CN111789964A - 具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 - Google Patents
具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111789964A CN111789964A CN202010887652.7A CN202010887652A CN111789964A CN 111789964 A CN111789964 A CN 111789964A CN 202010887652 A CN202010887652 A CN 202010887652A CN 111789964 A CN111789964 A CN 111789964A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- selenium
- formula
- micelle
- compound
- dmsesaha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
- A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/337—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing other elements
Abstract
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用。
背景技术
癌症治疗已经从传统的化疗药物转向更加机械化的靶向治疗,组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)平衡的紊乱会引起细胞形态、周期和分化的异常,从而导致癌症的发生;其中,HDAC在上述关系中起重要作用,故成为癌症靶向治疗的靶标。
目前HDAC抑制剂在临床前实验中对多种肿瘤都有作用,但其目前的临床适应症还是局限在血液肿瘤的治疗上,虽然有很多针对实体瘤的临床研究在开展中,但目前还无定论,在已进行的针对难治性乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌和甲状腺癌临床试验中,结果并不完全令人满意。另外,目前HDAC抑制剂还存在毒副作用的问题,例如第二代HDAC抑制剂伏立诺他(SAHA)存在严重的心脏毒性。
近年来,快速发展的纳米药物技术极大程度改善了传统化疗药物在肿瘤治疗中的效果,采用纳米药物载体递送化疗药物,不仅可以利用主/被动靶向策略将药物高浓度的富集在肿瘤组织内部,而且还可以根据肿瘤组织的微环境进行药物的控制释放,从而降低药物对于正常组织的损害。这其中,设计具有还原响应药物释放能力的聚合物前药胶束是该领域的研究热点,目前已有大量的研究报道证明在聚合物结构以及前药设计中引入二硫键可以有效的实现这一目的,S-S键在还原环境下会发生断裂,并且在超声或紫外条件下会发生交换,与硫元素在同一主族的硒元素所形成的Se-Se键在可见光下即可发生交换,并且比S-S键的还原断裂速率更快,使其在肿瘤环境中可以更快的裂解并释放,因此,运用Se-Se键作为载体被越来越广泛地研究。然而,目前同类研究中日趋繁琐的结构设计也带来了合成工艺上的复杂性和不可重现性,限制了该技术批量化生产应用;因此结构简单、易实现且效果好的HDAC抑制剂体系还需要进一步研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足,本发明提供了一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用,以SAHA为模型,首先合成了一种含有二硒键的SAHA衍生物,之后在上述衍生物的两端连接上亲水片段,将其制备成纳米胶束,使得药物在体内的稳定,显著提高了HDAC抑制效果,且方法简便,绿色环保,具有批量生产的潜力。
本发明的第一个目的是提供一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束,应用如下硒类前药聚合物制备而成,所述硒类前药聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构:
所述硒类聚合物前药胶束在还原环境中裂解生成式(Ⅱ)化合物:
上述硒类聚合物前药胶束可在肿瘤细胞微环境中裂解生成上述式(Ⅱ)化合物,该化合物具有HDAC抑制活性,将活性分子以胶束形成递送至肿瘤部位,实现了根据肿瘤组织的微环境进行药物的控制释放,提高了治疗效果的同时,也降低了药物对于正常组织的损害。
本发明的第二个目的是提供上述具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,包括以下步骤:
S1、保护气体氛围下,以7-溴庚酸乙酯和过硒化钠为原料,合成式(Ⅲ)化合物;
S2、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下脱酯生成式(Ⅳ)化合物;
S3、保护气体氛围下,将式(Ⅳ)化合物、3-氨基苄醇、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)溶于溶剂,0℃加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA),通过缩合反应生成式(Ⅴ)化合物;
S4、将式(Ⅴ)化合物和羰基二咪唑反应制得式(Ⅵ)化合物;
S5、保护气体氛围下,式(Ⅵ)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG2000-NH2,Mw=2.0KDa)反应,取代制得式(Ⅰ)所示的硒类前药聚合物;将式(Ⅰ)所示的硒类前药聚合物在水溶液中自组装,制得硒类聚合物前药胶束;
其合成路线如下:
优选地,S1中,溶剂为四氢呋喃;反应温度为25-65℃,反应时间为4-12h;7-溴庚酸乙酯和过硒化钠的摩尔比为2-3:1。
