CN107227371A - Cyp2c9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Cyp2c9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为：DNA聚合酶 0.05‑0.12U/μL；dNTPs 0.2mM；5X反应缓冲液1X；MgCl2 1.5‑3.5mM；十二烷基硫酸钠0.0005‑0.015％（w/v）；聚乙二醇辛基苯基醚0.001‑0.03％（w/v）；正向引物0.5‑1μM、反向引物0.5‑1μM；突变型探针0.5‑1μM、野生型探针0.5‑1μM，且其用于检测细胞样品。本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、避免污染且检测快速的CYP2C9*3基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

Description

CYP2C9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其 检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种CYP2C9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)：指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。
分子信标(Molecular Beacon)：是一种在5’和3’末端自身形成一个5-8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针。两端的核酸序列互补配对，标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光；在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发并被监测仪器探测到。
近年来药物代谢种族及个体差异与药物代谢酶基因的遗传多态性的关系越来越受到研究者们的重视。细胞色素P450超家族(Cytochrome P450Proteins,CYP)是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，可催化多种内、外源物质(包括大多数临床药物)的代谢。CYP有多个亚家族，其中CYP2C(Cytochrome P450 2C)是其中一个亚家族，CYP2C9是其中一员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。据统计，目前约有16％的的临床药物由CYP2C9负责代谢，主要包括苯妥因、华法林、醋酸香豆素、甲苯磺丁脲等。CYP2C9基因具有遗传多态性，CYP2C9*3是外显子7的第1061位核苷酸A突变为C，导致多肽链第359位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸。具有功能意义的基因突变导致CYP2C9酶活性降低，可使CYP2C9酶底物药物疗效下降或产生更多不良反应，甚至会危及生命，因此对CYP2C9代谢酶的基因检测就尤为重要。经实验证实，CYP2C9*3的杂合子可以降低对S-华法林的代谢。在英国人群中，CYP2C9的多态性等位基因在华法林低剂量需求人群中的发生率明显增加；在意大利人群中，CYP2C9的多态性也与华法林剂量的降低有关；在中国人口中,除了野生型CYP2C9*1，已发现的最主要的基因型是CYP2C9*3，其基因频率约为3.3％。
目前，用于临床检测CYP2C9*3基因型的试剂盒均需要进行抽血及提纯DNA的步骤，从抽血提取DNA到得出检测结果的整个过程至少需要8小时。现有模式的有创检测不仅会降低受检者的检测舒适度，而且难以满足临床疾病的快速诊断，增加了患者疾病治疗的风险，且操作复杂，污染的几率大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、避免污染且检测快速的CYP2C9*3基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为：DNA聚合酶0.05-0.12U/μL；dNTPs 0.2mM；5X反应缓冲液1X；MgCl2 1.5-3.5mM；十二烷基硫酸钠0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；正向引物0.5-1μM；反向引物0.5-1μM；突变型探针0.5-1μM；野生型探针0.5-1μM；且其用于检测细胞样品。
采用本发明技术方案的CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，以细胞为检测样本，以荧光探针法为基础，结合细胞裂解液(由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成)对CYP2C9*3进行检测分析。利用细胞裂解液在反应过程中直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA。在现有的PCR反应中，以细胞直接作为模板的PCR反应，通常无法彻底裂解细胞，并且裂解后的细胞碎片及一些细胞内容物(如蛋白酶)对PCR反应有抑制，最终导致分型结果不稳定，甚至失败。而本发明中使用的裂解液采用与基因相关的原料终浓度，在增强细胞裂解程度的同时还降低了这些潜在的抑制剂对PCR的抑制作用(通过溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间微弱的化学键，分解一些蛋白酶)。细胞裂解液的作用是溶解细胞质和细胞膜，继而破坏分子间许多微弱的化学键，分解蛋白酶，从而降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠是一种能够使蛋白质变性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域，十二烷基硫酸钠，简称SDS，被用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物，在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚简称Triton X-100，被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还用作限制性内切酶的缓冲液的成分之一。
