CN107641201A

CN107641201A - 快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107641201A
Application number: CN201711059493.6A
Authority: CN
Inventors: 倪沛红; 孙月; 何金林; 张明祖
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN111621024B; CN107641201B; CN111621024A

Abstract

本发明公开了一种快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物制备方法及其应用。具体制备方法为首先分别制备二叠氮基封端的双硒小分子（N₃‑SeSe‑N₃）和二炔丙基封端的聚乙二醇（PA‑PEG‑PA）。利用它们结构中的叠氮基与炔基的反应，获得两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物（PA‑PEG‑alt‑SeSe‑PA）。然后，与叠氮基单封端的聚己内酯（PCL‑N₃）反应，获得具有快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物（PCL‑PEGSeSe‑PCL）。利用这种两亲性共聚物在水溶液中自组装成纳米粒子，具有良好的生物相容和生物可降解性。包载疏水性抗癌药物，可以在肿瘤细胞环境中，聚合物纳米粒子被破坏，快速释放出包载的药物，因此，在癌症治疗方面具有潜在的应用前景。

Description

快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物制备方法及其应用。

背景技术

传统的纳米药物载体往往由不可降解型聚合物制备得到，如聚丙烯酸类、聚乙烯类、聚苯乙烯类，等等。这些聚合物载体会导致进入体内后无法降解，不易被肾脏排出，最终在体内残留和累积，长此以往会给患者造成很多副作用。

迄今为止，聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等均被美国食品药物监督管理局（FDA）批准，可用于医用材料。许多基于这类聚合物的纳米药物载体已被开发应用。这类高分子材料具有良好的生物相容性及生物可降解性，在生理条件下会发生水解或酶解，形成可以被机体吸收或者能被肾脏排泄的分子。但是，它们作为纳米药物载体仍有不足，即聚合物自身降解缓慢，水解或酶解速率无法满足药物的可控释放，这可能会导致药物在肿瘤病灶部位的释放量不足，一定程度上影响治疗效果。因此，近年来，人们提出合成各种生物相容性好、可生物降解的“智能型”纳米药物载体。

与传统的纳米药物载体相比，“智能型”纳米药物载体能够在体内微环境（pH值、氧化还原、酶等）或外部（温度、光、超声波等）条件的刺激下发生解离，实现药物的控释。载体的氧化还原响应性是目前研究较多的一类。这种刺激主要源于肿瘤细胞内还原或氧化的环境，导致具有氧化还原响应性的化学键发生断裂，进而影响聚合物的亲疏水性质，最终导致载药纳米粒子解离，将药物快速释放。

现有技术中，已有一些关于含双硒键的快速氧化/还原敏感性聚合物的报道，但是，这些结构中，有限的双硒键仅链接在较长的不同聚合物嵌段之间，作为药物载体，共聚物载体在体内的快速响应和解离程度非常有限。因此，需要研发新的聚合物，在聚合物主链中以双硒键交替键合嵌段，使其形成的载药纳米粒子在肿瘤细胞的环境中具有快速快速氧化/还原响应性，从而将药物快速释放出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于聚乙二醇和聚己内酯的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物及其制备方法；本发明的共聚物中，硒作为人体内一种基本的微量元素，其在人类的身体健康方面具有不可或缺的作用，硒能清除人体内自由基，有效抑制过氧化脂质的产生，并且能够刺激人体的免疫反应，提高免疫系统的保护能力，预防疾病，更重要的是，硒与防癌有着密不可分的联系；硒在人体内主要以含硒酶和硒蛋白形式存在，本发明创造性的将设计含双硒键的嵌段共聚物，具有抗氧化的功效，能够很好的保护细胞膜免受过氧化物的损害，防止过氧化物在体内的积累，减小其对DNA的损伤，预防突变，达到预防癌变的功效；此外，硒与硫属于同一主族的元素，不过存在区别，如硒的原子半径比硫大且硒的电负性弱于硫，使得双硒键的键能（172 kJ/mol）比双硫键的键能（240 kJ/mol）要低。因此，双硒键除了能被还原，还能被氧化，甚至具有辐射响应的特性。因此，含硒化学键键能更小，化学键更加敏感，这也极大的推动了双硒键在刺激响应性药物载体领域的应用。

本发明的具体技术方案为：一种快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物，由下列化学结构式表达：

其中，m为5～15，n为4～114，x为15～45。

上述技术方案中，快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物结构中具有双硒键，双硒组分与PEG的交替共聚物为亲水段，PCL为疏水段；形成的纳米粒子在正常生理条件下具有很好的稳定性，在氧化和还原条件下，双硒键发生断裂，纳米粒子被破坏，从而快速释放出聚集在纳米粒子内部的疏水性抗癌药物。

优选的技术方案中，快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物的数均分子量为7220～98250 g/mol；其中，聚乙二醇重复链段为15～45，聚己内酯重复链段为5～15。

本发明采用结构中含有双硒和末端为丙炔基封端的聚乙二醇(PA-PAG-alt-SeSe-PA)作为基本原料，在铜盐及配体催化作用下，与叠氮基单封端的聚己内酯反应(PCL-N₃)，制备基于聚乙二醇和聚己内酯的快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物PCL-PEGSeSe-PCL。

