CN107354212A

CN107354212A - Vkorc1基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN107354212A
Application number: CN201710615132.9A
Authority: CN
Inventors: 张洪娇; 贺庭祯; 向·霄; 熊伟
Original assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2017-11-17

Abstract

本发明公开了VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应混合液；PCR反应混合液的原料及终浓度为，DNA聚合酶0.04‑0.1 U/μL；dNTPs 0.1‑0.5mM；5X PCR缓冲液0.5‑1.5X；MgCl2 1.5‑3.5mM；十二烷基硫酸钠0.0005‑0.015％（w/v）；聚乙二醇辛基苯基醚0.001‑0.03％（w/v）；上游引物0.2‑1.0 μM；下游引物0.2‑1.0 μM；突变型分子信标0.2‑1.0μM；野生型分子信标0.2‑1.0 μM；其用于检测口腔黏膜脱落细胞样品。本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、避免污染且检测快速的VKORC1基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

Description

VKORC1基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种VKORC1基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此，SNP在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价值。

华法林是目前临床使用比较广泛的一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶栓的双重作用。华法林可用于机械心脏瓣膜置换术术后、非瓣膜性心房颤动以及深静脉血栓等患者的抗凝治疗。华法林的抗凝治疗指数范围狭窄，如果剂量不足则达不到治疗效果，剂量稍微过量则会引起出血，重者危及病人生命。同时，华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的个体差异，即使同一个体在不同时期所需的剂量也可能不同。华法林的剂量受多种因素影响，如遗传基因多态性、体重指数、年龄等及其他药物因素等。研究表明，不同患者使用抗凝药物华法林的剂量可以相差20倍，亚洲人的维持剂量比白种人要低30％-40％。因此，如何在临床上安全合理使用华法林长期以来是许多研究者关注的重点和难点。

维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(vitamin K epoxide reductasecomplex subunit 1，VKORC1)的基因多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素之一。VKORC1位于染色体16p11.2区域，全长约4100bp。VKORC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，其中对华法林剂量有影响的单核苷酸多态性位点主要有启动子区-1639G>A(rs9923231)，内含子1的1173C>T(rs9934438)和3c-未翻译区的3730G>A(rs7294)，目前研究的主要位点为-1639G>A(rs9923231)。

VKORC1-1639GG被称作非变异或野生纯合基因型,VKORC1-1639GA是杂合突变基因型，与野生基因型相比，携带杂合突变基因型的患者需要华法林剂量相对较低；VKORC1-1639AA是突变纯合基因型，与野生纯合基因型相比，携带突变纯合基因型的患者需要的华法林剂量更低一些。研究表明VKORC1-1639G>A的基因突变频率在不同种族间也存在显著差异。

目前，用于VKORC1基因多态性分型检测的方法有多种，主要包括以下几种：1、DNA测序法：分型检测的金标准，但通量低、价格较高、技术要求高、易污染，结果判读费时费力。2、扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)：通过设计特异性引物，有选择性的扩增野生或突变模板，通过扩增产物的量来确定是野生型或突变型。引物设计是决定检测灵敏度的关键。3、限制性酶切方法(RFLP)：费用较低，实验过程简单，准确性较好，但通量低，只适合部分SNP分型。4、高分辨率溶解曲线法(HRM)：简单快速、成本低(无须设计探针)，但结果准确度较低。5、基因芯片法(Genechips)：高通量，造价较高且条件难以控制，可重复性差，易出现假阳性、假阴性结果。

鉴于目前国内VKORC1基因多态性分型检测的方法各有优劣，但没有一种检测方法是相对优势非常突出的，因此需要建立一种操作简单、快速省时且特异性高、灵敏度好的分型检测方法。

本发明提供了一种特异且灵敏的VKORC1基因多态性快速分型检测的引物、分子信标、试剂盒及检测方法，为华法林临床用药提供依据，以减小患者疾病治疗风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速省时且特异性高、灵敏度好、分型正确的VKORC1基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应混合液；PCR反应混合液的原料及终浓度为：

