制备试验如下：将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，按一定比例加入至10mL的二甲基亚砜中完全溶解，室温下避光搅拌2h。称取壳聚糖溶于去离子水(叶酸与壳聚糖摩尔比为8:1)，缓慢滴加入上述反应体系中，避光反应16h，用氢氧化钠溶液调节pH为9.0终止反应，产物在磷酸盐缓冲液和水中各透析24h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖偶联物。
实施例1：
(1)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)1:4的重量比的混合物加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:1。继续反应1h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
(2)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝聚合物的制备：藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入至10mL的N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解，室温下避光搅拌1h。将步骤(1)中制备的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺，缓慢滴入上述反应体系中，避光反应24h，产物分别在N,N-二甲基甲酰胺和水中透析24h以去除未参与反应的藤黄酸，然后在去离子水中透析24h，冷冻干燥后即得藤黄酸聚合物前药。
(3)将步骤(2)得到的藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物5mg溶于1mL二甲基亚砜，缓慢滴入水中，然后置于透析袋中用水透析，冷冻干燥制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物胶束。
将叶酸的羧基与壳聚糖的氨基发生酰胺缩合反应生成酰胺键，使用戊二醛将氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与壳聚糖上的剩余氨基反应生成亚胺键，将抗肿瘤药物藤黄酸的羧基与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物上的羟基发生酯化反应生成酯键。
本实施例中胶束的存储方式为将胶束放置于4℃下保存，将胶束静置储存21天，分别在0，1，3，5，7，9，15，21天测定胶束的粒径与PI值。结果如图所示，在21天内，本发明制备的胶束的粒径与PI值没有发生显著的变化，表明胶束稳定性良好(图11为胶束储存稳定性的图)。我们也做了临界胶束浓度实验，结果表明本发明制备的胶束的临界胶束浓度为4.25×10-3mg/mL，胶束的临界胶束浓度值较低，稳定性良好。
核磁图如下：
(1)叶酸-壳聚糖偶联物的核磁共振氢谱如图8所示，其中1.90ppm代表壳聚糖上乙酰基的质子峰，2.51～3.75ppm的组峰分别代表壳聚糖环上基团的质子峰，在6.63ppm、7.51ppm与8.68ppm处生成的新峰代表叶酸上芳香环的质子峰，结果表明叶酸-壳聚糖偶联物已成功合成。叶酸-壳聚糖偶联物，其结构式如下：
Figure BDA0002504425850000061
(2)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的核磁共振氢谱如图9所示，与叶酸-壳聚糖偶联物的核磁图谱相比，1.97ppm与2.24ppm处新生成的峰代表戊二醛结构中不同-CH2-的质子峰，5.27ppm处新生成的峰代表碳氮双键-CH＝N-上的质子峰，结果表明表明叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物已成功合成，此外，6.63ppm、7.51ppm与8.68ppm处芳香环的质子峰没有消失，表明叶酸-壳聚糖偶联物中叶酸基团与壳聚糖的酰胺键比较稳定。
Figure BDA0002504425850000071
(3)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物的核磁共振氢谱如图10所示，与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的核磁图谱相比，通过酯化反应连接藤黄酸后，原来位于4.21ppm处的壳聚糖羟基的质子峰消失，1.21～1.65ppm、5.01ppm、5.75ppm与8.71ppm新生成的峰为藤黄酸上芳香环的质子峰，结果表明接枝聚合物已成功合成。
Figure BDA0002504425850000072
实施例2：
(1)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的泊洛沙姆188，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:1。继续搅拌，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
(2)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物：藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入至10mL的N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解，室温下避光搅拌1h。将步骤(1)中制备的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺，缓慢滴入上述反应体系中，避光反应24h，产物分别在N,N-二甲基甲酰胺和水中透析24h以去除未参与反应的藤黄酸，然后在去离子水中透析，冷冻干燥后即得藤黄酸聚合物前药。
