CN102203289A

CN102203289A - 利用内部校正定量检测rna

Info

Publication number: CN102203289A
Application number: CN200980142616XA
Authority: CN
Inventors: F·纳兹
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2011-09-28
Also published as: US20110262918A1; EP2352848A1; AU2009306339A1; JP2012506246A; WO2010046441A1

Abstract

本发明涉及一种定量样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤，(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品，(ii)在允许所述染料与所述样品中的一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触，(iii)检测所述样品中所述RNA-结合染料的荧光值，(iv)将所测得的荧光值与样品中的RNA总量相关联，(v)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸，(vi)扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和/或之后，在允许样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合所述一种或多种探针的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针，(vii)检测扩增期间和/或之后，结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光值，并将所测得的荧光值与样品中靶RNA序列的含量相关联，(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。

Description

利用内部校正定量检测RNA

发明技术领域

本发明属于生物学与化学领域。具体说，本发明属于分子生物学领域。更具体说，本发明属于核酸定量与实时PCR领域。此外，本发明涉及经校正的靶核糖核酸定量检测。

背景技术

核酸混合物中特定靶核糖核酸(本文中也称特定RNAs)的定量检测对分子生物学的许多应用，如基因表达分析、或核酸混合物中特定RNA的纯化至关重要。在定量检测方法中，需确定样品中特定RNA的浓度和/或相对或绝对含量。具体说，对于基因表达分析，例如测定生物样品中的mRNA水平，需要一种可重现和比较的方法。例如，不总是能获得具有相当体积、核酸含量、细胞材料等的生物样品。

此外，生物样品中核酸检测和定量的灵敏度和选择性至关重要。为了更好地比较两种或多种不同(生物学)样品中特定RNA的含量或者比较一个样品中两种或多种不同特定RNA的含量，必须把特定RNA的含量按输入核酸或输入核酸中的特定种类为基准进行校正。例如，特定RNA的含量可以通过将这些含量与样品中的内标或全部(即总)核酸量或样品中特定种类核酸的含量相关联而进行校正。

对于(生物学)样品中核酸的常规定量，广泛采用了定量(实时)PCR(qPCR)。对于RNA，具体是mRNA，本领域采用定量实时逆转录PCR(RT-qPCR)。已采用不同的方法对定量PCR方法得到的数据进行校正。将特定mRNA的含量按不同的参比基因，例如持家或保持基因如β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、或者28S或18S核糖体RNA的一种或多种mRNA的含量进行校正就是其中一种方法。然而，已经发现这些校正基因的表达水平取决于实验条件、样品的制备和来源(如组织或细胞类型)而不同，因此它们不是输入核酸的可靠指示。所以，通常需要在费力易错的过程中测试各种不同的持家基因以鉴定在所研究的样品之间没有变化的那些基因。

其它方法有，例如，依靠DNA和/或RNA总量或如核糖体RNA(rRNA)总量进行的校正。由于生物细胞和样品中核糖体RNA的含量同样取决于多种因素而有差异，用rRNA校正也不太优选。本领域现有的依赖于按例如核酸总量、RNA总量或基因组DNA总量进行校正的方法也有局限性，如这些含量变化或核酸样品的质量有所不同。用外来或人造分子如掺入样品(如细胞抽提物或者组织衍生样品)中的体外转录产物进行校正也不总是充分的方案，因为它们不能代表细胞内的核酸(如基因组DNA、RNA、mRNA)含量。

此外，为了比较经校正的数据以及实验方案的重现性，需要对所用的实验条件编制详尽的文档。当分别测定或用不同方法测定感兴趣的核酸与校正核酸的含量时，这一点特别相关。

因此，本发明主要的技术问题是开发和提供一种改进的、特别是较不费力不易错的方法来校正靶核糖核酸的含量。

发明概述

本发明涉及一种定量测定样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤：

(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；

(ii)在允许所述染料与所述样品中一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触；

(iii)测定所述样品中所述RNA-结合染料的荧光；

(iv)将所述测得的荧光与样品中的RNA总量相关联；

(v)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；

(vi)扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和/或之后，在允许一种或多种探针与样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针；

(vii)测定扩增期间和/或之后结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光，并把所述测得的荧光与样品中靶RNA序列的量相关联；

(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。

样品至少含有需定量的核糖核酸的核酸分子。所述核酸可以包含在细胞或者生物体内，但也可以存在于无细胞系统中。样品可以是液体、裂解液、固体基质或其它含有核酸分子的任何物质。在本发明中，样品可以是所有生物组织和所有液体如淋巴液、尿液、脑液。组织可以是，例如上皮组织、结缔组织如骨骼或血液、肌肉组织如内脏或平滑肌和骨骼肌，以及神经组织。在一种实施方式中，样品是细胞培养物或细胞培养抽提物。

本文中，靶核糖核酸可以是任何来源，如病毒、细菌、原始细菌、真菌、核糖体、真核或原核细胞来源。可以来自任何生物学样品和任何生物体、组织、细胞、或亚细胞区室。例如，可以是来自植物、真菌、动物的核酸，特别是人的核酸。在定量之前，可预先处理RNA，如分离、纯化或修饰。也可以定量测定人造RNA。RNA的长度可以不同。可以修饰RNA，例如可含有一种或多种修饰的核苷碱基或修饰的糖基(如含甲氧基团)。在肽核酸(PNA)中，RNA骨架可含一个或多个肽键。RNA可含碱基类似物如非嘌呤或非嘧啶类似物或者核苷酸类似物。也可含其它附着物如蛋白质、肽和/或氨基酸。

本文的“引物”指包含与待转录核酸(“模板”)基本互补序列的寡核苷酸。在复制过程中，聚合酶将各核苷酸加到与模板各对应核苷酸基本互补的引物的3’末端上。

本文的“RNA特异性染料”定义如下：

“RNA特异性染料”的光谱性质不得干扰用来检测靶RNA的光谱性质，允许进行同时检测。用于检测靶RNA的反应混合物含有可能干扰RNA的测定的各种物质，如DNA、核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、洗涤剂、盐。因此，所选的RNA特异性染料受这些物质影响的程度必须不会干扰对RNA的定量测定。在上述物质存在时，要求将RNA的浓度与荧光值之间相关连。

“RNA特异性染料”可以是能与RNA特异性结合、并且基本上不与样品中通常存在的其它核酸如DNA或其它成分结合的染料。结合后，RNA特异性染料的光谱特性可以改变，如荧光增强。

或者，“RNA特异性染料”也可以是与样品中的核酸非特异性结合的染料，但其光谱特性如荧光仅在与RNA结合时才发生显著改变。因此，“RNA特异性染料”允许选择性检测RNA而不受样品中通常存在的其它核酸或蛋白质、洗涤剂、盐或其它成分显著干扰。

本文的“DNA特异性染料”定义如下：“DNA特异性染料”的光谱性质不得干扰用来检测总RNA的染料的光谱性质，允许进行同时检测。“DNA特异性染料”需要对扩增产物有特异性，要么选择对双链DNA有选择性的染料，要么选择对扩增产物序列有选择性的探针。

本文的“荧光探针”是DNA特异性染料或者标记了荧光染料的核酸探针。本发明的核酸探针是与特定核酸序列基本互补的寡核苷酸、核酸或其片段。

RNA特异性染料的光谱性质不同于DNA特异性染料或者荧光染料，因此它们都可以被检出。

本发明还涉及定量测定样品中靶RNA的试剂盒，其包含，(i)与RNA特异性结合的荧光染料，和(ii)一种或多种DNA扩增产物的一种或多种特异性荧光探针。

本文所用的试剂盒是一种包装组件，任选地包括组件的使用说明和/或用于该用途的其它反应物和组分。

本发明还涉及RNA特异性荧光染料如Quant-iT^TM-RNA在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用。

发明详述

本发明人发现某些染料允许对RNA进行校正。本发明涉及一种定量测定样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤：

(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；

(iii)测定所述样品中所述RNA-结合染料的荧光；

(iv)将所述测得的荧光与样品中的RNA总量相关联；

(v)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；

(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。

在所述方法的一种实施方式中，样品为总RNA制品。在另一种具体实施方式中，需定量测定的靶RNA是选自下组的RNA：mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核开关(riboswitch)和病毒RNA，所述RNA总量选自下组：RNA总量、mRNA总量、rRNA总量、tRNA总量、nRNA总量、siRNA总量、snRNA总量、snoRNA总量、scaRNA总量、microRNA总量、dsRNA总量、核酶总量、核开关(riboswitch)总量、病毒RNA总量。

优选地，需定量测定的靶RNA是mRNA。

在一种优选的实施方式中，所述RNA特异性染料选自下组：

化合物6：

化合物11：

化合物19：

化合物20：

化合物23：

上述化合物已在US 2008/0199875A1第14-16页中公开。(见化合物6、11、19、20、23)。

在一种特别优选的实施方式中，本发明的RNA特异性染料是化合物11。

在另一种特别优选的实施方式中，本发明的RNA特异性染料是Quant-iT^TM-RNA试剂(见US 2008/0199875A1)。

DNA特异性荧光染料优选双链DNA的特异性荧光染料。本文中，这种染料可以选自下组：SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、SYTOX橙、SYBR绿I、TO-PRO-3、TOTO-3、POPO-3、溴乙啶和BOBO-3。Toto系列染料不如其它染料适合。

理想的DNA荧光染料是SYBR绿I(2-{2-[(3-二甲基氨基丙基)-丙基氨基]-1-苯基-1H-喹啉-4-内鎓甲基}-3-甲基-苯并噻唑-3-阳离子)。

在另一种实施方式中，DNA特异性荧光探针是标记有荧光染料的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针与从靶核糖核酸分子产生的DNA序列基本上互补。

具体说，所述荧光标记探针可以标记有选自下组的染料：FAM、VIC、NED、Fluorescein、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿(Oregon Green)、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红(Rhodamine Red)、德克萨斯红(Texas Red)、Yakima黄、Alexa Fluor和PET。

在一种实施方式中，定量检测样品中两种或多种靶核糖核酸，每个待定量的靶RNA各采用一种以不同荧光染料标记的寡核苷酸探针。理想地，这种探针与其靶序列互补。然而，在一些情况下错配也是需要的。这种探针也可以带有不结合靶序列的尾序列或末端序列。

技术人员知道如何根据延伸反应的温度、所用的具体酶(如热稳定聚合酶、逆转录酶)和各结合伴侣的序列来选择探针和引物的长度和序列。具体说，杂交探针是LightCycler探针(Roche)或水解探针是TaqMan探针(Roche)。在其它实施方式中，发夹探针选自下组：分子信标、蝎形(Scorpion)引物、发卡式(Sunrise)引物、LUX引物和Amplifluor引物。

在本发明的一些实施方式中，定量检测包括核酸扩增反应如非等温扩增方法聚合酶链反应(PCR)，特别是定量实时PCR或等温扩增方法如NASBA(基于核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)、3SR(自动维持序列)、SDA(链置换扩增)、HAD(解旋酶依赖扩增，采用不耐热或热稳定的酶)、RPA(重组酶聚合酶扩增)、LAMP(环介导的扩增)；或SMAP(Smart扩增过程)。这些技术采用了一些本领域技术人员熟知的不同的酶、蛋白质、引物和附件分子。聚合酶包括选自下组的聚合酶：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、嗜热球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶、嗜热古菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶、嗜热古生菌(Pyrococcus kodakaraensis)KOD DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)(Tfi)DNA聚合酶、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)Dpo4 DNA聚合酶、太平洋栖热菌(Thermus pacificus)(Tpac)DNA聚合酶、Thermus eggertsonii(Teg)DNA聚合酶和黄色栖热菌(Thermus flavus)(Tfl)DNA聚合酶以及噬菌体如Phi29-噬菌体、类Phi29噬菌体如Cp-1、PRD-1、Phi 15、Phi 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、或L 17的聚合酶。所述聚合酶还包括其它生物如大肠杆菌的聚合酶T4、T7。其它附加的蛋白质可以改进该方法，如解旋酶、单链结合蛋白、或其它DNA结合蛋白、以及重组酶。

优选逆转录靶RNA并在聚合酶链反应中扩增所产生的DNA。

本发明的一些实施方式中，在同一反应容器中进行逆转录和定量检测。

逆转录酶可以是用于定量检测步骤的同一种聚合酶。

本发明上下文中具有逆转录酶活性的酶可以是不同来源，包括病毒、细菌、原始细菌和真核来源，特别是来源于热稳定性生物。这包括来源于内含子、反转录转座子或逆转录病毒的酶。本发明上下文中具有逆转录酶活性的酶是能够在合适反应条件如缓冲条件下，在与互补脱氧核糖核酸或核糖核酸杂交的(或反之亦然)脱氧核糖核酸或核糖核酸的3’末端加入一个或多个与所述脱氧核糖核酸或核糖核酸互补的脱氧核糖核苷酸的酶。这不仅包括本身具有逆转录酶活性的酶，而且包括基因序列进化或突变获得这种功能或者通过调节缓冲液或其它反应参数获得这种功能的酶。

优选本发明上下文中具有逆转录酶活性的酶选自下组：HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、EAIV逆转录酶、AMV逆转录酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I、M-MLV核糖核酸酶H、Superscript、Superscript II、Superscript III、Monstersript(Epicentre)、Omniscript、Sensiscript逆转录酶(Qiagen)、ThermoScript以及Thermo-X(两者均购自Invitrogen)。所述酶还可以具有提高的保真度如AccuScript逆转录酶(Stratagene)。技术人员知道混合一种或多种合适的具有逆转录酶活性的酶能够得到优化的条件或新的特性。这可以包括混合例如嗜温酶与嗜热酶、具有核糖核酸酶(RNase)H活性的酶与RNase H阴性的酶、或保真度提高的酶与嗜热酶、等等。根据本发明范围内优选的具有逆转录酶活性的酶的列表，可以有许多其它的组合。

如上所述，为了分析基因表达，可采用定量实时逆转录PCR(RT-qPCR)进行样品中mRNA的定量检测。RT-qPCR方法采用了三步骤组合：(i)用RNA依赖型DNA聚合酶(如逆转录酶)将mRNA逆转录为cDNA，(ii)用PCR扩增cDNA，和(iii)实时检测并定量扩增产物。对于逆转录和基于PCR的扩增，反应缓冲液中需要有dNTP(“核苷酸混合物”)。本发明的核苷酸混合物是dNTP混合物，即适合于在PCR中使用的dATP、dCTP、dGTP和dTTP/dUTP的混合物。对于本发明的特定的实施方式，这些dNTP的相对量可以与模板核酸的具体核苷酸含量相适应。RT-qPCR步骤可以一阶段方式或两阶段方式进行。前者，在同一反应容器中进行逆转录和基于PCR的扩增，如采用本身具有逆转录功能的DNA聚合酶，例如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)聚合酶。在两阶段方式中，在不同的反应容器中分别进行RNA逆转录和DNA扩增步骤。可以在合适的反应缓冲液中，如包含盐例如镁离子的缓冲液中进行本发明方法的各步骤。如已指出的那样，可以在或可以不在同一缓冲液和反应容器内进行不同的步骤。与RT-qPCR相反，qPCR中不进行逆转录，因此它是DNA而非RNA的定量方法。

RT-qPCR中(m)RNA的逆转录与qPCR和RT-qPCR中的(c)DNA扩增需要用寡核苷酸(“引物”)引发。以用RT-qPCR定量检测mRNA为例，可采用mRNA特异性寡核苷酸，如能与mRNA的聚A尾杂交的寡聚-dT引物。然而也可采用不同长度的随机引物。

一些实施方式中的定量步骤包括选自下组的方法：凝胶电泳、毛细管电泳、标记反应后进行检测和定量实时PCR。优选定量检测包括定量实时PCR或定量实时逆转录PCR。在本发明优选的实施方式中，定量检测步骤包括：(i)用RNA-依赖性DNA聚合酶(如逆转录酶)将RNA(如mRNA)逆转录成DNA(如cDNA)，(ii)用PCR扩增逆转录产生的DNA，和(iii)实时检测并定量扩增产物。特别优选聚合酶链反应是定量实时PCR。在定量实时PCR中用选择性引物来定量检测靶RNA。

在本发明的一些实施方式中，靶RNA序列的定量检测包括在定量实时PCR过程中采用标记有一种或多种荧光染料和/或猝灭剂的寡核苷酸探针。例如，荧光标记的核酸探针可以选自下组：杂交探针、水解探针和发夹探针。

此外，标准的定量实时PCR方案和试剂盒可以适合或修改用作本发明的工具或方法。

如上所述，实时PCR(本文中也称为定量PCR或者定量实时PCR(qPCR))是采用聚合酶链反应同时扩增并定量检测核酸的一种方法。定量实时逆转录PCR(RT-qPCR)是一种进一步包括将RNA逆转录成DNA，如将mRNA逆转录成cDNA的定量实时PCR方法。在qPCR和RT-qPCR方法中，随着扩增的核酸积累对其进行定量检测。通常在基于qPCR的方法中，采用能插入双链DNA中的荧光染料(如溴乙啶或SYBR

绿I)或与互补核酸(如积累的DNA)杂交时能发出荧光的经修饰的探针(“报告探针”)来定量检测。具体说，可采用荧光引物、杂交探针(如LightCycler探针(Roche))、水解探针(如TaqMan探针(Roche))、或发夹探针，如分子信标、蝎形引物(DxS)、发卡式引物(Oncor)、LUX引物(Invitrogen)、Amplifluor引物(Intergen)或类似物作为报告探针。例如，本发明的荧光引物或探针可以是连接(如共价连接)有荧光染料的引物或探针。例如，这种荧光染料可以是FAM(5-或6-羧基氢化荧光素)、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、得克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET等。具体的报告探针可进一步包含荧光猝灭剂。

本发明还涉及定量检测样品中靶RNA的试剂盒，其包含：(i)与RNA特异性结合的荧光染料和(ii)一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针。在本发明优选的实施方式中，该试剂盒也包含聚合酶。该试剂盒还可包含核苷酸混合物和(a)反应缓冲液。在一些实施方式中，该试剂盒还包含逆转录酶。

如上所述，本发明优选的RNA特异性染料已经在US2008/0199875A1中具体公开。在本发明的上下文中特别优选的RNA特异性染料是US 2008/0199875A1中14-16页中描述的化合物6、11、19、20和23。

在一特别优选的实施方式中，本发明的RNA特异性荧光染料是化合物11。

在另一特别优选的实施方式中，本发明的RNA特异性荧光染料是Quant-iT^TM-RNA试剂(见US 2008/0199875A1)。

本发明涉及RNA特异性荧光染料在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用，这种染料例如但不限于Quant-iT^TM-RNA试剂。

本发明还涉及本发明的试剂盒在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用。

本发明还涉及本发明方法或本发明试剂盒在基因表达分析中的应用。

在一些实施方式中，利用本发明的工具或方法校正基因表达水平。

优选同时，即在同一时间校正需要定量检测的两种或多种核酸的含量。

在一些实施方式中，在同一反应容器中预先混合一种或多种成分。

实施例

实施例1：染料浓度的影响

为了用基于MTP的荧光计进行RNA定量检测，常1∶200稀释Quant-ITRNA。通过检测PCR循环仪中相应的荧光来测量RNA时，为测试所用染料浓度的影响，测试了不同浓度的Quant-IT RNA。用RNeasy Mini Spin微型旋转柱分离MCF7细胞的总RNA。用不同量的这种RNA作为基于SYBR绿的模板，采用QIAGEN QuantiTect SYBR绿RT-PCR试剂盒的一步法RT-PCR。在RT-PCR主混物(Mastermix)中添加Quant-IT RNA染料至所示的最终稀释度。用靶向ERK的mRNA的引物进行扩增。在96孔PCR平板和StratageneMX3005P热循环仪中进行一步法RT-PCR反应。一式两份进行反应。减去作为空白的没有RNA的对照反应孔的荧光值，每个Quant-IT RNA稀释度都有各自的空白孔；见图2。所有测试的Quant-IT RNA浓度都观察到RNA浓度的对数(log)与cT值有线性关系。最高染料浓度(1∶25)的cT值增加了～1。但是，扩增效率的指标即斜率并未由于Quant-IT RNA的增加而改变。这表明即使存在高浓度的Quant-IT RNA，基于SYBR绿的检测与定量也是可行的。

实施例2：染料的稀释

进行了与实施例1类似的实验，有如下改变：Quant-IT RNA仅采用1∶25的最终稀释度。每个RNA含量都测试了12倍的复制样品以检验该试验的变异系数。减去不含RNA空白孔的平均荧光值。图3和4显示了Quant-IT RNA测量和基于SYBR绿检测的的结果。

实施例3：10-100ng浓度的RNA

在前面的实施例中，所用的RNA浓度跨越了两个数量级，图6和7显示每个反应10-100ng浓度的RNA，浓度间隔为10ng的实验结果。

附图说明

图1

为了用基于SYBR绿的检测，定量测定一步法RT-PCR反应中存在的RNA，可以采用任何满足下面两个要求的荧光染料：(i)光谱性质不干扰用于检测感兴趣基因(GoI)的光谱性质。GoI主要用荧光染料SYBR绿检测。SYBR绿能与双链DNA结合，产生的DNA-染料复合物最大激发光为488nm，最大发射光为522nm，和(ii)一步法RT-PCR所用的反应混合物含有可能干扰RNA测定的各种物质：核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、洗涤剂、盐。因此，所选的RNA特异性染料受这些物质的影响程度必须不会干扰RNA的定量测定，但需要对RNA高度灵敏。这种荧光染料的一个例子是Invitrogen出售的Quant-IT RNA。它与RNA结合时的最大激发光/发射光是644/673nm，因此不干扰SYBR绿测定。它对RNA高度特异性，不受一步法RT-PCR反应中通常存在物质的干扰。

图2

该图显示荧光值随着加入RT-PCR反应中的RNA量的增加而增强。Quant-ITRNA浓度的增加提高了绝对荧光值，但信噪比也提高了。

图3

图3中，以同一次PCR运行中从SYBR绿荧光值获得的cT值对RNA含量作图。

图4和5

再次观察到Quant-IT RNA荧光值随着RNA含量的增加而增强。在Quant-It RNA染料存在时，SYBR绿获得的cT值随RNA含量的增加而降低。这表明在同一反应中，使用相同的设备(PCR循环仪)，可以利用特异性荧光染料定量检测加入PCR反应中的RNA量，和进行基于SYBR绿的特定的靶RNA的扩增和检测。

图6和7

同样，在这种更窄的连续稀释范围内也可能定量每次PCR反应的RNA含量。从相同的多元反应中由SYBR绿获得的cT值显示，随着RNA浓度的增加相应的cT值降低。因为本实验中x轴为线性刻度，因此cT曲线显示为对数样特征。

Claims

1.检测样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤：

(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；

(iii)测定所述样品中所述RNA-结合染料的荧光；

(iv)将所述测得的荧光与样品中的RNA总量相关联；

(v)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；

(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，其中所述反应在一个反应容器中进行。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，其中所述样品为总RNA制品。

4.如上述权利要求中任一项所述方法，其特征在于，其中所述RNA特异性荧光染料是Quant-iT^TM-RNA试剂。

5.如上述权利要求中任一项所述方法，其特征在于，其中所述DNA特异性荧光探针是双链DNA的异性荧光染料。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，其中所述荧光染料选自下组：SYBR Green I、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、SYTOX橙、SYBR绿I、TO-PRO-3、TOTO-3、POPO-3和BOBO-3。

7.如权利要求1-6中任一项所述方法，其特征在于，其中所述DNA特异性荧光探针是标记有荧光染料的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针与由靶RNA序列所产生的DNA序列基本互补。

8.如权利要求1-7中任一项所述方法，其特征在于，其中定量检测样品中的两种或多种的靶核糖核酸，每种需要定量检测的靶RNA采用一种标记有不同荧光染料的寡核苷酸探针。

9.如权利要求1-8中任一项所述方法，其特征在于，其中所述扩增反应是聚合酶链反应。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，其中所述聚合酶链反应是定量实时PCR。

11.定量检测样品中靶RNA的试剂盒，其包含：

(i)与RNA特异性结合的荧光染料，

(ii)一种或多种DNA扩增产物的一种或多种特异性荧光探针。

12.RNA特异性荧光染料在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用。

13.如利要求10所述试剂盒在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用。

14.权利要求1-9中任一项所述方法或权利要求10所述试剂盒在基因表达分析中的应用。