DNA聚合酶 0.04-0.1U/μL；

dNTPs 0.1-0.5mM；

5X PCR缓冲液 0.5-1.5X；

MgCl₂ 1.5-3.5mM；

十二烷基硫酸钠 0.0005-0.015％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％(w/v)；

上游引物 0.2-1.0μM；

下游引物 0.2-1.0μM；

突变型分子信标 0.2-1.0μM；

野生型分子信标 0.2-1.0μM；

其用于检测细胞样品。

采用本发明技术方案的VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，DNA聚合酶，本发明采用的GoTaq DNA聚合酶是一种Mg2+依赖性DNA聚合酶，以DNA为复制模板，将DNA由5'端开始复制到3'端。dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，dNTPs则是由四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复制的原料。上游引物、下游引物作为DNA复制的起始点，在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，因此，在核酸合成反应中，引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。MgCl₂的作用是提供Mg²⁺，与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别。PCR缓冲液的作用是有助于酶的稳定，给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。细胞裂解液(由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成)的作用是溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。因此，由于上述PCR反应混合液中含有细胞裂解液，所以加入口腔细胞作为模板就可实现对VKORC1基因多态性分型的检测。

在现有的PCR反应中，以细胞直接作为模板的PCR反应，通常无法彻底裂解细胞，并且裂解后的细胞碎片及一些细胞内容物(如蛋白酶)对PCR反应有抑制，最终导致分型结果不稳定，甚至失败。

本发明的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠是一种能够使蛋白质变性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域，十二烷基硫酸钠(简称SDS)经常被用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物，在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚(简称Triton X-100)被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还作为限制性内切酶的缓冲液的成分之一。在实验过程中，发明人发现通过SDS和Triton X-100混合组成，配合与基因相关的原料终浓度，在增强细胞裂解程度的同时还降低了这些潜在的抑制剂对PCR的抑制作用(通过溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间微弱的化学键，分解一些蛋白酶)可快速解决污染样品的问题。

由实验可知，PCR反应混合液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果均正确。其中，5X反应缓冲液1X的原料为5X反应缓冲液，指的是初始浓度为5倍的反应缓冲液，1X是指的应用的终浓度。

通过这一发明点不仅大大节省了检测的时间，操作的时间可控制在1-1.5h，还避免了繁琐操作可能带来的DNA污染。

进一步，所述的PCR反应混合液的原料终浓度为：

DNA聚合酶 0.09U/μL；

dNTPs 0.2mM；

5X PCR缓冲液 1.1X；

MgCl₂ 2.5mM；

十二烷基硫酸钠 0.005％w/v；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％w/v；

上游引物 0.3μM；

下游引物 0.3μM；

突变型分子信标 0.2μM；

野生型分子信标 0.5μM。

由实验可知，PCR反应混合液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果最准确，且准确率最高。

进一步，所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。本发明以直接刮取的口腔黏膜脱落细胞为样本，操作方便。

进一步，还包括有提纯的人类基因组DNA基因序列。试剂盒中包括质控品，为提纯的人类基因组DNA基因序列，是在测定时为了做平行试验，来测定试剂结果的有效性。

本申请还提出另一个技术方案，本发明试剂盒中的VKORC1基因多态性快速检测的引物，

上游引物5’-3’的基因序列为：CCAAAATGCTAGGATTATAGGC；

下游引物5’-3’的基因序列为：GTCAAGGCAAGAGAAGACCTG。

本申请还提出另一个技术方案，试剂盒中引物检测的VKORC1基因多态性快速检测的分子信标，野生型分子信标的5’-3’的基因序列为：CACGTGACCGCACCCGGCCAACACGTG；

突变型分子信标的5’-3’的基因序列为：CGACGTCCGCAC+CT+GGCCAATACGTCG；

+为LNA修饰；

且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团。LNA修饰为锁核酸修饰，即+为锁核酸修饰的碱基。

本技术方案使用了分子信标(molecular beacon)是一种茎环双标记寡核苷酸探针，此探针可以在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后所产生的光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种发夹结构被破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发并被监测仪器探测到。本发明中的分子信标具有检测灵敏度高，选择性强，无需除去未杂交的探针等优点。