优选地,S2中,溶剂为二恶烷;碱性条件为0℃加入氢氧化钠;反应温度为25~50℃,反应时间为2-12h;式(Ⅲ)化合物和氢氧化钠的摩尔比为1:2-6。
优选地,S3中,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;反应温度为25-50℃;
式(Ⅳ)化合物:3-氨基苄醇:HATU的摩尔比为1:2-4:2-4,式(Ⅳ)化合物:HOAT:DIEA的摩尔比为1:2-4:2-4。
优选地,S4中,溶剂为四氢呋喃;反应温度为25-65℃,反应时间为4-12h;
所述式(Ⅴ)化合物和羰基二咪唑的摩尔比为1:3-6。
优选地,S5中,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺,反应温度为25-50℃,反应时间为4-12h;
式(Ⅵ)化合物和mPEG2000-NH2的摩尔比为1:2-4。
本发明的第三个目的是提供上述具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用;所述肿瘤细胞为人肺腺癌细胞(A549细胞)、宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人恶性黑色素瘤细胞(A375细胞)。
本发明的第五个目的是提供上述具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束在制备放射治疗增敏剂中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明以现有HDAC抑制剂SAHA为模型,合成了一种含有二硒键的SAHA衍生物,并在上述小分子的基础上将两端连接上亲水片段,将其做成纳米胶束,上述胶束分子结构简单,且作为药物在体内稳定性较好;
(2)本发明硒类聚合物前药胶束能够抑制组蛋白去乙酰化酶,且对A549细胞、HeLa细胞和A375细胞具有很好的抑制效果,在乏氧条件下效果更好,以此对应了肿瘤细胞的乏氧环境,并且在放射增敏治疗上有较好的效果,具有很好的应用前景;原因在于,本发明合成了二硒键聚合物,硒元素与硫元素同处化学周期表的第四周期VI A族,但是与硫原子物理化学性质有明显的差异,硒的原子半径比硫的大,电负性比硫的小,使硒参与的化学键键能比硫参与的化学键键能小,能够对微环境的轻微变化都做出快速的响应,实现了根据肿瘤组织的微环境进行药物的控制释放,提高了治疗效果的同时,也降低了药物对于正常组织的损害;
(3)本发明制备的具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的硒类聚合物前药胶束拓宽了HDAC抑制剂在实体瘤方面的应用,且制备方法快速简便,绿色环保,具有批量生产的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制得的7,7’-二硒二庚酸乙酯核磁图1H NMR;
图2为实施例1制得的7,7’-二硒二庚酸核磁图1H NMR;
图3为实施例1制得的DmSeSAHA核磁图1H NMR;
图4为实施例1制得的CDI-DmSeSAHA核磁图1H NMR;
图5为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA核磁图1H NMR;
图6为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的临界胶束浓度;
图7为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的表征粒径图;
图8为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的电镜图;
图9为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束在室温避光闭氧及室温不避光不避氧条件下的稳定性;
图10实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束包载尼罗红后在还原GSH条件下尼罗红的荧光变化;
图11为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束对乙酰化组蛋白H3及β-actin蛋白含量的影响Westernblot图;
图12为实施例1制得的DmSeSAHA和(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的细胞毒性实验对比图,其中,A为乏氧条件;B为正常条件;
图13为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合放射治疗抑制细胞克隆形成的实验,其中,A为细胞克隆形成随γ射线剂量变化对比图;B为细胞克隆形成随γ射线剂量变化曲线;
图14为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合放射治疗对DNA损伤程度评价的彗星电泳实验,其中,A为彗星电泳荧光拍摄图及单个片段放大图;B为DNA破碎片段对比图;
图15为实施例1制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合放射治疗体内抑瘤效果评价,其中,A为体内肿瘤解剖对比图,B为时间对肿瘤体积的变化曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,均属于本发明的范围。除非另有定义,下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明,本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
本发明提供了一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束,应用如下硒类聚合物制备而成,所述硒类聚合物具有式(Ⅰ)所示的结构:
所述硒类聚合物前药胶束在还原环境中裂解生成式(Ⅱ)化合物:
式(Ⅱ)化合物具有HDAC抑制活性,将活性分子以胶束形成递送至肿瘤部位,实现了根据肿瘤组织的微环境进行药物的控制释放,提高了治疗效果的同时,也降低了药物对于正常组织的损害。
上述具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,包括以下步骤:
S1、在保护气体氛围下,以7-溴庚酸乙酯和过硒化钠为原料,合成式(Ⅲ)化合物;
S2、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下脱酯生成式(Ⅳ)化合物;
S3、保护气体氛围下,将式(Ⅳ)化合物、3-氨基苄醇、HOAT、HATU溶于溶剂,0℃加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA),通过缩合反应生成式(Ⅴ)化合物;
S4、将式(Ⅴ)化合物和羰基二咪唑反应制得式(Ⅵ)化合物;
S5、在保护气体氛围下,式(Ⅵ)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG2000-NH2,Mw=2.0KDa)反应,取代制得式(Ⅰ)硒类聚合物;将式(Ⅰ)硒类聚合物在水溶液中自组装,制得硒类聚合物前药胶束;
其合成路线如下:
下面通过实施例来具体说明上述硒类聚合物前药胶束及其制备方法。
实施例1
一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,包括以下步骤:
1)由7-溴庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸乙酯;
化合物7-溴庚酸乙酯(2.42g,13.87mmol)加入反应瓶中,氮气保护下加入四氢呋喃(15mL),同时加入过硒化钠(6.94mmol);40℃反应8h,恢复到室温,旋干四氢呋喃,水相用乙酸乙酯(30mL×3)萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥,抽滤,旋干溶剂,得到了到浅黄色油状物1.68g,产率:74%;图1给出了所得7,7’-二硒二庚酸乙酯核磁图1H NMR;
2)由7,7’-二硒二庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸;
化合物7,7’-二硒二庚酸乙酯(4.00g,8.80mmol)溶于二恶烷(15mL),0℃下加入3MNaOH 15mL,升温至25℃下反应12h,反应液用10mL二氯甲烷萃取,分液,水相用1M的HCl调节pH至3,并用EA(10mL×3)萃取三次,用Na2SO4干燥,抽滤,旋干溶剂,得到产物3.40g,收率:90%;图2给出了所得7,7’-二硒二庚酸核磁图1H NMR;
3)由7,7’-二硒二庚酸制备7,7'-二硒(N-(3-(羟甲基)苯基)庚酰胺)(DmSeSAHA);
氮气保护下,化合物7,7’-二硒二庚酸(200mg,0.48mmol)、3-氨基苄醇(147.6mg,1.20mmol)、HATU(365.02mg,0.96mmol),HOAT(130.67mg,0.96mmol)溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(5ml),加入DIEA(124.08mg,0.96mmol),在35℃下反应过夜,体系中加入乙酸乙酯(20mL),饱和食盐水(20mL×2)洗涤两次,无水硫酸钠干燥有机相,旋干乙酸乙酯得到了淡黄色固体280mg,产率:93%;图3给出了所得DmSeSAHA核磁图1H NMR;
4)由DmSeSAHA制备((7,7'-二硒双(庚酰基))双(氮杂二基))双(3,1-亚苯基))双(亚甲基)双(1H-咪唑-1-羧酸酯)(CDI-DmSeSAHA);
化合物DmSeSAHA(300mg,0.478mmol)溶于干燥的四氢呋喃(6mL),加入羰基二咪唑(232.76mg,1.44mmol)反应液40℃下反应8h,分批加入乙酸乙酯(10mL)和饱和食盐水(10mL×2)洗涤两次,分液,无水硫酸钠干燥有机相,抽滤,旋干,得到了黄色粘稠油状物300mg,产率:77%,图4给出CDI-DmSeSAHA核磁图1H NMR。
5)CDI-DmSeSAHA经过PEG化后制备硒类聚合物前药((mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA)胶束;
氮气保护下,CDI-DmSeSAHA(30mg,0.0365mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL),加入mPEG2000-NH2(Mw=2.0KDa,0.0767mmol,153.3mg)的N,N-二甲基甲酰胺(3mL),35℃下反应12h,反应液转入分子量截留为1Kda的透析袋中透析24h,冻干,得到了白色蓬松固体148mg,产率:86%,图5给出了所得(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA核磁图1H NMR,将该固体溶解于四氢呋喃,剧烈搅拌下将其快速加到超纯水中,并转移至分子量截留为3.5KDa的透析袋中透析,制成(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束。
实施例2
一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,包括以下步骤:
1)由7-溴庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸乙酯,步骤同实施例1,不同之处在于,25℃反应12h,7-溴庚酸乙酯和过硒化钠的摩尔比为3:1;
2)由7,7’-二硒二庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸,步骤同实施例1,不同之处在于,反应时间为2h,7,7’-二硒二庚酸乙酯和氢氧化钠的摩尔比为1:2;
