CN105647908A - 一种聚合酶链式反应的优化方法 - Google Patents

一种聚合酶链式反应的优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种聚合酶链式反应的优化方法，所述优化方法中有效用量的聚乙烯亚胺PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料作为添加剂加入到聚合酶链式反应PCR中。本发明具有优化扩增的效果显著，添加剂成本低廉，易于保存，应用广泛的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高；在基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片等领域有着潜在而巨大的应用价值。

Description

一种聚合酶链式反应的优化方法
技术领域
本发明属于聚合酶链式反应领域，特别涉及一种聚合酶链式反应的优化方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR技术由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生，并因此荣获1993年诺贝尔化学奖。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的TaqDNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加，即使目的DNA分子的合成量呈指数增长，因此微量的遗传物质在数小时内即能扩增数百万达到检测水平，可进行测序、DNA探测、基因分析、食品检验、环境监测等。具体说来，PCR的体外酶促合成特异DNA片段，主要由高温变性、低温退火和适温延伸等三个步骤反复的热循环构成。即在高温(95℃)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；然后在低温(37～55℃)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度(72℃)下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。如此反复进行，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。PCR技术具有特异性高、灵敏度高、快速、易自动化等突出优点，彻底改革了分子遗传学，成为现代生物学和药物科学最流行的技术之一，与克隆、DNA序列分方法构成了整个现代分子生物学研究工作的基础。
尽管PCR技术已发展成为一项相当成熟的技术，但在实际操作中，PCR扩增始终存在一些难以克服的问题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖带或涂抹带等，寻找解决PCR中这些问题的方法至关重要，常规的办法有向PCR体系中添加各种添加剂，优化PCR体系的各种参数，改进PCR的扩增策略等，这些方法虽然在一定程度上提高了PCR的特异性、产量以及效率，但是并未彻底解决上述难题，PCR扩增仍达不到理想的预期效果。常用的添加剂有甘油、牛血清白蛋白、二甲基亚砜、甜菜碱、氯化四甲基铵、甲酰胺及单链结合蛋白等。这些优化剂的作用机理各不相同，所适用的范围也是不一样的。但是，目前已经发现的PCR体系优化剂主要是小分子化合物、高聚物以及蛋白质，这些添加剂只可以使扩增体系的某一方面得到优化；甚至在改善一种特性时会牺牲其它方面，如甜菜碱，提高特异性时产量会降低；还有一些添加剂在某些体系有作用，在其它体系则无效。
自从20世纪90年代初，人们认识到量子尺度效应并提出纳米材料的概念以来，在过去的十几年里，这一研究领域已经取得了令人瞩目的进展。纳米材料在生物医药领域的应用研究已经被许多国家列为纳米科技发展的重点。纳米材料因其独特的理化性质而越来越多的被研究者应用到PCR反应中，这为改善PCR技术打开了新的思路，大大拓宽了PCR技术的应用范围。
经对现有技术文献的检索发现，美国专利USPATENT5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB,single-strandednucleicacidbindingprotein)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于－20℃，并且其生物活性保持期限较短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚合酶链式反应的优化方法，该方法增加PCR反应的特异性，提高PCR目标产物的产量的效果。同时，由于该树枝状聚合物复合物成本低廉，易于保存，相比于其他生物分子添加材料SSB等成本大大降低。
为了提高PCR反应的扩增特异性和目标DNA的产量，同时不引起成本的明显增高，本发明提供一种新的优化聚合酶链式反应的方法。
本发明的一种聚合酶链式反应的优化方法，有效用量的聚乙烯亚胺PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料作为添加剂加入到聚合酶链式反应PCR中；其中，有效用量的确定方法包括：通过对PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料的有效用量。
所述包裹纳米金颗粒的PEI复合材料为Au/PEI摩尔比为100:1，200:1，300:1的超支化的聚乙烯亚胺树枝状大分子。
所述PEI的末端基团为氨基、乙酰基、羧酸基或羟基。
所述聚合酶链式反应体系为易产生非特异性扩增的体系、GC含量高的扩增体系、模板数为低拷贝(小于103)的体系、复杂基因背景体系和人基因组ApolipoproteinE(ApoE)基因的高GC含量扩增体系中的至少一种。
所述产生非特异性扩增的PCR再扩增体系可以作为一个典型的体系。PCR再扩增体系是指以第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，进行第二次扩增；当以第一次扩增的产物稀释10倍作为第二次扩增的模板，且在常规PCR扩增体系下进行扩增时，会产生大量的非特异性扩增产物，而如果在该PCR体系中加入适量的特定末端端基的树枝状聚合物材料，则能够消除这些非特异性扩增，在琼脂糖凝胶电泳图上得到单一的目标产物。
针对产生非特异性扩增的PCR反应体系，PEI产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系0.45～0.49mg/L。
针对产生非特异性扩增的PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系0.36～0.42mg/L。
针对产生非特异性扩增的PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系0.34～0.39mg/L。
针对产生非特异性扩增的PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系0.24～0.34mg/L。
