CN101974628A

CN101974628A - 包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶反应的应用

Info

Publication number: CN101974628A
Application number: CN 201010506888
Authority: CN
Inventors: 曹雪雁; 陈晶晶; 史向阳
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明涉及一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。本发明扩增显著，成本低，应用广泛，添加剂易于保存；在基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片等领域有着潜在而巨大的应用价值。

Description

包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶反应的应用

技术领域

本发明属包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的应用领域，特别是涉及一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术。该技术由K.Mullis于1985年发明，他本人也因此于1995年获得了诺贝尔化学奖。PCR技术模拟了体内DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温(95℃)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(37～55℃)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq DNA聚合酶的最适温度(72℃)下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，PCR产物得以2ⁿ的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增10⁹倍以上。

短短几十年，PCR技术因其特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、可定量模板数等优点，在生物科学众多领域的应用日趋广泛。在分子生物学研究中，PCR是必备的基础技术之一；在医学临床诊断方面，实时定量PCR技术已应用于乙肝病毒、HIV病毒的检测；应用PCR技术还可检测正在繁殖的病原体或处于潜伏期的病原体，尤其对于目前尚不能在体外培养或难以培养的病原体，其检测结果对临床诊断有重要的参考价值；PCR技术在法医鉴定、古生物学研究等方面也有不可替代的作用。

尽管PCR技术已经日益成为一个成熟的技术，但实际操作中，进行PCR扩增仍旧存在一些需要改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题。最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的DNA链式扩增反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。科学家们从不同的角度来尝试解决这个问题，如从模板、引物、Mg²⁺浓度、退火温度等角度改善其特异性，或者将增效剂如甲酰胺、甘油、二甲基亚砜，甜菜碱、氯化四甲基铵等引入PCR体系。但是在实际应用过程中，有些效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩增过程。

经对现有技术文献的检索发现，美国专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于-20℃，并且其生物活性保持期限较短。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，扩增效果显著，成本低廉，应用广泛。

本发明的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。

具体步骤包括：

(1)按照常规方法制备PCR反应体系，包括合适用量的DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR缓冲液等；

(2)进行PCR反应；第一次扩增完成后对产物进行检测；

(3)制备再扩增体系

体系组成与上述第一次扩增相同，但模版为稀释1000倍的上述第一次扩增产物，引物序列不变；加入包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物进行扩增；所述扩增程序与第一次扩增条件相同。

所述步骤(1)或(2)均为常规方法。

所述步骤(2)PCR产物检测可以采用多种检测方法，如对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对扩增后样品进行毛细管电泳检测，或在实时定量PCR仪上进行实时定量检测PCR的实时扩增过程。

树状大分子是一类树枝状结构的高度单分散的合成性大分子，它的几何形状和化学结构精确可控。它具有非常精确的核、内部空间和表面功能基团。它的分子量随着代数的增加而精确的增加，在代数增加至4代时，整个分子呈球形结构。这类分子具有精确的表面功能团，很容易进行修饰和改性。适合的树枝状聚合物实例见Angew.Chem.Int.Ed.Engl，1990，29(2)第138-175页所述。

所述的树状大分子是聚酰胺-胺型或聚丙烯亚胺型dendrimer。其中聚酰胺-胺型聚合物是以乙二胺或丁二胺为核生长的。随着代数的增加，树状大分子的末端氨基基团呈指数增长，即末端氨基基团数＝2^(代数+2)。本发明优选的是基于乙二胺核的聚酰胺-胺型(PAMAM)dendrimer。

所述基于乙二胺核的聚酰胺-胺型树状大分子的代数以3.0到8.0(G₃～G₈)为佳，优选聚合度5.0(G₅)的聚酰胺-胺型dendrimer。目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献(Macromolecules，1986，19，2466；Tomalia，D.A.；Frechet，J.M.J.Dendrimers andOther Dendritic Polymers.New York，John Wiley & Sons Ltd，2001)。

所述包裹纳米金颗粒的PAMAM dendrimer复合物(PAMAM dendrimer entrapped goldnanoparticles，Au DENPs)为水溶液，可以自制纳米金颗粒与第五代dendrimer(G5.NH₂)一定摩尔比的样品，目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献(Soft Matter，2007，3，71-74；Journal of Physical Chemistry C，2010，114，50-56)，优选的Au/G5.NH₂摩尔比为25∶1，50∶1，75∶1，100∶1。图1为Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的Au DENPs复合物分子动力学模拟结构图。

所述Au DENPs复合物表面氨基可以部分或全部连接上各种修饰官能基团，优选来自下列基团的修饰基团：乙酰基和羟基。末端基团的修饰方法是公知的(Soft Matter，2007，3，71-74)，可以通过使dendrimer表面氨基全部或部分与合适的反应剂反应来获得。Au DENPs合成过程及末端氨基的修饰反应见图2。