上述快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

（1）以硒代胱胺盐酸盐、酰氯化合物、叠氮化合物为原料，反应制备叠氮基封端的双硒小分子；

（2）以聚乙二醇、氢化钾、丙炔化合物为原料，反应制备两端炔丙基封端的聚乙二醇；

（3）将步骤（1）制备的叠氮基封端的双硒小分子与步骤（2）制备的两端炔丙基封端的聚乙二醇反应，制备两端炔丙基封端的含双硒键聚乙二醇交替共聚物；

（4）将ε-己内酯聚合后与叠氮化合物反应，制备叠氮基单封端的聚己内酯；

（5）将步骤（3）制备的两端炔丙基封端的含双硒键聚乙二醇交替共聚物与步骤（4）制备的叠氮基单封端的聚己内酯反应，制备所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物。

上述技术方案中，步骤（1）中，将硒代胱胺盐酸盐与酰氯化合物的反应产物与叠氮化合物反应，制备叠氮基封端的双硒小分子；步骤（2）中，将聚乙二醇与氢化钾的反应产物与丙炔化合物反应，制备两端炔丙基封端的聚乙二醇；步骤（3）中，反应在铜盐催化剂以及催化剂配体存在下进行；步骤（4）中，在有机催化剂存在下，利用小分子醇引发ε-己内酯聚合；步骤（5）中，反应在铜盐催化剂以及催化剂配体存在下进行。步骤(1)中，酰氯化合物为氯乙酰氯，叠氮化合物为叠氮化钠；步骤(2)中，丙炔化合物为3-溴丙炔；步骤(3)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，催化剂配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；步骤(4)中催化剂选自辛酸亚锡或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；步骤(5)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，催化剂配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

上述技术方案中，步骤(1)中，反应的温度为25℃～60℃，反应的时间为12 h～40h；步骤(2)中，反应的温度为0℃～50℃，反应的时间为1 h～40 h；步骤(3)中，反应的温度为35℃～45℃，反应的时间为24 h～48 h；步骤(4)中，反应的温度为60℃～90℃，反应的时间为4 h～24 h；步骤(5)中，反应的温度为35℃～45℃，反应的时间为24 h～48 h。

步骤(1)中，以硒代胱胺盐酸盐为原料，与高活性的氯乙酰氯反应，在催化剂存在下，制备二氯封端的双硒小分子（Cl-SeSe-Cl）；进一步与叠氮化钠反应，获得叠氮基封端的双硒小分子；步骤(2)中，利用高活性的KH与聚乙二醇反应，制备氧阴离子引发剂；进一步与3-溴丙炔亲核反应，制备得到两端炔丙基封端的聚乙二醇（PA-PEG-PA）；步骤(3)中，在铜盐催化剂和配体的存在下，利用叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）与两端炔丙基封端的聚乙二醇（PA-PEG-PA）反应，得到两端炔基封端的含双硒的聚乙二醇交替共聚物(PA-PAG-alt-SeSe-PA)；步骤(4)中，以2-溴乙醇为引发剂，Sn(Oct)₂为催化剂，使用开环聚合引发ε-己内酯（ε-CL）聚合，制备单溴基封端的聚己内酯（PCL-Br）；进一步采用叠氮化钠对PCL-Br的端基进行修饰，制备得到叠氮基单封端的聚己内酯（PCL-N₃）；步骤(5)中，在铜盐催化剂和配体的存在下，两端炔基封端的含双硒键聚乙二醇交替共聚物与叠氮基单封端的聚己内酯反应，获得快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物。步骤(1)中，硒代胱胺盐酸盐与氯乙酰氯的摩尔比为1：(2～10)；二氯封端的双硒小分子（Cl-SeSe-Cl）与叠氮化钠的摩尔比为1：(2～10)；步骤(2)中，聚乙二醇与氢化钾和3-溴丙炔的摩尔比为1：(2～6)：(2～10)；步骤(3)中，叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）与两端炔丙基封端的聚乙二醇和铜盐催化剂的摩尔比为1∶(1.05～1.3)∶（0.5～1.5）；铜盐催化剂和配体的摩尔比为1∶(1～2)；步骤(4)中，2-溴乙醇与ε-己内酯的摩尔比1：(15～45)；步骤(5)中，两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物与叠氮基单封端的聚己内酯的摩尔比1：(2～4)。

本发明还公开了上述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物在制备纳米药物中的应用；或者上述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物作为纳米药物载体的应用。

本发明还公开了一种快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子及其制备方法，包括下列步骤：

（5）将步骤（3）制备的两端炔丙基封端的含双硒键聚乙二醇交替共聚物与步骤（4）制备的叠氮基单封端的聚己内酯反应，制备快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物；

（6）将步骤（5）制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物经过自组装、透析，制备快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物纳米粒子。比如将快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物在水溶液中自组装，形成纳米粒子；利用良溶剂透析法制备快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物纳米粒子。

本发明还公开了上述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子在制备纳米药物中的应用；或者作为纳米药物载体的应用。

