CN104644559B - 一种pH和氧化还原双重敏感性纳米粒子 - Google Patents
一种pH和氧化还原双重敏感性纳米粒子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种pH和氧化还原双重敏感性壳聚糖/胱二酰胺二羧酸纳米粒子的制备方法，属于载体与缓释材料技术领域。首先制备含双硫键的胱二酰胺二羧酸，然后以此为交联剂,在活化剂作用下将壳聚糖在水溶液中交联，可得到窄分布的纳米粒子。测定了不同pH值条件下纳米粒子的粒径，证明其具有pH敏感性。利用所得到纳米粒子的pH敏感性成功负载了疏水性药物喜树碱，在以不同谷胱甘肽浓度的PBS溶液为介质的体外释放实验中，证明了该载药纳米粒子具有较好的还原敏感性。
Description
技术领域
本发属于载体与缓释材料技术领域，涉及一种pH和氧化还原双重敏感性纳米粒子的制备方法及其应用。
背景技术
聚合物纳米粒子在负载和控制释放抗癌药物方面具有独特的优越性，因而引起研究者的广泛兴趣。为了实现药物的靶向输送和体内条件的控制释放，愈来愈多的人们把研究重点集中在具有环境响应(如pH、温度、氧化还原、磁响应等)功能的智能纳米材料上。
近几十年来，具有还原敏感性的聚合物生物材料由于优异的响应性能，在药物载体方面获得了快速的发展。这些聚合物药物载体是基于细胞内与细胞外还原型谷胱甘肽(GSH)浓度的显著性差异设计的，它们通常在主链、侧链或者交联剂上含有二硫键。动物细胞中含有大量谷胱甘肽，其在细胞内的浓度(约2～10mM)大约为细胞外环境中浓度(约2～20μM)的100-1000倍，使得细胞内部具有很强的还原性环境，因此，二硫键在体内循环或者细胞外环境能够保持足够的稳定性，而在细胞内通过巯基-二硫键的交换反应可以快速断裂，使得聚合物药物载体的结构受到破坏而快速释放出药物。而肿瘤组织由于代谢异常，其细胞中的谷胱甘肽浓度比正常细胞高数倍，使得还原敏感性纳米粒子在癌细胞中具有更快的响应性。
喜树碱(CPT)是一种广谱抗肿瘤药物，对消化道肿瘤(胃癌、结肠癌、直肠癌)、肝癌、膀胱癌和白血病等都有较好疗效，然而喜树碱和其他抗肿瘤药物一样也存在着明显的缺陷：如水溶性差，分子上的内酯环在中性或碱性条件下容易开环，生成溶于水的羧酸盐形式，导致活性降低，而酸化后羧酸盐会重新转变为低溶解度的内酯形式。
壳聚糖自然界存在的带正电荷的多糖，由于其良好的生物相容性、可降解性、低毒性及价廉等特点在生物医药领域得到了广泛的应用。以壳聚糖为原料制备纳米载体一直是药物载体研究领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是利用低分子量壳聚糖为主要原料通过一种简单的方法制备还原敏感性的纳米粒子。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
(1)首先以胱胺和二元内酸酐为原料制备了一种新型交联剂，胱二酰胺二羧酸；
(2)再以粘均分子量为6.03×104的壳聚糖为基体，以胱二酰胺二羧酸为交联剂，分散于去离子水中，调节pH，加入双组分活化剂，在室温附近反应，经过透析后得到纳米粒子；
(3)将壳聚糖/胱二酰胺二羧酸纳米粒子用于抗癌药物喜树碱的控制释放，证明了药物载体具有pH和还原性。
本发明的有益效果：
(1)通过制备胱二酰胺二羧酸充当交联剂，在制备的纳米粒子中引入了二硫键，使得纳米粒子具备了还原敏感性，在体内循环或细胞外能保持一定的稳定性，而在细胞内能快速降解。
(2)所制备的壳聚糖纳米粒子一方面本身具有未完全反应的氨基，另一方面由于交联剂两端的羧基不可能完全反应，一部分胱二酰胺二羧酸与壳聚糖反应后保留一个游离的羧基，所以其具有pH敏感性。
(3)本发明所采用制备纳米粒子的方法简单，且不使用有机溶剂，过程比较环保。
(4)本发明利用了纳米粒子的pH敏感性及喜树碱本身随pH变化的特点，成功实现了纳米粒子对喜树碱的负载，避免传统方法负载喜树碱需使用有机溶剂的缺点。
附图说明
图1实施例1胱二酰胺二丙烯酸的合成示意图
图2壳聚糖/胱二酰胺二丙烯酸纳米粒子的结构图
图3实施例1的得到的胱二酰胺二丙烯酸1H NMR谱图
图4实施例1的得到的纳米粒子的SEM图
图5实施例1的得到的纳米粒子的粒径随pH的变化曲线图
图6实施例1的得到的载药纳米粒子的体外释放曲线
具体实施方式：
实施例1：
胱二酰胺二丙烯酸的制备：
在有氮气保护装置的三口烧瓶中加入40mL丙酮和4.83g(0.049mol)马来酸酐，升温至50℃，待马来酸酐完全溶解，再向溶液中缓慢滴加胱胺的丙酮溶液(3.02g胱胺溶于10mL丙酮)，反应2h后冷却至室温，将溶液过滤，沉淀用丙酮洗涤三次得到白色粉末状固体，最后在40℃真空干燥箱中干燥12h得到胱二酰胺二丙烯酸。
实施例2：
pH和氧化还原双重敏感性纳米粒子的制备：
称取100mg粘均分子量为6.03×104的壳聚糖分散于100mL蒸馏水中，加入120mg由实施例1所得胱二酰胺二丙烯酸，磁力搅拌2h后调节混合溶液的pH值至5，待两组分完全溶解后向溶液加入328mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和320mg N-羟基琥珀酰亚胺，25℃反应24h后将溶液装透析袋(MWCO＝8000-14000)中置于蒸馏水中透析5天(第一天每隔4h换一次水，后4天每隔8h换一次水)，最后得到纳米粒子溶液CS-CDMA-120。
实施例3：
pH和氧化还原双重敏感性载药纳米粒子的制备及体外释放表征：