由实验可知，PCR反应液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果均正确。其中，5X反应缓冲液1X的原料为5X反应缓冲液，指的是初始浓度为5倍的反应缓冲液，1X是指的应用的终浓度。
通过这一发明点不仅大大节省了检测的时间，操作的时间可控制在1-1.5h，还避免了繁琐操作可能带来的DNA污染。
进一步，所述的PCR反应液的原料终浓度为：DNA聚合酶 0.09U/μL；dNTPs 0.2mM；5X 反应缓冲液 1X；MgCl2 2.5mM；十二烷基硫酸钠 0.005％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.01％(w/v)；正向引物 0.7μM；反向引物 0.7μM；突变型探针 0.7μM；野生型探针 0.6μM。
由实验可知，PCR反应液的终浓度为上述范围时检测结果最准确，且准确率最高。
进一步，所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。本发明以直接刮取的口腔黏膜脱落细胞为样本，操作方便。
进一步，还包括有提纯的人类DNA基因序列。试剂盒中包括质控品，为提纯的人类DNA基因序列，是在测定时为了做平行试验，来测定试剂结果的有效性。
本申请还提出另一个技术方案，本发明试剂盒中的CYP2C9*3基因多态性快速检测的引物，
正向引物5’-3’的基因序列为：CTGCATGCAAGACAGGA；
反向引物5’-3’的基因序列为：AACTTACCTTGGGAATGAGA。
本申请还提出另一个技术方案，试剂盒中引物检测的CYP2C9*3基因多态性快速检测的分子信标，野生型探针的5’-3’的基因序列为：CGACGTGATA+C+A+TTGACCTTCTCCCACGTCG；
突变型探针的5’-3’的基因序列为：CGCACGCAGAGATA+C+C+TTGACCTTCCGTGCG；
且野生型探针和突变型探针基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的荧光淬灭基团。
+为锁核酸修饰的碱基。
本技术方案使用了分子信标探针，分子信标为一种在5’和3’末端可自身形成由5-8个碱基组成的发夹结构的双标记寡核苷酸探针。即为上述探针的基因序列和结构。自由状态时，发夹结构的两个末端使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭。当分子信标与细胞的基因序列完全互补的靶标序列结合形成双链杂交体时，茎结构互补区的碱基对被分开，荧光分子和淬灭分子之间距离增大，这时分子信标的荧光几乎100％恢复。这种设计能有效地增加探针的特异性，提高对CYP2C9*3检测的正确性。
检测的原理为：利用荧光探针法(分子信标技术)对CYP2C9*3等位基因进行定性检测。检测时利用两对特异性引物分别对两条目的片段进行扩增。再通过两对由不同荧光基团标记，且可与这些位点不同碱基互补的分子信标探针与扩增片段进行特异性杂交。杂交过程致使荧光基团远离淬灭基团从而释放荧光信号。随着扩增片段数量的积累，荧光信号也得到相应的增加并被仪器采集。通过配套软件对采集的荧光信号进行分析，即可获得所检测样本的基因型。
进一步，所述的荧光基团为Fam标记基团，所述的淬灭基团为BHQ1标记基团；
或者荧光基团为Alexa Fluor 594标记基团，所述的淬灭基团为BHQ2标记基团。以上为本发明中所使用的两种荧光基团和淬灭基团，当然，也可用其他荧光基团和与其配合的淬灭基团代替，不影响检测结果。
本申请还提出另一个技术方案，利用上述的引物、分子信标及试剂盒进行的CYP2C9*3基因多态性快速检测方法，操作方法为，
(1)取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；
(2)取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上、下为1次；
(3)取样后将取样装置的取样部插入PCR反应液中，混匀；
(4)取1μL提纯的人类基因组DNA基因序列加入到另一支PCR反应液中，混匀；
(5)将完成加样的PCR反应液放入定量PCR仪中，运行反应程序。
进一步，其定量PCR仪的反应程序为：
A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；
B、变性：95℃，8s；
C、退火及延伸：55℃，35s；
D、B、C程序操作50个循环。
进一步，所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。
附图说明
图1是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图；
图2是本发明实施例一的第二个样品检测扩增曲线图；
图3是本发明实施例一的第三个样品检测扩增曲线图；
图4是本发明实施例二的第一个样品检测扩增曲线图；
图5是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图；
图6是本发明实施例二的第三个样品检测扩增曲线图；
图7是本发明实施例三的第一个样品检测扩增曲线图；
图8是本发明实施例三的第二个样品检测扩增曲线图；
图9是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图。
具体实施方式
以下是本发明CYP2C9*3基因多态性快速检测试剂盒中的各实施例的原料终浓度，如表1所示：
表1
以下为本发明CYP2C9*3基因多态性快速检测的具体操作方式：
一、细胞裂解液的配制
不同总浓度的细胞裂解液均配制成为200×的储存液，首先是因为每一支反应液所需原料少，加之聚乙二醇辛基苯基醚为粘稠液体，不易精准吸取。
所有试剂配制均在灭菌后的超净工作台进行。
(1)实施例一中200X细胞裂解液的配制
使用1.5mL的离心管，加入10μL SDS和1.88μL Triton X-100，再加入988.12μL无核酸酶的水至总体积1000μL，使SDS的终浓度达到0.1％，使TritonX-100的终浓度达到0.2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