(3)将步骤(2)得到的藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物10mg溶于3mL二甲基亚砜，缓慢滴入水中，然后置于透析袋中用水透析，冷冻干燥制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物胶束。
实施例3：
(1)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的十二烷基硫酸钠，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:2。继续搅拌，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
(2)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物：藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入至10mL的N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解，室温下避光搅拌1h。将步骤(2)中制备的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺，缓慢滴入上述反应体系中，避光反应24h，产物分别在N,N-二甲基甲酰胺和水中透析24h以去除未参与反应的藤黄酸，然后在去离子水中透析24h，冷冻干燥后即得藤黄酸聚合物前药。
(3)将步骤(2)得到的藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物50mg溶于10mL二甲基亚砜，缓慢滴入水中，然后置于透析袋中用水透析，冷冻干燥制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物胶束。
实施例4：
(1)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:1。继续搅拌，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
(2)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物：藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入至10mL的N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解，室温下避光搅拌1h。将步骤(2)中制备的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺，缓慢滴入上述反应体系中，避光反应24h，产物分别在N,N-二甲基甲酰胺和水中透析24h以去除未参与反应的藤黄酸，然后在去离子水中透析，冷冻干燥后即得藤黄酸聚合物前药。
(3)将步骤(2)得到的藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物10mg溶于6mL二甲基亚砜，缓慢滴入水中，然后置于透析袋中用水透析，冷冻干燥制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物胶束。
实施例5：
(1)叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2:8:1。继续搅拌，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
(2)藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物：藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入至10mL的N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解，室温下避光搅拌1h。将步骤(2)中制备的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺，缓慢滴入上述反应体系中，避光反应24h，产物分别在N,N-二甲基甲酰胺和水中透析24h以去除未参与反应的藤黄酸，然后在去离子水中透析，冷冻干燥后即得藤黄酸聚合物前药。
(3)将步骤(2)得到的藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物5mg溶于2mL二甲基亚砜，缓慢滴入水中，然后置于透析袋中用水透析，冷冻干燥制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物胶束。
通过以下试验(实施例1为例)对本发明的应用效果作进一步的说明：
1.聚合物结构鉴定与分析
使用红外光谱仪测定了壳聚糖、叶酸-壳聚糖偶联物、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物、藤黄酸、藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物红外光谱，结果如图1所示，表明叶酸-壳聚糖偶联物、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物和藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝聚合物的成功合成。
2.聚合物前药胶束形态观察