针对产生非特异性扩增的PCR反应体系，乙酰化的Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系40～70mg/L。
针对高GC含量PCR反应体系，PEI产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系12～14mg/L。
针对高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系8～10mg/L。
针对高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系5.6～8mg/L。
针对高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系4～6mg/L。
针对改进的高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系3.2～4mg/L。
针对改进的高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系2.4～3.2mg/L。
针对改进的高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系2～2.8mg/L。
针对缩短变性时间至25s的高GC含量PCR反应体系，Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}产生优化作用的有效用量为每25μLPCR反应体系4mg/L。
聚乙烯亚胺(PEI)是一类树枝状大分子。PEI的结构有两种类型：线型PEI和支化PEI。用于PCR的聚乙烯亚胺基本上都是超支化结构，支化PEI分子量大多为25000。PEI分子由CH2CH2N结构单元组成，是已知的电荷密度最大的阳离子有机高分子。在生理条件下能部分质子化可以使PEI分子带有正电荷。这类分子具有精确的表面功能团，很容易进行修饰和改性。
所述的超支化聚乙烯亚胺结构如下所示，其具有高度对称的几何构造、很精确的分子结构以及其分子量可控的优点。PEI具有很多的末端氨基，可被其他基团共价结合，从而得到不同功能化的聚乙烯亚胺；其三维结构内部可形成空腔，可以包裹纳米金颗粒等其他无机颗粒，可以增加它的刚性。聚乙烯亚胺结构的多样性决定了它在研究的各个方面具有不同的功能。目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献(Macromolecules,1986,19,2466；Tomalia,D.A.；Frechet,J.M.J.DendrimersandOtherDendriticPolymers.NewYork,JohnWiley&SonsLtd,2001)。
所述包裹纳米金颗粒的PEI复合物(PEIentrappedgoldnanoparticles，AuPENPs)为水溶液。目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献(Zhou,B.,etal.ACSApplMaterInterfaces,2014.6(19):p.17190-9.)。
在实际应用中，将有效量的聚乙烯亚胺复合物作为添加剂加入到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。针对AuPENPs复合物纳米金颗粒与PEI摩尔比不同，聚合酶链式反应体系不同，产生优化作用的所需添加的该复合物有效用量范围是不同的。本领域技术人员可以方便地通过下述方法来实验得出有效用量：针对不同聚合酶链式反应体系，不同Au/PEI摩尔比的聚乙烯亚胺复合物产生优化作用的有效用量范围通过以下方法进行确定：通过对该种AuPENPs复合物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该AuPENPs复合物的有效用量范围。
所述的PCR体系的一般组成成份见于各种常用分子生物学工具书或各种商业聚合酶说明书。以Takara公司rTaq酶为例，一个PCR扩增反应的组成为：
所述的PCR反应的一般过程为：
(1)制备PCR反应体系，包括合适用量的DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR缓冲液等；
(2)在PCR仪上以设定的程序进行PCR反应；
(3)扩增完成后的产物进行检测。
当该PCR反应需要优化时，在制备PCR反应体系过程中加入起优化作用的添加剂，在本发明中，添加剂为有效量的包裹纳米金颗粒的聚乙烯亚胺复合物。
PCR产物检测可以采用多种检测方法，如对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对扩增后样品进行毛细管电泳检测，或在实时定量PCR仪上进行实时定量检测PCR的实时扩增过程。
本发明与已有方法相比，具有优化扩增的效果显著，添加剂AuPENPs复合物成本低廉，易于保存，应用广泛的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。和之前申请的相关专利相比，如纳米金颗粒(专利号CN200410099186.7)和树状大分子(专利申请号CN200810041931.0)，本发明中AuPENPs复合物的水溶液可以长期保存在4℃和-20℃，并且没有失去活性和形成聚集的担心，另外由于分子内部包裹了纳米金颗粒，使得表面有效基团大大增加，用量更省。聚乙烯亚胺价格(一般低于0.005元/反应)也比单链结合蛋白(0.48元/反应)便宜很多，试剂均一度好，易于保存和准确加样。本发明优化后的PCR反应体系不仅适用于控温精确的PCR仪，也适用于控温性能较差的PCR仪。本发明发展的向PCR反应中添加包裹纳米金颗粒的聚乙烯亚胺复合物的方法可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法诸如：一次扩增不成功而需要再扩增、高GC含量的扩增、人类基因组GAP的扩增、高背景低拷贝模板的扩增、古生物DNA扩增等等。本发明也适用于实时定量PCR反应。本发明对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。
有益效果
(1)本发明的方法优化扩增的效果显著，添加剂成本低廉，易于保存，应用广泛；
(2)本发明对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中PCR体系进行第一次扩增结果图；
图2为实施例1中添加PEI对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；
图3为实施例2中添加Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；
图4为实施例3中添加Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；
图5为实施例4中添加Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；
图6为实施例5中添加末端氨基乙酰化的Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；
图7为实施例6中添加PEI对高GC含量PCR反应进行优化的效果图；