同时，对本发明中分子信标的部分碱基还加入了LNA(Lock Nucleiacids)修饰(序列中显示“+”)。LNA是一种双环状核苷酸衍生物，含有2'-O，4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，即核糖的2'氧原子和4'碳原子通过一个亚甲基桥连接起来。这个环形连接限制了呋喃核糖的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。通过核磁共振(Nuclear Nagnetic Resonance，NMR)研究发现随着LNA的增加，杂交双螺旋结构构型发生变化(寡核苷酸的碱基由β构型改变成α构型)，此时核酶不能识别磷酸二酯键，使得寡核苷酸的稳定性有提高(抗核酸酶降解)。而磷酸盐骨架局部结构的调整而导致碱基堆积作用力的增加也是提高LNA杂交双链稳定性的原因之一，因此LNA修饰的探针有很强的热稳定性。寡核苷酸中掺入一个LNA碱基就能使熔解温度(Tm)升高4-9℃，有效地增加了探针的特异性，不仅降低了对需求设计序列的选择性，还提高了对SNP的分型正确性。

检测的原理为：在VKORC1基因SNP突变位点两侧保守区域设计一对引物：上游引物、下游引物，并在突变位点序列处设计两个分子信标：突变型分子信标、野生型分子信标；野生型分子信标5’端用荧光素标记，3’端用淬灭基团标记；而突变型分子信标5’端用荧光素标记，3’端用淬灭基团标记。在PCR退火阶段，野生型分子信标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，在结合后，荧光基团远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，从而通过荧光的颜色来判断所检测基因的基因型。

进一步，所述的荧光基团为Fam标记基团，所述的淬灭基团为BHQ1标记基团；

或者荧光基团为Alexa Fluor 594标记基团，所述的淬灭基团为BHQ2标记基团。为本发明中所使用的两种荧光基团和淬灭基团，当然，也可用其他荧光基团和与其配合的淬灭基团代替，不影响检测结果。

本申请还提出另一个技术方案，利用上述的引物、分子信标及试剂盒进行的VKORC1基因多态性快速检测方法，操作方法为，

(1)取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上、下为1次；

(3)取样后将取样装置的取样部插入PCR反应混合液中，混匀；

(4)取1μL提纯的人类基因组DNA基因序列加入到另一支PCR反应混合液中，混匀；

(5)将完成加样的PCR反应混合液放入定量PCR仪中，运行反应程序。

进一步，其定量PCR仪的反应程序为：

A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；

B、变性：95℃，8s；

C、退火及延伸：55℃，35s；

D、B及C程序操作50个循环。

进一步，所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。

附图说明

图1是本发明实施例一的检测结果一；

图2是本发明实施例一的检测结果二；

图3是本发明实施例一的检测结果三；

图4是本发明实施例二的检测结果一；

图5是本发明实施例二的检测结果二；

图6是本发明实施例二的检测结果三；

图7是本发明实施例三的检测结果一；

图8是本发明实施例三的检测结果二；

图9是本发明实施例三的检测结果三；

图10是本发明实施例四的检测结果一；

图11是本发明实施例四的检测结果二；

图12是本发明实施例四的检测结果三；

图13是本发明实施例五的检测结果一；

图14是本发明实施例五的检测结果二；

图15是本发明实施例五的检测结果三。

具体实施方式

以下是本发明VKORC1基因多态性快速检测试剂盒中的各实施例的原料终浓度，如表1所示：

表1

以下为本发明VKORC1基因多态性快速检测的具体操作方式：

一、细胞裂解液的配制

不同总浓度的细胞裂解液均配制成为200×的储存液，首先是因为每一支反应液所需原料少，加之聚乙二醇辛基苯基醚为粘稠液体，不易精准吸取。

所有试剂配制均在灭菌后的超净工作台进行。

(1)实施例一、实施例二、实施例三中200X细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管，加入100ul十二烷基硫酸钠(SDS)和18.78ul聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，再加入881.22ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到1％，使TritonX-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。细胞裂解液在加入PCR反应体系时稀释200倍，使其终浓度为1倍。