取藤黄酸聚合物前药胶束水分散液少量滴于铜网上，自然干燥后，于Tecnai G2Spirit Twin型透射电镜下观察，为类球形粒子，粒径在60～100nm之间。结果见图2。
3.粒径与Zeta电位
取藤黄酸聚合物前药胶束，用适量的水稀释，采用Nicomp 380/ZLS型纳米粒度-Zeta电位测定仪测定其粒径、多分散系数及Zeta电位。Zeta电位值为-8.12mV，平均粒径为87nm，与透射电镜结果基本吻合。图3为藤黄酸接枝聚合物前药胶束的粒径分布图。
4.载药量的测定
藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物的合成过程中，将产物在N,N-二甲基甲酰胺中透析以去除未参与反应的藤黄酸，HPLC测定透析液中藤黄酸的含量，计算藤黄酸聚合物前药胶束中藤黄酸的载药量。
Figure BDA0002504425850000101
HPLC图谱见图4。根据测定结果，计算得到载药量为20.61％。
5.体外释放试验
分别以含0.5％聚山梨酯80的pH7.4磷酸盐缓冲液、含0.5％聚山梨酯80及30U/mL酯酶的pH7.4磷酸盐缓冲液、含0.5％聚山梨酯80的pH5.0醋酸盐缓冲液、含0.5％聚山梨酯80及30U/mL酯酶的pH5.0醋酸盐缓冲液为释放介质，将1.5mg/mL的聚合物前药胶束溶液投入介质中；将装有透析袋的烧杯置于恒温气浴振荡器中(37℃/42℃，100rpm)考察其释放行为。分别于12、24、48、72、96h取1mL溶液，同时补充等量释放介质；样品液用0.45μm微孔滤膜过滤，除去初滤液，取续滤液加入适量的流动相稀释，混匀，HPLC测定藤黄酸的含量，计算其累积释放百分率，绘制体外释放曲线。图5为藤黄酸接枝聚合物前药胶束的体外释放曲线，结果表明在42℃，含酯酶的pH5.0醋酸盐缓冲液中，藤黄酸的释放速率明显高于其他条件下的释放，表明藤黄酸接枝聚合物前药胶束具有pH、酯酶及温度多重环境响应性。
为模拟人体内正常组织的生理环境与肿瘤组织中的微环境，分别使用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)与pH5.0的醋酸盐缓冲液(ABS)做为释放介质，此外，考虑到细胞中存在酯酶，研究了胶束在酯酶存在下的释放情况。37℃下，在无酯酶的PBS中，藤黄酸在12h仅从胶束中释放25.51％，96h时藤黄酸释放了47.61％，然而在ABS中，藤黄酸能够快速、大量从胶束中释放，12h释放量为30.81％，48h释放量可达60.67％，表明在肿瘤酸性环境下壳聚糖发生溶胀能够促进连接藤黄酸的酯键水解，促进藤黄酸释放；添加酯酶后，藤黄酸释放速率提高，在96h时在含有30U/mL酯酶的PBS(pH7.4)与ABS(pH5.0)中分别释放了55.65％和81.03％，表明酯酶的存在可加速酯键水解。42℃下，由于胶束上连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)能够由亲水状态变为疏水状态，促使胶束发生解聚，因此更容易暴露出连接药物的酯键，释放速率较37℃下增加。因此，胶束的药物释放对pH、酯酶和温度都具有响应性，可供藤黄酸在肿瘤细胞中进行“按需”释放。
6.肿瘤靶向性试验
荷H22肝癌细胞小鼠模型的建立：取昆明小鼠18只，体重15-20g，随即在每只小鼠右前侧腋下接种0.2mL的H22肝癌细胞悬液于皮下，接种后第3d，小鼠右侧腋下可触及移植局部有隆起的肿瘤硬块，接种第7d时肿瘤体积约100mm3，肿瘤形成。将成瘤小鼠随机分为2组，每组6只。给药方案分别为：藤黄酸原药、藤黄酸接枝聚合物前药胶束组。给药方式为小鼠尾静脉注射。小鼠尾静脉注射后2h取出动物，颈椎脱臼法处死小鼠，立刻进行解剖，取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，在生理盐水中洗涮，滤纸吸干表面水分，称量记录组织湿重，取部分组织称重后加入等量蒸馏水进行组织匀浆，取组织匀浆液20μL，涡旋混合均匀，加入蛋白沉淀溶剂乙腈60μL，涡旋混合3min，然后再补充加入萃取剂，10000rpm离心10min，沉淀蛋白及脂质，HPLC测定上清液中药物的含量。图6及下表结果显示，与藤黄酸原药相比，藤黄酸接枝聚合物前药胶束的荷瘤小鼠除肿瘤组织外其余组织中的分布量均较少，藤黄酸原药在肝组织分布最多，再次是肾、脾、肺、瘤、心，充分证明藤黄酸接枝聚合物胶束与藤黄酸原药相比，具有更明显的肿瘤靶向性。
Figure BDA0002504425850000121
7.体内抗肿瘤药效学试验
建立H22荷瘤小鼠动物模型，待荷瘤小鼠的肿瘤体积长至100-150mm3左右，随机分为5组，每组7只。分组情况如下：生理盐水、藤黄酸原药、藤黄酸聚合物前药胶束、藤黄酸聚合物前药胶束加局部热疗(42±1℃)，藤黄酸的等效给药剂量为6mg/mL，给药方式为小鼠尾静脉注射。每隔一天给1次药，一共给药7次，每次给药后测量和记录荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重。图7结果显示，给药14天后，生理盐水无法有效抑制肿瘤的快速生长，肿瘤体积较大。藤黄酸聚合物前药胶束局部热疗组能够很好地抑制肿瘤生长，其荷瘤小鼠的肿瘤体积明显小于生理盐水组和藤黄酸原药组的肿瘤体积(P＜0.05)。
实施例6：针对叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备的摸索，本发明还尝试了：
1、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1。室温继续搅拌1h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
2、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1。室温继续搅拌0.5h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