本发明还公开了一种快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系及其制备方法，包括以下步骤：

（6）将步骤（5）制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物与抗癌药物混合后经过自组装、透析，制备快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系。比如将快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物与抗癌药物混合，利用良溶剂溶解、在水相透析，制备具有快速氧化/还原双重刺激响应性的抗癌纳米载药体系。

本发明还公开了上述快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系在制备抗癌药物中的应用，尤其在制备刺激响应性抗癌纳米载药体系中的应用。

本发明中，抗癌药物选自阿霉素、紫杉醇、喜树碱、姜黄素中的一种。

具体的，本发明可举例采用如下方案：

(1) 以硒代胱胺盐酸盐和氯代乙酰氯为原料，二氯甲烷为溶剂，以三乙胺、吡啶或乙二胺为缚酸剂，通过酰氨化反应，合成二氯封端的双硒小分子；进一步与叠氮化钠反应，制备二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）；

其中，硒代胱胺盐酸盐和氯代乙酰氯的摩尔比为1：(2～10)；

所述二氯封端的双硒小分子的化学结构式为：

所述二叠氮基封端的双硒小分子的化学结构式为：

(2) 以聚乙二醇为原料，以四氢呋喃为溶剂，在无水无氧条件下，通过末端羟基与氢化钾（KH）反应，形成氧阴离子；进一步与3-溴丙炔反应，制备二炔基封端的聚乙二醇(PA-PEG-PA)；

其中，聚乙二醇与氢化钾和3-溴丙炔反应的摩尔比为1：(2～6)：(2～10)；

所述氧阴离子的化学结构式为：

所述二炔丙基封端的聚乙二醇的化学结构式为：

上述n为4～114；

(3) 惰性气体气氛条件下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以炔丙基封端的聚乙二醇和二叠氮基封端的双硒小分子为原料，以N,N,N,N,N-五甲基二乙基三胺为配体，以N,N,-二甲基甲酰胺为溶剂，通过反应，制备两端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物(PA-PAG-alt-SeSe-PA)；

其中，炔丙基封端的聚乙二醇、二叠氮基封端的双硒小分子和铜盐催化剂的摩尔比为1：(1.05～1.3)：(0.5～1.5)；铜盐催化及和配体的摩尔比为1：(1～2)；

所述两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物的化学结构式为：

上述m为5～15，n为4～114；

(4) 以2-溴乙醇为引发剂，引发ε-己内酯开环聚合，经修饰，得到叠氮基单封端的聚己内酯(PCL-N₃)；

其中，ε-己内酯与2-溴乙醇和叠氮化钠的摩尔比为1：(15～45)：(2～4)；

所述叠氮基单封端的聚己内酯的化学结构式为：

上述x为15～45；

(5) 惰性气体气氛条件下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以两端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物和叠氮基单封端的聚己内酯为原料，以N,N,N,N,N-五甲基二乙基三胺为配体，以N,N,-二甲基甲酰胺为溶剂，通过反应，制备快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物(PCL-PEGSeSe-PCL)；

其中，两端炔基封端的含硒聚乙二醇交替共聚物、叠氮基单封端的聚己内酯和铜盐的摩尔比为1：(2～4)：(0.5～1.5)；铜盐催化及和配体的摩尔比为1：(1～2)；

所述快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物的结构式为：

上述m为5～15，n为4～114，x为15～45。

本发明首次在铜盐催化剂和配体的存在下，通过原料及参数的限定，制备得到两端炔基封端的含硒聚乙二醇交替共聚物原料及快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物，解决了现有反应体系无法制备出主链含双硒交替的共聚物的问题，是一种新型、高效、快速的合成方法。

进一步的技术方案，在步骤(1)～(5)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

(i) 二叠氮基封端的双硒小分子的纯化：反应结束后，将粗产物过滤，除去未反应的叠氮化钠。采用油泵减压除去DMF溶剂。加入CH₂Cl₂使浓缩产物充分溶解，进行萃取。收集有机相并加入无水硫酸钠进行干燥处理，过滤，旋蒸除去CH₂Cl₂溶剂。将所得产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得到暗黄色固体产物；

(ii) 炔丙基封端的聚乙二醇的纯化：反应结束后，将粗产物过滤，旋蒸除去THF溶剂。用CH₂Cl₂溶剂萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠进行干燥处理，过滤，旋蒸除去大部分CH₂Cl₂溶剂。在正己烷中沉淀三次，产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得到淡黄色黏稠液体产物；

(iii) 两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物的提纯：反应结束后，将粗产物通过中性Al₂O₃的短层析柱。将溶液转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，置于二次水中透析48 h-72 h，定期换水，最后冷冻干燥，得到淡黄色固体产物；

(iv) 叠氮基单封端的聚己内酯的提纯：反应结束后，将粗产物过滤，除去未反应的叠氮化钠。用油泵减压浓缩反应液，用CH₂Cl₂溶剂萃取。收集有机层，加入无水硫酸钠进行干燥处理。随后过滤，旋蒸除去CH₂Cl₂溶剂。将所得产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得白色固体产物；