(2)实施例四中200X细胞裂解液的配制

使用1.5mL的离心管，加入10μL十二烷基硫酸钠和1.88μL聚乙二醇辛基苯基醚，再加入988.12μL无核酸酶的水至总体积1000μL，使十二烷基硫酸钠的终浓度达到0.1％，使聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度达到0.2％，即为200×的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。

(3)实施例五中200X细胞裂解液的配制

使用1.5mL的离心管，加入300μL十二烷基硫酸钠和56.34μL聚乙二醇辛基苯基醚，再加入643.66μL无核酸酶的水至总体积1000μL，使十二烷基硫酸钠的终浓度达到3％，使聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度达到6％，即为200X的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。

上游引物5’-3’的基因序列为：CCAAAATGCTAGGATTATAGGC；

下游引物5’-3’的基因序列为：GTCAAGGCAAGAGAAGACCTG。

野生型分子信标5’-3’的基因序列为：

(Fam标记)-CACGTGACCGCACCCGGCCAACACGTG-(BHQ1标记)；

突变型分子信标5’-3’的基因序列为：

(Alexa Fluor 594标记)-CGACGTCCGCAC+CT+GGCCAATACGTCG-(BHQ2标记)；

+为LNA修饰。

上述原料，除上游引物、下游引物、分子信标、细胞裂解液外，均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。上游引物、下游引物、分子信标均由上海占标生物科技有限公司合成。

二.PCR反应混合液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在灭菌后的超净工作台的冰盒上进行，保证低温且无污染。

表2

细胞裂解液为PCR反应体系中的最终浓度，由于此浓度非常小，配制少量此浓度的裂解液加样时误差会增大，所以为了配制的裂解液的浓度准确，采用将上述十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的浓度扩大，在加样时，将其扩大的浓度增加一定体积量，使其满足上述终浓度的要求。

三、VKORC1基因型检测；

VKORC1基因型快速检测试剂盒由12支分装好的试剂管组成，每个被测者检测2次重复(一次一支试剂管)，每个患者检测需要2次重复，即每个患者检测VKORC1基因型需要2个试剂管。

将配制好的PCR反应混合液分装于试剂管中，每支分装23.5μL，分装完之后在-20℃避光保存；

(1)取样前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液；

(2)取出一次性使用无菌拭子(专利授权公告号：CN205359515U)及反应液，拔掉反应液塞子及拭子端盖；

(3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜；

(4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压使其与试剂管密封，避光暂存；

(5)按压顶部使其与试剂管密封，而后轻弹试剂管使样本与反应液充分混匀；

(6)用移液器取1μL质控品加入到另一支反应液中，轻弹试剂管并混匀；

(7)将完成加样的反应液放入OM-1000型荧光PCR仪器(专利授权公告号：CN103820306B)中，并运行表3中程序。

在20s内连续完成步骤(2)～(4)。

表3

(7)得到扩增曲线和荧光颜色，分析结果。

四、结果分析：

因为人类基因组为二倍体，每一基因座位上含有两个等位基因。因此结果共有三种，分别是“GG”、“GA”或“AA”，其中阴性结果是“GG”，阳性结果是“GA”和“AA”。如图所示，图中G线表示VKORC1未突变基因扩增情况，A线表示VKORC1突变基因扩增情况。

实施例一的检测结果为：

由图1可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由图2可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；

由图3可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由此，可从上述图1、图2和图3中分析得出VKORC1的基因型，从而可以得出，患者对药物的代谢类型。

实施例二的检测结果为：

由图4可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由图5可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；

由图6可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由此，可从上述图4、图5和图6中分析得出VKORC1的基因型，从而可以得出，患者对药物的代谢类型。

实施例三的检测结果为：

由图7可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由图8可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；

由图9可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由此，可从上述图7、图8和图9中分析得出VKORC1的基因型，从而可以得出，患者对药物的代谢类型。

实施例四的检测结果为：

由图10可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由图11可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；

由图12可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由此，可从上述图10、图11和图12中分析得出VKORC1的基因型，从而可以得出，患者对药物的代谢类型。