在实际应用中，将有效量的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物作为添加剂加入到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。针对Au DENPs复合物纳米金颗粒与dendrimer摩尔比不同，末端端基不同，聚合酶链式反应体系不同，产生优化作用的所需添加的该复合物有效用量范围是不同的。本领域技术人员可以方便地通过下述方法来实验得出有效用量：

针对不同聚合酶链式反应体系，不同端基和Au/dendrimer摩尔比的树状大分子复合物产生优化作用的有效用量范围通过以下方法进行确定：通过对该种Au DENPs复合物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该Au DENPs复合物的有效用量范围。

所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的有效用量为0.3nM-1.0μM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为25∶1的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.4nM～0.57nM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.4nM～0.49nM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为75∶1的{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.39nM～0.51nM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为100∶1的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.31nM～0.43nM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100％末端氨基羟基化的Au∶G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.42nM～1.35nM。

所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100％末端氨基乙酰化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系42.85nM～0.96μM。

所述聚合酶链式反应体系可以是那些容易产生非特异性扩增的体系、GC含量高的扩增体系、模板数为低拷贝(小于10³)的体系、复杂基因背景体系或包含上述数种因素的体系。

例如，产生非特异性扩增的PCR再扩增体系可以作为一个典型的体系。PCR再扩增体系是指以第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，进行第二次扩增。当以第一次扩增的产物稀释1000倍作为第二次扩增的模板，且在常规PCR扩增体系下进行扩增时，会产生大量的非特异性扩增产物，而如果在该PCR体系中加入适量的特定末端端基的树枝状聚合物材料，则能够消除这些非特异性扩增，在琼脂糖凝胶电泳图上得到单一的目标产物；

所述聚合酶链式反应体系也可以是扩增大鼠Thy-1基因的扩增体系。

所述的PCR体系的一般组成成份见于各种常用分子生物学工具书或各种商业聚合酶说明书。以Takara公司Ex Taq酶为例，一个PCR扩增反应的组成为：

Ex Taq酶(5U/μL)	0.125μL
		10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)	2.5μL
dNTP底物(2.5mM)	2μL
		Mg²⁺(25mM)	1.5μL
引物1(10μM)	0.5μL
		引物2(10μM)	0.5μL
模板	0.5μL
		H₂O	加水补足总体积为25μL

本发明与已有方法相比，具有优化扩增的效果显著，添加剂Au DENPs复合物成本低廉，易于保存，应用广泛的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。和之前申请的相关专利相比，如纳米金颗粒(专利号CN200410099186.7)和树状大分子(专利申请号CN200810041931.0)，本发明中Au DENPs复合物的水溶液可以长期保存在4℃和-20℃，并且没有失去活性和形成聚集的担心，另外由于分子内部包裹了纳米金颗粒，使得表面有效基团大大增加，用量更省。树状大分子复合物价格(一般低于0.03元/反应)也比单链结合蛋白(0.48元/反应)便宜，试剂均一度好，易于保存和准确加样。本发明优化后的PCR反应体系不仅适用于控温精确的PCR仪，也适用于控温性能较差的PCR仪。本发明发展的向PCR反应中添加包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的方法可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法诸如：一次扩增不成功而需要再扩增、高GC含量的扩增、人类基因组GAP的扩增、高背景低拷贝模板的扩增、古生物DNA扩增等等。本发明也适用于实时定量PCR反应。本发明对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。

附图说明

图1为Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的Au DENPs复合物分子动力学模拟结构图；

图2为Au DENPs合成过程及末端氨基的修饰反应图；

图3添加Au/G5.NH₂摩尔比为25∶1的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；

图4添加Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；

图5添加Au/G5.NH₂摩尔比为75∶1的{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；

图6添加Au/G5.NH₂摩尔比为100∶1的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；

图7添加100％末端氨基羟基化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图；

图8添加100％末端氨基乙酰化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

添加Au/G5.NH₂摩尔比为25∶1的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。

在进行一些目标模板很少或样品极其稀少的扩增实验时，常常会发现一次扩增无法得到目标条带，这时就需要进行再扩增，即用一次扩增得到的产物作为模板继续进行第二次的扩增，提高产物中目标条带的产量。但是用再扩增提高产量的同时也会形成一些非特异性的扩增。

针对这种形成非特异性扩增的PCR再扩增情况，通过向PCR再扩增体系中添加有效量的树枝状聚合物来实现对其的优化。

具体而言，包括下列步骤：

1、制备PCR体系进行第一次扩增。

体系组成如下表：

Takara Ex Taq酶(5U/μL)	0.125μL
		10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)	2.5μL
dNTP底物(2.5mM)	2μL
		Mg²⁺(25mM)	1.5μL
引物p1(10μM)	0.5μL
		引物p2(10μM)	0.5μL
模板	0.5μL
		H₂O	补足总体积至25μL

其中，模板为lambdaDNA，稀释为10⁷copy/μL，Ex Taq酶购自Takara公司，扩增片段长度为283bp。引物序列为p1：5′-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3′；p2：5′-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3′。

扩增条件为：95℃预热3分钟；30个循环，每个循环包括：94℃变性20秒，55℃退火30分钟，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5min。

对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现明亮的单一目标条带，说明第一次扩增结果良好。

2、制备PCR再扩增体系。

体系组成如上表，但不同的是模板为稀释1000倍的上述第一次扩增产物，引物序列依旧为p1：5′-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3′；p2：5′-CACCACCTGTT CAAACTCTGC-3′。同时，加水补足为25μL之前，需要加入一定量的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs溶液。

3、包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物优化材料制备

Au/dendrimer摩尔比为25∶1的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs为自制，浓度为1μg/μL，分子量为30935，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

4、向以上PCR体系中加入不同体积的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs，使得每25μL PCR反应体系中{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs的浓度分别为0.40nM，0.45nM，0.51nM，0.57nM，同时做不加优化剂的相应对照组。

5、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序与第一次扩增条件相同。

6、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检查扩增条带，与对照体系进行比较。

扩增结果如图3所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5为分别加入0.40nM，0.45nM，0.51nM，0.57nM{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs的再扩增体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs为0.4nM～0.57nM的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs加入量为0.45nM～0.51nM左右时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

实施例2

添加Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。

反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，浓度为1.0μg/μL，分子量为35860，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

扩增结果如图4所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6分别为加入0.35nM，0.40nM，0.45nM，0.49nM，0.54nM{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs为0.4nM～0.49nM的体系，PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs加入量为0.45nM～0.49nM时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

实施例3

添加Au/G5.NH₂摩尔比为75∶1的{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。

反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs，浓度为1.0μg/μL，分子量为40785，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

扩增结果如图5所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5为分别加入0.39nM，0.45nM，0.51nM，0.57nM{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs的再扩增体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs为0.39nM～0.51nM的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs加入量为0.45nM～0.51nM时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

实施例4

添加Au/G5.NH₂摩尔比为100∶1的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。

反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs，浓度为1.0μg/μL，分子量为45710，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

扩增结果如图6所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5为分别加入0.31nM，0.37nM，0.43nM，0.49nM{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs的再扩增体系；6为不加入模板的空白对照。可以看出加入{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs为0.31nM～0.43nM的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs加入量为0.37nM～0.43nM时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

实施例5

添加100％末端氨基羟基化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化。

反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs，浓度为1.0μg/μL，分子量为40166，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

扩增结果如图7所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5为分别加入0.42nM，1.25nM，1.35nM，1.47nM{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs的再扩增体系。可以看出加入{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs为0.42nM～1.35nM的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs加入量为1.25nM～1.35nM时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NGlyOH}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

实施例6

添加100％末端氨基乙酰化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化

反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是添加的优化剂为自制的{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs，浓度为1.0μg/μL，分子量为41076，使用前需要在超净台中稀释1000倍后备用。

扩增结果如图8所示。从左至右依次为M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs水溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6，7为分别加入42.85nM，53.56nM，64.27nM，0.86mM，0.96mM，1.07mM{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs的再扩增体系。可以看出加入{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs为42.85nM～0.96mM的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs加入量为64.27nM～0.96mM时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc}DENPs的常规PCR体系扩增结果显示严重后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。

Claims

1.一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：具体步骤包括，

(1)按照常规方法制备PCR反应体系；

(2)进行PCR反应；第一次扩增完成后对产物进行检测；

(3)制备再扩增体系

体系组成与上述第一次扩增相同，但模版为稀释1000倍的上述第一次扩增产物，引物序列不变，加入包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物进行扩增；所述扩增与第一次扩增条件相同。

3.根据权利要求2所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物中树状大分子的末端基团为氨基、乙酰基、羟基，或者部分的乙酰基或羟基；树状大分子是代数从3.0到8.0的基于乙二胺核的聚酰胺-胺型dendrimer。

4.根据权利要求2或3所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物是Au∶dendrimer摩尔比为25∶1，50∶1，75∶1，100∶1的代数为5.0的基于乙二胺核的聚酰胺-胺型dendrimer。

5.根据权利要求2所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的有效用量的确定，通过对该种复合物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该复合物的有效用量范围。

6.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为25∶1的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.4nM～0.57nM。

7.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.4nM～0.49nM。

8.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为75∶1的{(Au⁰)₇₅-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.39nM～0.51nM。

9.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au∶G5.NH₂摩尔比为100∶1的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.31nM～0.43nM。

10.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100％末端氨基羟基化的Au∶G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0.42nM～1.35nM；

或所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100％末端氨基乙酰化的Au/G5.NH₂摩尔比为50∶1的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系42.85nM～0.96μM。