3、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1。室温继续搅拌2h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
4、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1。40℃继续搅拌1h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
5、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1。60℃继续搅拌1h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
6、叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的制备：将叶酸-壳聚糖偶联物和氨基封端聚(N-异丙基丙烯酰胺)的混合物以1:4的重量比加入至0.3％(v/v)乙酸溶液中，加入1％(v/v)的聚山梨酯80，室温搅拌1h后向反应体系中缓慢滴入戊二醛溶液，其中叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：2。室温继续搅拌1h，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
将不同戊二醛加入量、反应时间与反应温度下制备得到的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物采用采用Nicomp 380/ZLS型纳米粒度仪测定其粒径，并采用紫外分光光度计测定其低临界溶解温度，当叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1，室温下反应0.5h，1h和2h时，所得叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的粒径分别为314.73nm，258.07nm和271.97nm，低临界溶解温度分别为35.1℃，36℃和35℃；当反应时间为1h，反应温度分别为40℃和60℃时，所得叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的粒径分别为291.87nm和261.27nm，低临界溶解温度分别为34℃和33℃。当叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：2，反应时间为1h，反应温度为室温时，所得叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的粒径为317.47nm，低临界溶解温度为35.8℃。因此，根据所得实验结果以及从实验安全、成本、经济效益各因素综合考虑，我们选取了叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、戊二醛的质量比例为2：8：1，在室温下反应1h得到叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物作为最优处方，进行后续实验。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，是自然界中大量存在的一种碱性氨基多糖，具有良好的生物相容性与黏附性，是一种安全理想的药物载体材料。壳聚糖具有pH敏感特性，在酸性条件下其伯胺基能够发生质子化作用，使壳聚糖发生溶胀或溶解，因此壳聚糖是一种可控制药物在酸性条件下释放的载体材料。此外，壳聚糖上还含有丰富的游离羟基和氨基，能够与靶向性基团或功能性材料发生酰胺化、亚胺化、酯化、醚化、氧化、卤化等多种化学反应生成不同的衍生物，实现丰富的结构改造和功能化修饰。
本发明将抗肿瘤药物藤黄酸通过酯化反应连接至叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物上形成聚合物前药，在水中进一步自组装形成胶束结构，本发明制备的胶束在正常组织下能够保持稳定，在肿瘤组织中的微酸环境和酯酶的存在下促进胶束解聚，释放药物。相比于物理包封形式的载药系统，通过化学键合连接药物能够增加载药量，提高稳定性，使其在生理条件下能够稳定存在。发明制得的聚合物前药胶束粒径为60～100nm且分布较窄，载药量达20.61％。其特点是通过载体材料的叶酸修饰，在叶酸受体的靶向作用下浓集于肿瘤部位，并具有pH、温度和酯酶多重环境响应性，在肿瘤弱酸性、酯酶环境及热疗条件下可被触发，快速释放出藤黄酸，有效抑制肿瘤细胞的生长繁殖，从而增强藤黄酸对肿瘤的治疗效果，并降低毒副作用。作为载体材料的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)相比与生理盐水组对小鼠肿瘤生长具有轻微的抑制作用，本发明发现低分子量的壳聚糖除了具有良好的生物相容性、组织活性和可降解以外，还可以通过抑制糖酵解、增加机体免疫功能、抑制肿瘤血管生成等机制发挥抗肿瘤效果，因此，壳聚糖为主要载体其本身也具有一定的抗肿瘤效果；藤黄酸接枝共聚物前药胶束的抗肿瘤效果主要来自于该胶束改善了藤黄酸原药的溶解性与稳定性，增加了药物的肿瘤靶向性，降低了毒副作用，使得藤黄酸原药的药效在肿瘤组织中得到了充分的发挥，叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)仅具有一定的抗肿瘤药效，在藤黄酸存在的情况下与其配合能够发挥协同增效的作用。
本发明提供的藤黄酸环境多重响应型聚合物前药胶束，可依靠叶酸介导作用富集于肿瘤组织，由肿瘤的酸性环境以及热疗局部升温触发胶束的解聚、化学键暴露和水解，从而快速释放藤黄酸，发挥抗肿瘤疗效。
