CN103239738A

CN103239738A - 一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法

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Publication number: CN103239738A
Application number: CN2013101932032A
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 周本青; 彭琛; 张贵祥; 郑林丰
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital; Donghua University
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital; Donghua University
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103239738B

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，包括：用mPEG-COOH修饰PEI，透析，冷冻干燥得PEI-mPEG；取上述固体，用水将其溶解，再加入HAuCl₄溶液，搅拌，然后加入NaBH₄溶液，室温反应；再加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后，将产物透析，冷冻，即得；本发明采用了价廉易得的聚乙烯亚胺作为载体，降低了材料的成本，使用mPEG-COOH修饰PEI表面提高了材料的生物相容性和纳米金粒子的胶体稳定性，并成功地应用于大鼠的活体CT成像；本发明设计方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施前景。

Description

一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法

技术领域

本发明属于CT造影剂的制备领域，特别涉及一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法。

背景技术

金纳米粒子（Au NPs）由于其独特的物理化学性质被广泛应用于生物医学领域，尤其是在生物传感、疾病诊断、光热疗法以及药物和基因传递领域。在众多的以聚合物辅助合成的Au NPs的实例中，以超支化聚乙烯亚胺分子（PEI）为模板或稳定剂合成的纳米粒子已经引起人们大量的关注。这主要是由于PEI是一种超支化大分子，外表面覆盖了大量的氨基，而氨基易于被进一步修饰，使得研究者能轻松地在其表面修饰各种生物功能团。例如，PEI已作为一种非常有效的非病毒基因载体用于基因传递（Mintzer et al.,Chem.Rev.2008,109(2),259-302;Pack et al.,Nat.Rev.Drug Discov.2005,4(7),581-593），同时PEI也可以用来作为模板和稳定剂合成或组装金属纳米颗粒、金属氧化物纳米粒子、半导体纳米粒子或碳纳米管（Sunet al.,Chem.Commun.2011,47(13),3817-3819）。一般情况下，以PEI为模板或稳定剂功能化金或银纳米颗粒往往涉及两个步骤：1）功能化PEI分子；2）合成金属纳米颗粒。这两个步骤的顺序可以根据颗粒胶体稳定性和复合物的最终应用等实际过程进行调整。

据了解，预先功能化的树状大分子可以用来作为模板包裹纳米金颗粒（dendrimer-entrapped gold nanoparticles,Au DENPs）（Shukla et al.,Soft Matter2008,4,2160-2163）。最近的报导表明，乙酰化的Au DENPs可以作为医用造影剂用于活体CT成像，但是，乙酰化在消除树状大分子材料表面正电性的同时降低了树状大分子对金原子的稳定作用，在金原子与树状大分子的摩尔比大于50时，稳定性大幅下降，需要加入额外的保护剂才能很好的存储，在一定程度上限制了Au DENPs的应用(Peng et al.,J.Appl.Polym.Sci.,2011,119(3),1673-1682)。由于PEI分子的结构与树状大分子类似，利用其结构特点制备的AuNPs，乙酰化也可能会影响PEI分子包裹纳米金颗粒的稳定性。因此，通过适当对PEI分子进行表面修饰，可以使PEI对Au NPs发挥更好的模板作用，从而提高材料的稳定性。

由于血液中血浆蛋白和矿物质对裸露纳米金颗粒的吸收，会造成纳米金颗粒在血液中大量团聚，最直接的结果就是纳米金颗粒会迅速被网状内皮系统（RES）包括肝和脾上的巨噬细胞吞噬，因此需要在纳米金颗粒的外表面修饰具有良好生物相容性的试剂。PEG（polyethyene glycol，聚乙二醇）是一种具有良好生物相容性的试剂，由于其独特的亲水长链结构受到了人们广泛的关注。近年来，PEG系列产品被广泛应用于生物医学材料上。Peng等人用PEG修饰树状大分子的表面，以此为模板包裹纳米金颗粒应用于体内血池CT成像，一方面能增加金原子的上载量，提高纳米金颗粒的稳定性，另一方面能降低材料的毒性，延长血池造影的时间（Peng et al.,Biomaterials2012,33,1107-1119）。