3)由7,7’-二硒二庚酸制备DmSeSAHA,步骤同实施例1,不同之处在于,反应温度为25℃,7,7’-二硒二庚酸:3-氨基苄醇:HATU:HOAT:DIEA的摩尔比为1:4:4:4:4;
4)由DmSeSAHA制备CDI-DmSeSAHA,步骤同实施例1,不同之处在于,25℃反应12h,DmSeSAHA和羰基二咪唑的摩尔比为1:6;
5)CDI-DmSeSAHA经过PEG化后制备(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束,步骤同实施例1,不同之处在于,反应温度为25℃,CDI-DmSeSAHA和mPEG2000-NH2的摩尔比为1:4。
实施例3
一种具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,包括以下步骤:
1)由7-溴庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸乙酯,步骤同实施例1,不同之处在于,65℃反应4h;
2)由7,7’-二硒二庚酸乙酯制备7,7’-二硒二庚酸,步骤同实施例1,不同之处在于,反应温度为50℃,7,7’-二硒二庚酸乙酯和氢氧化钠的摩尔比为1:6;
3)由7,7’-二硒二庚酸制备DmSeSAHA,步骤同实施例1,不同之处在于,反应温度为50℃;
4)由DmSeSAHA制备CDI-DmSeSAHA,步骤同实施例1,不同之处在于,65℃反应4h;
5)CDI-DmSeSAHA经过PEG化后制备(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束,步骤同实施例1,不同之处在于,反应温度为50℃。
实施例1~3制得的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束性能近似,下面仅以实施例1为例,说明其性能及应用。
(1)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的临界胶束浓度(CMC)测定
将(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA配成质量浓度为0.05、0.75、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100、250、500μg/mL的包载尼罗红(2μg/mL)的水溶液,利用荧光分光光度计,检测其散射信号强度,并对每个浓度下散射强度作散点图拟合曲线,寻找突变点即为临界胶束浓度。
结果分析:从图6可以看出聚合物(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA组装成的胶束的临界胶束浓度(CMC)从两条曲线的交点可以算出为21.53μg/mL;在亲疏水6:1时能形成组装体,这说明二硒键之间存在超强的组装力。
(2)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的理化性质表征
胶束溶液1.5mg/mL置于测试皿中,25℃温度下,测定粒径和电位分布,从图7可以看出聚合物(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA组装成的胶束利用马尔文粒径仪测定(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA的粒径和电位分布,结果如表1所示,粒径为123.5±0.32nm。
表1实施例1中(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的理化性质表征
(3)负染法用冷冻透射电镜观察(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的形态
胶束浓度为1.5mg/mL,取胶束溶液10μL,滴于铜网上,再用醋酸双氧铀进行染色,室温保存,利用透射电子显微镜(TEM)观察(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束形态及尺寸,结果如图8所示,可见胶束为球形,粒径与表1及图7所测一致。
(4)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束在有氧及无氧条件下的稳定性
利用马尔文粒径仪测定(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的稳定性,具体为:胶束置于在室温有氧避光和室温无氧避光环境中,在24h,48h,72h,96h时测定粒径分布及大小。结果如图9所示,从图9可以看出在有氧的环境下,胶束的粒径会随时间而增大,较不稳定,而在无氧环境下胶束可以储存较长时间。
(5)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束包载尼罗红(NR)的实验
将尼罗红(1mg/mL)溶解在0.02mL四氢呋喃中并且加入到1mL四氢呋喃溶解的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA(20mg/mL),预混合两种溶液30min,缓慢滴加入15mL超纯水中(氮气保护),搅拌15min后,用超纯水进行透析,透析袋孔径在7KDa MWCO,透析完成后冻干用二甲基2mL DMSO溶解,用荧光分光光度计测定尼罗红的包载量(激发光:580nm,发射光:634nm)。该实验全程避光,实验结果如表2所示。
尼罗红的包载率(LC)和包封率(EE)计算公式如下
公式中WNR表示总的NR质量,WfreeNR表示未包载入胶束的NR质量,WloadedNR表示包载入胶束的NR质量,Wpolymer表示空胶束的质量。
表2实施例1中(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA@NR胶束的理化性质表征
(6)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA@NR胶束在还原响应下释放尼罗红实验