图8为实施例7中添加Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化的效果图；
图9为实施例8中添加Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化的效果图；
图10为实施例9中添加Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化的效果图；
图11为实施例10中添加PEI(a),{(Au)100-PEI-mPEG24}(b),{(Au)200-PEI-mPEG24}(c)and{(Au)300-PEI-mPEG24}(d)对缩短PCR反应时间的PCR反应进行优化的效果图；其中d图中的第四列和第五列是缩短了变性时间至25s的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
添加单纯PEI对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。
在进行一些目标模板很少或样品极其稀少的扩增实验时，常常会发现一次扩增无法得到目标条带，这时就需要进行再扩增，即用一次扩增得到的产物作为模板继续进行第二次的扩增，提高产物中目标条带的产量。但是用再扩增提高产量的同时也会形成一些非特异性的扩增。
针对这种形成非特异性扩增的PCR再扩增情况，通过向PCR再扩增体系中添加有效量的树枝状聚合物来实现对其的优化。
具体而言，包括下列步骤：
1、制备PCR体系进行第一次扩增。
体系组成如下表：
Takara rTaq酶(5U/μL) 0.125μL
10×PCR缓冲液(不含Mg2+) 2.5μL
dNTP底物(2.5mM) 2μL
Mg2+(25mM) 1.5μL
引物p1(10μM) 0.5μL
引物p2(10μM) 0.5μL
模板 0.5μL
H2O 补足总体积至25μL
其中，模板为lambdaDNA，稀释为108copy/μL，rTaq酶购自Takara公司，扩增片段长度为283bp。引物序列为p1:5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3'；p2:5'-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3'。
扩增条件为：95℃预热3分钟；30个循环，每个循环包括：94℃变性20秒，55℃退火30分钟，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5min。
对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现明亮的单一目标条带，说明第一次扩增结果良好，如图1所示。
2、将购买的PEI配成浓度为1μg/μL，分子量为25000，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
3、向以上PCR体系中加入不同体积的PEI，使得每25μLPCR反应体系中PEI的浓度分别为0,0.4,0.45,0.47,0.49,0.52mg/L，同时做不加优化剂的相应对照组。
4、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序与第一次扩增条件相同。
5、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检查扩增条带，与对照体系进行比较。
扩增结果如图2所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入PEI水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6为分别加入0.4,0.45,0.47,0.49,0.52mg/LPEI的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入PEI为0.4～0.49mg/L的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是PEI加入量为0.45～0.49mg/L左右时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入PEI的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。
实施例2
添加Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)100-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为92700，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图3所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)100-PEI-mPEG24}水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6分别为加入0.3,0.36,0.38,0.42,0.46mg/L{(Au)100-PEI-mPEG24}的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)100-PEI-mPEG24}为0.3～0.42mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)100-PEI-mPEG24}加入量为0.36～0.42mg/L时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au)100-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。
实施例3
添加Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)200-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为112400，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图4所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)200-PEI-mPEG24}水溶液的再扩增体系；2，3，4，5分别为加入0.32,0.34,0.39,0.43mg/L{(Au)200-PEI-mPEG24}的再扩增体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)200-PEI-mPEG24}为0.32～0.39mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)200-PEI-mPEG24}加入量为0.34～0.39mg/L时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au)200-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。
