CN108815136A

CN108815136A - 一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法

Info

Publication number: CN108815136A
Application number: CN201810737704.5A
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 钱倩倩; 牛世伟; 章学易
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2018-11-16

Abstract

本发明涉及一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法，将叶酸FA、EDC、NHS加入到溶剂中搅拌，得到混合液并缓慢加入到CS‑g‑NIPAM的水溶液中室温避光搅拌，将得到的FA‑CS‑g‑PNIPAM溶于水中，加入DOX搅拌反应，透析，冷冻干燥，即得。本发明的载药材料具有pH敏感型释放及乳腺癌细胞靶向的特点，可以用于抗肿瘤研究，有着很好的实用价值。

Description

一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法

技术领域

本发明属于纳米复合材料的制备领域，特别涉及一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法。

背景技术

壳聚糖作为一种天然的阳离子多糖，来源广泛并且价格比较便宜、没有毒害,具有良好的生物相容性和生物可降解性等优点，可广泛应用于医药、食品还有化工等领域。但是壳聚糖也存在很多的不足，壳聚糖分子间存在氢键使得壳聚糖结晶度高，因此它不溶于一般的有机溶剂，从而大大限制了壳聚糖的应用。所以壳聚糖的改性研究应运而生，并取得了许多进展。目前，伴随着可控/活性自由基聚合在合成结构明确、分子量可控高分子方面的发展，壳聚糖的可控接枝改性也取得了十分不错的成绩。在壳聚糖分子中键合、亲水性的或具有某种特殊功能的合成高分子，可以改善壳聚糖的某些性能，提高壳聚糖的应用范围。另外，CS也被认为是具有pH敏感性质的天然聚合物。壳聚糖的接枝聚合物不仅具有壳聚糖的特点，而且具有合成聚合物的优点。由于其在药物递送系统开发中的潜力已经广泛应用于制药工业。

叶酸(FA)具有肿瘤靶向性，将FA连在壳聚糖表面，得到具有肿瘤主动靶向效果的纳米颗粒(FA-CS-g-PNIPAM)。叶酸受体(FR)在一些实体肿瘤细胞表面呈现高表达状态，如卵巢癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，肺癌等。然而，在正常组织细胞中表达量很低甚至不表达，叶酸修饰的生物材料具有主动靶向于肿瘤组织与细胞的潜能。叶酸修饰的纳米颗粒可以通过其受体介导的细胞内吞作用的方式进入细胞。通过EDC-NHS技术将肿瘤靶向FA缀合到纳米颗粒的表面，经过FA修饰后的壳聚糖接枝聚合物在乳腺癌细胞的靶向治疗中具有良好的研究前景。

盐酸阿霉素(DOX)是肿瘤治疗的研究领域，最常用的药物模型。DOX作为一种临床上常用的抗肿瘤药物，在科学研究中经常被用于典型药物进行模拟研究。DOX的功效应用于多种疾病领域，包括肿瘤疾病，包括恶性淋巴瘤、骨及软组织肉瘤、乳腺癌、肺癌、急性白血病、头颈部肿瘤、肝癌、胃癌、食道癌等。DOX能够杀死肿瘤细胞，是由于DOX能够嵌入DNA的相邻碱基对使DNA发生错误配对，造成DNA链的裂解，从而高效阻截DNA与RNA的合成。因此，DOX属于一种周期性非特异型药物。根据其治病原理，DOX在治疗肿瘤细胞时，对于正常组织细胞也会产生较大的杀伤力。

新型药物传递系统能够实现DOX药物的可控释放，避免对正常组织造成伤害。药物可控释放，即能够在特定的肿瘤区域大量，快速地释放，而在正常组织区域不释放或者少量释放。研究中为了实现可控释放，最常用的方法是在药物外包裹聚合物，该聚合物能够在特定条件下降解或者分散，使包裹的药物泄露。而近年来，为了实现药物可控释放，研究者多关注于由敏感性造成释放，例如pH敏感性释放，氧化还原敏感性释放，温度敏感性释放等。

乳腺癌是威胁女性健康最常见的癌症之一。然而，它最常用化疗治疗，但其中使用的活性成分是全身分布的，导致许多副作用。化疗药物对癌细胞和健康细胞都有毒性，会引起不良反应(如脱发，肝肾衰竭等)在开发新的药物递送系统中，引起很多关注的方法是生产靶向递送的纳米级药物载体。这些具有高特异性，避免对正常组织的损害。已经开发出使用生物靶向配体的，例如肽，蛋白质，单克隆抗体，核酸适体和其他小分子，其结合肿瘤细胞表面上的作为特定生物标志物。这些主动靶向分子修饰纳米颗粒的表面，所述靶分子可以识别并特异性结合肿瘤细胞，增强纳米颗粒从细胞外空间转运到肿瘤细胞中的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法，克服了现有技术特异性差，靶向能力不足的缺陷，该方法操作简单、反应条件温和，壳聚糖接枝聚合物纳米颗粒粒径在200nm左右能很大程度到达乳腺癌被特定组织或细胞选择性代谢，且具有pH敏感型释放及乳腺癌靶向的特性。