检索相关的文献和专利发现，目前mPEG（聚乙二醇单甲醚）修饰的不同摩尔配比的聚乙烯亚胺包裹的纳米金粒子的制备方法尚未见相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，该方法采用的超支化聚乙烯亚胺价廉易得，纳米金颗粒制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；设计合成的mPEG修饰的聚乙烯亚胺包裹的纳米金颗粒，很大程度上提高了Au/PEI摩尔比，提高了纳米金粒子的稳定性，并成功地应用于大鼠的活体CT成像。

本发明的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，包括：

（1）将羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温条件下，搅拌反应15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液中，继续室温搅拌2-3h，然后边搅拌边滴加入超支化聚乙烯亚胺PEI溶液中，反应60-80h，透析，冷冻干燥，得到PEI-mPEG；其中EDC·HCl与mPEG–COOH摩尔比为10:1；NHS与mPEG–COOH摩尔比为10:1；mPEG–COOH与PEI的摩尔比为30:1；

（2）将上述PEI-mPEG溶解在水中，加入HAuCl₄溶液，室温条件下搅拌20-40min，然后再加入NaBH₄溶液，室温搅拌反应1.5-2.5h，加入三乙胺，室温搅拌20-40min，然后再加入乙酸酐，在室温搅拌下反应1-2天，透析、冷冻干燥，得到聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹的纳米金颗粒({(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs)，n为50、100、15、200、250、300、350或400；其中NaBH₄与HAuCl₄中金的摩尔比为5:1；三乙胺与PEI的摩尔比为3000:1；乙酸酐与PEI的摩尔比为2750:1。

所述步骤（1）中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤（1）中mPEG–COOH的分子量为2000g/mol，超支化PEI的分子量为25000g/mol。所述步骤（1）中mPEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/ml，EDC·HCl溶液的浓度为10-13mg/ml，NHS溶液浓度为6-8mg/ml，超支化PEI溶液的浓度为2-3mg/ml。

所述步骤（1）中的透析为透析膜为纤维素透析膜，截留分子量为10000，在水中透析3-4天。所述步骤（2）中HAuCl₄溶液的浓度为10mg/mL，NaBH₄溶液的浓度为1mg/ml。

所述步骤（2）中透析为透析膜为纤维素透析膜，截留分子量为10,000，先在PBS缓冲溶液中透析1-2天，再在水中透析1-2天。

所述步骤（2）中所得的mPEG修饰的PEI包裹的纳米金粒子为{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs应用于血池CT成像。

本发明使用核磁共振谱（NMR）、紫外－可见分光光度计（UV-Vis）、透射电子显微镜（TEM）、MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）法等方法表征本发明所制产品的物理化学性质及细胞毒性，同时用CT测试mPEG修饰的PEI包裹的纳米金粒子的大鼠活体成像效果，具体测试结果如下：

（1）¹H NMR谱

通过图1a知化学位移在2.4-3.4ppm是PEI的亚甲基(-CH₂NH-)的质子信号，3.5-3.8ppm是mPEG的重复单元(-CH₂-CH₂-O-）的亚甲基的质子信号，根据它们峰面积之比计算知每个PEI分子上链接了26个mPEG（投料摩尔比为mPEG-COOH/PEI=30:1）。根据图1b知在1.8ppm的信号代表二级酰胺的乙酰基(-NHCOCH₃)的甲基质子信号，2.1ppm的信号对应于三级酰胺的乙酰基

