JP4495595B2 - 診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響及び基線上昇の作用の両方を低下させるための方法、このような方法を実施するためのアッセイ及び前記アッセイにおける使用のためのプローブ - Google Patents

Description

本発明は、増幅した核酸分析物を検出するために核酸プローブを使用する診断ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、配列変異の影響を低下させるための方法に関する。本発明はまた、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける分子ビーコンの使用を制限する、望ましくないＩＢＬ（基線上昇）作用を低下させるための方法に関する。本発明はさらに、このようにして得られるアッセイ及びこのようなアッセイにおける使用のためのプローブに関し、前記診断アッセイ及びプローブは、診断結果への望ましくない影響を低減するためのこれらの２つの方法の少なくとも１つを使用する。多くの診断アッセイは、プライマーを助けとした核酸分子又はその部分の増幅及びプローブによる増幅物質の検出に基づく。適切な反応条件下で、プライマーは検出する分析物にハイブリダイズし、標的配列の増幅を開始させる。これはアンプリコンの生成を導く。

一方で、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＲＣＲ、３ＳＲ及びＳＤＡなどの様々な増幅手法が開発されており、今や当業者には周知である。これらの手法についての関連情報は様々な文書に認めることができる。

・ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は米国特許第ＵＳ−Ａ−４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，８００，１５９号に述べられており、ＲＮＡ増幅を実施するためのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）は特に欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．５６９．２７２号に開示されている、
・ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）は欧州特許第ＥＰ−Ａ−０．２０１．１８４号に開示されている、
・ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）は国際公開広報第ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８号に述べられている、
・ＴＭＡ（転写媒介性増幅）は米国特許第ＵＳ−Ａ−５，３９９，４９１号に開示されている、
・ＲＣＲ（修復連鎖反応）は国際公開広報第ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９号に開示されている、
・３ＳＲ（自己維持配列複製）は国際公開広報第ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５号に詳細に説明されている。

分析物又はその部分の増幅中又は増幅後に、生成されたアンプリコンの存在又は量を検出しなければならない。これは、ゲル上での試料の分離とその後のブロット法及びプローブ検出などの様々な公知の手法で実施することができる。これは、増幅が終了した後でのみ実施できる。

均一系手順では、反応成分を分離せずに増幅と検出が行われる。アンプリコンは増幅の経過中に検出される。従って、アンプリコンの生成をリアルタイムで観測することができ、このようにして得られたデータは、アンプリコンの存在又は不在又は量を判定するために使用できる。このような均一系手法において非常に有用な１つのタイプのプローブは、分子ビーコンである。

分子ビーコンは、ステム−ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ループ部分は標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に相補的な配列を含む。ステムは、３’末端と５’末端の相補的配列のハイブリダイゼーションによって形成される。ステムは標的に無関係でもよく、二本鎖である。ステムの１本の腕は蛍光染料（発蛍光団）で標識され、他方の腕は消光性分子に結合される。ステム−ループ状態では、発蛍光団のエネルギーが消光性分子に転移するのでプローブは蛍光を生じない。分子ビーコンが標的にハイブリダイズすると、ステム−ループ構造が失われて、消光基と蛍光基が離れる。その段階で、発蛍光団によって放出される蛍光を検出し、定量することができる。最近出願人は、標的の検出のためにＭＢ（分子ビーコン）を使用するアッセイの開発中に、通常増幅工程に使用される市販の酵素（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７））の品質が異なることを認めた。これは、同じ供給者からであっても、同じ比活性及び容積活性（ｖｏｌｕｍｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）を備えるＴ７の異なるバッチが、ＭＢが天然デオキシリボヌクレオチドから成る場合、異なるレベルのＭＢの有害開口（ＩＢＬ作用）を有するとの所見に至った。従って、試験する生物学的試料中に特定標的配列が存在しない場合でも蛍光シグナルが現われ、偽陽性の結果を生じる可能性がある。

当業者はＩＢＬ作用をＴ７そのものに結びつけることもできようが、本発明者らの研究は、意外にもこの現象を生じさせるのは、Ｔ７自体ではなく、バッチによって異なりうる、少なくともＴ７内の未知の夾雑物である可能性がより高いことを示した。診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響を低減するための方法に関連して発表されている公表文献と一致して、当業者は、ＩＢＬ作用を克服するためには２’−Ｏ−メチル誘導体だけから成るＭＢが有用であると結論することができよう。出願人は、意外にも、ＭＢに導入する２’−Ｏ−メチル基が少ないほどより効率的であること、及び全ての天然デオキシリボヌクレオチドを置換することは全く又はより機能性でないＭＢを導くことを認めた。