实施例4
添加Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)300-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为132100，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图5所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)300-PEI-mPEG24}水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6分别为加入0.2,0.24,0.28,0.34,0.38mg/L{(Au)300-PEI-mPEG24}的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)300-PEI-mPEG24}为0.2～0.34mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)300-PEI-mPEG24}加入量为0.24～0.34mg/L时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au)300-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。
实施例5
添加乙酰化了的Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图6所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6分别为加入20,40,60,70,80mg/L{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}为20～70mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}加入量为40～70mg/L时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au)200-PEI-Ac-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。
实施例6
在进行一些目标模板中GC碱基较高的扩增实验时，常常因为其中的二级结构导致错配，和GC间的三个氢键需要较高的温度才能断裂，而太高的温度又会使酶失活，因此常常会得不到目标条带，或者只能得到非特异性条带。
针对这种容易得不到目的条带或者有非特异性扩增的PCR扩增情况，通过向PCR高GC含量体系中添加有效量的树枝状聚合物来实现对其优化。
具体而言，包括下列步骤：
1、制备高GC含量扩增体系。
体系组成如下表：
Takara rTaq酶(5U/μL) 0.125μL
10×PCR缓冲液(不含Mg2+) 2.5μL
dNTP底物(2.5mM) 2μL
Mg2+(25mM) 1.5μL
引物p3(10μM) 0.5μL
引物p4(10μM) 0.5μL
模板 1μL
H2O 补足总体积至25μL
高GC含量体系将选用Mousavian,Z等(Mousavian,Z.,etal.AdvBiomedRes,2014,3,65)提到以人类基因组为模板，扩增ApolipoproteinE(ApoE)基因时,即使在复杂的且时间非常长的PCR程序下，也只能得到有非特异性的条带，当缩短PCR时间时，会无法得到目标条带。扩增高GC含量的DNA片段常常会遇到无法得到目标条带的问题，因此我们还建立了扩增人类ApoE基因片段的体系，用来进一步研究纳米材料对高GC含量扩增体系的优化效果。以人类基因组作为模板，用量为200ng/uL，扩增片段长度约为219bp。PCR体系为25uL，引物序列为p3:5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’；p4:5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’。扩增条件为：94℃预变性2分钟；35个循环，每个循环包括：94℃变性1分钟，64.2℃退火2分钟，72℃延伸3分钟；最后72℃延伸5分钟。
2、将购买的PEI配成浓度为1μg/μL，分子量为25000，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
3、向以上PCR体系中加入不同体积的PEI，使得每25μLPCR反应体系中PEI的浓度分别为0,10,12,14,16mg/L，同时做不加优化剂的相应对照组。
4、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序与第一次扩增条件相同。
5、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检查扩增条带，与对照体系进行比较。
扩增结果如图7所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入PEI水溶液的高GC体系；2，3，4，5为分别加入10,12,14,16mg/LPEI的高GC体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入PEI为12～14mg/L的体系PCR扩增得到单一目标带，而相应的未加入PEI的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性。
实施例7
添加Au/PEI摩尔比为100:1的{(Au)100-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例6，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)100-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为92700，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图8所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)100-PEI-mPEG24}水溶液的高GC体系；2，3，4，5，6分别为加入6,8,10,12,14mg/L{(Au)100-PEI-mPEG24}的高GC体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)100-PEI-mPEG24}为8～10mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)100-PEI-mPEG24}加入量为8mg/L时扩增得到单一目标带，而相应的未加入{(Au)100-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性。
实施例8