本发明的一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法，包括：

(1)将叶酸FA、EDC、NHS加入到溶剂中，搅拌完全溶解，得到混合液；

(2)将步骤(1)的混合液缓慢加入到CS-g-NIPAM的水溶液中搅拌，透析，冷冻干燥，得到壳聚糖纳米粒FA-CS-g-PNIPAM；其中FA与CS-g-PNIPAM的质量比为1:1～2；

(3)将上述壳聚糖纳米粒FA-CS-g-PNIPAM溶于水中，加入阿霉素DOX，搅拌反应，透析，冷冻干燥，即得叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX；其中DOX与FA-CS-g-PNIPAM的质量比为1:2～5。

上述制备方法的优选方式如下：

所述步骤(1)中叶酸、EDC、NHS的摩尔比为1:1:1。

所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤(1)中搅拌为在室温条件下搅拌22～26h。

所述步骤(2)中CS-g-NIPAM由以下方法制备：将乙酰化壳聚糖溶于溶剂中，加入链转移剂、催化剂、脱水剂，室温搅拌，提纯，冻干，得到壳聚糖的RAFT试剂；将壳聚糖的RAFT试剂溶于溶剂中，氮气保护下，加入N-异丙基丙烯酰胺NIPAm和引发剂，油浴反应，提纯，即得。

CS-g-PNIPAM的制备具体为：壳聚糖CS溶解于1％醋酸溶液中，加入甲醇搅拌至澄清，再滴加入乙酸酐溶液，室温搅拌反应，10％NaOH析出沉淀，经过滤、烘干得到乙酰化壳聚糖，溶于二甲基甲酰胺DMF搅拌溶解，加入链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸DDACT、催化剂4-(N，N-二甲基氨基)吡啶DMAP、脱水剂二环己基碳二亚胺DCC，室温搅拌反应，经提纯、冻干得到壳聚糖的RAFT试剂溶于二甲基甲酰胺DMF中，氮气保护下，加入NIPAm和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，油浴反应，经提纯得到壳聚糖温敏嵌段共聚物CS-g-pNIPAM。

所述步骤(2)中混合液、CS-g-NIPAM的水溶液的体积比为1:1。

所述步骤(2)中搅拌为避光条件下搅拌22～26h。

所述步骤(2)中透析为采用MWCO＝3500的透析袋；冷冻干燥时间为2-4天。

本发明的一种上述方法制备的叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料。

所述复合材料的粒径为200～250nm。

本发明的一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的应用，如在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

有益效果

(1)本发明利用壳聚糖与阿霉素之间的物理吸附作用，纳米颗粒的疏水核可负载大量治疗药物(载药量11.8％)，合成含阿霉素的叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；

(2)本发明中壳聚糖接枝聚合物纳米颗粒粒径200nm左右能很大程度到达乳腺癌被特定组织或细胞选择性代谢；(低于300纳米这由于EPR效应适合于肿瘤靶向；)

(3)本发明的叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料，能够长效缓释，且具有pH敏感型输送，在较低pH值(pH＝5.0)环境下释放率可高达46％，适合肿瘤组织的微环境(肿瘤微环境是偏酸性)，具有应用其做后续相关实验分析的潜力；

(4)本发明叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料FA可以实现其对乳腺癌癌细胞的主动靶向作用，并能进一步研究其体内循行和代谢分布。

附图说明

图1中(A)为实施例3中FA-CS-g-PNIPAM/DOX在不同pH环境下的药物释放曲线；(B)为实施例4中FA-CS-g-PNIPAM/DOX在不同温度环境下的药物释放曲线；