診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響に関して、増幅反応で生成されるアンプリコンを定量的又は定性的に検出することができる。前者の場合は、生成されるアンプリコンの量を定量する。定性的アッセイでは、分析物の存在又は不在だけを判定する。

分析物内の配列変異（多型）は、分析物の過少定量を導き得る。また定性的アッセイの場合も、配列変異は偽陰性を生じることがある。一般に、これは、分析物と分析物を増幅するために使用されるプライマーの間のミスマッチによって又はプライマーを結合させないようにする分析物の構造によって引き起こされると考えられる。

例えばＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ等の分析物に関して、様々な多型病原性菌株のウイルスが存在することは公知である。これらの多型株は、通常は１又はそれ以上のヌクレオチドによって相互に異なる。プライマーが分析物と異なるときは、あまり良好に適合せず、増幅の低下を導く。分析物が線形ではなく、特定構造を有するときは、プライマーがアクセスしにくく、その結果やはり増幅低下を導くことになる。

加えて、分析物の増幅標的配列と検出のために使用するプローブの間の配列の相違が検出の効率をさらに低下させる。従って、多型を有する分析物は、プローブのコンセンサス配列と完全に一致する分析物ほどには良好に検出されない。しかし、検出は通常増幅よりも低い温度で実施され、従ってプローブと標的の間のミスマッチの負の作用は、プライマーと分析物の間の相違によって引き起こされるものよりははるかに少ないと予想される。

プローブは、公知の多型に適合するように最適化することができる。しかし、未知の多型の場合にはこれは不可能である。特にＨＩＶの場合には信頼し得る検出又は定量の妨げとなる、新しい未知の多型が絶えず生成されるので、これは特に問題である。

本発明を導いた研究の中で、今や、未知の多型を有するＨＩＶウイルスの（臨床）試料のＮＡＳＢＡ増幅反応において、分子ビーコン検出系ではシグナルが全く生成されない又はより低いシグナルしか生成されないことが認められた。しかし驚くべきことに、分析物に関するプローブの融解温度を上昇させるように分子ビーコンプローブを修飾したとき、アンプリコンを検出することができた。これは、アンプリコンが実際には生成されているが、検出されない又は部分的にしか検出されないという予想外の結論を導いた。

ＩＢＬ作用に関して、出願人はまた、ＮＡＳＢＡ増幅の間に使用されるもの（ＡＭＶ−ＲＴ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮアーゼＨ）のような、酵素のバッチ内に存在する夾雑物の作用による分子ビーコンのステムの望ましくない開口を原因とするこの作用を、ステム内のヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル誘導体で部分的に置換されるように分子ビーコンプローブのステムを修飾したとき、低下させ得ることを認めた。

プローブ、特に分子ビーコンプローブを構成するヌクレオチドの修飾は、以下に挙げる公表文献から導かれるように広く普及している手法である。

例えば国際公開広報第ＷＯ−Ａ−００／６６６０４号では、オリゴヌクレオチドの構築におけるＬ−リボ−ＬＮＡヌクレオチドの使用を開示する。Ｌ−リボ−ＬＮＡは、プローブの親和性及び／又は特異性を高めるため及びまた相補的配列に対する種々のオリゴヌクレオチドの親和性を等しくするための手段として使用できる。短いプローブと組み合わせたこのＬＮＡの特殊形態はまた、ＲＮＡとＤＮＡプローブを識別するためにも使用できる。これは、診断及び分子生物学手順を改善するためにオリゴヌクレオチド内の選択ヌクレオシドをＬ−リボ−ＬＮＡで置換することによって実施できる。

Ｍａｊｌｅｓｓｉら（第２６巻、９号、１９９８、ｐ．２２２４−２２２９（ＸＰ００２２４１７００））の公表文献は、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドだけを含む線状プローブを述べている。この公表文献の目的は、修飾プローブの改善されたＴｍとより迅速なハイブリダイゼーション動態を示すための、２’−Ｏ−メチルプローブと通常の２’−デオキシプローブの比較に限定される。彼らは、マッチ二本鎖とミスマッチ二本鎖の間のＴｍ値の変動は、２’−デオキシプローブよりも２’−Ｏ−メチルプローブの方がはるかに大きいという結論に至った。この記述は検討された全てのプローブ長（８−２６ヌクレオチド）に当てはまり、Ｔｍの差はプローブ長が１６塩基以下であるとき最も著明であった。