由于肿瘤微环境具有还原特性,因此为了评价(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束被还原触发的分解行为,我们对胶束在不同体系(肿瘤和正常细胞)和不同GSH浓度(0.1mM和10mM)环境下释放NR(1mL,0.1mg·mL-1)的行为进行了研究,将包载好NR的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA@NR胶束溶液浓缩至2mg/mL,分为4份,每份10mL,分别加入0.1mM GSH,10mM GSH及一个空白对照组,分别在不同时刻取2mL胶束溶液进行荧光测定。
结果分析:从图10中可以看出,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束在10mM GSH条件下可以快速释放出NR,说明还原条件可以使Se-Se键发生断裂,从而导致胶束发生解离。对比两条曲线发现,胶束溶液在10mM GSH环境下30min内即可发生Se-Se键的断裂从而释放NR,48h时释放量可达到80%以上;而在0.1mM GSH环境下,虽然尼罗红也有一定程度的释放,但速度要明显弱于肿瘤环境。
(7)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的Westernblot实验
以乙酰化组蛋白H3蛋白为目标蛋白,采用Westernblot法检测胶束使H3蛋白增加程度,来表征胶束对HDAC的抑制能力,在96孔板上接种Hela细胞,加入不同浓度和不同分子量的胶束溶液,以不同浓度的DmSeSAHA为阳性对照,按照Westernblot实验标准流程进行实验,数据处理得到实验结果。
结果分析:由图11可得,聚合物前药胶束可使乙酰化的H3蛋白量有明显的增加,并且有一定的浓度依赖关系,说明(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束具有HDAC抑制活性;这是因为聚合物前药胶束在肿瘤环境中裂解生成下式活性分子,从而抑制HDAC:
(8)SAHA、DmSeSAHA、(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的细胞毒性实验对比
根据细胞的生长选择生长状态良好的细胞分别将A549,A375,MDA-MB-231,HepG2,HCT-116和HeLa细胞(上述细胞均购自上海盖宁生物科技有限公司)接种在96孔板中,密度为5000个/孔,培养液体积为90μL。放入含5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养24h,用DMSO将SAHA,DmSeSAHA配成1mM的溶液,再用培养基将溶液稀释至不同浓度;(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束溶液将其制备成无菌胶束,并冻干测定浓度,再用培养基稀释至不同浓度,以每孔10μL的量加入到6个孔板中,先放在特定细胞培养器(Billups Rothenberg)中,培养器中条件是5%CO2,1%O2,在N2环境下10分钟,封闭96孔板,再放入含5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养72h。在避光环境中,将MTT溶液以每孔10μL的量加入到96孔板中,再放入培养箱中继续培养4h。将孔板中的上清液吸走,加入一定量的DMSO,轻轻振荡使生成的结晶完全溶解。在570nm的波长下,用酶联免疫监测仪测量并记录每个孔的吸光度。通过得到的吸光度计算A549,A375,MDA-MB-231,HepG2,HCT 116和HeLa细胞的细胞抑制率。
细胞的存活率使用以下的公式进行计算:
公式中N1表示样品的吸光值,N2表示control的吸光值。
结果分析:从图12中可以看出,单体DmSeSAHA在正常条件和乏氧条件下的细胞毒性普遍高于上市抗癌药物伏立诺他(SAHA),在HepG2和HCT-116细胞中(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA(对应图中的(mPEG2k)2-DmSeSAHA)胶束的细胞毒性明显高于单体DmSeSAHA,并且DmSeSAHA单体和(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束对于有氧和乏氧的细胞环境具有一定的选择性,在乏氧环境下细胞毒性普遍大于正常环境,这也与肿瘤细胞的乏氧环境相对应;在乏氧环境下,可以看出在A549,HeLa和A375中,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的细胞毒性明显高于单体DmSeSAHA。
(9)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合放射治疗抑制克隆形成实验
取对数生长期的A549细胞,以1000个/孔的密度接种于六孔板中,摇匀使细胞单个分散开,置于CO2培养箱(37℃,5%CO2)中培养24h,弃去原有培养液,加入含有1μM SAHA或0.5μM(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的1640培养基,药物作用24h后,将含药培养液更换成新鲜培养液,然后进行γ射线照射,照射剂量分别为2Gy、4Gy、6Gy和8Gy,照射后继续在培养箱中培养,直至观察到肉眼可见的克隆团(镜下观察单个克隆团超过50个细胞,一般再培养7-9天),终止培养,弃去原培养液,用PBS洗两遍后加入300μL 0.25%结晶紫乙醇溶液,室温染色30min后,弃去染色液,置于干燥通风处晾干晾干后,使用凝胶成像仪曝光克隆板,然后肉眼统计克隆数,计算克隆形成率。