图2为实施例1中FA-CS-g-PNIPAM的DLS结果；

图3为实施例5中不同浓度的DOX、CS-g-PNIPAM/DOX和FA-CS-g-PNIPAM/DOX对MCF-7细胞的MTT细胞毒性结果；

图4为实施例6中FA-CS-g-PNIPAM/DOX、CS-g-PNIPAM/DOX对MCF-7及HUVEC细胞的激光共聚焦显微镜结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)CS-g-PNIPAM的合成：将5g壳聚糖CS溶解于250mL 1％醋酸溶液中，搅拌使其完全溶解，缓慢加入250mL甲醇搅拌至澄清，再滴加入1mL乙酸酐溶液，室温搅拌反应3.5h，加入10％NaOH溶液析出溶液中的壳聚糖，经过滤、烘干得到乙酰化壳聚糖，研磨成细细的粉末备用。将0.298g得到的乙酰化壳聚糖溶于5mLDMF中搅拌溶解，加入0.370gDDACT、0.015gDMAP、0.205gDCC，室温搅拌反应48h，倒入冰水，冰水浴过夜，用MWCO＝3500的透析袋透析三天，然后冻干得到壳聚糖的RAFT试剂。将0.047g得到的壳聚糖RAFT试剂溶于5mLDMF中，在氮气氛下磁力搅拌4.5h使其完全溶解，加入0.0016gAIBN作为引发剂、0.5gNIPAm氮气保护下60℃油浴反应24h，加入50ml乙醚沉淀3次，纯化后得到壳聚糖温敏嵌段共聚物CS-g-NIPAM。

(2)按1:1:1的摩尔比将叶酸、EDC和NHS加入到30ml DMSO中，在室温条件下搅拌，直至溶质完全溶解得到的混合溶液缓慢加入到30ml含有30mg CS-g-PNIPAM的水溶液中，在室温下避光条件搅拌24h，透析袋透析冻干。

(3)将25mg FA-CS-g-PNIPAM溶于5ml水中，加入5mg阿霉素DOX，搅拌反应24h，透析除去未连接上的DOX，冷冻干燥3天，得到叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX。药物负载量为11.8％

本实施例中CS、N-acetyl、CS-RAFT、CS-g-PNIPAM、FA-CS-g-PNIPAM的Zeta电位如表1所示。

表1实施例1中各部分化合物的Zeta电位值

本实施例中FA-CS-g-PNIPAM的DLS结果如图2所示，可知纳米颗粒粒径约为200nm。

实施例2

(1)CS-g-PNIPAM的合成：将5g壳聚糖CS溶解于250mL 1％醋酸溶液中，搅拌使其完全溶解，缓慢加入250mL甲醇搅拌至澄清，再滴加入1mL乙酸酐溶液，室温搅拌反应3.5h，加入10％NaOH溶液析出溶液中的壳聚糖，经过滤、烘干得到乙酰化壳聚糖，研磨成细细的粉末备用。将0.298g得到的乙酰化壳聚糖溶于5mLDMF中搅拌溶解，加入0.370gDDACT、0.015gDMAP、0.205gDCC，室温搅拌反应48h，倒入冰水，冰水浴过夜，用MWCO＝3500的透析袋透析三天，然后冻干得到壳聚糖的RAFT试剂。将0.047g得到的壳聚糖RAFT试剂溶于5mLDMF中，在氮气氛下磁力搅拌4.5h使其完全溶解，加入0.0032gAIBN作为引发剂、1gNIPAm氮气保护下60℃油浴反应24h，加入50ml乙醚沉淀3次，纯化后得到壳聚糖温敏嵌段共聚物CS-g-NIPAM。

(2)按照1:1:1的摩尔比，将叶酸、EDC和NHS加入到30ml无水DMSO中，在室温条件下搅拌，直至溶质完全溶解，得到混合溶液。将上述混合溶液缓慢加入到含有15mgCS-g-PNIPAM水溶液中，在室温、避光条件下搅拌16h，得到FA-CS-g-PNIPAM水溶液,透析冻干。

(2)将30mg FA-CS-g-PNIPAM溶于5ml水中，加入10mg阿霉素DOX，搅拌反应24h，透析除去未连接上的DOX，冷冻干燥3天，得到叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX。药物负载量为11.8％

实施例3

对实施例1制得的载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX在不同pH条件下进行药物释放试验：

称取2mg载药复合物FA-CS-g-PNIPAM/DOX于纯水中充分溶解，分别放入两个透析袋(MW＝3500)中，并放置在溶出仪，分别补加20ml的PBS溶液(pH＝7.4)及醋酸溶液(pH＝5.0)，溶出仪温度设为37℃，转速90转/分，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取出1ml透析液，并回补1ml相应的PBS缓冲溶液和醋酸缓冲溶液。对收集的透析液进行紫外检测，吸收波长设为480nm，收集数据并计算药物释放情况。

DOX在两种pH环境下的释放曲线如图1A所示，可知在72h后，DOX在pH＝5.0的醋酸缓释液中约释放46％；而在pH＝7.4的PBS环境中仅释放26％，两者释放存在显著差异。由于肿瘤组织较正常组织细胞相比其pH要低，故该载药复合材料的释放正好符合这一特性，表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的pH敏感型材料。