本发明的创造点在于：先将叶酸与壳聚糖通过酰胺缩合相连接，然后通过戊二醛将温敏材料聚(N-异丙基丙烯酰胺)与壳聚糖形成亚胺键相连接，再将抗肿瘤药物藤黄酸与壳聚糖通过酯化反应相连接，构成藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物，进一步在水中自组装形成外部亲水，内部疏水的胶束结构。壳聚糖链上含有大量的游离氨基和羧基，为结构修饰和功能性改造提供了大量可能性，此外，由于壳聚糖的氨基能够在酸性条件下发生质子化而溶胀，因此具有pH敏感特性。将叶酸引入壳聚糖能够增加胶束的肿瘤靶向性，聚(N-异丙基丙烯酰胺)具有温度敏感特性，在低临界溶解温度下能够由亲水状态转变为疏水状态，可作为一种智能材料控制药物释放，然而聚(N-异丙基丙烯酰胺)的低临界溶解温度仅为32℃，未达到人体正常生理温度，本发明以壳聚糖为母体材料，合成了兼具pH和温度敏感性的叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)，在通过酯键连接藤黄酸，合成了藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝聚合物，酯键能够在酸性条件与酯酶存在下发生水解，释放活性药物藤黄酸。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：包括，
用将叶酸-壳聚糖偶联物与氨基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺），制备叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）；
制备藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）的接枝聚合物；
将所述接枝聚合物溶解于二甲基亚砜中，缓慢滴入水中，透析后冷冻干燥得到胶束。
2.如权利要求1所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：所述制备叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺），其使用的表面活性剂包括聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆188中的一种或几种；所述将所述接枝聚合物溶解于二甲基亚砜中，其为，每10mg所述接枝聚合物溶解于2~6mL所述二甲基亚砜。
3.如权利要求1所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：所述叶酸-壳聚糖偶联物、氨基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）、戊二醛的质量比例为2:8:(1～2)，反应温度为25～60℃，反应时间为0.5～2h；所述叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）的接枝聚合物与藤黄酸的质量比例为3:2。
4.如权利要求1~3任一所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：所述制备叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺），其为，将叶酸-壳聚糖偶联物与氨基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）溶于含有表面活性剂的乙酸溶液中，加入戊二醛溶液，进行反应，用水透析，冷冻干燥后得到叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）聚合物。
5.如权利要求1~3任一所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：所述制备藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）的接枝聚合物，其为，将藤黄酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶于N, N-二甲基甲酰胺，加入得到的叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）聚合物，避光反应后，置于透析袋中分别用N,N-二甲基甲酰胺和水透析，然后冷冻干燥，制得藤黄酸与叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）的接枝聚合物。
6.如权利要求5所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：所述藤黄酸与所述叶酸-壳聚糖-聚（N-异丙基丙烯酰胺）的接枝聚合物，其结构式如下，
Figure 813656DEST_PATH_IMAGE001
。
7.如权利要求1~6任一所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法制得的聚合物前药胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求1~6任一所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法制得的聚合物前药胶束，其特征在于：由壳聚糖、叶酸、聚（N-异丙基丙烯酰胺）和抗肿瘤药物藤黄酸制成。
9.如权利要求1~6任一所述的基于壳聚糖的环境多重响应型聚合物前药胶束的制备方法制得的聚合物前药胶束，其特征在于：所述胶束为类球形粒子，粒径在60~100nm之间，具有pH、酯酶及温度多重环境响应性和明显的肿瘤靶向性。
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