实施例五的检测结果为：

由图13可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由图14可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；

由图15可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由此，可从上述图13、图14和图15中分析得出VKORC1的基因型，从而可以得出，患者对药物的代谢类型。

实施例一～实施例五分型结果均正确。综合应该强度、CT值及曲线拟合情况，最终选择实施例二组合为最佳配方。

核苷酸序列表如下：

<110>重庆京因生物科技有限责任公司

<120>VKORC1基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

CCAAAATGCTAGGATTATAGGC

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

GTCAAGGCAAGAGAAGACCTG

<210>3

<211>27

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

CACGTGACCGCACCCGGCCAACACGTG

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

CGACGTCCGCAC+CT+GGCCAATACGTCG。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

<110> 重庆京因生物科技有限责任公司

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

CCAAAATGCTAGGATTATAGGC

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

GTCAAGGCAAGAGAAGACCTG

<210>3

<211>27

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

CACGTGACCGCACCCGGCCAACACGTG

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

CGACGTCCGCAC+CT+GGCCAATACGTCG。

Claims

1.VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应混合液；PCR反应混合液的原料及终浓度为：

DNA聚合酶 0.04-0.1 U/μL；

dNTPs 0.1-0.5mM；

5X PCR缓冲液 0.5-1.5X；

MgCl₂ 1.5-3.5mM；

十二烷基硫酸钠 0.0005-0.015％（w/v）；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％（w/v）；

上游引物 0.2-1.0 μM；

下游引物 0.2-1.0 μM；

突变型分子信标 0.2-1.0 μM；

野生型分子信标 0.2-1.0 μM；

其用于检测细胞样品。

2.根据权利要求2所述的VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应混合液的原料终浓度为：

DNA聚合酶 0.09 U/μL；

dNTPs 0.2mM；

5X PCR缓冲液 1.1X；

MgCl₂ 2.5mM；

十二烷基硫酸钠 0.005％ w/v；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％ w/v；

上游引物 0.3μM；

下游引物 0.3 μM；

突变型分子信标 0.2μM；

野生型分子信标 0.5μM。

3.根据权利要求3所述的VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。

4.根据权利要求4所述的VKORC1基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：还包括提纯的人类基因组DNA基因序列。

5.根据权利要求1~4任意一项所述的试剂盒中的VKORC1基因多态性快速检测的引物，其特征在于，

上游引物5’-3’的基因序列为：CCAAAATGCTAGGATTATAGGC；

下游引物5’-3’的基因序列为：GTCAAGGCAAGAGAAGACCTG。

6.利用与权利要求5所述的试剂盒中引物检测的VKORC1基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：

野生型分子信标的5’-3’的基因序列为：cacgtgACCGCACCCGGCCAAcacgtg；

突变型分子信标的5’-3’的基因序列为：cgacgtCCGCAC+CT+GGCCAATacgtcg；+为LNA修饰；

且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团。

7.根据权利要求6所述的VKORC1基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：所述的荧光基团为Fam标记基团，所述的淬灭基团为BHQ1标记基团；

或者荧光基团为Alexa Fluor 594标记基团，所述的淬灭基团为BHQ2标记基团。

8.利用权利要求6或7所述的引物、分子信标和试剂盒进行的VKORC1基因多态性快速检测方法，其特征在于：操作方法为，

（1）取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

（2）取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上、下为1次；

（3）取样后将取样装置的取样部插入PCR反应混合液中，混匀；

（4）取1μL提纯的人类基因组DNA基因序列加入到另一支PCR反应混合液中，混匀；

（5）将完成加样的PCR反应混合液放入定量PCR仪中，运行反应程序。

9.利用权利要求8所述的引物、分子信标和试剂盒进行的VKORC1基因多态性快速检测方法，其特征在于：其定量PCR仪的反应程序为：

A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；

B、变性：95℃，8s；

C、退火及延伸：55℃，35s；

D、B及C程序操作50个循环。

10.如权利要求9所述的VKORC1基因多态性快速检测方法，其特征在于：所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。