的甲基质子信号。根据二级酰胺的乙酰基(-NHCOCH₃)的甲基质子信号的峰面积与PEI的亚甲基质子信号的峰面积之比计算知PEI表面的氨基已全部被乙酰化。

（2）紫外－可见分光光度计

在水溶液中合成的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs（n=50、100、150、200、250、300、350、400）在520nm左右处显示纳米金颗粒的表面等离子体共振峰（参见附图2a）；mPEG修饰的PEI包裹的Au NPs能稳定分散在水中，即使在乙酰化修饰后，材料在不同温度（4-50℃）和不同的pH值（5.0-8.0）范围内均具有良好的稳定性，说明mPEG修饰的PEI不仅大大提高了Au/PEI的摩尔比，同时还对生成的Au NPs起到了良好的稳定化作用（参见附图3和附图4）。

（3）透射电子显微镜

在水溶液中合成的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs（n=100、200、300、400）的TEM图片和粒度分布直方图（参见附图5），表明形成的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs（n=100、200、300、400）纳米颗粒均匀且粒径分布较窄（1.9-4.6nm），纳米金颗粒尺寸大小可通过改变Au/PEI摩尔比来控制。其中{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的高分辨TEM图片（参见附图6b）和选区电子衍射图（SAED）说明纳米金颗粒晶格清晰可见。（111）、（200）、（220）和（311）环说明(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG纳米金颗粒呈面心立方（fcc）晶体结构(参见附图6c)。{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的EDS谱（X-射线能谱分析）则证实金元素的存在（参见附图6d）。

（4）X-射线衰减性能测试

为了检测{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的CT成像效果，在离心管中用超纯水配制Au浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06M的溶液0.2mL，然后用CT成像仪测定纳米金颗粒的X-射线衰减特性（参见附图7）。从图可知随着金浓度的增加，纳米金颗粒CT信号强度也随之增加，并且纳米金颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系，同时比相同浓度下的含碘小分子造影剂欧乃派克的CT值高。奠定了本发明制备的纳米金颗粒作为体内血池CT造影剂的应用基础。

（5）MTT细胞存活率和相差显微镜测试结果

通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类口腔上皮癌的细胞株）的存活率来检测所合成纳米颗粒的细胞毒性（参见附图8）。KB细胞与{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs在浓度为15、75、150、225和300μg/mL时于37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后用酶标仪测量570nm处吸光值，并根据此值计算细胞的存活率。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS处理细胞为对照进行比较。与对照组相比，不同浓度的该纳米材料处理后的细胞存活率均在80%以上。这充分说明合成的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs在一定浓度下具有较低的细胞毒性，可以应用到生物体内成像诊断。我们进一步通过相差显微镜来检测材料对细胞的毒性。如图9所示，被不同浓度的该纳米材料处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞形态相比，没有发生明显的变化，进一步说明了该纳米材料的低细胞毒性。

（6）大鼠活体血池CT成像

将800μL的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs（[Au]=0.1mol/L）尾部静脉注射体重为149g的大鼠体内，通过CT扫描检测（参见附图10）。从图中能够清楚地看见大鼠的主动脉、左右侧肾动脉和骼总动脉。且大鼠生命体征明显，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs在成像浓度下生物毒性较低，并且CT成像效果良好。

有益效果

（1）本发明采用的超支化聚乙烯亚胺价廉易得，纳米金颗粒制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；

（2）本发明设计合成的mPEG修饰的聚乙烯亚胺包裹的纳米金颗粒，很大程度上提高了Au/PEI摩尔比，提高了纳米金粒子的稳定性，并成功地应用于大鼠的活体CT成像；

（3）本发明的Au NPs能够长时间的稳定分散，没有发生团聚现象，纳米金颗粒的尺寸大小可控，且具有较低的细胞毒性、较高的X-射线衰减强度和较好的CT成像效果，使其具有诊断早期肿瘤的应用潜力。

附图说明

图1为本发明制备的PEI-mPEG(a)和{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs(b)的核磁共振氢谱图；

图2为本发明制备的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs（n=50、100、150、200、250、300、350、400）（a）和{(Au⁰)_n-PEI-mPEG}NPs（n=50、100、150、200、250、300、350、400）（b）在25℃,pH=7.0时的紫外吸收光谱图；

图3为本发明制备的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs(n=50(1)、100(2)、150(3)、200(4)、250(5)、300(6)、350(7)、400(8))在不同pH值时的紫外吸收光谱图（(a)pH=5.0、(b)pH=6.0、(c)pH=7.0、(d)pH=8.0）；

图4为本发明制备的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs(n=50(1)、100(2)、150(3)、200(4)、250(5)、300(6)、350(7)、400(8))在不同温度时的紫外吸收光谱图（(a)4℃、(b)25℃、(c)37℃、(d)50℃）；

图5为本发明制备的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs（n=100(a)、200(b)、300(c)、400(d)）的TEM图片和对应的粒径分布直方图；

图6为本发明制备的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的（a)TEM图片、（b)高分辨率TEM图片、(c)选区电子衍射（SAED）图、（d）X-射线能谱（EDS）图；

图7为相同浓度下欧乃派克（含碘造影剂）和{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的体外CT图及对应的不同浓度下的X-射线衰减系数线性图（浓度：0.005mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L、0.06mol/L、0.1mol/L）；

图8为MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液（对照组）和{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs（浓度：15μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、225μg/mL、300μg/mL）处理24小时后的细胞存活率；

图9为KB细胞经过PBS缓冲液（对照组a）和不同浓度的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs（b:10μg/mL、c:25μg/mL、d:50μg/mL、e:75μg/mL、f:100μg/mL）处理24小时后的细胞形态图（标尺为100μm）；

图10为800μL的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs（[Au]=0.1mol/L）尾部静脉注射进SD大鼠体内，通过CT扫描检测得到的CT图片（a:注射15秒后的CT图像及对应的三维重建图、b:注射30分钟后的CT图像及对应的三维重建图、c:注射75分钟后的CT图像及对应的三维重建图)；

图11为本发明反应方程式简图（Ac₂O为醋酸酐，N(C₂H₅)₃为三乙胺）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）用5mL的二甲基亚砜溶解60.00mg的mPEG-COOH，然后加入57.51mg的EDC·HCl（用5mL的二甲基亚砜溶解）室温搅拌反应30min，然后加入34.53mg的NHS（用5mL的二甲基亚砜溶解）继续室温搅拌3h。

（2）用10mL的二甲基亚砜溶解25.00mg的PEI，然后边搅拌边滴加步骤（1）所制备的溶液，反应3天，随后将反应产物在水中透析3天(9x2L)透析，冷冻干燥得白色粉末固体PEI-mPEG。

（3）取步骤（2）所制固体PEI-mPEG5.00mg溶于水中，取269.1μL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入1.237mL的1mg/mL的NaBH₄溶液，溶液瞬间变成酒红色，在室温下继续强力搅拌反应2h。

（4）向步骤（3）的反应液中加入27.32μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入16.97μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h完成乙酰化过程，随后将反应产物先在PBS(磷酸盐)缓冲溶液中透析1天(3x2L)，再在水中透析1天(3x2L)，冷冻干燥得到PEI包裹的纳米金颗粒（{(Au⁰)₁₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs）。

制备的纳米金颗粒（{(Au⁰)₁₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs），其紫外－可见光谱在512nm处显示纳米金颗粒的表面等离子体共振峰（参见附图2a）;TEM测试结果显示其纳米金颗粒粒径为1.9nm，分布均匀（参见附图5a）。

实施例2

（3）取步骤（2）所制固体PEI-mPEG5.00mg溶于水中，取538.2μL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入2.474mL的1mg/mL的NaBH₄溶液，溶液瞬间变成酒红色，在室温下继续强力搅拌反应2h。

（4）向步骤（3）的反应液中加入27.32μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入16.97μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h完成乙酰化过程，随后将反应产物先在PBS(磷酸盐)缓冲溶液中透析1天(3x2L)，再在水中透析1天(3x2L)，冷冻干燥得到PEI包裹的纳米金颗粒（{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs）。

制备的纳米金颗粒（{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs），其¹H NMR谱图在1.8ppm的信号代表二级酰胺的乙酰基(-NHCOCH₃)的甲基质子信号，2.1ppm的信号对应于三级酰胺的乙酰基

的甲基质子信号。根据二级酰胺的乙酰基(-NHCOCH₃)的甲基质子信号的峰面积与PEI的亚甲基质子信号的峰面积之比计算知PEI表面的氨基已全部被乙酰化（见附图1b）。其紫外－可见光谱在515nm处显示纳米金颗粒的表面等离子体共振峰（见附图2a）。TEM测试结果显示其纳米金颗粒粒径为2.9nm，分布均匀（见附图5b），高分辨TEM图片（参见附图6b）和选区电子衍射图（SAED）表明其纳米金颗粒晶格清晰可见。（111）、（200）、（220）和（311）环说明其纳米金颗粒呈面心立方（fcc）晶体结构(参见附图6c)。{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的EDS谱（X-射线能谱分析）则证实金元素的存在（参见附图6d）。

实施例3

（3）取步骤（2）所制固体PEI-mPEG5.00mg溶于水中，取807.3μL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入3.711mL的1mg/mL的NaBH₄溶液，溶液瞬间变成深红色，在室温下继续强力搅拌反应2h。

（4）向步骤（3）的反应液中加入27.32μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入16.97μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h完成乙酰化过程，随后将反应产物先在PBS(磷酸盐)缓冲溶液中透析1天(3x2L)，再在水中透析1天(3x2L)，冷冻干燥得到PEI包裹的纳米金颗粒（{(Au⁰)₃₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs）。

制备的纳米金颗粒（{(Au⁰)₃₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs），其紫外－可见光谱在523nm处显示纳米金颗粒的表面等离子体共振峰（参见附图2a）。TEM测试结果显示其纳米金颗粒粒径为3.9nm，分布均匀（见附图5c）。

实施例4

（3）取步骤（2）所制固体PEI-mPEG5.00mg溶于水中，取1076.4μL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入4.948mL的1mg/mL的NaBH₄溶液，溶液瞬间变成深红色，在室温下继续强力搅拌反应2h。

（4）向步骤（3）的反应液中加入27.32μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入16.97μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h完成乙酰化过程，随后将反应产物先在PBS(磷酸盐)缓冲溶液中透析1天(3x2L)，再在水中透析1天(3x2L)，冷冻干燥得到PEI包裹的纳米金颗粒（{(Au⁰)₄₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs）。

制备的纳米金颗粒（{(Au⁰)₄₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs），其紫外－可见光谱在530nm处显示纳米金颗粒的表面等离子体共振峰（参见附图2a）。TEM测试结果显示其纳米金颗粒粒径为4.6nm，分布均匀（见附图5d）。

实施例5

分别用10mL的蒸馏水溶解干重为1.00mg的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs(n=50(1)、100(2)、150(3)、200(4)、250(5)、300(6)、350(7)、400(8))和{(Au⁰)_n-PEI-mPEG}NPs(n=50(1)、100(2)、150(3)、200(4)、250(5)、300(6)、350(7)、400(8))。然后在25℃依次测其紫外吸收值，通过图2知，在520nm左右是金原子的表面等离子体共振峰，说明材料已成功包裹纳米金粒子。进一步通过紫外可见吸收光谱图发现，随着Au/PEI摩尔比的递增金原子的表面等离子体共振峰略红移，说明随着Au/PEI摩尔比的递增，Au NPs平均直径增大，这与材料的透射电镜图（附图5）相吻合。

实施例6

用10mL的蒸馏水溶解1.00mg的{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs(n=50(1)、100(2)、150(3)、200(4)、250(5)、300(6)、350(7)、400(8))，得溶液，分成A与B，A与B各5mL。将A溶液通过温度调节，温度依次设为4、25、37及50℃，分别测定各个温度值下溶液的紫外吸收值（图4）；依次测定B溶液在pH为5、6、7、8下的紫外吸收值（图3）。发现{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs在不同温度、不同pH值下的的表面等离子体共振峰没有发生明显的位移，说明纳米颗粒在给定温度和pH范围内具有较好的稳定性。

实施例7

分别取0.1mg/mL{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs用超纯水配制成1.5mL的水溶液，然后测表面电势和水动力直径（如表1）。电势测量结果（表1）表明，由于大量表面氨基的存在，{(Au⁰)₂₀₀-PEI-mPEG}NPs的表面电势是+29.7mV，乙酰化之后，{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的表面电势降到了+8.6mV。说明纳米颗粒的表面氨基已成功乙酰化。但是，乙酰化后纳米颗粒的表面电势未达到中性，这可能是因为表面部分氨基与金原子发生强相互作用，因此不能再发生乙酰化反应。乙酰化前后，纳米金颗粒的水动力直径均较小，说明其具有良好的胶体稳定性。

表1.{(Au⁰)_n-PEI-mPEG}NPs和{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs的电势和水动力直径。

实施例8

实施例9

以KB细胞（一种人类口腔上皮癌的细胞株）为模型细胞检测实施例1制备的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的细胞毒性。称取{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs1mg，配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用无菌的PBS配制浓度为150、750、1500、2250和3000μg/mL的无菌纳米颗粒胶体（材料加入培养基中其浓度要稀释10倍）。KB细胞种植于96孔板后与{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs在浓度为15、75、150、225和300μg/mL和37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时，然后弃去培养液，并加入150μL DMSO，振荡15分钟后用酶标仪测量在570nm处吸光值，并根据此值计算细胞的存活率（如图8）。不同浓度的材料对细胞增殖的影响，并以缓冲液PBS处理细胞为对照。数据处理后发现不同浓度的纳米材料处理后的细胞存活率都在80%以上。这充分说明浓度为15、75、150、225和300μg/mL的纳米材料都具有很低的生物毒性，可以应用到生物体内CT成像诊断。我们进一步通过相差显微镜检测了材料对细胞的毒性。如图9所示，被不同浓度的纳米材料（15、75、150、225和300μg/mL）处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞形态相比，没有发生明显的变化，进一步说明了一定浓度下该纳米材料的低细胞毒性。

实施例10

以SD鼠为模型动物评价{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs的体内CT成像特性。腹腔注射麻药迷昏大鼠，然后向SD鼠尾静脉注射{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs(800μL,[Au]=0.1M)，用CT成像仪测试SD鼠不同时间点的CT成像效果。与未注射纳米金颗粒胶体的对照组相比，注射后15秒，大鼠的主动脉、左右肾静脉、骼总动脉血管清晰可见，明显变亮；注射后30分钟，主动脉、左右肾静脉、骼总动脉的亮度稍弱，而肝脏的亮度明显增加（图10a），说明这段时间纳米金颗粒从主动脉血管逐渐代谢到肝脏区域。注射后75分钟大鼠的主动脉、左右肾静脉、骼总动脉明显变暗而膀胱处明显变亮，说明材料在上述部位已基本代谢。纳米金颗粒随着血液的循环从主动脉、左右肾静脉、骼总动脉逐渐代谢到肝脏区域再转移到膀胱区域。这些实验结果说明制备的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NHAc-mPEG}NPs是一种良好的CT成像造影剂。

Claims

1.一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，包括：

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO。

3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中mPEG–COOH的分子量为2000g/mol，超支化PEI的分子量为25000g/mol。

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中mPEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/ml，EDC·HCl溶液的浓度为10-13mg/ml，NHS溶液浓度为6-8mg/ml，超支化PEI溶液的浓度为2-3mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的透析为透析膜为纤维素透析膜，截留分子量为10000，在水中透析3-4天。

6.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中HAuCl₄溶液的浓度为10mg/mL，NaBH₄溶液的浓度为1mg/ml。

7.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中透析为透析膜为纤维素透析膜，截留分子量为10,000，先在PBS缓冲溶液中透析1-2天，再在水中透析1-2天。

8.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中所得的mPEG修饰的PEI包裹的纳米金粒子为{(Au⁰)_n-PEI.NHAc-mPEG}NPs应用于血池CT成像。