实施例4

对实施例2制得的载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX在不同温度条件下进行药物释放试验：

称取2mg载药复合物FA-CS-g-PNIPAM/DOX于纯水中充分溶解，分别放入两个透析袋(MW＝3500)中，并放置在溶出仪，补加20ml的PBS溶液(pH＝7.4)，溶出仪温度设为37℃和25℃，转速90转/分，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取出1ml透析液，并回补1ml相应的PBS缓冲溶液。对收集的透析液进行紫外检测，吸收波长设为480nm，收集数据并计算药物释放情况。

DOX在两种温度环境下的释放曲线如图1B所示，可知在72h后，DOX在37℃的缓释液中约释放26％。而在25℃环境中仅释放20％，两者释放存在显著差异。由于肿瘤组织较正常组织细胞相比其温度大约高于正常细胞组织0.5℃以上，故该载药符合材料的释放正好符合这一特性，表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的温度敏感型材料。

实施例5

对本发明制得(实施例1)的载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX进行细胞毒性试验：

在96孔细胞培养板中种入MCF-7细胞，每孔细胞密度大约为10,000个，并补足每孔200μL的培养液，在5％CO₂，的条件下于培养箱中培养24h。第二天倒掉旧培养基，加入含有不同浓度的DOX、CS-g-PNIPAM/DOX和FA-CS-g-PNIPAM/DOX的20μL的PBS溶液，并补足180μL新鲜培养基，使每孔总体积仍为200μL。孵育24h后，每孔加20μL的0.5％的MTT溶液，置37℃恒温箱中静止4h，吸去孔内培养液，并添加200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪570nm处各孔的紫外吸收值。

载药复合物及纯药DOX对MCF-7细胞的MTT细胞毒性结果如图3所示，可知FA-CS-g-PNIPAM/DOX中DOX浓度在0.5-4μM的情况下均对MCF-7细胞产生了较大的毒性，进一步验证复合载药材料对细胞的杀伤作用仅与其中的DOX有关，同时对药物载体FA-CS-g-PNIPAM进行了MTT检测，与载药复合物中FA-CS-g-PNIPAM浓度相同的载体材料均不产生细胞毒性，也验证了载药复合物对细胞的杀伤仅与其中的DOX有关。

实施例6

对本发明制得(实施例1)的载药复合材料FA-CS-g-PNIPAM/DOX进行靶向性验证试验：

在24孔细胞培养板中放入盖玻片，并种入MCF-7细胞，每孔细胞密度大约为30,000个，并补足每孔1mL的培养液，在5％CO₂，的条件下于培养箱中培养24h。第二天倒掉旧培养基，加入含5μM DOX的FA-CS-g-PNIPAM/DOX的100μL的PBS溶液，并补足900μL新鲜培养基，孵育2h。吸去含材料的培养液，并用PBS冲洗，加1ml 2.5％的戊二醛固定15min。吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加1ml DAPI染色15min。吸去DAPI，并用PBS冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。为了对材料靶向性进行检测，选取非靶向细胞HUVEC细胞，操作过程与MCF-7相同。

CS-g-PNIPAM/DOX、FA-CS-g-PNIPAM/DOX对HUVEC及MCF-7细胞的激光共聚焦显微镜结果如图4所示，可以发现，经过材料孵化后的MCF-7细胞的FITC荧光强度均比HUVEC细胞高，说明材料对乳腺癌癌细胞均有一定的靶向性。

Claims

1.一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的制备方法，包括：

(1)将叶酸FA、EDC、NHS加入到溶剂中，搅拌，得到混合液；

(2)将步骤(1)的混合液加入到CS-g-NIPAM的水溶液中搅拌，透析，冷冻干燥，得到壳聚糖纳米粒FA-CS-g-PNIPAM；其中FA与CS-g-PNIPAM的质量比为1:1～2；

(3)将上述壳聚糖纳米粒FA-CS-g-PNIPAM溶于水中，加入阿霉素DOX，搅拌反应，透析，冷冻干燥，即得叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料；其中DOX与FA-CS-g-PNIPAM的质量比为1:2～5。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中叶酸、EDC、NHS的摩尔比为1:1:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌为在室温条件下搅拌22～26h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中CS-g-NIPAM由以下方法制备：将乙酰化壳聚糖溶于溶剂中，加入链转移剂、催化剂、脱水剂，室温搅拌，提纯，冻干，得到壳聚糖的RAFT试剂；将壳聚糖的RAFT试剂溶于溶剂中，氮气保护下，加入N-异丙基丙烯酰胺NIPAm和引发剂，油浴反应，提纯，即得。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌为避光条件下搅拌22～26h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中透析为采用MWCO＝3500的透析袋；冷冻干燥时间为2-4天。

8.一种权利要求1所述方法制备的叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料。

9.根据权利要求8所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料的粒径200～250nm。

10.一种叶酸修饰的壳聚糖纳米载药复合材料的应用。