Ｔｓｏｕｒｋａｓらのもう１つの公表文献（第３０巻、２３号、２００２年１２月１日、ｐ．５１６８−５１７４（ＸＰ００２２４１７０１））は、分子ビーコンのヌクレアーゼ分解を低下させることを提案する。このために、彼らは、分子ビーコンプローブの全ての２’−デオキシヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドで置換することによってＭＢを保護し、同時にプローブとＲＮＡの間の親和性を高める。

Ｂｒｏｗｎ−Ｄｒｉｖｅｒら（第９巻、２号、１９９９年４月（１９９９−０４）、ｐ．１４５−１５４（ＸＰ００９００８８８１））の文書では、ＨＣＶの翻訳を阻害するために、非修飾オリゴヌクレオチドの代わりにＨＣＶ ＲＮＡに相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提案された。とりわけ良好な候補物質である修飾オリゴヌクレオチドの１つは２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドである。前記の２つの公表文献に述べられているように、各々の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成される。この構造の結果は、親和性の上昇、次に標的と修飾オリゴヌクレオチドの間の強い結合である。

ここで前述した先行技術と異なり、本発明は、プローブ当り数個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ハイブリダイズする２６ヌクレオチドのうち６から１５個、すなわち組込み量の２３％から５８％）だけを組み込んだ分子ビーコンがＲＮＡ標的の検出に有用であり、全面的に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換されたオリゴヌクレオチドよりもさらに一層効率的であることを示す。

診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響に関しては、ＬＮＡ類似体も本発明の最終結果に到達するための良好な候補物質である。ＬＮＡで部分修飾された分子ビーコンは、診断アッセイにおいて標的の配列変異への依存性を低下させるための非常に用途の広いツールとなる。

同じように、増幅酵素混合物中に存在する夾雑物によって分子ビーコンのステム−ループ構造に生じうる開口によるＩＢＬ作用は、これらの分子ビーコンプローブを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで部分修飾したとき低下する。これは、この改善された構造によって分子ビーコンプローブがよりよい安定性を有し、（増幅）酵素（の夾雑物）の存在下で自然に開口しないという予想外の結論を導いた。

従って、プローブと分析物の間の親和性の操作によってハイブリダイゼーションアッセイにおける配列多型の影響を低下させることが本発明の１つの目的である。これは、分析物とプローブの間の親和性の上昇をもたらす１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体のプローブへの導入により、本発明に従って達成される。

本発明は、従って、核酸分析物内の配列変異の影響を低下させるための、プローブ―分子ビーコンでありうる―の診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に関し、前記アッセイは、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブは、親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含み、及び前記診断アッセイは、試料中に存在する分析物の量を評価するためである。

本発明はまた、核酸分析物内の配列変異の影響を低下させるための、プローブ―分子ビーコンでありうる―の診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に関し、前記アッセイは、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブは、親和性を高める修飾を有する、すなわちハイブリダイゼーションの一定温度で、何らかの可能性のある分析物の多型を有するプローブの融解温度が、何らかの分析物の多型を有する非修飾プローブの融解温度に比べて高い、１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含み、及び前記診断アッセイは、試料中に存在する分析物の量を評価するためである。

本発明は、増幅酵素混合物中に存在する少なくとも１つの夾雑物によって分子ビーコンのステムに生じうる開口によるＩＢＬ作用を低下させるための分子ビーコンプローブの、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に関し、前記アッセイは、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブのステムは、
・親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体、特に２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
・１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
を含む。

本発明はまた、
・核酸分析物内の配列変異の影響、及び／又は
・汚染された酵素によって分子ビーコンのステム−ループ構造に生じうる開口によるＩＢＬ作用
を低下させるためのプローブの診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に関し、前記アッセイは、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブのループは、
・親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体、及び
・１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
を含む、及び／又は
前記プローブのステムは、
・親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、特に２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
・１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
を含む。

核酸アッセイにおける配列変異の影響の低下に関して、プローブと標的の間の結合は、一方では非結合標的と非結合プローブ及び他方では前記二者間の二本鎖との間での平衡である。

この平衡は、ここではプローブの５０％が二本鎖において標的核酸と結合する温度と定義される、二本鎖の融解温度（Ｔｍ）によって表わされる。平衡を二本鎖の方にシフトさせることは、融解温度の上昇によって達成できる。アッセイでは、これは、完全にマッチする分析物の等しい定量、プローブに相補的な配列内に多型を含む分析物のより良い（すなわちより高い）定量及び非常の小量の（多型）分析物の改善された検出を導く。

ここで使用する「プローブ」という用語は、標的にハイブリダイズする一続きのヌクレオチドを包含することが意図されている。好ましくは、ハイブリダイズする部分は、１０から５０個、より好ましくは１５から３５個、最も好ましくは１５から３０個の一続きのヌクレオチドである。

「親和性を高める」という用語は、親和性を高める修飾を含むプローブと分析物の間での二本鎖の融解温度が、分析物と非修飾プローブの間での融解温度に比べて高いことを意味する。

ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に対するプローブの親和性を高める修飾を有するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、好ましくは２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）から成る群より選択される。２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチドの場合は、好ましくは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。

本発明に従ったプローブは、好ましくはいわゆる分子ビーコン（ＭＢ）である。これらのプローブは、線状プローブよりも高い特異性で標的を認識し、１個のヌクレオチドによって互いに異なる標的を容易に識別することができる。親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体の導入、特に分子ビーコンのループ内への導入により、多型分析物へのプローブの親和性が上昇するため、多型に対する感受性が低下し、アッセイにおいてより正確な結果が得られる。従って、改変された分子ビーコンは、均一系アッセイにおいて標的の配列変異に対する依存性を低下させるための非常に用途の広いツールとなる。

ＩＢＬ作用に関して、「分子ビーコン」プローブという用語は、プローブの５’末端の相補的配列とハイブリダイズする、プローブの３’末端の配列に属する一続きのヌクレオチドを包含することが意図されている。好ましくは、ハイブリダイズする部分は、４から１５個、より好ましくは５から１０個、最も好ましくは６から８個の一続きのヌクレオチドである。

修飾ヌクレオチドは、プローブ全体を合成するため又は幾つかのヌクレオチドだけが修飾ヌクレオチドで置換されているキメラプローブを作製するために使用できる。

ミスマッチを中和するために最小限必要な修飾の量は、分析物のコンセンサス配列と検出する分析物の配列との相違の量に依存する。一般に、修飾の量は、プローブと検出する分析物の間の二本鎖の融解温度が検出温度、すなわち検出が実施される温度を上回るようにすべきであると言うことができる。

プローブ内の修飾ヌクレオチドの量はまた、使用する修飾のタイプにも依存する。プローブ内に１個のＬＮＡヌクレオチドを導入したときのＴｍ（その標的に関するプローブの融解温度）の上昇は、１個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの作用に比べてはるかに高い。実施例において、例えばプローブ内への２個のＬＮＡヌクレオチドの導入はＴｍを１５℃上昇させ、一方同じＴｍの上昇を得るためには１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが必要であることが明らかにされる。

ＨＩＶなどの検出すべき分析物は、突然変異を生じやすく、従って多型を導く、いわゆる「ホットスポット」を含みうる。公知の単離物の場合のように、これらのホットスポットの位置又は分析物とプローブのミスマッチの他の位置が公知であるときは、多型位置付近に、好ましくは保存された位置に、親和性を高める修飾を有するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を配置することが好ましい。

本発明はさらに、核酸分析物を検出するために核酸プローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイに関し、前記プローブは、親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含む。プローブにおいて使用する修飾ヌクレオチド及び／又はその類似体は、前記で定義したとおりである。

本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、核酸分析物を検出するために核酸プローブを使用するいかなる種類のものであってもよい。このようなアッセイは、ＰＣＲ、ＴＭＡ又はＮＡＳＢＡに基づくアッセイにおけるように、増幅された分析物の検出に基づきうる。しかし、プローブはまた、アレイにおいても使用できる。本発明は、標的の配列多型がアッセイの信頼度に影響を及ぼす、定量的及び定性的診断アッセイにおいて使用できる。

本発明から恩恵を受ける診断アッセイは、例えば、これらの診断アッセイが、対象とする分析物と修飾オリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを利用することを特徴とする限り、例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、エボラウイルス、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコプラスマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ＲＳＶ、ＭＲＳＡ、ＨＳＶ、ＴＮＦ−α、ＥＲ−α、のようなウイルス、細菌及び他のバイオマーカーを検出するためのアッセイである。

本発明はまた、親和性を高める修飾を有する１又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含むプローブに関する。前記プローブは、好ましくは分子ビーコンである。

本明細書において、「分析物」、「アンプリコン」、及び「標的」又は「標的配列」という用語は、交換可能に使用しうる。分析物は、検出すべきオリジナル核酸分子である。標的配列は、プライマーによって増幅される分析物の部分である。増幅は、プローブへのハイブリダイゼーションによって物理的に検出される核酸分子である、アンプリコンの形成を導く。アンプリコンの配列は、分析物内の標的配列と同じか又は標的配列に相補的である。

いかなる意味においても本発明を限定することを意図しない、以下の実施例及び図面において本発明を説明する。添付の図面を参照して本発明をさらに示す。

（実施例）
実施例の実験詳細の全般的説明：
以下で述べる実施例は、実施例の中で特に異なる記述がない限り、以下で述べる条件及び方法を使用する。

増幅ＲＮＡ物質を使用する実験では、この物質を、標準的な単離及びＮＡＳＢＡ増幅条件を使用して抽出し、増幅した、ＲＮＡ鋳型（ウイルス溶解産物）の増幅によって得た。

あらゆる実験において、使用するプローブ（分子ビーコン）の種類の変異を除き、反応条件は同一に保持した。

改善されたサブタイプ反応性を調べるためのモデル系として、ＨＩＶ−１の種々のサブタイプの大部分を占める、十分に特性決定されたウイルス溶解産物のセットを使用した。

定量的結果を得るために増幅反応を使用する場合は、単離の前に添加する、周知量の内部検定物質を使用して標的を共増幅した。この内部検定物質を、異なる色を有するもう１つ別の分子ビーコンを用いて検出する。リアルタイム増幅曲線から及び特別に開発されたソフトウエアを使用して、存在する物質の量を正確に測定することが可能である。混合物の蛍光強度を漸次上昇する温度の関数として測定することにより、標的と分子ビーコンの間の融解温度（Ｔｍ）を判定した。これらの融解曲線からＴｍを決定することができる。過剰標的がアンプリコン（ＲＮＡ）である場合は、ＴｍをＴｍループＲＮＡと称する。標的が過剰の合成ＤＮＡである場合は、ＴｍをＴｍループＤＮＡと称する。後者は、分子ビーコンに対して相補的な合成ＤＮＡ鎖を用いて測定した。この配列に、本発明者らはイノシンではなく２個のＣを導入した。ＲＮＡ標的（アンプリコン）では、これらの位置は２個のＴを含む。

プローブ内のヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル誘導体で置換することの、二本鎖のＴｍへの影響
３個の新規及び１個の標準ＭＢのハイブリダイズする部分の配列を表１に示す。また、合成ＤＮＡ及び増幅物質（ＲＮＡ）に関して測定した種々の分子ビーコンのＴｍ値も表１に示す。

表１のデータからわかるように、２’−Ｏ−メチル誘導体の導入は、標的ＲＮＡと分子ビーコンのループの間の親和性上昇（より高いＴｍループＲＮＡ）を導く。２’−Ｏ−メチル誘導体はＤＮＡ標的よりもＲＮＡとより強く結合することが知られているので、予想されたように、この上昇はＤＮＡ−分子ビーコン複合体に関するほど著明ではない。

表２において、２個の新しいＭＢのハイブリダイズする配列を標準ＭＢと共に示す。新しいＭＢはそれぞれ２個及び３個のＬＮＡ構築ブロックを含む。また、相補的ＤＮＡ及び増幅物質（ＲＮＡ）に関するＴｍ値も測定し、結果を表に示している。この表から、ＬＮＡヌクレオチドがＤＮＡ及びＲＮＡ複合体の両方のＴｍを上昇させることがわかる。また、増幅当りのＴｍへの影響が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドに比べてはるかに高いことも認められる。

修飾分子ビーコンによる種々のＨＩＶ−１単離物の検出
標的ＲＮＡ配列内の５つの配列多型の影響を調べるためにモデル系として働くように選択したＨＩＶ−１単離物を表３に示す。これらの物質は既知濃度のウイルス溶解産物として入手可能であり、実施例１及び２の分子ビーコンによるＮＡＳＢＡ増幅において使用した。

本発明者らの標準分子ビーコンと比較してこれらの分子ビーコンの３つに関して、サブタイプごとに等量の標的を含む試料について得た定量結果を表４に示す。

Ａ−サブタイプは４つの分子ビーコン全てと完全に適合するので、全ての定量データをこのサブタイプに基づいて正規化する。他のサブタイプは、これらが分子ビーコンのループ結合領域に関して配列変異を示すことから選択した（表３参照）。表からわかるように、５つのサブタイプ全てについて最も高い定量は、Ｍｅ−７分子ビーコン誘導体で認められた。

より良好な定量と種々の分子ビーコンのＴｍループＲＮＡ値（℃）の関係を検討するため、後者を、分子ビーコン誘導体とＮＡＳＢＡアンプリコンの間の二本鎖に関して測定した。これは表５に示す結果を生じた。

表４及び５からわかるように、より高いＴｍループＲＮＡ（アンプリコンと分子ビーコンの間）とより高い定量の間に明らかな相関を認めることができる。

ＩＢＬ低下へのステム構造の影響
ＨＩＶ標的に対してハイブリダイズする同一配列を有する一連のＭＢを比較した。ＭＢ間の相違は、ステムの配列及びステム内の２’−Ｏ−メチル誘導体の含量と位置であった。検討した構造を図１０−１９に示している。図９は、標準として使用した、２’−Ｏ−メチル誘導体を含まない分子ビーコンを示す。

以下に述べる実験では全てのＭＢを、これらのＭＢで検出できる標的の不在下で標準ＮＡＳＢＡ増幅条件に供した（鋳型なし反応）。ＭＢ内に存在する発蛍光団のシグナルを時間の関数として測定した。これらのデータより、ＩＢＬ作用は６０分間にわたるシグナルの上昇として得られる。ＩＢＬパーセンテージは出発シグナルと比較したときの上昇である。

この表から、ＭＢの３’又は５’末端のいずれかに連続する一続きの２’−Ｏ−メトキシヌクレオチドを含むＭＢ４及びＭＢ１０は最適に機能しないと結論することができる。またこれらのデータから、低いＩＢＬ作用を有するステムの設計は、ＭＢ８及びＭＢ９に関して予想外に低かったことが認められる。

ＩＢＬ作用への種々のＴ７酵素バッチの影響
エンテロウイルス属のために設計されたＭＢ（図７）を、同じハイブリダイズ配列を含むが、ステム構造が先の実施例からのＭＢ８（図１７参照）に基づくＭＢと比較した。エンテロウイルス属のために設計された修飾ＭＢを図８に示す。

２個のＭＢを以下に述べる実験において検討した。これらを、ＭＢで検出できる標的の不在下で標準ＮＡＳＢＡ増幅条件に供した（鋳型なし反応）。反応条件は両方のＭＢについて同一に保持し、検討した変異は、
１）プローブ内への新しいステムの導入の影響及び
２）ＮＡＳＢＡ反応におけるＴ７酵素の３つのバッチの影響
であった。

３つのバッチは同じ販売者から入手したものであり、同じ比活性を有していた。これらは、観測されたＩＢＬ作用が異なっていた（ＩＢＬ作用に関して正常、中等度、不良（不良は、ＭＢの多量の望ましくない開口である））。ＭＢ内に存在する発蛍光団のシグナルを時間の関数として測定した。これらのデータより、ＩＢＬ作用は１２０分間にわたるシグナルの上昇として得られる。ＩＢＬパーセンテージは出発シグナルと比較したときの上昇である。

図２０から、正常デオキシヌクレオチドを含む全てのＭＢ、いわゆる「ＷＴ Ｅｎｔｅｒｏ」に関して、分子ビーコンの望ましくない開口は、中等度Ｔ７バッチの使用と不良Ｔ７バッチの使用との間で起こるＩＢＬ作用の劇的な上昇を生じさせる。しかし、ステム内に２’−Ｏ−メトキシヌクレオチドを含む修飾ＭＢ（図８）は、Ｔ７バッチの品質に関してほとんど影響を示さない。これは、ＩＢＬを決定するのはＴ７の品質（例えばＴ７の少なくとも１つの夾雑物が存在し得ること）であり、Ｔ７そのものではないことを明らかに示している。

種々の酵素バッチの異なるＩＢＬ作用への最適ステム構造の影響
種々の標的（レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（図１）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（図３）、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（図５））のために設計された第二シリーズのＭＢを、同じハイブリダイズ配列を含むが、ステム構造が先の実施例からのＭＢ８（図１７参照）に基づくＭＢ（それぞれレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（図２）及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（図６））と比較した。マイコプラスマ標的に関してはこれが不可能であったので、ＭＢ８と比較してステム構造に小さな逸脱を作製し、この標的に特異的な修飾分子ビーコンを得た（図４参照）。

以下に述べる実験ではＭＢを対で（標的ごとに）検討した。これらを、ＭＢで検出できる標的の不在下で標準ＮＡＳＢＡ増幅条件に供した（鋳型なし反応）。反応条件はＭＢのセットごとに同一に保持し、検討した変異はプローブ内への新しいステムの導入であり、第二の変異はＮＡＳＢＡ反応における２つのバッチのＴ７酵素の使用であった。第一バッチ（Ｔ７と称する）は良好であることが知られており、及び第二バッチ（同じ販売者からで、同じ比活性を有する）は、ＩＢＬ作用の劇的な上昇をもたらす、分子ビーコンのより多くの望ましくない開口を生成することがわかっていた。ＭＢ内に存在する発蛍光団のシグナルを時間の関数として測定した。これらのデータより、ＩＢＬ作用は６０分間にわたるシグナルの上昇として得られる。パーセンテージＩＢＬは出発シグナルと比較したときの上昇である。

図２１から、正常デオキシヌクレオチドを含む全てのＭＢに関して、不良Ｔ７は望ましくないＩＢＬのより高い作用を生じさせることがわかる。しかし、ステム内に２’−Ｏ−メトキシヌクレオチドを含む修飾ＭＢはＴ７の品質に関する影響をほとんど示さなかった。言い換えると、ステム構造内でのメトキシ誘導体の使用によってＭＢは酵素品質の影響を受けにくくなる。

以下レジオネラと称する、技術水準に従った、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）の検出を可能にする分子ビーコンの概略図。 以下Ｌｅｇ−ｍｅｔ１と称する、同じレジオネラ菌の検出を可能にし、及びＩＢＬ作用を低下させる、本発明による改善された分子ビーコンの概略図。 以下マイコプラスマと称する、技術水準に従った、マイコプラスマ菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の検出を可能にする分子ビーコンの概略図。 以下Ｍｙｃｏ−ｍｅｔと称する、同じマイコプラスマ菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の検出を可能にし、及びＩＢＬ作用を低下させる、本発明による改善された分子ビーコンの第一実施形態の概略図。 以下クラミジアと称する、技術水準に従った、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）の検出を可能にする分子ビーコンの概略図。 以下Ｃｈｌａｍ−ｍｅｔと称する、同じクラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）の検出を可能にし、及びＩＢＬ作用を低下させる、本発明による改善された分子ビーコンの概略図。 以下ＷＴ Ｅｎｔｅｒｏと称する、技術水準に従った、野生型エンテロコッカス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の検出を可能にする分子ビーコンの概略図。 以下ＷＴ Ｅｎｔｅｒｏ−ｍｅｔと称する、同じ野生型エンテロコッカス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の検出を可能にし、及びＩＢＬ作用を低下させる、本発明による改善された分子ビーコンの概略図。 以下標準ＭＢと称する、ステム内又はループ内のいずれにも２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを組み込んでいない、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする分子ビーコンの概略図。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 以下ＭＢ１からＭＢ１０と称する、技術水準に従った、ＨＩＶの検出を可能にする一連の分子ビーコンの概略図。各々の分子ビーコンは、２’−Ｏ−メチル誘導体を含有する、異なるステムを有する。 種々のＴ７酵素バッチのＩＢＬ作用への影響を示す棒グラフ。 種々の酵素バッチの異なるＩＢＬ作用への最適ステム構造の影響を示し、及びアッセイにおいて使用した様々な分子ビーコン、すなわち一方は非修飾分子ビーコン及び他方は修飾分子ビーコン、の構造に関連するＩＢＬ作用の比較試験を示す棒グラフ。 図２０及び２１において、修飾分子ビーコンはステム内に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを組み込んでいる。 図１から８及び１０から１９において、修飾ヌクレオチドは、主としてグアニジンについてのＧ又はアデニンについてのＡを、太字、イタリック体及び下線付きの対応する文字で表わしている。