结果分析:细胞克隆数形成越少,说明药物抗癌作用越强。从图13中可以看出,IR照射联合(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA(对应图13中的(mPEG2k)2-DmSeSAHA)胶束比单纯IR照射,IR照射与SAHA联合效果好很多,在存活曲线B图中可以看出,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA在4Gy照射下与单纯的IR照射的8Gy效果相同,与SAHA在6Gy时相同,说明(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束对于放射治疗增敏有很好的效果。
(10)(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合放射治疗乏氧彗星电泳实验
取常氧培养的A549细胞,待其生长至对数生长期,以20万/孔的密度接种于六孔板中,待其贴壁后转移至乏氧装置中再培养24h,弃去原有培养液,加入含有1μM SAHA或0.5μM(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束的1640培养基,置于乏氧装置中药物作用24h后,取出细胞进行γ射线照射,照射剂量为8Gy。随后收集细胞进行彗星电泳实验测定DNA断裂片段及尾部长度,长度越长,说明DNA损伤程度越大。
结果分析:从图14中可以看出,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合IR的治疗效果比SAHA联合IR、单纯IR治疗要好,断裂的DNA片段更多,说明(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束具有一定的放射治疗增敏作用,且比小分子上市药SAHA要好。
(11)SAHA、(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束及联合放射治疗体内抑瘤动物实验
将A549细胞制成2×106个/mL密度的细胞悬液,取200μL对Balb/c裸鼠进行皮下接种,构建裸鼠皮下肿瘤模型,待肿瘤体积达到100mm3时,将裸鼠划分为6组:
①PBS组,②单纯照射(IR)组,③SAHA组,④(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束组,⑤照射联合SAHA组(IR+SAHA),⑥照射联合(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束组(IR+(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA),每组5只,SAHA和(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束分别以30mg/kg和265mg/kg尾静脉注射入裸鼠体内,给药后6h以3Gy的剂量进行射线照射,第1、3、6天给药,共给药3次,每天用游标卡尺测量肿瘤大小,根据公式V=长×宽×宽/2计算体积大小并绘制肿瘤生长曲线,同时用天平称量裸鼠体重,绘制裸鼠体重变化曲线,待抑瘤实验结束后,解剖取出肿瘤,比较肿瘤大小并拍照。
结果分析:从图15中可以看出,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA胶束联合IR的治疗效果比SAHA联合IR、单纯IR治疗要好。SAHA,(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA和所有放射治疗组均表现出不同程度的肿瘤生长抑制作用,经IR照射的(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA组显示出最佳的抗肿瘤效果,在以265mg/kg的剂量,注射(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA后6小时进行3Gy辐射的第6天,肿瘤的生长受到了极大的抑制,其效果比SAHA与IR协同治疗要高两倍左右。图15(A)显示了在治疗结束时(第13天)从不同组的小鼠获得的肿瘤图,这与图15(B)中的肿瘤抑制数据一致,并且表明(mPEG2000-NH2)2-DmSeSAHA可以显著增强放射敏感性。
综上所述,本发明制得的硒类聚合物前药胶束可以作为药物,相比较于小分子药物在体内的稳定性更高,可以针对肿瘤微环境响应释放药物,降低了其对正常组织的损害,且其对A549细胞、HeLa细胞和A375细胞具有很好的治疗效果,在乏氧条件下治疗效果更好,以此对应了肿瘤细胞的乏氧环境,并且在放射增敏治疗上有较好的效果,具有很好的应用前景;本发明制备具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的硒类聚合物前药胶束的方法快速简便,绿色环保,具有批量生产的潜力。
需要说明的是,本发明权利要求书中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,由于采用的步骤方法与实施例相同,为了防止赘述,本发明描述了优选实施例及其效果,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
3.根据权利要求1所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、在保护气体氛围下,以7-溴庚酸乙酯和过硒化钠为原料,合成式(Ⅲ)化合物;
S2、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下脱酯生成式(Ⅳ)化合物;
S3、保护气体氛围下,将式(Ⅳ)化合物、3-氨基苄醇、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶于溶剂,0℃加入N,N-二异丙基乙胺,通过缩合反应生成式(Ⅴ)化合物;
S4、将式(Ⅴ)化合物和羰基二咪唑反应制得式(Ⅵ)化合物;
S5、保护气体氛围下,式(Ⅵ)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚反应,取代制得式(Ⅰ)所示的硒类前药聚合物;将式(Ⅰ)所示的硒类前药聚合物在水溶液中自组装,制得硒类聚合物前药胶束;