添加Au/PEI摩尔比为200:1的{(Au)200-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例6，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)200-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为112400，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图9所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)200-PEI-mPEG24}水溶液的高GC体系；2，3，4，5，6分别为加入5,5.6,6,8,10mg/L{(Au)200-PEI-mPEG24}的高GC体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)200-PEI-mPEG24}为5.6～8mg/L的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au)200-PEI-mPEG24}加入量为6mg/L时扩增得到单一目标带，而相应的未加入{(Au)200-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性。
实施例9
添加Au/PEI摩尔比为300:1的{(Au)300-PEI-mPEG24}对高GC含量PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程同实施例6，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au)300-PEI-mPEG24}，浓度为1.0μg/μL，分子量为132100，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图10所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au)300-PEI-mPEG24}水溶液的高GC体系；2，3，4，5分别为加入4,5.6,6,8mg/L{(Au)300-PEI-mPEG24}的高GC体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au)300-PEI-mPEG24}为4～6mg/L的体系，PCR扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au)300-PEI-mPEG24}的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性。
实施例10
添加PEI(a),{(Au)100-PEI-mPEG24}(b),{(Au)200-PEI-mPEG24}(c)and{(Au)300-PEI-mPEG24}(d)对缩短PCR总时间和只缩短变性时间至25s的改进高GC含量PCR反应进行优化。
反应体系和具体过程大致同实施例6，只是(1)PCR扩增条件改变为：94℃预变性2分钟；35个循环，每个循环包括：94℃变性45s，64.2℃退火90s，72℃延伸60s；最后72℃延伸5分钟；(2)PCR扩增条件实施例6，唯一的不同是变性时间缩短为25s(见图10中d图的第四列和第五列)。另外就是添加的优化剂为自制的PEI(a),{(Au)100-PEI-mPEG24}(b),{(Au)200-PEI-mPEG24}(c)and{(Au)300-PEI-mPEG24}(d)，浓度均为1.0μg/μL，使用前需要在超净台中稀释10倍后备用。
扩增结果如图11所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入材料水溶液的扩增体系；最后一列为不加入模板的空白对照,(b)图中2，3，4分别为加入3.2,4,4.4mg/L{(Au)100-PEI-mPEG24}的高GC体系，(c)图中2，3，4分别为加入2.4,3.2,3.6mg/L{(Au)200-PEI-mPEG24}的高GC体系,(d)图中2，3，4，5分别为加入2,2.8,0,4mg/L{(Au)300-PEI-mPEG24}的高GC体系。可以看出加入PEI时没有效果(a)，而当加入3.2～4mg/L的{(Au)100-PEI-mPEG24}(b)，2.4～3.2mg/L的{(Au)200-PEI-mPEG24}(c)或者2～2.8mg/L的{(Au)300-PEI-mPEG24}(d)时，PCR扩增由无目标条带变成了有单一目标带，另外加入4mg/L的{(Au)300-PEI-mPEG24}时，PCR产品由有非特异性条带(d中第四列)变成了单一条带(d中第五列)。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和效率。

Claims (6)

1.一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，有效用量的聚乙烯亚胺PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料作为添加剂加入到聚合酶链式反应PCR中；其中，有效用量的确定方法包括：通过对PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为PEI或者包裹纳米金颗粒的PEI复合材料的有效用量。
2.根据权利要求1所述的一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，所述包裹纳米金颗粒的PEI复合材料为Au/PEI摩尔比为100:1，200:1，300:1的超支化的聚乙烯亚胺树枝状大分子。
3.根据权利要求1或2所述的一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，所述PEI的末端基团为氨基、乙酰基、羧酸基或羟基。
4.根据权利要求1所述的一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应体系为易产生非特异性扩增的体系、GC含量高的扩增体系、模板数为低拷贝的体系、复杂基因背景体系和人基因组ApolipoproteinE基因的高GC含量扩增体系中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，所述PCR反应的步骤包括：制备PCR反应体系；在PCR仪上以设定的程序进行PCR反应；对扩增完成后的产物进行检测。
6.根据权利要求5所述的一种聚合酶链式反应的优化方法，其特征在于，所述制备PCR反应体系包括DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR缓冲液；所述对扩增完成后的产物进行检测包括：对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对扩增后样品进行毛细管电泳检测，或实时定量检测PCR的实时扩增过程。
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