Claims (16)

1. アッセイが、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブが、
   −２’−Ｏ−メチルヌクレオチド又はＬＮＡヌクレオチドから選択される１又はそれ以上のヌクレオチド、及び
   −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とする、核酸分析物内の配列変異の影響を低下させるためのプローブの、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用であって、
   前記診断アッセイが試料中に存在する分析物の量を評価するためである、前記使用。
2. アッセイが、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブが、
   −ハイブリダイゼーションの一定温度で、分析物の多型を有するプローブの融解温度が、分析物の多型を有する非修飾プローブの融解温度に比べて高い、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド又はＬＮＡヌクレオチドから選択される１又はそれ以上のヌクレオチド、及び
   −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とする、核酸分析物内の配列変異の影響を低下させるためのプローブの、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用であって、
   前記診断アッセイが試料中の分析物の存在を評価するためである、前記使用。
3. 前記プローブが分子ビーコンである、請求項１〜２に記載の使用。
4. アッセイが、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブのステムが、
   １又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
   １又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とする、増幅酵素混合物中に存在する少なくとも１つの夾雑物によって分子ビーコンのステムに生じうる開口を低下させるための分子ビーコンプローブの、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用。
5. アッセイが、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブのループが、
   −２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ又はペプチド核酸から選択される１又はそれ以上のヌクレオチド又は核酸、及び
   −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とし、及び／又は
   前記プローブのステムが、
   −１又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
   −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とする、
   −核酸分析物内の配列変異の影響、及び／又は
   −増幅酵素混合物中に存在する少なくとも１つの夾雑物によって分子ビーコンのステム−ループ構造に生じうる開口
   を低下させるための分子ビーコンプローブの、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用。
6. 前記診断アッセイが均一系アッセイである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記診断アッセイが不均一系アッセイである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
8. ハイブリダイゼーションの一定温度で、分析物の多型に関するプローブの融解温度が、同じ標的に関する非修飾プローブの融解温度に比べて高い、１又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド及び１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチドを含む、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための分子ビーコンプローブ。
9. アッセイが、一組のプライマーと核酸分析物を含む試料を接触させて前記分析物を増幅する工程及び増幅された分析物又はその相補物をプローブによって検出する工程を含み、前記プローブのステムが、
   −１又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
   −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
   を含むことを特徴とし、増幅酵素混合物中に存在する少なくとも１つの夾雑物によって分子ビーコンのステム−ループ構造に生じうる開口の低下を可能にする、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための分子ビーコンプローブ。
10. プローブのループが、
    −２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ又はペプチド核酸から選択される１又はそれ以上のヌクレオチド又は核酸、及び
    −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
    を含むことを特徴とし、及び／又は
    プローブのステムが、
    −１又はそれ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び
    −１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチド
    を含むことを特徴とする、
    −核酸分析物内の配列変異の影響、及び／又は
    −酵素によって分子ビーコンのステム−ループ構造に生じうる開口
    の低下を可能にする、診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための分子ビーコンプローブ。
11. 前記ヌクレオチド又は核酸が、２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ及びペプチド核酸から成る群より選択される、請求項９または１０に記載の分子ビーコンプローブ。
12. ２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである、請求項１１に記載の分子ビーコンプローブ。
13. 前記ステムを構成する各々の塩基対が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを１個だけ含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の分子ビーコンプローブ。
14. 前記ステムを構成する少なくとも１つの塩基対が、２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ又はペプチド核酸から選択されるヌクレオチド又は核酸を含まない、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の分子ビーコンプローブ。
15. 前記ステムを構成する１つの塩基対が、２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ又はペプチド核酸から選択されるヌクレオチド又は核酸を含まない、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の分子ビーコンプローブ。
16. 前記ステムを構成する各々の鎖が、少なくとも１個の２’−Ｏ−誘導体化ヌクレオチド、ＬＮＡ又はペプチド核酸から選択されるヌクレオチド又は核酸を含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の分子ビーコンプローブ。

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