其合成路线如下:
4.根据权利要求3所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,S1中,溶剂为四氢呋喃;反应温度为25-65℃,反应时间为4-12h;7-溴庚酸乙酯和过硒化钠的摩尔比为2-3:1。
5.根据权利要求3所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,S2中,溶剂为二恶烷;碱性条件为0℃加入氢氧化钠;反应温度为25-50℃,反应时间为2-12h;式(Ⅲ)化合物和氢氧化钠的摩尔比为1:2-6。
6.根据权利要求3所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,S3中,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;反应温度为25-50℃;
式(Ⅳ)化合物:3-氨基苄醇:2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐的摩尔比为1:2-4:2-4式(Ⅳ)化合物:1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑:N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2-4:2-4。
7.根据权利要求3所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,S4中,溶剂为四氢呋喃;反应温度为25-65℃,反应时间为4-12h;所述式(Ⅴ)化合物和羰基二咪唑的摩尔比为1:3-6。
8.根据权利要求3所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束的制备方法,其特征在于,S5中,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺,氨基聚乙二醇单甲醚的Mw=2.0KDa,反应温度为25-50℃,反应时间为4-12h;式(Ⅵ)化合物和氨基聚乙二醇单甲醚的摩尔比为1:2-4。
9.根据权利要求1所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用以及在制备放射治疗增敏剂中的应用。
10.根据权利要求1所述的具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用,所述肿瘤细胞为人肺腺癌细胞、宫颈癌细胞和人恶性黑色素瘤细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010887652.7A CN111789964B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010887652.7A CN111789964B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111789964A true CN111789964A (zh) | 2020-10-20 |
CN111789964B CN111789964B (zh) | 2022-05-27 |
Family
ID=72834457
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010887652.7A Active CN111789964B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111789964B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113230400A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-08-10 | 上海交通大学 | 一种基于表观遗传调控的金纳米团簇放疗增敏组装体及其制备和应用 |
CN113456579A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-01 | 南开大学 | 具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107641201A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-01-30 | 苏州大学 | 快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物制备方法及其应用 |
-
2020
- 2020-08-28 CN CN202010887652.7A patent/CN111789964B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107641201A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-01-30 | 苏州大学 | 快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
RAGHAVENDRA GOWDA,ET AL: "Selenium-containing histone deacetylase inhibitors for melanoma management", 《CANCER BIOLOGY & THERAPY》, vol. 13, no. 9, 31 July 2012 (2012-07-31), pages 756 - 765 * |