称取10mg喜树碱溶解于pH＝12的水溶液中搅拌12h，将其逐滴添加到50mL浓度为1mg/mL、pH＝12、由实施例2所得纳米粒子水溶液中，搅拌2h后用0.1M盐酸缓慢调pH至5，搅拌2h后离心10min(10,000rpm)取上层清夜，得到纯净的载药纳米粒子溶液。测定所得载药纳米粒子的载药率和包封率，再取5mL载药纳米粒子溶液，分别在50mL谷胱甘肽(GSH)浓度分别为0、10mM、20mM的pH＝7.4的PBS进行了体外释放，每隔一段时间取3mL释放介质在紫外分光光度计上测定波长在368nm处的吸光度，通过标准曲线计算喜树碱的浓度，同时每次补充等量新鲜释放介质以维持其总体积不变。
实施例4：
与实施例2相同，但是加入胱二酰胺二丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的量分别为100mg、272mg、268mg，得到纳米粒子溶液CS-CDMA-100。
实施例5：
与实施例2相同，但是加入胱二酰胺二丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的量分别为80mg、218mg、212mg，得到纳米粒子溶液CS-CDMA-80。
实施例6：
与实施例2相同，但是加入胱二酰胺二丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的量分别为60mg、164mg、160mg，得到纳米粒子溶液CS-CDMA-60。
实施例7：
与实施例2相同，但是加入胱二酰胺二丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的量分别为40mg、110mg、108mg，得到纳米粒子溶液CS-CDMA-40。
实施例8:纳米粒子细胞毒性测定
用10％的MCDB131细胞培养液将对数生长期的人微血管内皮细胞(HMEC-1cells)配成浓度为6×103个/mL的细胞悬浮液，每孔150μL接种于两个96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。吸出每孔中的原培养液，每孔加入150μL的阴性对照液(10％MCDB131培养基)、阳性对照液(0.64％苯酚培养基)、实验组(实施例2所得pH和氧化还原双重敏感性纳米粒子溶液)，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养，两块板分别培养1天、3天，每组设6个平行孔。
分别于第1、3天各取出一块板测试。取出第一块培养板后通过倒置显微镜观察、评价细胞生长状况。计算细胞相对增值率：倒出培养液，每孔加入200μL10％TCA固定液，在4℃固定40min，弃固定液，去离子水洗涤，晾干。每孔加入100μL0.4％SRB染色液，37℃染色30min，弃染色液，去离子水洗涤，晾干。每孔加入150μL10mmol/L Tris，于酶标仪上540nm处震荡(每孔测3次，每次60s，取均值)，测定每孔的吸光度OD值。
根据公式(1)计算细胞相对增值率(RGR)，评价样品毒性等级。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种胱二酰胺二羧酸交联剂，其特征是以胱胺和马来酸酐按照摩尔比1:2～1:8为原料，以丙酮为溶剂，通氮气保护，在30～60℃的反应温度下，反应时间为2小时，所得的沉淀过滤后用丙酮洗涤三次后，得到胱二酰胺二丙烯酸，可用于壳聚糖的交联；胱二酰胺二丙烯酸的结构为：
2.一种pH和氧化还原双重敏感性壳聚糖/胱二酰胺二丙烯酸纳米粒子，其特征是以粘均分子量为6.03×104的低分子量壳聚糖为基体，以权利要求1所述的胱二酰胺二丙烯酸为交联剂，添加活化剂，在水溶液中反应制得，部分胱二酰胺二丙烯酸起到交联剂作用，将壳聚糖交联，另一部分胱二酰胺二丙烯酸与壳聚糖反应后保留一个游离的羧基，所以具有pH敏感性，同时产物结构中的双硫键具有还原敏感性，产物无细胞毒性，合成配方及反应条件在以下范围内：
(1)加入的低分子量壳聚糖与胱二酰胺二丙烯酸交联剂的质量比为1:0.1～1:2；
(2)活化剂是双组份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，添加时二者按等摩尔比；活化剂中任一组分摩尔数与胱二酰胺二丙烯酸摩尔数之比为1:1～1:10，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐可以用1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐或者1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺碘甲烷盐替代，N-羟基琥珀酰亚胺可以用N-羟基硫代琥珀酰亚胺替代；
(3)反应介质为去离子水，水溶液的pH为3～6；
(4)反应温度为5～30℃；
(5)反应时间12～48h；
(6)纳米粒子的提纯需在上述反应完成后将纳米粒子溶液装入透析袋中，MWCO＝8000～14000，在室温下以去离子水为介质透析3～5天。
3.一种pH和氧化还原双重敏感性壳聚糖/胱二酰胺二丙烯酸纳米粒子的应用，其特征是:事先将喜树碱溶解于pH＝12的水溶液搅拌一夜配制喜树碱水溶液,将权利要求2所述的壳聚糖/胱二酰胺二丙烯酸纳米粒子的水溶液调节pH至12，再逐渐滴加喜树碱水溶液于其中，搅拌2h后用0.1M盐酸缓慢调pH至5，搅拌2h后，10000rpm离心10min，除去较大颗粒的纳米粒子和未被包覆的喜树碱，测定其载药率和包封率，并在不同谷胱甘肽浓度的磷酸缓冲溶液中考察其释放性能，证明该载药纳米粒子有氧化还原敏感性。
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