(2)实施例二中200X细胞裂解液的配制
使用1.5mL的离心管，加入100μL SDS和18.78μL Triton X-100，再加入881.22μL无核酸酶的水至总体积1000μL，使SDS的终浓度达到1％，使TritonX-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
(3)实施例三中200X细胞裂解液的配制
使用1.5mL的离心管，加入300ul SDS和56.34ulTriton X-100，再加入643.66ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到3％，使TritonX-100的终浓度达到6％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
正向引物5’-3’的基因序列为：CTGCATGCAAGACAGGA；
反向引物5’-3’的基因序列为：AACTTACCTTGGGAATGAGA。
野生型探针5’-3’的基因序列为：
(Fam标记)-CGACGTGATA+C+A+TTGACCTTCTCCCACGTCG-(BHQ1标记)；
突变型探针5’-3’的基因序列为：
(Alexa Fluor 594标记)-CGCACGCAGAGATA+C+C+TTGACCTTCCGTGCG-(BHQ2标记)；
+为锁核酸修饰的碱基。
上述原料，除特异性引物、分子信标、细胞裂解液外，均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。特异性引物由上海占标生物科技有限公司合成；分子信标由上海英骏生物技术有限公司合成。
二.PCR反应液配制
各原料的加入量如表2所示。所有配制均在灭菌后的超净工作台进行。
表2
三、CYP2C9*3基因型检测；
CYP2C9*3基因型快速检测试剂盒由9支分装好的试剂管组成，每个被测者检测3次重复(一次一支反应液)，每测试9支试剂，同时测试一次质控品，质控品即为提纯的人类基因组DNA基因序列样品，作为平行测试。
将配制好的PCR反应液分装于试剂管中，实施例一、二、三每支分装23.5μL，-20℃避光保存；
(1)取样前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液；
(2)取出一次性使用无菌拭子(专利授权公告号：CN205359515U)及反应液，拔掉反应液塞子及拭子端盖；
(3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，实施例一、二、三均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜；
(4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压顶部使其与试剂管密封，而后轻弹试剂管使样本与反应液充分混匀；
(5)用移液器取1μL质控品加入到另一支反应液中，轻弹试剂管并混匀；
(6)将完成加样的反应液放入OM-1000型荧光PCR仪器(专利授权公告号：CN103820306B)中，并运行表3中程序。
表3
(7)得到扩增曲线和荧光颜色，分析结果。
四、结果分析：
标记姓名、科室、针对药物等，一个小时后观察结果。结果有三种情况，分别是“AA”、“AC”或“CC”，其中阴性结果是“AA”，阳性结果是“AC”和“CC”。
实施例一的检测结果为：
如图1、图2和图3所示，图中A线表示未检测到CYP2C9*3，C线表示检测到CYP2C9*3。
由图1可知，只有A线有指数增长，而C线没有指数增长，因此检测结果是野生纯合型AA，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图2可知，A线和C线都有指数增长，表示检测结果是突变杂合型AC，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图3可知，只有C线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是突变纯合型CC，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图1、图2和图3中分析得出CYP2C9*3的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
实施例二的检测结果为：
如图4、图5和图6所示，图中A线表示未检测到CYP2C9*3，C线表示检测到CYP2C9*3。
由图4可知，只有A线有指数增长，而C线没有指数增长，因此检测结果是野生纯合型AA；
由图5可知，A线和C线都有指数增长，表示检测结果是突变杂合型AC；
由图6可知，只有C线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是突变纯合型CC；
由此，可从图4、图5和图6中分析得出CYP2C9*3的基因型。
实施例三的检测结果为：
如图7、图8和图9所示：
由图7可知，只有A线有指数增长，而C线没有指数增长，因此检测结果是野生型AA；
由图8可知，A线和C线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型AC；
由图9可知，只有C线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型CC；
由此，可从图7、图8和图9中分析得出CYP2C9*3的基因型。
实施例一～实施例三的测试均能正确进行得出CYP2C9*3位点的基因型分型，从而可知被测试对象的药物代谢类型。但实施例一中，引物的使用量较实施例二、三少，导致其分型曲线较后两者进入平台期的循环晚。虽实施例二、三差异不大，但从突变杂合型观察到实施例三配方显示两曲线各循环间荧光强度波动较大，因此选择实施例二中配方比例作为最优配方。
本发明的核苷酸序列表如下：
<110>重庆京因生物科技有限责任公司
<120>CYP2C93基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
<160>4
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>1
CTGCATGCAAGACAGGA
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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AACTTACCTTGGGAATGAGA
<210>3
<211>34
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<213>人工序列
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<400>3
CGACGTGATA+C+A+TTGACCTTCTCCCACGTCG
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>4
CGCACGCAGAGATA+C+C+TTGACCTTCCGTGCG。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
<110> 重庆京因生物科技有限责任公司
<120>CYP2C93基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
<160>4
<210>1
<211>17
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<400>1
CTGCATGCAAGACAGGA
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<400>3
CGACGTGATA+C+A+TTGACCTTCTCCCACGTCG
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>4
CGCACGCAGAGATA+C+C+TTGACCTTCCGTGCG。

Claims (10)

1.CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为：
DNA聚合酶 0.05-0.12 U/μL；
dNTPs 0.2mM；
5X 反应缓冲液 1X；
MgCl2 1.5-3.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.0005-0.015％（w/v）；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％（w/v）；
正向引物 0.5-1μM；
反向引物 0.5-1μM；
突变型探针 0.5-1μM；
野生型探针 0.5-1μM；
且其用于检测细胞样品。
2.根据权利要求2所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应液的原料终浓度为：
DNA聚合酶 0.09 U/μL；
dNTPs 0.2mM；
5X 反应缓冲液 1X；
MgCl2 2.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.005％（w/v）；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％（w/v）；
正向引物 0.7μM；
反向引物 0.7μM；
突变型探针 0.7μM；
野生型探针0.6μM。
3.根据权利要求3所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。
4.根据权利要求4所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：还包括有提纯的人类基因组DNA基因序列。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的试剂盒中的CYP2C9*3基因多态性快速检测的引物，其特征在于：
正向引物5’-3’的基因序列为：CTGCATGCAAGACAGGA；
反向引物5’-3’的基因序列为：AACTTACCTTGGGAATGAGA。
6.利用与权利要求5所述的试剂盒中引物检测的CYP2C9*3基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：
野生型探针的5’-3’的基因序列为：CGACGTGATA+C+A+TTGACCTTCTCCCACGTCG；
突变型探针的5’-3’的基因序列为：CGCACGCAGAGATA+C+C+TTGACCTTCCGTGCG；
且野生型探针和突变型探针基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团；
+为锁核酸修饰的碱基。
7.根据权利要求6所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：所述的荧光基团为Fam标记基团，所述的淬灭基团为BHQ1标记基团；
或者荧光基团为Alexa Fluor 594标记基团，所述的淬灭基团为BHQ2标记基团。
8.利用权利要求6或7所述的引物、分子信标和试剂盒进行的CYP2C9*3基因多态性快速检测方法，其特征在于：操作方法为，
（1）取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；
（2）取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上、下为1次；
（3）取样后将取样装置的取样部插入PCR反应液中，混匀；
（4）取1μL提纯的人类基因组DNA基因序列加入到另一支PCR反应液中，混匀；
（5）将完成加样的PCR反应液放入定量PCR仪中，运行反应程序。
9.如权利要求8所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测方法，其特征在于：其定量PCR仪的反应程序为：
A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；
B、变性：95℃，8s；
C、退火及延伸：55℃，35s；
D、B、C程序操作50个循环。
10.如权利要求9所述的CYP2C9*3基因多态性快速检测方法，其特征在于：所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。
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