WEINA MA,ET AL: "Sensitizing Triple Negative Breast Cancer to Tamoxifen Chemotherapy via a Redox-Responsive Vorinostat-containing Polymeric Prodrug Nanocarrier", 《THERANOSTICS》, vol. 10, no. 6, 20 January 2020 (2020-01-20), pages 2463 - 2478 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113230400A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-08-10 | 上海交通大学 | 一种基于表观遗传调控的金纳米团簇放疗增敏组装体及其制备和应用 |
CN113456579A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-01 | 南开大学 | 具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用 |
CN113456579B (zh) * | 2021-07-12 | 2023-04-25 | 南开大学 | 具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111789964B (zh) | 2022-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ding et al. | Tumor microenvironment-responsive multifunctional peptide coated ultrasmall gold nanoparticles and their application in cancer radiotherapy | |
CN111789964B (zh) | 具有还原响应性的硒类聚合物前药胶束、制备方法和应用 | |
CN105963706B (zh) | 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用 | |
CN109880021B (zh) | 聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用 | |
JP6965248B2 (ja) | ポリマー、ポリマーの製造方法、及び薬物複合体 | |
CN111053911A (zh) | 还原响应型交联剂及其交联羟基药物分子的制备及应用 | |
CN103976956A (zh) | 一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法和应用 | |
Cheng et al. | Synthesis of biotin-modified galactosylated chitosan nanoparticles and their characteristics in vitro and in vivo | |
CN108619527B (zh) | 一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备方法 | |
CN113209106A (zh) | 一种聚乙二醇-苯硼酸修饰的树状大分子包裹铜离子/替拉扎明复合物及其制备方法和应用 | |
Sun et al. | Acid-breakable TPGS-functionalized and diallyl disulfide-crosslinked nanogels for enhanced inhibition of MCF-7/ADR solid tumours | |
CN104877092A (zh) | 含有缩醛键的双重靶向的两亲共聚物及其制备和作为抗肿瘤药物载体的应用 | |
CN107007550B (zh) | 一种氧化还原响应性两亲性共聚物及其制备方法和应用 | |
CN111944140B (zh) | 具有还原响应性的聚合物前药胶束及其制备方法和应用 | |
Li et al. | Colon-targeted bacterial hydrogel for tumor vascular normalization and improved chemotherapy | |
CN111249473B (zh) | 一种聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶递送系统及其制备方法 | |
CN114887061B (zh) | 靶向肿瘤的光热基因联合治疗纳米系统的制备方法及应用 | |
CN115969992A (zh) | 一种用于重塑肿瘤免疫微环境的苯硼酸共聚物及其应用 | |
Wang et al. | Preparation of curcumin loaded hyaluronic acid-poly (lactic-co-glycolic acid) micelles with pH response and tumor targeting | |
CN110922587B (zh) | 一种纳米药物的制备方法及其在治疗骨肉瘤中的应用 | |
CN110279856B (zh) | 一种PEG-Peptide光动力-化疗联用给药系统及其制备方法和用途 | |
CN112546236A (zh) | 一种pH敏感的双药物骨架聚合物前药及其制备方法和应用 | |
CN107778377B (zh) | 四碘甲腺乙酸修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物及制备和应用 | |
CN111467322A (zh) | Vb12靶向型西地那非纳米药物的合成方法及应用 | |
Zhang et al. | Dual-mode US/MRI nanoparticles delivering siRNA and Pt (iv) for ovarian cancer treatment |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |