CN114657235B - 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于评估逆转录效率的方法。对所建立的或所使用的逆转录‑PCR定量方法的逆转录效率，提出一套基于同位素稀释质谱法的高准确度逆转录效率评估方案。首先通过逆转录数字PCR对目的基因的RNA进行拷贝数浓度的测定，再进一步通过同位素稀释质谱法来测定该目的基因的RNA拷贝数浓度，计算获得的两种RNA拷贝数浓度的比值，从而获得相应的逆转录体系的逆转录效率。通过对逆转录效率准确评估，修正逆转录PCR结果，从而获得目标RNA分子的准确含量，满足不同领域对RNA分子准确定值的需求。

Description

一种用于评估逆转录效率的方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因转录分析领域，具体涉及一种用于评估逆转录效率的方法及其应用。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是重要的遗传信息载体，参与蛋白质合成以及基因表达调控等过程。RNA普遍存在于植物、动物、微生物及病毒中。在细胞中，RNA的种类包括信使RNA以及非编码RNA等；而在某些病毒中(如艾滋病毒，新型冠状病毒)，RNA是其唯一的遗传物质。因此，对RNA分子的定性、定量检测，广泛应用于临床检测、微生物检测、转基因检测、法医检测等领域。通常待测样本中RNA含量较低，检测较为困难。基于逆转录以及聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)的方法是目前RNA分子定性、定量检测的最常用方法。PCR技术能够将微量的DNA通过扩增反应使其含量呈指数级增加。因此，通过逆转录反应将RNA分子逆转录为预期序列互补的DNA分子，再通过荧光定量PCR、数字PCR等技术则可以实现RNA分子的定量检测。
逆转录是指在逆转录酶(也称依赖RNA的DNA聚合酶)的催化作用下，以RNA为模板，合成与其序列互补的DNA链的过程。PCR反应能在短时间内在体外通过扩增指数放大特定DNA的含量，但是PCR过程只能以DNA分子为模板进行反应，因此RNA分子必须经过逆转录过程转换成cDNA之后才能采用PCR方法进行定量检测。
逆转录过程是一个酶促反应。逆转录效率指的是将全部RNA分子转化为相应cDNA的比例，这和RNA模板的二级结构以及所用的逆转录酶体系相关。RNA模板GC含量高或二级结构复杂可能会降低逆转录效率。逆转录酶体系包括逆转录酶、dNTP、逆转录引物等成分，其中逆转录酶是最关键的组分。目前市面上主要有莫洛尼鼠白血病病毒MMLV逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶两种，并且多是经过了基因工程改造，使得逆转录酶一方面具有了更高的热稳定性，一些经过基因工程改造的MMLV逆转录酶可以耐受55℃的高温，这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含GC的RNA模板合成cDNA；另一方面，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，使得逆转录酶所附带的RNase H活性(切割单链RNA，降低cDNA合成效率)降低甚至完全消除，从而提高逆转录效率。因此，以上多种因素造成RNA的逆转录效率并不是恒定的，对于同一种RNA模板，用不同的逆转录酶体系可能得到不同的定量结果(牛春艳，杨佳怡，王晶，李晶，刘文军.逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合症病毒定量检测的影响[J/OL].中国动物传染病学报.http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.s.20190117.1409.008.html)，其逆转录效率是完全不同的，这造成了在进行RNA定量时，通过逆转录PCR方法得到的只是成功逆转录为cDNA分子的准确含量，原始RNA的含量需要对逆转录效率进行准确评估后才能得到。目前，市场上存在商品化的逆转录试剂盒，包括逆转录酶、引物、缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂等必要组分，加入客户的目标RNA即可完成逆转录反应，再经过建立的特异性PCR反应方法，即可对RNA分子进行定量检测。但是，对同种目标RNA分子，当使用不同逆转录体系时，可能会得到不同的定量结果。这是由于所使用的逆转录体系不同，逆转录效率不同所造成的。因此，逆转录效率的评估是RNA分子准确定量的关键因素。但是，目前还没有一种直接的、准确的方法能够准确评估RNA逆转录效率。
通过选择不同试剂盒进行逆转录-PCR对RNA分子进行定量与比较，可以筛选出针对目标分子，定量结果较高的逆转录体系。但是,这种比较并不能知道具体多少比例的RNA转化为了cDNA，也就是说不能得知具体逆转录效率是多少。要想得到具体的逆转录效率，必须用不依赖于逆转录的方法来定量检测得到RNA的真实含量。最常用的方法是紫外分光光度法，利用分子在260nm下的吸光度计算核酸浓度。RNA及DNA分子在260nm处的吸收与其浓度符合朗博-比尔定律，对于RNA来说，一般采用c＝40*A进行计算，其中c为分子浓度(ng/μL)，A为260nm下的吸光度。另一种方法是荧光检测法，利用荧光染料与靶分子特异性结合发射荧光信号检测RNA浓度，但这种方法需要用标准品作为外标，而标准品的值一般仍然都是用紫外分光光度法测定的。
利用紫外分光光度法检测总RNA含量来推测逆转录效率存在准确不够高而检测限太高等缺点。因为紫外分光光度检测RNA浓度一般是对RNA分子浓度的估计值，在标准物质定值等应用领域并不适用。RN溶液中可能存在的DNA、蛋白质、有机溶剂以及多余的盐离子等都在260nm下有吸光值，从而对RNA定量准确性造成影响。RNA结构的改变(pH不同，RNA发生降解等)也会造成消光系数的不同。荧光检测法由于依赖标准品作为外标，而标准品的值一般仍然都是用紫外分光光度法测定的，因此在准确度方面存在与紫外分光光度法同样的缺点。
本发明的目的是针对目标基因，对所建立的或所使用的逆转录-PCR定量方法的逆转录效率，提出一套基于同位素稀释质谱法的高准确度逆转录效率评估方案，通过对逆转录效率准确评估，修正逆转录PCR结果，从而获得目标RNA分子的准确含量，满足不同领域对RNA分子准确定值的需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中没有一种直接的、准确的方法能够准确评估RNA逆转录效率的问题，提供一种基于同位素稀释质谱法的高准确度逆转录效率评估方案。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种用于评估逆转录效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)针对目的基因序列设计并体外转录获得RNA；
(2)将步骤(1)的部分RNA稀释后作为模板进行逆转录数字PCR反应；
(3)通过步骤(2)中的逆转录数字PCR反应的结果进一步计算获得逆转录的模板RNA的拷贝数浓度，并通过步骤(2)中的稀释的倍数计算稀释前的RNA拷贝数浓度为n1；
(4)采用同位素稀释质谱法检测步骤(1)中的转录RNA的拷贝数浓度为n2；
(5)计算步骤(2)中所述逆转录的效率为A＝n1/n2×100％。
优选的，所述步骤(4)中同位素稀释质谱法的操作为：
①RNA分子酶切，在酶切体系中加入体外转录的RNA分子及同位素内标；
②配制核苷酸标准溶液；
③液质联用仪分析，将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分析，记录每种溶液中四种核苷酸及核苷酸内标的峰面积；
④核苷酸质量浓度计算。
优选的，所述步骤(1)中RNA浓度为0.1～10μg/g；
优选的，所述配置核苷酸标准溶液为：利用紫外分光光度法测量体外转录RNA分子溶液的估算浓度，根据分子量及其分子组成估算四种核苷酸的浓度；配制两个浓度的标准溶液，高标溶液及低标溶液，在标准溶液中加入已知纯度的四种核苷酸标准物质，以及四种核苷酸内标，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量，两个标准溶液中，同位素核苷酸内标的浓度均与体外转录RNA分子中核苷酸浓度接近1：1，高标溶液中，核苷酸浓度大于同位素内标浓度，低标溶液中，核苷酸浓度小于同位素内标浓度。
优选的，所述核苷酸质量浓度计算采用如下公式：
式中：Wx--核苷酸质量浓度，μg/g；
P——核苷酸标准物质纯度，％；
D——稀释倍数；
Ws——样品中同位素内标的质量浓度，μg/g；
Ix——样品中核苷酸与同位素内标的峰面积比；
W1——高标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
W2——低标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
I1——高标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比；
I2——低标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比。
优选的，按公式(2)计算RNA分子质量浓度，
式中：WRNA--RNA分子质量浓度，μg/g；
MRNA--RNA分子相对分子质量；
MNMP——所选核苷酸的相对分子质量；
N--RNA分子中所选核苷酸的数量。
优选的，按公式(3)计算RNA拷贝数浓度，
式中：n2--RNA分子拷贝数浓度，copies/μL；
NA——阿伏伽德罗常数。
优选的，所述目的基因为新型冠状病毒基因。
优选的，所述步骤(2)中的逆转录包括不同逆转录酶、逆转录引物种类与浓度的优化以及逆转录温度的优化条件。
本发明还提供所述的方法在评估不同逆转录酶逆转录效率、逆转录中引物种类或浓度的优化，或逆转录中反应温度的优化中的应用。
本发明旨在提出一套基于同位素稀释质谱方法的高准确度逆转录效率评估方案，通过对逆转录效率准确评估，修正逆转录PCR结果，从而获得RNA分子的准确含量，满足不同领域对RNA分子准确定值的需求。
附图说明
图1.逆转录效率评估方案流程图。
图2.四种核苷酸的MRM谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
1.逆转录效率评估方案流程图如图1所示。利用体外转录RNA，分别采用优化建立的逆转录-数字PCR定量方法及同位素稀释质谱法对RNA进行拷贝数浓度测量，两种方法得到的结果比值用于评估逆转录效率。
2.目的基因逆转录-PCR定量方法建立
针对需要定量检测的目的基因，进行逆转录-PCR定量方法的优化与建立。首先选择适当的逆转录方法进行逆转录，包括逆转录酶、逆转录引物种类与浓度的优化设计以及逆转录温度的优化，得到cDNA分子，再选择合适的数字PCR方法进行定量检测，包括引物探针设计，退火温度优化。本发明将对此处建立的逆转录-PCR定量方法的逆转录效率进行评估。
3.外转录RNA的设计、获得与定量
通常所检测的目的基因是基因组或者转录产物中的一段序列，针对此段序列设计引物探针，可以利用逆转录-数字PCR方法得到目的基因的拷贝数浓度。数字PCR方法由于是一种绝对定量方法，可以准确得到cDNA的含量，因此如果要得到逆转录过程的效率，需要利用一种不依赖于逆转录过程的定量方法来得到目标基因的准确含量，通过与cDNA含量的比较，从而计算出逆转录效率。本发明所用的同位素稀释质谱检测方法的原理是利用磷酸二酯酶将RNA分子酶解为AMP,UMP,CMP,GMP四种核苷酸，再通过高效液相色谱进行分离，以同位素标记的四种核苷酸为内标，以准确定量的核苷酸标准物质作为外标，通过三重四级杆质谱进行同位素稀释质谱法定量，得到RNA分子的质量分数，根据RNA分子的分子量，计算出RNA分子的拷贝数浓度。由于此方法将RNA分子所有核苷酸完全酶解，不具备序列特异性，因此需要目标序列是一条序列完整的、单一的RNA分子。所以本方案的第一步是根据所检测的目的基因设计一段DNA序列，此序列与目的基因RNA分子序列反向互补，长度要覆盖PCR方法的引物探针所扩增的区域，并在5’端添加启动子序列，3’端添加酶切位点，利用基因合成得到这段DNA序列，克隆至载体中，也可以直接克隆至含有启动子序列的质粒载体中，得到体外转录的模板，开始进行体外转录，体外转录及定量的具体过程如下：
1)质粒单酶切。在酶切体系中加入质粒模板，限制性内切酶，酶切缓冲液，于30℃或37℃进行酶切反应，1-2小时后，利用酶切产物纯化试剂盒对酶切体系进行纯化，得到线性化质粒模板。
2)体外转录。在体外转录体系中加入线性化质粒模板，体外转录酶，四种NTP，缓冲液，于37℃进行体外转录反应，2-4小时后，加入不含RNA酶的DNA酶对质粒模板进行酶切消化，37℃反应15分钟。利用RNA纯化试剂盒，对转录的RNA进行纯化，除去多余的NTP，酶等杂质，得到体外转录的RNA分子。稀释为0.1～10μg/g。
3)逆转录-PCR定量。利用第一部分建立的定量方法对体外转录RNA分子进行定量。此处所用体外转录RNA分子浓度一般高于远高于数字PCR定量范围，需要首先进行梯度稀释，用含有酵母RNA的RNA专用稀释液进行稀释，再进行逆转录-PCR反应，得到体外转录RNA分子的拷贝数浓度n1。
4.同位素稀释质谱法检测体外转录RNA
1)RNA分子酶切。在酶切体系中加入体外转录的RNA分子，四种核苷酸内标，磷酸二酯酶，酶切缓冲液，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量。于37℃反应15分钟-1小时后，80℃反应15分钟使酶失活，结束酶切过程。
2)核苷酸标准溶液配制。首先利用紫外分光光度法测量体外转录RNA分子溶液的估算浓度，根据分子量及其分子组成估算四种核苷酸的浓度。配制两个浓度的标准溶液，高标及低标。在标准溶液中加入已知纯度的四种核苷酸标准物质，以及四种核苷酸内标，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量。两个标准溶液中，同位素核苷酸内标的浓度均与目标RNA分子中核苷酸浓度接近1：1,高标溶液中，核苷酸浓度大于同位素内标浓度，低标溶液中，核苷酸浓度小于同位素内标浓度。
3)液质联用仪分析。将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分析，记录每种溶液中四种核苷酸的峰面积。分析条件如下：
色谱条件：SB-AQ C18 100mm柱；流动相：0.1％甲酸。
质谱条件：正离子，多反应监测模式(MRM)。
质谱参数见下表。
按公式(1)计算核苷酸质量浓度。
式中：Wx--核苷酸质量浓度，μg/g；
D——稀释倍数；
Ws——样品中同位素内标的质量浓度，μg/g；
Ix——样品中核苷酸与同位素内标的峰面积比；
W1——高标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
W2——低标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
I1——高标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比；
I2——低标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比。
4)按公式(2)计算RNA分子质量浓度。根据四种核苷酸质量浓度及RNA的序列组成计算RNA分子质量浓度。
式中：WRNA--RNA分子质量浓度，μg/g；
MRNA--RNA分子相对分子质量；
MNMP——所选核苷酸的相对分子质量；
N--RNA分子中所选核苷酸的数量。
5)按公式(3)计算RNA拷贝数浓度。根据核苷酸的分子量及阿伏伽德罗常数计算RNA拷贝数浓度。
式中：n2--RNA分子拷贝数浓度，copies/μL；
NA——阿伏伽德罗常数；
5.按公式(4)计算逆转录效率A。
A＝n1/n2×100％ (4)
式中：n1为逆转录PCR得到的体外转录RNA拷贝数浓度,copies/μL。
n2为同位素稀释质谱法得到的体外转录RNA拷贝数浓度,copies/μL。
实验例：新型冠状病毒ORF1ab基因数字PCR方法逆转录效率评估1.目的基因逆转录-PCR定量方法建立
为了对新型冠状病毒样品进行定值，针对SARS-CoV-2ORF1ab基因建立了逆转录数字PCR方法，首先设计并合成ORF1ab引物探针，引物探针序列见表1。并在微滴式数字PCR平台(伯乐，QX200)上优化反应体系及反应条件，建立定量方法。
实验反应体系：One-step SuperMix(包含缓冲液、dNTP等组分)5μL，逆转录酶2μL，300mM DTT 1μL,20X引物探针混合液1μL,RNA模板5μL，加ddH2O补足终体积至20μL。
将20μL反应混合液分装至对应微滴生成卡的sample孔位中，在微滴生成卡的Oil孔位中加入70μL微滴发生专用油，进行微滴生成。将生成的微滴(40μL)转入96孔深孔板中进行PCR反应。
PCR扩增条件为：
表1.引物探针序列
序列
正向引物 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物 ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
表2.PCR循环条件
2.体外转录RNA的设计、获得
根据所检测的SARS-CoV-2-ORF1ab基因,设计一段DNA序列，序列见SEQ ID NO：4。，此序列与目的基因RNA分子序列反向互补，长度覆盖PCR方法的引物探针所扩增的区域，并在3’端添加酶切位点NotI，利用基因合成得到这段DNA序列，克隆至含有启动子序列的pBluescript II SK(+)质粒载体中，得到体外转录的模板，开始进行体外转录，得到体外转录的RNA分子，稀释为大约1μg/g。
3.体外转录RNA逆转录-PCR定量
利用已建立的逆转录-数字PCR方法对体外转录RNA进行定量。首先将体外转录RNA进行梯度稀释，再进行数字PCR反应。天平称量记录稀释过程，计算总稀释倍数。以数字PCR反应结果乘以稀释倍数作为RNA拷贝数浓度。
定量结果如下表所示。
因此，体外转录RNA逆转录-数字PCR定量结果为3.46E+08copies/μL。
4.体外转录RNA同位素稀释质谱法定量
1)RNA分子酶切。在酶切体系中加入体外转录的RNA分子，四种核苷酸内标，磷酸二酯酶，酶切缓冲液，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量。于37℃反应15分钟后，80℃反应15分钟使酶失活，结束酶切过程。
2)核苷酸标准溶液配制。首先利用紫外分光光度法测量体外转录RNA分子溶液的估算浓度为大约1μg/g，根据分子量及其分子组成估算四种核苷酸CMP、UMP、GMP、AMP的估算浓度。配制两个浓度的标准溶液，高标及低标。在标准溶液中加入已知纯度的四种核苷酸有证标准物质，以及四种核苷酸内标，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量。两个标准溶液中，四种同位素核苷酸内标的浓度均与目标RNA分子中核苷酸浓度为1：1,高标溶液中，标准物质核苷酸浓度与同位素内标浓度之比为1.1，低标溶液中，标准物质核苷酸浓度与同位素内标浓度之比为0.9。
3)液质联用仪分析。将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分析，记录每种溶液中四种核苷酸的峰面积。RNA分子重复测量三次，取平均值进行计算。四种核苷酸的MRM谱图如图2所示。
按公式(1)计算样品中四种核苷酸CMP、UMP、GMP、AMP的质量浓度。
计算过程如下：
CMP UMP AMP GMP
D 1.133 1.133 1.133 1.133
Ws 0.099 0.099 0.099 0.099
Ix 1.003 1.067 0.940 1.052
W1 1.341 1.520 2.195 1.532
W2 1.535 2.334 2.450 1.695
I1 0.976 0.933 0.915 0.997
I2 1.004 1.091 1.021 1.086
WX 0.171 0.248 0.253 0.183
按公式(2)计算RNA质量浓度：
根据RNA分子组成及四种核苷酸浓度推算RNA分子质量浓度为：0.83、0.85、0.79、0.78μg/g，平均值为0.81μg/g。由四种核苷酸得到的RNA质量浓度的扩展不确定度U(k＝2)分别为0.08，0.04，0.03，0.03μg/g。
4)按公式(3)计算RNA拷贝数浓度。
n2＝0.81×6.02×1023/1264317.8/109＝3.86E+08copies/μL。
5.计算逆转录效率
A＝n1/n2×100％＝3.46E+08/3.86E+08×100％＝89.6％。
6.方法准确性验证
1)本发明方法中，利用同位素稀释质谱法对RNA分子的真实拷贝数浓度进行测量，由于同位素稀释质谱法采用有证标准物质作为外标，稳定同位素作为内标，可以保证方法准确性，并且量值可以溯源至SI单位，保证结果准确可靠。
2)同位素稀释质谱法测量中，RNA质量浓度由四种核苷酸计算出的质量浓度取平均值得到，这四种核苷酸计算得到的RNA质量浓度(取包含因子k＝2，以测量值±U来表示)分别为(0.83±0.08)μg/g，(0.85±0.04)μg/g，(0.79±0.03)μg/g，(0.78±0.03)μg/g，四种核苷酸互相独立，但测量结果在不确定度范围内准确一致，验证了本方法的准确性。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
<110> 中国计量科学研究院
<120> 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ACGATTGTGCATCAGCTGA 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG 28
<210> 4
<211> 3491
<212> DNA
<213> 新型冠状态病毒SARS-CoV-2
<400> 4
GTCGACATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAATCGATATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAGGATCCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATCCTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATGACTTCTTTAAGTTTAGAATAGACGGTGACATGGTACCACATATATCACGTCAACGTCTTACTAAATACACAATGGCAGACCTCGTCTATGCTTTAAGGCATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTAAAAGAAATACTTGTCACATACAATTGTTGTGATGATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTGTGATGCCATGCGAAATGCTGGTATTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATCTCAATGGTAACTGGTATGATTTCGGTGATTTCATACAAACCACGCCAGGTAGTGGAGTTCCTGTTGTAGATTCTTATTATTCATTGTTAATGCCTATATTAACCTTGACCAGGGCTTTAACTGCAGAGTCACATGTTGACACTGACTTAACAAAGCCTTACATTAAGTGGGATTTGTTAAAATATGACTTCACGGAAGAGAGGTTAAAACTCTTTGACCGTTATTTTAAATATTGGGATCAGACATACCACCCAAATTGTGTTAACTGTTTGGATGACAGATGCATTCTGCATTGTGCAAACTTTAATGTTTTATTCTCTACAGTGTTCCCACCTACAAGTTTTGGACCACTAGTGAGAAAAATATTTGTTGATGGTGTTCCATTTGTAGTTTCAACTGGATACCACTTCAGAGAGCTAGGTGTTGTACATAATCAGGATGTAAACTTACATAGCTCTAGACTTAGTTTTAAGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGACCCTGCTATGCACGCTGCTTCTGGTAATCTATTACTAGATAAACGCACTACGTGCTTTTCAGTAGCTGCACTTACTAACAATGTTGCTTTTCAAACTGTCAAACCCGGTAATTTTAACAAAGACTTCTATGACTTTGCTGTGTCTAAGGGTTTCTTTAAGGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAACACTTCTTCTTTGCTCAGGATGGTAATGCTGCTATCAGCGATTATGACTACTATCGTTATAATCTACCAACAATGTGTGATATCAGACAACTACTATTTGTAGTTGAAGTTGTTGATAAGTACTTTGATTGTTACGATGGTGGCTGTATTAATGCTAACCAAGTCATCGTCAACAACCTAGACAAATCAGCTGGTTTTCCATTTAATAAATGGGGTAAGGCTAGACTTTATTATGATTCAATGAGTTATGAGGATCAAGATGCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCCCTACTATAACTCAAATGAATCTTAAGTATGCCATTAGTGCAAAGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGTGTCTCTATCTGTAGTACTATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAATCAATAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAATGCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCGCGGCCGC 3491

Claims (7)

1.一种用于评估逆转录效率的方法， 其特征在于，包括如下步骤：
（1）针对目的基因序列设计并体外转录获得RNA；
（2）将步骤（1）的RNA稀释后作为模板进行逆转录数字PCR反应；
（3）通过步骤（2）中的逆转录数字PCR反应的结果计算获得逆转录的模板RNA的拷贝数浓度，并通过步骤（2）中的稀释的倍数计算稀释前的RNA拷贝数浓度为n 1；
（4）采用同位素稀释质谱法检测步骤（1）中的转录RNA的拷贝数浓度为n 2；
（5）计算步骤（2）中所述逆转录的效率为A=n 1/n2×100%；
所述步骤（4）中同位素稀释质谱法的操作为：
①RNA分子酶切，在酶切体系中加入体外转录的RNA分子及同位素内标；
②配制核苷酸标准溶液；
③液质联用仪分析，将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分析，记录每种溶液中四种核苷酸及核苷酸内标的峰面积；
④核苷酸质量浓度,采用如下公式计算：
；
式中：W x--核苷酸质量浓度，μg/g；
P——核苷酸标准物质纯度，%；
D——稀释倍数；
W s——样品中同位素内标的质量浓度，μg/g；
I x——样品中核苷酸与同位素内标的峰面积比；
W 1——高标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
W 2——低标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；
I 1——高标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比；
I 2——低标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比;
所述配置核苷酸标准溶液为：利用紫外分光光度法测量体外转录RNA分子溶液的估算浓度，根据分子量及其分子组成估算四种核苷酸的浓度；配制两个浓度的标准溶液，高标溶液及低标溶液，在标准溶液中加入已知纯度的四种核苷酸标准物质，以及四种核苷酸内标，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量；两个标准溶液中，同位素核苷酸内标的浓度均与体外转录RNA分子中核苷酸浓度1：1，高标溶液中，核苷酸浓度大于同位素内标浓度，低标溶液中，核苷酸浓度小于同位素内标浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中RNA浓度为0.1~10 μg/g。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按公式（2）计算RNA分子质量浓度，
（2）
式中：WRNA--RNA分子质量浓度，μg/g；
M RNA--RNA分子相对分子质量；
M NMP ——所选核苷酸的相对分子质量；
N--RNA分子中所选核苷酸的数量。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按公式（3）计算RNA拷贝数浓度，
（3）
式中：n 2--RNA分子拷贝数浓度，copies/μL；N A ——阿伏伽德罗常数。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因为新型冠状病毒基因。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的逆转录是不同逆转录酶、逆转录引物种类或浓度的优化，或者逆转录温度的优化条件的逆转录。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法在评估不同逆转录酶逆转录效率、逆转录中引物种类或浓度的优化，或逆转录中反应温度的优化中的应用。
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