(v) 快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物的提纯：反应结束后，将粗产物通过中性Al₂O₃的短层析柱。将溶液转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，置于二次水中透析48 h-72 h，定期换水，最后冷冻干燥，得淡黄色固体产物。

本发明公开的快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物PCL-PEGSeSe-PCL，可以在水溶液中自组装，形成纳米粒子。疏水性聚己内酯嵌段形成纳米粒子的核；亲水性聚乙二醇链段形成纳米粒子的外壳，起到稳定纳米粒子的作用。而双硒键在快速氧化/还原条件下，易发生断裂，纳米粒子被破坏，从而快速释放出所包载的疏水性抗癌药物。因此，本发明请求保护上述快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物在制备刺激响应性抗癌纳米药物体系中的应用。

由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明采用生物相容性良好的亲水性聚乙二醇和疏水性聚己内酯为原料，通过化学反应，首次将双硒键引入嵌段共聚物主链，共聚物载体在体内的快速响应和解离程度非常优异；制备的具有快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物，在水溶液中，该嵌段共聚物可以自组装形成纳米粒子，作为疏水性抗癌药物的载体；

2、本发明公开的聚合物中，由于双硒键不仅能够在还原剂的作用下发生断裂，甚至在氧化剂的作用下也能发生断裂，因此，赋予了载药纳米粒子快速氧化/还原双重刺激响应行为；在正常生理条件下，载药纳米粒子能够稳定存在，而在氧化环境（如H₂O₂）或还原条件（如谷胱甘肽）下，双硒键能够快速断裂，聚合物解离，导致聚合物纳米粒子迅速被破坏，从而快速释放出抗癌药物；此外，硒作为一种抗癌元素，可与药物协同作用，能很好的起到预防癌症的功效，因此，在癌症治疗方面，此类载药纳米粒子具有潜在的应用价值；

3、本发明提供的快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物，结构明确，合成条件温和，具有以下显著特点：(1) 所用原料和试剂容易获得；(2) 反应条件简单温和；(3) 产率高；(4) 产物分离简便；(5) 产物稳定性好，提纯方便。

附图说明

图1 为实施例一中二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）及其中间体的核磁共振氢谱图：(A) NH₂-SeSe-NH₂；(B) Cl-SeSe-Cl；(C) N₃-SeSe-N₃；溶剂为氘代二甲亚砜；

图2为实施例一中二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）及其中间体的红外光谱谱图： (A) NH₂-SeSe-NH₂; (B) Cl-SeSe-Cl; (C) N₃-SeSe-N₃；

图3为实施例二中二炔基封端的聚乙二醇(PA-PEG-PA)的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代二甲亚砜；(A) HO-PEG-OH；(B) PA-PEG-PA；

图4为实施例三中两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物（PA-PEG-alt-SeSe-PA）的核磁共振氢谱图；

图5为实施例四中叠氮基单封端的聚己内酯及中间体的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；(A) PCL-Br；(B) PCL-N₃；

图6为实施例四中叠氮基单封端的聚己内酯及中间体的凝胶渗透色谱流出曲线；

图7为实施例四中叠氮基单封端的聚己内酯及中间体的红外光谱谱图，(A) PCL-Br；(B) PCL-N₃；

图8为实施例五中合成的快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物（PCL-PEGSeSe-PCL）的核磁共振谱图，溶剂为氘代二甲亚砜；

图9为实施例五中叠氮基单封端的聚己内酯、二炔基封端的聚乙二醇、炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物及含双硒三嵌段共聚物的凝胶渗透色谱流出曲线，(A) PA-PEG-PA；(B) PCL-N₃；(C) PA-PEG-alt-SeSe-PA ；(D) PCL-PEGSeSe-PCL；

图10为实施例六中快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物（PCL-PEGSeSe-PCL）在水溶液中形成的纳米粒子及其粒径分布曲线；

图11为实施例七中快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物与阿霉素形成的载药纳米粒子在不同条件下的粒径变化；

图12为实施例八中载药纳米粒子在不同谷胱甘肽（GSH）浓度下的体外药物释放曲线；

图13为实施例九中L929细胞以及HeLa细胞分别与不同浓度的双硒聚合物纳米粒子及其载药纳米粒子溶液培养72 h后的细胞存活率；

图14为实施例十中利用活细胞工作站观察的细胞内吞结果： (A) 包载阿霉素（DOX）的纳米粒子与 (B) 游离DOX进入HeLa细胞的荧光照片 (DOX的浓度为1 mg/L)；从左至右的荧光信号分别为经蓝色染料Hoechst 33342染色的细胞核的蓝色荧光、阿霉素自发的红色荧光以及两种荧光信号的重叠荧光；

图15为实施例十中载药纳米粒子和游离DOX的流式细胞曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：

实施例一：二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）的合成

二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）主要通过两个步骤制备而成，第一步，制备二氯基封端的双硒小分子（Cl-SeSe-Cl）；第二步，制备二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃），具体合成方法如下：

合成二氯基封端的双硒小分子（Cl-SeSe-Cl）：将装有搅拌子的250 mL三颈烧瓶、弯管、恒压滴液漏斗以及具活塞放入120℃烘箱干燥12 h，使用前从烘箱中取出放入保干器，待其降至室温再行使用。将装置搭上，通氮气，向三颈烧瓶中加入70 mL无水CH₂Cl₂，称取硒代胱胺盐酸盐（1 g, 3.12 mmol）加入三颈烧瓶，再使用针筒抽取无水三乙胺（2.536 g, 25mmol）加入，使其充分混匀。在恒压滴液漏斗中加入30 mL无水CH₂Cl₂，吸取氯乙酰氯（1.416g, 12.5 mmol）加入，充放气三次后密封。将反应瓶置于冰水浴中，待反应液降温后打开恒压滴液漏斗，以1滴/2秒的速度缓慢滴加液体。待溶液完全滴完，将其从冰水浴转移至25℃油浴中，反应24 h。反应结束后，将粗产物转移至250 mL圆底烧瓶，浓缩。加入150 mL THF，过滤除盐。旋蒸除去THF，加入100 mL CH₂Cl₂，充分溶解。随后进行萃取处理：加入50 mL饱和食盐水，振荡后静置，收集有机相。再用30 mL CH₂Cl₂萃取水相，合并有机相，重复操作三次。收集有机相，加入适量无水硫酸钠干燥除水，过滤，旋蒸除去溶剂。将所得产物放入真空干燥箱干燥至恒重，得到暗黄色固体产物，即Cl-SeSe-Cl（0.93 g，产率为38.4%）。产物的核磁共振谱图如图1(B)所示，红外光谱谱图如图2(B)所示。

合成二叠氮基封端的双硒小分子（N₃-SeSe-N₃）：将Cl-SeSe-Cl（0.4 g, 1 mmol）、NaN₃（0.65 g, 10 mmol）以及10 mL DMF依次加入50 mL圆底烧瓶。将圆底烧瓶转移至60℃油浴中，反应40 h。反应结束后，将粗产物过滤，除去未反应的叠氮化钠。采用油泵减压除去DMF溶剂。加入100 mL CH₂Cl₂使浓缩产物充分溶解，进行萃取。收集有机相，加入无水硫酸钠进行干燥处理，过滤，旋蒸除去CH₂Cl₂溶剂。将所得产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得到暗黄色固体产物，即N₃-SeSe-N₃（0.38 g，产率为36.2%）。产物的核磁共振谱图如图1(C)所示，红外光谱谱图如图2(C)所示。

实施例二：合成二炔丙基封端的聚乙二醇（PA-PEG-PA）

二炔丙基封端的聚乙二醇（PA-PEG-PA）主要通过“一锅法”制备而成。第一步：利用高活性的KH与乙二醇末端羟基反应，制备氧阴离子的引发剂；第二步，利用氧阴离子引发剂与3-溴丙炔反应，制备二炔丙基封端的聚乙二醇（PA-PEG-PA），具体合成方法如下：

将装有搅拌子的100 mL支管烧瓶、恒压滴液漏斗以及具活塞放入120℃烘箱干燥12 h，使用前从烘箱中取出放入保干器中，待降至室温再行使用。首先称取HO-PEG-OH（5 g, 5mmol）装入支管烧瓶中，随后加入50 mL甲苯进行共沸除水，重复蒸馏二次。随后将支管烧瓶接入双排管充放气三次，使用针筒抽取50 mL无水THF加入，适当加热至HO-PEG-OH完全溶解。吸取封装于矿物油中的KH放入小盐水瓶中，用无水THF洗涤三次。抽干后从中称取KH（1.2 g, 30 mmol）加入支管烧瓶中，搅拌1 h，装上恒压滴液漏斗，加入20 mL无水THF，使用针筒抽取3-溴丙炔（5.9 g, 50 mmol）加入恒压滴液漏斗。对反应装置充放气三次后密封。打开恒压滴液漏斗，以1滴/2秒的速度缓慢滴完其中液体。将反应瓶转移至45℃油浴中，反应40 h。

反应结束后，将粗产物过滤，旋蒸除去THF溶剂。使用CH₂Cl₂进行萃取处理。收集有机相，加入无水硫酸钠进行干燥处理，过滤，旋蒸除去大部分CH₂Cl₂溶剂。在正己烷中沉淀三次，产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得到淡黄色粘稠液体，即PA-PEG-PA（4.19 g，产率为38.4%）。产物的核磁共振谱图如图3(B)所示。

实施例三：两端炔基封端的含双硒聚乙二醇交替共聚物（PA-PEG-alt-SeSe-PA）的合成

将装有搅拌子的50 mL支管烧瓶放入120℃烘箱干燥12 h，使用前从烘箱中取出并使用双排管抽冷降温，降至室温。将CuBr（71.73 mg, 0.5 mmol）、PMDETA（86.65 mg, 0.5 mmol）以及5 mL无水DMF加入，充分搅拌。称取PA-PEG-PA（281.5 mg, 0.25 mmol）、N₃-SeSe-N₃（103.5 mg, 0.25 mmol）装入离心管中，加入5 mL无水DMF使两种原料完全溶解后加入支管烧瓶，充放气三次后密封，将支管烧瓶转移至35℃油浴中，反应24 h。为了确保聚合物以炔丙基封端，过量的PA-PEG-PA（140.8 mg, 0.125 mmol）被加入，继续反应24 h。

反应结束后，将粗产物过一根中性Al₂O₃的短层析柱。将溶液转移至透析袋（MWCO7000 Da）中，置于二次水中透析48 h，定期换水，最后冷冻干燥，得到淡黄色固体产物，即PA-PEG-alt-SeSe-PA（0.25 g，产率为67%）。产物的核磁共振谱图如图4所示。

实施例四：叠氮基单封端的聚己内酯（PCL-N₃）的合成

叠氮基封端的聚己内酯主要通过两个步骤制备而成。第一步，以2-溴乙醇为引发剂，Sn(Oct)₂为催化剂，使用开环聚合引发ε-己内酯聚合，制备单溴封端的聚己内酯（PCL-Br）；第二步，使用叠氮化钠对PCL-Br的端基进行修饰，制备叠氮基封端的聚己内酯（PCL-N₃），具体合成方法如下：

第一步，合成PCL-Br。将装有搅拌子的50 mL支管烧瓶放入120℃烘箱干燥12 h，使用前从烘箱中取出并使用双排管抽冷降至室温。将2-溴乙醇（0.23 g, 1.84 mmol）、ε-己内酯（3.58 g, 31.28 mmol）以及10 mL无水甲苯依次加入支管烧瓶，充分搅拌，使混合均匀。加入Sn(Oct)₂（0.037 g, 0.092 mmol），充放气三次后密封，将支管烧瓶转移至90℃油浴中，反应4 h。反应结束后，旋蒸除去大部分甲苯。在乙醚中沉淀三次，产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得白色固体产物，即PCL-Br（2.84 g，产率为74.5%）。产物的核磁共振谱图如图5(A)所示。

第二步，合成PCL-N₃。将上述第一步合成的PCL-Br（1.08 g, 0.44 mmol）、NaN₃（0.14 g, 2.2 mmol）以及10 mL DMF依次加入50 mL圆底烧瓶。将圆底烧瓶转移至60℃油浴中，反应24 h。反应结束后，将粗产物过滤，除去未反应的叠氮化钠。用油泵减压浓缩反应液。使用CH₂Cl₂进行萃取处理。收集有机层，加入无水硫酸钠进行干燥处理。随后过滤，旋蒸除去CH₂Cl₂溶剂。将所得产物放入真空干燥箱中干燥至恒重，得白色固体，即PCL-N₃（0.89g，产率为73.0%）。产物的核磁共振谱图如图5(B)所示，凝胶渗透色谱流出曲线如图6所示，红外光谱表征如图7所示。

实施例五：叠氮快速氧化/还原双重响应的ABA型三嵌段共聚物PCL-PEGSeSe-PCL的合成

将装有搅拌子的50 mL支管烧瓶放入120℃烘箱干燥12 h，使用前从烘箱中取出并使用双排管抽冷降温，降至室温后将CuBr（27.7 mg, 0.193 mmol）、PMDETA（66.8 mg, 0.386mmol）以及5 mL DMF加入，充分搅拌。称取PA-PEG-alt-SeSe-PA（206.8 mg, 0.016 mmol）、PCL-N₃（176.0 mg, 0.064 mmol）装入离心管中，加入3 mL DMF使两种原料完全溶解后加入支管烧瓶中，充放气三次后密封。将支管烧瓶转移至45℃油浴中，反应24 h。反应结束后加入炔基修饰的聚苯乙烯树脂继续反应24 h以便反应吸附残留的PCL-N₃。反应结束后，将粗产物过一根中性Al₂O₃的短层析柱。将溶液转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，置于二次水中透析48 h，定期换水，最后冷冻干燥，得淡黄色固体产物，即PCL-PEGSeSe-PCL（197.6 mg，产率为51.7%）。产物的核磁共振谱图如图8所示，凝胶渗透色谱流出曲线如图9所示。

实施例六：采用透析法制备PCL-PEGSeSe-PCL聚合物纳米粒子

首先，准确称取7.93 mg的芘溶解在丙酮溶液中，定容至50 mL得到0.78 mM的芘/丙酮溶液。在若干带有搅拌子的小盐水瓶中加入50 微升的芘/丙酮溶液，使用减压抽滤的方式将丙酮抽干。分别加入5 mL不同浓度的PCL-PEGSeSe-PCL聚合物（实施例五的产物）溶液（1.0X 10^-3 mg mL^-1 ~ 0.5 mg mL^-1），剧烈搅拌48 h。采用荧光分光光度计检测各个盐水瓶中溶液的荧光信号，其中激发波长设为335 nm，发射波长扫描范围在350~550 nm，狭缝宽度设为2.5 nm，电压设为800 V。分析荧光谱图，取I ₃/I ₁与Log C作图，高浓度和低浓度的线性拟合曲线的交点即为PCL-PEGSeSe-PCL聚合物的临界聚集浓度。

PCL-PEGSeSe-PCL聚合物纳米粒子采用良溶剂透析法制得。准确称取10 mg的PCL-PEGSeSe-PCL聚合物，溶于1.5 mL 二甲亚砜，搅拌4 h使其完全溶解。随后一边搅拌一边使用微量进样泵（WZS-50F）以1.5 mL h^-1的流速缓慢加入6 mL去离子水。滴加完成后继续搅拌6 h，随后将溶液转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，置于二次水中透析18 h，定期换水，最后使用二次水将透析液定容至10 mL，在水溶液中形成的纳米粒子及其粒径分布曲线如图10所示。

实施例七：采用快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物与阿霉素形成的载药纳米粒子在不同条件下的粒径变化

称取50 mg PCL-PEGSeSe-PCL聚合物（实施例五的产物）溶于4 mL二甲亚砜（DMSO）中，搅拌4 h使其完全溶解。加入4 mL DOX/DMSO溶液（1.25 mg mL^-1），继续搅拌4 h后，边搅拌边使用微量进样泵以3 mL h^-1的流速逐滴加入25 mL去离子水。滴加完成后继续搅拌4 h，最后将溶液转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，置于二次水中透析24 h，定期换水，使用二次水将透析液定容至50 mL。

利用DLS观察不同条件下观察载药纳米粒子随时间的粒径变化。具体操作如下：取两份5 mL 载药纳米粒子溶液，分别加入0.1 mL 30% H₂O₂溶液和16 mg的谷胱甘肽（GSH），配置成0.5 wt% H₂O₂溶液和10 mM的GSH溶液，室温搅拌，每隔一段时间测试载药纳米粒子的粒径，观察粒径变化，结果如图11所示。

实施例八：载药纳米粒子在不同谷胱甘肽（GSH）浓度下的体外药物释放测试

取5 mL PCL-PEGSeSe-PCL聚合物包载DOX的纳米溶液（实施例七），转移至透析袋（MWCO7000 Da）中，密封后浸入装有20 mL不同条件缓冲液的离心管中。将离心管转移至恒温水槽中持续恒温（37℃）震荡。每隔一定时间从离心管中取出5 mL释放液用于监测其药物释放行为，同时补加5 mL对应的缓冲溶液使其总体积保持不变。采用荧光分光光度计检测释放液中DOX的荧光强度，其中激发波长设为480 nm，发射波长扫描范围在520~620 nm，狭缝宽度设为10 nm，电压设为700 V，根据DOX荧光发射浓度标准曲线得到释放液中的DOX浓度。当不存在GSH或GSH浓度很低（2 μM）的时候，药物释放速率较慢，60 h仅释放约23%或28%的DOX；而在模拟细胞内GSH浓度的还原条件下，DOX的药物释放速率明显加快，60 h能释放近72%的DOX，如图12所示。药物释放结果表明，该含双硒的嵌段共聚物（PCL-PEGSeSe-PCL）纳米粒子具有明显的快速氧化/还原双重响应性，可以达到控制释放抗癌药物的目的。

实施例九：纳米粒子体外毒性的研究

采用常规的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）来检测空白纳米粒子的生物相容性以及包载阿霉素的载药纳米粒子抑制肿瘤细胞增殖的能力。具体操作如下：将小鼠成纤维细胞（L929细胞）和宫颈癌细胞（HeLa 细胞）分别接种到含培养基（DMEM）的96孔培养皿上，其中培养基由10%热灭活性胎牛血清（FBS），1%青霉素（penicillin）和链霉素（streptomycin）组成。将其放置于37℃，5% CO₂条件下培养12 h后加入不同浓度的纳米粒子溶液继续培养72 h。在培养皿的每个小孔中加入25 μL的MTT溶液（5 mg mL^-1），培养4 h，吸取上层清液，加入150 μL的二甲亚砜溶解形成的甲瓒晶体。采用酶标仪（Bio-Rad 680）检测每个孔在570 nm处的吸光度（Optical density, OD）。细胞相对存活率根据如下公式计算：细胞相对存活率 (%) = (OD_Test/OD_Control)X100。式中，OD_Test为待测样品孔中溶液的吸光度测量值，OD_Control无待测样品孔中溶液的吸光度测量值。每个浓度的样品进行五组平行实验，每个样品测试三次，取其平均值。附图13所示为L929细胞和人宫颈癌HeLa细胞分别与不同浓度的双硒聚合物（实施例五的产物）纳米粒子及其载药纳米粒子溶液培养72 h后的细胞存活率。结果表明，空白纳米粒子几乎无细胞毒性，即使纳米粒子浓度达到0.2 mg mL^-1，在与L929细胞和HeLa细胞培养72 h后，细胞的存活率依然在90%以上，证实合成的含双硒键共聚物具有优良的生物相容性。此外，其载药纳米粒子表现出一定抑制肿瘤细胞增殖的能力，显示其作为药物载体的潜力。

实施例十：载药纳米粒子的细胞内吞测试

采用活细胞工作站（Live cell imaging system, Cell’R, Olympus, Japan）观察载药纳米粒子在HeLa细胞中的内吞过程。具体操作如下：将HeLa细胞接种到含培养基DMEM的6孔培养皿上，将其置于37℃，5% CO₂条件下培养12 h使其贴壁生长。吸走上清液并使用PBS缓冲溶液清洗3次，加入Hoechst 33342再培养30 min，使其对细胞核进行染色。将培养皿放置于载物台上，同时安装进样管。从倒置的显微镜中观察，选择合适的细胞区域。利用进样管将培养皿中的培养基置换成等体积的含DOX/聚合物载药纳米粒子（实施例七）或者游离DOX的培养基（DOX浓度为1 mg L^-1），在40倍焦距下实时观察6 h。每隔半小时，拍摄所选定区域内细胞的荧光成像图，实时跟踪记录HeLa细胞内荧光强度的变化。结果如图14所示，(A)包载阿霉素（DOX）的纳米粒子与 (B) 游离DOX进入HeLa细胞的荧光照片 (DOX的浓度是1mg L^-1)。从左至右的荧光信号分别为经蓝色染料Hoechst 33342染色的细胞核的蓝色荧光、阿霉素自发的红色荧光以及两种荧光信号的重叠荧光。

采用流式细胞仪对包载DOX的聚合物纳米粒子和游离的DOX进入细胞内的荧光强度进行测试，实验结果如图15所示。随着采用聚合物载药纳米粒子溶液培养时间的延长，HeLa细胞内的荧光强度逐渐增加，说明越来越多的DOX/聚合物载药纳米粒子通过内吞进入细胞，并且在细胞内将DOX释放出来。与游离DOX培养5 h后，HeLa细胞内也存在DOX的荧光。但是，与DOX/聚合物载药纳米粒子相比，其平均荧光强度要弱了许多，这一实验结果与活细胞工作站所得结果一致。

以上结果表明，DOX/聚合物载药纳米粒子能够被高效地内吞进入HeLa细胞，并且在肿瘤细胞高浓度GSH或活性氧作用下实现药物的有效释放，展现出快速药物释放的能力。图15为所示为DOX/聚合物载药纳米粒子和游离DOX与HeLa细胞培养不同时间的流式细胞曲线（DOX的浓度是1 mg L^-1）。

更换本发明限定的其他催化剂以及配体，同样可以得到产物；更换聚乙二醇的分子量以及本发明限定的原料比例，可以得到不同m值、n值的产物。本发明限定的具有快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物（PCL-PEGSeSe-PCL），在水溶液中可以组装成聚合物纳米粒子纳米粒子，并稳定存在。而在氧化或者还原条件下，二硒键发生断裂，使纳米粒子被破坏，从而可以将包载的抗癌药物快速地释放，用于治疗，取得了如实施例记载的技术效果。因此，本发明公开的含双硒键的聚合物具有非常快速的氧化及还原刺激响应特性，使其在肿瘤细胞内能够实现快速的裂解，从而将药物释放出来，并且不会在细胞内富集，此外，作为抗肿瘤药物的载体，具有良好的生物相容和生物可降解性的含双硒键的聚合物，甚至纳米粒子本身也具有抑制肿瘤细胞增殖的能力。

Claims

1.一种快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物，其特征在于，由下列化学结构式表达：

其中，m为5～15，n为4～114，x为15～45。

2.权利要求1所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，将硒代胱胺盐酸盐与酰氯化合物的反应产物与叠氮化合物反应，制备叠氮基封端的双硒小分子；步骤（2）中，将聚乙二醇与氢化钾的反应产物与丙炔化合物反应，制备两端炔丙基封端的聚乙二醇；步骤（3）中，反应在铜盐催化剂以及催化剂配体存在下进行；步骤（4）中，在有机催化剂存在下，利用小分子醇引发ε-己内酯聚合；步骤（5）中，反应在铜盐催化剂以及催化剂配体存在下进行。

4.根据权利要求3所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，酰氯化合物为氯乙酰氯，叠氮化合物为叠氮化钠；步骤(2)中，丙炔化合物为3-溴丙炔；步骤(3)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，催化剂配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；步骤(4)中催化剂选自辛酸亚锡或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；步骤(5)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，催化剂配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

5.根据权利要求2所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，反应的温度为25℃～60℃，反应的时间为12 h～40 h；步骤(2)中，反应的温度为0℃～50℃，反应的时间为1 h～40 h；步骤(3)中，反应的温度为35℃～45℃，反应的时间为24 h～48 h；步骤(4)中，反应的温度为60℃～90℃，反应的时间为4 h～24h；步骤(5)中，反应的温度为35℃～45℃，反应的时间为24 h～48 h。

6.权利要求1所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物在制备纳米药物中的应用；或者权利要求1所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物作为纳米药物载体的应用。

7.一种快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

（6）将步骤（5）制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物经过自组装、透析，制备快速氧化/还原双重响应性含双硒的嵌段共聚物纳米粒子。

8.权利要求7所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子的制备方法制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子在制备纳米药物中的应用；或者权利要求7所述快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子的制备方法制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物纳米粒子作为纳米药物载体的应用。

9.一种快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（6）将步骤（5）制备的快速氧化/还原双重响应性含双硒键的嵌段共聚物与抗癌药物混合后经过自组装、透析，制备快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系。

10.权利要求9所述快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系的制备方法制备的快速氧化/还原双重响应性抗癌纳米药物体系在制备抗癌药物中的应用。