JP6255353B2 - 多重生化学アッセイにおける信号エンコードおよびデコード - Google Patents

多重生化学アッセイにおける信号エンコードおよびデコード Download PDF

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Description

クロスレファレンス．この出願は、米国仮出願第61/594480号、2012年2月3日付け出願および、61/703093号、2012年9月19日付け出願の利益を主張し、それらの各々は参照によりその全体がここに組み込まれる。
背景．マルチプレックス化された反応は、伝統的なユニプレックス反応よりも著しい利益を提供し、それには、複数の反応を実行するために、同じ試料上での並列反応の性能、同じチャンバの使用、および高速、かつ、効率的な形で試料から豊富な情報を抽出する能力が含められる。しかしながら、これらの利益を達成するために、マルチプレックス化されたアッセイは、一般的には複雑な報告メカニズム、すなわち、スペクトル的に分解された蛍光または化学ルミネセンス（化学発光）（例は、PCR、ELISA）、空間分解された信号（例は、マイクロアレイ、ゲル電気泳動）、時間分解した信号（例は、キャピラリー電気泳動）、またはそれらの組み合わせ〔例は、サンガー配列決定（Sanger sequencing）〕を必要とする。単一の溶液中で行うことができる多重反応のための必要性が存在する。
発明の概略．この開示は、分析対象の多重（multiplexed）検出のための方法、組成物、システム、およびキットを提供する。若干の場合において、この開示は、少なくとも7つの分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一試料容量（シングルサンプルボリューム）において、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析することなく、はっきりと検出することが可能であるアッセイを提供する。若干の例では、分析対象のそれぞれは、信号（シグナル）の一つ（または少なくとも一つの）成分の値としてエンコード（コード化、符号化とも言う。）される。
若干の例では、この開示において提供されるアッセイは、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、明確に検出することができ、そこでは、M=log2(F+1)であり、およびすべての分析対象が存在するとき、Fは信号の一つの成分（例は、強度）の累積最大値である。
いくつかの場合において、各分析対象は、信号の第一の成分において少なくとも一つの第一の値（例は、少なくとも一つの強度または強度群の範囲）、および信号の第二の成分において少なくとも一つの第二の値（例は、少なくとも一つの波長または波長群の範囲）としてエンコードされる。若干の例において、各分析対象は、信号の第二成分において複数の第二の値のそれぞれで信号の第一の成分において第一の値としてエンコードされる（例は、複数の波長または波長群の範囲群のそれぞれで信号強度または信号強度群の範囲）。
いくつかの例において、ここで提供されるアッセイは、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、明確に検出することが可能であり、そこでは、M=C*log2(F+1)であり、そこでは、Cは分析対象をエンコードするために用いられる第二の値の数であり、および分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、信号の第一の成分の最大累積値である。
いくつかの場合では、この開示において提供されるアッセイは、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、明確に検出することが可能であり、そこでは、M=(P*T)+1であり、そこでは、Pはコード体系において段階あたりのコードの数（the number of codes per tier）であり、およびTは段階の数である。若干の場合において、段階（tiers）の数T=log4(F+1)、および分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、信号の第一の成分の最大累積値である。
いくつかの例において、第一の値は強度または強度群の範囲である。若干の場合では、コード体系には、少なくとも三つの強度または強度群の範囲が含まれる。
いくつかの場合において、第二の値は波長または波長群の範囲である。若干の例では、コード体系には、少なくとも五つの波長または波長群の範囲が含まれる。
いくつかの例では、信号は電磁信号である。若干の場合では、電磁信号は、蛍光発光（蛍光放射）シグナル（fluorescence emission signal）である。若干の例では、蛍光発光シグナルの強度は、少なくとも四つの波長または波長群の範囲で測定される。
いくつかの場合において、ここで提供されるアッセイは、使用前に凍結乾燥される試薬で実行される。
いくつかの場合において、検出ステップはハイブリダイゼーションプローブが含まれる試薬を用いて行われる。若干の例では、ハイブリダイゼーションプローブの数は分析対象の数を超える。若干のケースでは、ハイブリダイゼーションプローブのセットには、異なる分析対象に特異的な一以上（一またはそれよりも多く）のハイブリダイゼーションプローブが含まれ、そしてそれには、同一のフルオロフォアまたはフルオロフォア群の組合せが含まれる。若干の例において、試料は、前記ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも18と接触される。若干の例において、検出ステップは、プライマーの少なくとも一対を含む試薬を用いて行われる。若干の場合には、プライマーの少なくとも一対は、前記ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも三つに相補的な領域を増幅することが可能である。
いくつかの例では、測定される信号はポリメラーゼ連鎖反応の間に生成される。若干の場合には、ポリメラーゼ連鎖反応は、エンドポイントポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、およびこれらの組合せからなる群より選ばれる。
いくつかの例において、少なくとも一つの累積的な測定は溶液上で行われる。
いくつかの例では、少なくとも一つの分析対象は、少なくとも一つの追加の値によって（すなわち、少なくとも二つの値と一緒に）エンコードされ、そこでは、少なくとも一つの追加の値は、信号の少なくとも一つの追加の成分からの値、異なる信号の少なくとも一つの成分からの値、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。たとえば、少なくとも一つの追加の値は、蛍光発光強度、蛍光発光波長、フォースター（Forster）（蛍光）共鳴エネルギー移動（転移）（resonance energy transfer）（FRET）発光強度、FRET発光波長、電気化学的信号、化学発光波長、化学発光強度、蛍光漂白率（fluorescence bleaching rate）、化学発光漂白率、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。
いくつかのケースでは、クロマトグラムが構成される。クロマトグラムは、各分析対象のために陽性コントロール試料について第一の値および第二の値のすべての可能な（possible）組合せをプロットすることによって構築されうる。
いくつかの例では、分析対象の少なくとも一つには、ポリヌクレオチドが含まれる。若干のケースでは、ポリヌクレオチドは、動物、植物、細菌、真菌、寄生体、およびウイルスからなる群より選ばれる供給源由来である。若干の例において、ポリヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、プラスモジウム（変形体、マラリア）、マイコバクテリウム、デング（熱）ウイルス、肝炎ウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選ばれる供給源由来である。若干の場合において、ポリヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルスポリプロテアーゼ（polyprotease）、ヒト免疫不全ウイルスp17、ヒトパピローマウイルスE6、およびヒトパピローマウイルスE7からなる群より選ばれる。
いくつかの場合において、試料は、臨床サンプル、食物サンプル、環境サンプル、製薬サンプル、および消費者製品からのサンプルからなる群より選ばれる。
いくつかの例では、分析対象の存在または不存在に関する情報は、コンピュータネットワークを通して送信される。
いくつかのケースでは、分析対象の存在または不存在に関する情報は医師に提供される。若干の例では、臨床上の決定はそのような情報に基づいて行われる。
いくつかの例において、ここで提供される方法の少なくとも一つのステップは、コンピュータ読み取り可能な媒体上のインストラクションズ（命令）を用いて実行される。若干の場合において、命令はリモートサーバ上に設置される。若干の例では、命令はサーマルサイクラー上に設置される。若干のケースでは、命令はサーマルサイクラーと連通するコンピュータ上に設置される。
いくつかのケースでは、分析対象の少なくとも一つは陽性コントロール分析対象である。
いくつかの例では、コード体系は非縮重（非縮退）である。若干のケースでは、コード体系は非縮重であるように設計される。いくつかの例において、コード体系は、コード体系から得ることができるあらゆる正当（legitimate）結果を列挙すること、縮重される各正当結果を識別すること、および縮重を排除するために少なくとも一つの潜在的な（potential、可能性がある）分析対象コードをコード体系から排除することによって非縮重が行われる（made non-degenerate）。
いくつかのケースでは、ここに提供されるアッセイはエンドポイントアッセイである。いくつかの例において、この開示において提供されるアッセイは、機器の検出限界によって設定されるサイクルの閾値数で終了される（is ended at a threshold number of cycles set by the limit of detection of an instrument）。
一定の例では、ここに提供されるアッセイは液相アッセイである。
いくつかのケースでは、ここに提供されるアッセイは定量的である。
いくつかの場合において、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法を提供し、それには、（a）前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、（b）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、（c）前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、（d）前記試料範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めることが含まれる。
若干の例では、先行する段落に記載された方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、はっきりと検出可能であり、そこでは、M=log2(F+1)であり、および分析対象のすべてが存在するとき、Fは第一の値の最大累積値である。若干の場合には、第一の値は強度または強度群の範囲である。若干の例において、第一の値はコード体系において最小値を有し、それは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも8、少なくとも16、少なくとも32、および少なくとも64からなる群より選ばれる。若干の場合には、第一の値は、コード体系において前記先行する第一の値プラス1の累積最大値に等しい量だけインクリメントされる。他の場合には、第一の値は、コード体系において先行する第一の値プラス1の累積最大値よりも多くの量だけインクリメントされる。
若干の場合において、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法を提供し、それには、（a）前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、（b）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、（c）前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの前記第二の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、（d）前記試料範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めることが包含され、そこでは、縮重が排除されるとき、前記方法は、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないとき、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、はっきりと検出することが可能である。
若干の場合において、先行する段落において説明する方法の分析対象の各々は、信号の第二の成分において複数の第二の値の各々で前記信号の第一の成分において第一の値としてエンコードされる。若干の場合には、縮重が排除されるとき、この方法は、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量において、四つの第二の値を用いてはっきりと検出することが可能である。若干の例では、縮重が排除されるとき、コード体系にはT非縮重段階が含まれ、そこでは、T=log4(F+1)であり、および分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、信号の第一の成分の最大累積値である。若干の場合には、縮重が排除されるとき、本方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、はっきりと検出することが可能であり、そこでは、M=(P*T)+1であり、およびPは段階あたりのコードの数である。若干の例では、縮重が排除されるとき、本方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、はっきりと検出することが可能であり、そこでは、M=C*log2(F+1)であり、Cはコード体系において第二の値の数であり、および分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、信号の第一成分の最大累積値である。
また、この開示は、少なくとも7つの分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一試料容量において、固定化、分離、または融解曲線解析なしに、はっきりとエンコードすることが可能である、非縮重コード体系を提供する。
若干の例では、この開示の非縮重コード体系は、ある方法によって生じ、それには、（a）各潜在的分析対象についてコードを生成することであり、そこでは、各潜在的分析対象は信号の少なくとも一つの成分の少なくとも一つの値によってエンコードされること、（b）各分析対象の存在または不存在のすべての潜在的組合せについてあらゆる正当累積結果を列挙すること、（c）縮重される各正当結果を識別すること、および（d）縮重を排除するために少なくとも一つのコードを排除することが包含される。若干の場合では、コード体系は、信号の少なくとも一つの成分においてすべての以前のコードの合計よりも多くの少なくとも一つの単位である追加のコードを加えることによって拡張されうる。コード体系は、構成によって非縮重を保証する数学的反復の方法によって生成される。
若干の場合、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのシステムを提供し、それには、（a）前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、（b）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、（c）前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、（d）前記試料範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めることが包含される。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのシステムを提供し、それには、（a）前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、（b）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、（c）前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記少なくとも一つの第一の値および前記少なくとも一つの第二の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、（d）前記試料範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めることが包含され、そこでは、縮重が排除されるとき、前記システムは、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないとき、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、はっきりと検出することが可能である。
若干の場合では、この開示により、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法が提供され、それには、（a）前記分析対象の各々の識別情報をサードパーティから取得すること、（b）前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、（c）分析対象に特異的な試薬を前記パーティに提供することであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値が前記コード体系において表されるように生じることであり、前記パーティは、（i）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料と前記試薬とが接触され、および（ii）前記試料範囲内で前記第一の値を累積的に測定し、それによって累積測定値が提供されること、および（d）前記累積測定値を前記パーティから得ること、（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること、および（f）前記パーティに前記分析対象の各々の存在または不存在についての情報を提供することが包含される。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法を提供し、それには、（a）前記分析対象の各々の識別情報をパーティから取得すること、（b）前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および前記少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、（c）分析対象に特異的な試薬を前記パーティに提供することであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値が前記コード体系において表されるように生じることであり、前記パーティは、（i）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料と前記試薬とが接触され、および（ii）前記試料範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定し、それによって累積測定値が提供され、および（d）前記累積測定値を前記パーティから得ること、（e）前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること、および（f）前記パーティに前記分析対象の各々の存在または不存在についての情報を提供することが包含される。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するための組成物を提供し、それには、分析対象に特異的な試薬が含まれ、各試薬は第一の値が含まれる信号を生成し、そこでは、前記試薬は、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一試料容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析なしに、はっきりと検出することが可能である。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するための組成物を提供し、それには、分析対象に特異的な試薬が含まれ、各試薬は、信号の第一の成分からの値である少なくとも一つの第一の値および前記信号の第二の成分からの値である第二の値が含まれる信号を生成し、そこでは、前記試薬は、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないとき、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、はっきりと検出することが可能である。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのキットを提供し、それには、分析対象に特異的な試薬、包装、および説明書が含まれ、各試薬は第一の値が含まれる信号を生成し、そこでは、前記キットは、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一試料容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析なしに、はっきりと検出することが可能である。
若干の例では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのキットを提供し、それには、分析対象に特異的な試薬、包装、および説明書が含まれ、各試薬は、信号の第一の成分からの値である少なくとも一つの第一の値および前記信号の第二の成分からの値である第二の値が含まれる信号を生成し、そこでは、前記キットは、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないとき、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、検出することが可能である。
若干の場合では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのキットを提供し、それには、キット本体（601）、ボトルを設置するためにキット本体において配置されたクランプスロット（clamping slots）、分析対象の検出のためにプローブを含むボトル（602）、増幅のためにプライマーを含むボトル（603）、および増幅のために試薬を含むボトル（604）が含まれ、前記キットは、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一試料容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析なしに、はっきりと検出することが可能である。
若干の例では、この開示は、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのキットを提供し、それには、キット本体（601）、ボトルを設置するためにキット本体において配置されたクランプスロット、分析対象の検出のためにプローブを含むボトル（602）、増幅のためにプライマーを含むボトル（603）、および増幅のために試薬を含むボトル（604）が含まれ、各プローブは、信号の第一の成分からの値である少なくとも一つの第一の値および前記信号の第二の成分からの値である少なくとも一つの第二の値が含まれる信号を生成し、前記キットは、前記プローブの各々が一つの第二の値しか生成しないとき、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、検出することが可能である。
参照による援用
この明細書において言及するすべての刊行物および特許出願は、ここに、各個別の刊行物または特許出願が具体的に、かつ、個別に参照により組み込まれることが示されたかのように同じ範囲にまで参照により組み込まれる。
本発明の新規な特長は、添付の請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特長および利益のより一層良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載、および次の添付図面を参照することによって得られるであろう。
四つの分析対象を四色で検出する伝統的なエンコード方法と、16以上の配列（シーケンス）を四色で検出可能な本発明のエンコード方法との間の比較を示す。色は、B、G、Y、およびRで示され、それらはそれぞれ、青、緑、黄、および赤を表す。 六つの分析対象（コントロールを含む）の四色での検出の概略図を示す。分析対象は、フルオロフォア（B、G、Y、R；それぞれ、青、緑、黄、および赤）に付着するハイブリダイゼーションプローブおよびクエンチャー（「X」を有する楕円形）を用いて検出される。コントロール配列および五つの他の配列〔デング熱=デング（熱）ウイルス；結核=結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）；P17=HIV p17；マラリア=熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum、プラスモジウム・ファルスィパラム）、およびヘルペス=単純ヘルペスウイルス2〕は、すべて青フルオロフォア（蛍光色素分子）により標識したプローブを用いて検出される。非コントロール分析対象は各々1-3の追加のプローブを用いて検出される。たとえば、デングウイルス分析対象は、緑、黄、および赤のフルオロフォアを有する三つの追加のプローブにより検出され、単純ヘルペスウイルス2分析対象は赤のフルオロフォアを有する追加のプローブにより検出され、その他さまざまである。 例2に記載のように得られる実験結果のクロマトグラムを示す。 本発明の例示的な実施形態を示し、そこでは、コンピュータがここで提供される方法の一以上のステップを実行するために使用される。 光信号、たとえば、蛍光放射信号（fluorescence emission signal）のようなものの波長および強度を検出する二つの異なる方法の概略図を示す。 模範的なキットの概略図を示す。 例3に記載のように得られる実験結果のクロマトグラムを示す。 正当結果（上部）および非正統（illegitimate）結果（下部）の概略図を示す。
本発明の詳細な記載
蛍光検出は、いくつかの望ましい特長から、生化学的アッセイとの適合性、蛍光標識の比較的小さなサイズ、興味がある分子への結合の簡単な手段、値ごろ感、低毒性、安定性、ロバスト性（robustness、堅牢性）、安価なオプティクス（inexpensive optics）での検出可能性、および空間アレイ（spatial arrays）と組み合わされる能力を含めて、多重アッセイの好ましい技術であった。しかし、標準的なフルオロフォアは広い発光スペクトルを有する。したがって、スペクトルの重なりを避けるため（すなわち、スペクトル分解能を維持するため）に、典型的には、色の比較的少数（例は、4乃至6）だけが、多重蛍光アッセイにおいて同時に使用される。
多重蛍光アッセイのための伝統的なコード化方法は、単一色で各分析対象をエンコードすることであり、すなわち、M=N、式中、Mは検出することができる分析対象の数であり、およびNは、スペクトル的に分解された蛍光プローブの数である。多重化のより一層高い因子が必要とされるとき（すなわち、M>N）はいつでも、蛍光発光は概して、たとえば、等分、空間的整列、または逐次処理のような他の技術と組み合わされる。これらの追加の処理ステップは、労働集約的であり、そしてしばしば、比較的高価で複雑な光学的および機械的システム（例は、分光計、機械化された顕微鏡ステージ、微小流体工学、液滴発生装置、スキャナ、およびその他同種類のもの）を必要とする。そのようなシステムは、一定のセッティング、特に、ポイントオブケアおよび低リソースの設定で、配置することは非実用的であることが多い。それゆえ、高価な追加の処理ステップの使用を回避しながら、多重化の安価な手段を提供することができる多重エンコードおよびデコード（復号化）方法のために著しい必要性が存在する。
この開示は、試料において複合的（マルチプル）な分析対象を検出するための方法、システム、組成物、およびキットを提供する。分析対象は、ここに示されるエンコード、分析、およびデコード方法に基づいて検出される。いくつかの例では、検出されるべき各分析対象は、信号（例は、強度）の値としてエンコードされ、そこでは、アッセイの結果がアッセイされる分析対象の存在または不存在をはっきりと指し示すように値が割り当てられる。他の例では、検出されるべき各分析対象は、信号の少なくとも二つの成分（例は、強度および波長）のそれぞれの値としてエンコードされる。信号の少なくとも二つの成分は直交性でもよい。同様に、この開示の別の場所でより一層十分に説明されるように、蛍光信号および電気信号の組合せのように、複合的な直交性信号を用いることができる。分析対象は、たとえば、ポリヌクレオチド、タンパク質、小分子、脂質、炭水化物（糖質）、またはそれらの混合物などのような任意の適切な分析対象でありうる。信号は、たとえば、電磁信号、光信号、蛍光放射信号、電気化学的信号、化学ルミネセンス信号、およびそれらの組合せなどのような任意の適切な信号であってもよい。信号の少なくとも二つの成分は、たとえば、振幅および周波数または強度および波長などのような任意の適した二つの成分であってもよい。
分析対象のエンコード後、試料が提供され、そこでは、試料は、エンコードされた分析対象の少なくとも一つを含み、または含むことができる。試料は、分析対象特異的試薬または試薬と接触され、それで、コード体系で、分析対象の存在下において、各分析対象について規定されるように、特定の信号を生成する。試薬は、任意の適切な試薬であってもよく、それはその対応する分析対象の存在下においてそのような信号、たとえば、フルオロフォアおよびクエンチャーに付着されるオリゴヌクレオチドプローブ（例は、TAQMANプローブ）を生成することができる。試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャーに付着したオリゴヌクレオチドプローブである場合、核酸増幅が信号を生成するために実行されてもよい。
試薬（複数を含む、「群」とも言う。）の添加後、信号が定量される。若干の場合において、この定量化は、信号の一つの成分（例は、蛍光強度）を測定すること、および各分析対象の存在をエンコードするために使用される値および信号の累積値に基づいて一定の分析対象の存在および不存在を決定することによって行われる。
いくつかの場合では、信号の少なくとも二つの成分（例は、強度および波長）は試料のために累積的に測定される。この測定は、たとえば、特定の波長での強度または波長群の特定の範囲内の強度を測定することによって行うことができる。次いで、分析対象の存在または不存在は、信号の少なくとも二つの成分の各々の値および分析対象の存在をエンコードするために使用される値（すなわち、コード体系においてそれらの値）に基づいて決定することができる。
エンコードは、本方法によって得ることができる可能な縮重（例は、曖昧な）結果の数を低減または排除する形（方式）で行ってよい。この明細書のほかの箇所に記載されるように、特定のコード体系の十分なコーディング能力を列挙することができ、そして一定の潜在的な分析対象コードは縮重を低減または排除するためにコード体系から排除することができる。同様に、コード体系は、縮重の減少または排除を必要としないように、非縮重であるように設計することができる。デコードマトリクスは、累積信号測定値（例は、強度または特定の波長での強度）を、一定の分析対象の存在または不存在に変換するために構成することができ、累積信号測定値の構成信号が対応する。
I．定義
ここで使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、それで制限されるものではない。
ここで用いるように、単数形「ある（子音の前）」、「ある（母音の前）」および「その」は、前後関係が明らかに他の状態を示さない限り、複数形も含むことを意図する。さらに、用語「含む（動名詞）」、「含む（3人称単数現在形）」、「もつ（動名詞）」、「もつ（3人称単数現在形）」、「有する」、「のようなもの」、またはその変形は、本明細書および/または請求の範囲のいずれかで使用されている限り、そのような用語は制限されず、そして用語「包含する」と同様な形で包括的であることが意図される。
用語「約」は、ここで用いられるように、概して、特定の用法の前後関係内で述べられた数値よりも15％だけ大きいか、またはそれだけ小さい範囲に言及する。たとえば、「約10」は、8.5から11.5までの範囲を含むことになる。
用語「大きさ（次元）」および「成分」は、概して、信号を参照するときにここで使用されるように、定量化することができる信号の態様に言及する。たとえば、信号が蛍光分子により生成される場合、それはその波長（例は、第一の大きさまたは成分）およびその強度（例は、第二の大きさまたは成分）に関して定量化することができる。
用語「デコーディング」は、ここで用いるように、概して、累積信号およびコード体系または一以上の分析対象の存在または不存在に関する情報への累積信号の変換を可能にするデコーディングマトリクスに基づいて、分析対象が存在していることを定める方法に言及する。
用語「エンコーディング」は、ここで用いるように、概して、信号の値で、たとえば、強度などのようなもの、または信号または信号群の少なくとも二つの成分のそれぞれにおいての値で、たとえば、波長および強度などのようなものを含むコードを用いて分析対象を表わすプロセスに言及する。
用語「フルオロフォアおよびクエンチャーに付着したオリゴヌクレオチドプローブ」および「TAQMANプローブ」は、概して、分析対象の存在をポリヌクレオチド増幅アッセイにおいて検出するために使用される加水分解プローブに言及する。これらのプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーに付着したオリゴヌクレオチドプローブを含む。クエンチャーおよびフルオロフォアは近接している限り、クエンチャーは、光源による励起の際にフルオロフォアによって放出される蛍光をクエンチ（消光）する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、分析対象において存在するポリヌクレオチド配列に相補的、そして従って、分析対象において存在するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能であるように設計される。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、プライマーを含む核酸増幅反応において実行される（例は、ポリメラーゼ連鎖反応）。DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長の際には、ポリメラーゼの5'ないし3'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを分解し、フルオロフォアおよびクエンチャーが培地中に放出される。フルオロフォアおよびクエンチャーの間の近接は壊れ、そして、フルオロフォアからの信号はもはやクエンチされない。それゆえ、検出されるフルオレセンス（蛍光発光）の量は、存在する分析対象の量の関数である。分析対象が存在しない場合、プローブは分析対象にハイブリダイズせず、そしてフルオロフォアおよびクエンチャーはごく近接して留まる。信号はほとんどまたはまったく生成されない。
用語「直交の」は、ここで用いるように、概して、信号の少なくとも二つの成分（例は、波長および強度）、または少なくとも二つの異なる信号（例は、蛍光発光および電気化学的シグナル）に言及し、それは無関係に、またはほぼ無関係に変動することができる。たとえば、蛍光分子を用いるとき、波長および強度は、直交またはほぼ直交すると考えられる。他の要因の中でも、蛍光放射の波長は蛍光分子の組成に依存し、そして蛍光の強度は存在する分子の量に依存するであろう。波長および強度は、ほぼ無関係に変動することができる信号の二つの成分の例であるが、ここで記載される方法は、無関係に、またはほぼ無関係に変動させることができる構成要素に制限されない。信号の成分、または信号群は、また、構成要素または信号が、エンコード、測定、およびデコードを可能にするのに十分によく特徴付けられる限り、使用することができる。たとえば、一成分または信号において分散が他の成分または信号の分散において影響を与える場合、二つの成分または信号は依然として、分散の間の関係が理解される限り、使用することができる。
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「核酸」は、ここで用いられるように、複数のヌクレオチドを含む生物学的分子に言及するためにここで使用される。模範的なポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸、リボ核酸、およびそれらの合成類似体が含まれ、ペプチド核酸が含まれる。
用語「プローブ」は、ここで用いられるように、大抵、特定の分析対象の存在下で信号を生成することが可能な試薬に言及する。プローブは、大抵、少なくとも二つの部分を有し、すなわち、分析対象を特異的に認識可能な部分、またはその一部分、および分析対象の存在下で信号を生成可能な部分、またはその一部分である。上記および本開示において他の場所で記載されるように、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーに付着するオリゴヌクレオチドプローブであることができる。プローブはまた、分析対象の存在下で信号を生成する任意の試薬であることができ、たとえば、抗体の分析対象への結合の際に、放出し、または消光される蛍光標識と一緒に、分析対象を検出する抗体のようなものである。任意の適切なプローブは、プローブが分析対象の存在下で定量可能な信号を生成する限り、本開示で提示される方法で用いることができる。たとえば、プローブの分析対象特異部分は、分析対象の存在下で、非荷電基質を荷電生成物に変換する酵素に結合することができ、それによって時間と共に培体において導電率を高める。この場合、異なる分析対象は、プローブの分析対象特異部分（例は、ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体）を異なる比率での酵素に結合することによってエンコードすることができる。培体において増加した伝導性の得られる比率は、培体において存在するすべての分析対象について累積される。ここで提供される方法に従う分析対象のエンコーディングは、特定の分析対象の存在または不存在についての情報を提供するはっきりとした（すなわち、非縮重の）結果への導電率測定の変換を可能にする。同様に、プローブには、基質からの化学ルミネセンス生成物を生成する酵素が含まれてよい。次いで、化学ルミネセンスの量は、特定の分析対象の存在をエンコードするために使用することができる。
II．エンコードおよびデコードの方法
A．伝統的蛍光発光エンコードおよびデコードの方法
分析対象の存在を決定する普通に使用される方法は、四つの分析対象の存在または不存在を示すために、四つのスペクトル的に分解された蛍光分子を使用する。この方法の例は図1の左側に示される。図1の左側には、四つの分析対象〔Seq（配列）1、Seq 2、Seq 3、およびSeq 4〕が各々単一色（それぞれ、青、緑、黄、および赤）によってエンコードされるコード体系を示す。色は、また、クエンチャーを含むオリゴヌクレオチドプローブに付着したフルオロフォアを表す。図1の左側に示すシステムでは、四つの異なるオリゴヌクレオチドプローブが存在し、各々は単一のフルオロフォア（青、緑、黄、または赤）およびクエンチャーを含む。分析対象の存在または不存在は特定の色において信号の存在または不存在に基づいて定まる。
図1の左側のチャートは、二つの分析対象：配列1および配列3を含む仮想的なサンプルについての強度対色を示す。これらの分析対象の存在は、青の信号（配列1に対応する）および黄の信号（配列3に対応する）の測定に基づいて定まる。配列2および配列4が存在しないことは、青および赤のシグナルの不存在によって示される。
表1は、このコード体系のバイナリーフォーマットへの変換を示す。各分析対象は、蛍光信号の二つの成分の各々において値としてエンコードされる（1）色（波長としてまたは波長の範囲としても知られ）：および（2）強度（表内の数字によって示される）。たとえば、A（例は、配列1）は青の色および1の強度を有し；B（例は配列2）は緑の色および1の強度を有し；および等々である。各色範囲内の信号の強度は、たとえば、バンドパスフィルターによって定められる特定の波長範囲内の信号の強度を測定することによって、ここに記載のように定量化することができる。1000の結果は分析対象Aだけが存在することを示し、1100の結果は分析対象AおよびBが存在することを示し；等々である。
B．分析対象あたり一よりも多くの色を用いるエンコード方法
上述する伝統的方法は、それがスペクトル的に分解可能なフルオロフォアの数によって制限されているという事実に悩まされる。より一層具体的には、検出可能な分析対象の数は、スペクトル的に分解可能なフルオロフォアの数に等しい。したがって、分析対象の数は、スペクトル的に分解可能なフルオロフォアの数を増加させることによって増加させることができるにすぎない。
この開示は、この制限を克服する方法を提供する。より一層具体的には、いくつかのケースでは、エンコードの間に信号の少なくとも二つの成分を利用することによって、ここに記載する方法は、フルオロフォアあたりに一よりも多くの分析対象を検出するために使用することができる。たとえば、ここで提供される方法を使用して1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象は、フルオロフォアごとに検出することができる。いくつかの場合において、ここで提供される方法は、少なくとも1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象を検出するために使用することができ、フルオロフォアごとに検出してもよい。いくつかの場合において、ここで提供される方法は、フルオロフォアあたり1.5-2、2-4、1.5-4、4-6、2-6、6-10の分析対象を検出するために使用することができる。
いくつかのケースでは、本開示において提供される方法は、コントロールカラーの使用を含むことができる。コントロールカラーは、陽性コントロール分析対象、そして試料において、検出すべき各分析対象を結合する一以上のプローブに付着することができる。同じシーケンスが陽性コントロール分析対象および検出されるべき各分析対象において発生した場合、単一のコントロールプローブを使用することができる。同じシーケンスが陽性コントロール分析対象および検出されるべき各分析対象において発生しない場合、異なるプローブを使用することができるが、各プローブは、依然としてコントロールカラーに付着することができる。
たとえば、上述する伝統的方法での構築により、一つの色（例は、青）は、常に試料において存在するコントロール分析対象の存在をエンコードするために使用することができる。コントロール分析対象は、試料に添加してもよいし、または試料において本質的に存在してもよい。残りの色（例は、緑、黄、赤）は、追加の分析対象の存在をエンコードするために使用することができる。表2は、一つのそのような方法の例を示す。
表2において、コントロール（p）の存在は1000の結果によって示される。コントロールおよび分析対象Aの存在は2001の結果によって示される。コントロールおよびすべての他の三つの分析対象の存在は4111の結果によって示される。コントロールカラー（青）はアッセイが適切に機能している指標を示す。青色の強度はテスト試料において存在する分析対象の数を報告する。もちろん、任意の色がコントロールカラーとして使用されてよい。この技術における熟練の者（当業者）は、一定の実際的な考慮が、コントロールカラーとして別のものを超えた一つの色を使用することを好ましくするかもしれないことを認識するであろう。たとえば、一つの色が特定の光学系（またはフルオロフォアのシステム）においてより一層良好に検出される場合、コントロールカラーとしてその色を使用することが実用上好ましいことかもしれない。
表2に示すコード体系は、一つのコントロールカラーおよび一つの追加（分析対象ごとに最大2つのプローブまで）を使用して各分析対象をエンコードする。ただし、以下に示すように、分析対象あたり最大四色を使用するとき、エンコードすることができる検体の数は増加する。表3は各分析対象が最大4色までによってエンコードされる模範的なコード体系を示す。表3に示す体系では、コントロールカラー（青）は、コントロールシーケンスおよび他の7つの分析対象（A-G）の各々の存在下で生成される。他の七つの分析対象は、各々一ないし三の追加の色の存在によってエンコードされる。色が異なるプローブ上（例は、フルオロフォアおよびクエンチャーに付着するオリゴヌクレオチドプローブ）または同じプローブ上（それは複合的フルオロフォアおよび複合的クエンチャーを有することができる）に含まれていてもよい。
表3において、コントロールおよびすべての七つの他の分析対象の存在は、8444の結果によって示される。三つの分析対象（A、B、およびC）は二つの色によってエンコードされる。三つの分析対象（D、E、およびF）は、三つの色によってエンコードされ、そして一つの分析対象（G）は、四色によってエンコードされる。コントロール（p）の存在は1000の結果によって示される。コントロールおよび分析対象Aの存在は2001の結果によって示される。コントロールおよび分析対象Gの存在は2111の結果によって示される。これらの結果は、各色において信号の累積的な強度を表す。たとえば、結果2111は青のチャネルにおいて2Xの信号強度を有し、その一方、結果1000は青のチャネルにおいて1Xの信号強度を有する。
表3を使用して、可能な累積アッセイの結果の各々は、色（青、黄、緑、赤）および強度（0-8）の観点から列挙することができる。表4は、表3に示すエンコード方法に基づいて、可能な累積アッセイ結果のそれぞれを列挙し、および試料において存在する分析対象（群）の観点から各アッセイの対応するデコード結果を提供することによって生成された「デコードマトリクス」を示す。同様のデコードマトリクスは、ここに記載される任意のコード体系のために、コード体系に基づいて可能な累積アッセイ結果の各々を列挙すること、および試料において存在する（または存在しない）分析対象（群）の観点から各アッセイの対応するデコード結果を提供することによって生成することができる。いくつかのケースでは、以下に説明するように、一以上の分析対象は、縮重を低減または排除するためにコード体系から除去することができる。
表4において提供するデコードマトリクスは二つの仮定を用いて構成される。第一に、デコードマトリクスは、陽性コントロール（p）が常に肯定的な成果を生成することを仮定する。第二に、デコードマトリクスは、どのプローブから信号が来るかに関係なく、各色内で、強度が追加的（additive）であり、そしてプローブ濃度と共に同様にスケーリングすることを仮定する。これは、本質的に信号が追加的であり、そしてデジタルであることを意味する。これらの仮定の基礎となる条件は、適切にアッセイを準備することによって満足させることができる。蛍光シグナルを用いる場合、ここに提供される例において実証されるように、強度は、ほぼ追加的であり、そしてデジタルであれば十分である。
表4は、蛍光波長（すなわち、各色の範囲内での信号強度）の四つの範囲において強度の累積測定を、試料において存在する対応する分析対象に変換することを認める。たとえば、4321の結果は、p、C、F、およびGが存在し、そして他の分析対象が存在しないことを示す。この結果は、それがデコードマトリクスにおいて存在するので、「正当（レジティメート）」な結果と称される。対照的に、4000の結果は、測定することが可能ではあるが、デコードマトリクスにおいて生じない。より一層具体的には、4000の結果は、表3からコントロールおよび分析対象コードの任意の組合せを添加することによって達成することができない。この結果は「非正統（イレジティメート）」な結果と称される。非正統な結果は、アッセイがうまく機能しないことを示すことがある。したがって、コントロール（p）およびデコードマトリクスは、アッセイが適切に機能していることを検証する手段を提供する。
表4は、四つの分解可能な発光スペクトル（例は、色）を生成するフルオロフォアの任意の組合せについて網羅的である。用語「ランク」は、検出される分析対象の数を、コントロールを含めて記述するために用いられる。上記に提供された例では、アッセイが適切に機能する場合、ランクは青信号の値に等しい。たとえば、8のランクは、コントロールおよびすべての七つの他の分析対象（A-G）が存在することを示す。2のランクは、コントロールおよびただ一つの分析対象が存在することを示す。最低のランクは1のランクであり、それはコントロールだけが存在することを示す。各ランクでの可能性の数を列挙することができる。たとえば、表3-4に記載されたエンコードおよびデコードの方法を参照し続けることで、2ランクについて7つの可能性がある。ランク3での可能性の数は、7テイク2、または7!/(5!*2!)=21の可能性の組合せとして計算することができる。より一層ほとんどの場合、NテイクKの組合せについて可能性の数はN!/((NK)!*K!)である。類似して、ランク4、5、6、7、および8で、可能性の数は、それぞれ35、35、21、7、および1である。表4を参照すると、表が理論的予測と一致することを示す。それゆえ、表4は、表3に提供されるエンコード方法のための網羅的なデコードマトリクスである。
C．縮重の削減または排除
用語「縮重する」および「縮重」は、ここで用いるように、それが分析対象の存在または不存在に関して、一よりも多くの可能性を示すことができるので、大抵、正当な結果が決定的ではない状況を説明する。たとえば、表4を参照すると、結果5233は、それがpADFGまたはpBDEGのいずれかとしてデコードすることができるので、縮重される。同様に、結果4222は、それが、次の任意のものとして、すなわち、pCDG、pAFG、pBEG、PDEFをデコードすることができるため、縮重される。対照的に、結果3110はpBCだけを示すことができ、そしてそれ故縮重されない。
この開示は、縮重を低減または排除する方法を提供し、それによって、分析対象が検出されるとの信頼が増加する。一実施形態では、縮重は、次の、（i）信号の値として、および随意に、信号の少なくとも二つの成分の各々において値として、検出されるべき各潜在的（potential、可能性がある）分析対象をエンコードすること；（ii）コード体系から得ることができるあらゆる正当な結果を列挙すること；（iii）縮重される各正当な結果を識別すること； および（iv）コード体系から少なくとも一つの潜在的な分析対象（または潜在的分析対象コード）を排除することであり、そこでは少なくとも一つの潜在的分析対象を除去することが縮重を減少または排除することを含む方法によって除去される。たとえば、表3に記載されるコード体系および表4に記載されるデコードマトリクス（あらゆる正当な結果が列挙される）を参照して、分析対象D、E、およびFの任意の二つを排除することは縮重を排除する。分析対象D、E、およびFの任意の一つを排除することは縮重を排除しないが、それを減少させるであろう。
表3に記載されるコード体系を参照し続けることで、コード体系結果から分析対象D、E、およびFの任意の二つを排除することは、六つの分析対象（コントロールを含む）を、縮重を伴わず、単に4色を使用して、分析することができる。これとは対照的に、多重化の慣習的な方法は、3つの分析対象および1つのコントロールの報告だけが4色の使用により可能になるであろう。したがって、分析することができる分析対象の数は、ここに提供される方法を用いることによってほぼ倍になる。
図2は、五つの分析対象およびコントロールを検出するために4色を用いる本発明の模範的な実施形態を示す。分析対象は、デング熱ウイルス（「デング熱」）、結核菌（「結核」）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）p17（P17）、プラスモジウム（「マラリア」）、および単純ヘルペス（単純疱疹）（「ヘルペス」）からの核酸である。この例では 「色」はオリゴヌクレオチドプローブに付着するフルオロフォアであり、それはクエンチャーをも含む。オリゴヌクレオチドプローブは、概して、異なる分析対象に対し異なることになるが、その一方で、色は同じである。たとえば、プローブ1として指定されたすべてのプローブは青色を有するが、大抵、異なるオリゴヌクレオチド配列を有するであろう。もちろん、相補的配列が分析対象の各々において存在した場合、プローブ1として指定されたプローブは、同じオリゴヌクレオチド配列を有することができた。これらのプローブを用いた検出のメカニズムは、本開示において別の場所に記載する。プローブ1（青）は、すべての六つの分析対象、コントロールを含めて、それらにハイブリダイズする。プローブ2（緑）は、デング熱ウイルス、マイコバクテリウム、およびHIV p17からの分析対象にハイブリダイズする。プローブ3（黄）はデング熱およびプラスモジウムからの分析対象にハイブリダイズする。プローブ4は、デング熱ウイルス、マイコバクテリウム、および単純ヘルペスからの分析対象にハイブリダイズする。これらのプローブによって規定されるコード体系は、表5に示される。表3を参照すると、潜在的な分析対象D（1011）およびF（1110）はコード体系から排除される。したがって、表5において示すコード体系は非縮重であり、そしてアッセイからの各正当な結果は、試料において分析対象の独特の組合せの存在または不存在に対応する。
上記に示したエンコードおよびデコードのための方法は、縮重を排除するための方法を含め、すべてが追加の色を用いるエンコード方法に等しく適用可能である。たとえば、表3は、追加の色および追加の強度を含むことによって拡張することができた（詳細は後述）。次に、デコードマトリクスは上記のように生成され、コード体系から得ることができるあらゆる正当な結果が列挙される。表4において提供されるデコードマトリクスに類似するデコードマトリクスは、本開示に記載される任意のコード体系について構築されることができる。縮重している正当な結果は、次いで識別され、そして少なくとも一つの潜在的な分析対象コードは縮重を減少または排除するために、コード体系から排除される。縮重を排除する方法は、コンピュータ可読媒体、または方法を実行するように構成されたハードウェア（例は、マイクロチップ）上でソフトウェアを使用して行うことができる。
縮重は上記に、およびこの開示において別の場所に記載の方法により低減または除去されるが、この開示はまた、計画的に非縮重であるコード体系を提供することができる。たとえば、表3において記載したコード体系において縮重の除去後に、コード体系は、非縮重が計画的である非縮重の形で無制限に延ばすことができる（例は、表6に例示するコード体系を参照、以下により一層十分に説明する）。同様に、この開示は、設計により完全に非縮重であるコード体系を提供し、それでそれゆえ、縮重の任意の減少または排除は必要とされない（例は、表8において例示するコード体系を参照、以下でより一層詳細に説明する）。このように、この開示において提供されるコード体系は縮重を低減または除去している場合があり、または設計によって非縮重であることができる。
D．一よりも多くの色および一よりも多くの強度を用いるエンコード方法
上記のエンコード方法（例は、表3-5）は、さらに、分析対象が1より大きな強度によってエンコードされるのを可能にすることによって拡げることができる。たとえば、表5において提供されるコード体系においてエンコードされる分析対象の各々は、1または0のいずれかの蛍光強度によってコードされる。少なくとも一つの色において信号強度についてより一層高い値を許可すると、さらに、この開示において提供される方法のいずれかによってエンコードすることができる分析対象の数が増加する。若干の例では、これらのより一層高い強度値は、コントロールカラーの分析対象カウンティング能力を維持するために、コントロールカラーを除く任意の色を割り当てることができる。
表6は、四色および複合的強度を利用した模範的なコード体系の最初の三つの段階（tiers）を示す。表6の段階（Tier、ティア）1は表3の再現であり、七つの分析対象およびコントロールの四つの色によるエンコードが示される。上述のように、潜在的な分析対象D、E、およびFの任意の二つは、非縮重コード体系を生産するために、コード体系から排除することができる。表6のティア1は、潜在的な分析対象D（1011）およびF（1110）が縮重を排除するために、コード体系から排除されていることを示す。したがって、表6のティア1において示されるコード体系は、上述のように、四色を用いて五つの分析対象および一つのコントロールの存在を決定することが可能である。
表6のティア1のコード体系は、色のいずれかでの強度が増加するのを可能にすることにより、第二段階（ティア2）に拡がることができる。上述のように、コントロールカラーの強度は、コントロールのシーケンスカウンティング能力を保持するために、1に維持することができる。残りの三色のいずれかの強度を増加させることは、コード100Y、10Y0、1Y00、10YY、1Y0Y、1YY0、および1YYYを産生し、式中でY>1である。エンコードの新しい段階のためのYの最小値は、以前の段階（群）からの累積最大値プラス1に等しい。強度間の差異を最大にするために、後述するように、1より大きい値も使用することができる。
このように、この前後関係において、用語「段階（ティア）」は、概して、第一の値（例は、強度）および第二の値（例は、色）の特定の数によって、縮重を伴わずに提供されるコーディングキャパシティ（コード能力）を十分に利用するコードのセットを記述するために使用される。たとえば、表6のティア1は、各色において最大で一の強度を有する四つの色によって縮重を伴わずに提供されるコード能力を十分に利用する。表6、ティア1に示されるように、これは、六つのエンコードされた分析対象を、コントロールを含めて招く。第二の段階を導入するために、Yの最小値（上記）は、以前の段階（群）からの累積最大値の結果プラス一つ（または一よりも多く）に等しくなるようにインクリメントされる。表6において示す例では、青（コントロール）色の強度は、この色においてシーケンスカウント能力を保持するために一として維持される。このように、ティア2は、緑、黄、および赤のチャネルにおいて、ティア1、プラス一からのこれらのチャネルの各々において累積最大結果に等しくなるように強度をインクリメントすることによって五つの非縮重エンコードの可能性から構成される。次に、これらのコードのすべての可能性は、ティア2のために列挙することができ、そして縮重がもたらされるコードを排除することができ、またはティア2は、設計によって、ティア1から対応するコードを排除するために用いられる情報を使用して、非縮重とされてもよい。さらに次に、コード能力は、第3段階、またはさらなる段階の付加によって達成することができ、それらは類似の方法に従って構築される。コード体系は無数の段階を有してよく、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれよりも多くの段階である。
より一層具体的には、表6、ティア2を参照して、分析対象Hを1004によってエンコードする。コントロールカラーの値は1として維持される。赤色の値は、以前の段階からの累積最大結果（3）プラス1、または4と等しい。同様に、分析対象IおよびJは、それぞれ、1030および1400によってエンコードされる。これらのコードの組合せを、ティア1において分析対象D-Gのために行われたように残りの四つの分析対象（K-N）をエンコードするために使用される。このことは、ティア2を完成させる。ティア2では、潜在的な分析対象K（1034）およびM（1430）の包含は縮重をもたらす。したがって、これらの分析対象は、縮重を排除するために、コード体系から排除されている。
表6を継続参照し、第3段階（ティア3）は上記と同じ原理を用いて構成される。分析対象Oは1-0-0-16によってエンコードされる。コントロールカラーの値はまだ1として維持される。赤色の値は以前の段階（15）からの累積最大結果プラス1、または16に等しい。同様に、分析対象PおよびQはそれぞれ、1-0-9-0および1-16-0-0によりコードされる。これらのコードの組合せは、ティア1において分析対象D-Gおよびティア2において分析対象K-Nについて行ったように、残りの四つの分析対象（R-U）をエンコードするために使用される。ティア3において、潜在的な分析対象R（1-0-9-16）およびT（1-16-9-0）の包含は縮重をもたらす。したがって、これらの分析対象は、縮重を排除するために、コード体系から排除されている。
表6において示す三ティアコード体系は、15の分析対象および一つのコントロールの四色を用いたエンコードを示す。このコード体系は、追加の段階を生成するために、より多くの強度を加えること、および/または段階内に付加的なコード能力を生成するために、より多くの追加の色を加えることによって、無制限に拡げることができる。この開示に記載されるように、縮重を減少または排除する方法は、縮重の結果を低減または排除するために、各強度および/または色の付加により使用することができる。
より一般的には、表6に示すコード体系は表3-5に示すコード体系の非縮重、無限の拡張である。第一の段階での累積測定値の最大強度は6である。第二の段階での累積測定値の最大強度は15である。第三の段階での累積測定値の最大強度は63であり、および等々である。最大累積強度値（F）とすると、このコード体系において利用可能な段階の最大数（T）はT=log4(F+1)である。表6において示されるコード体系は段階（P）あたり五つの非縮重コードを提供する。したがって、コードの最大数はM=5*log4(F+1)、またはM=P*T、ここでPは段階あたりの非縮重コードの数であり、そしてTは段階の数である。たとえば、F=63とすると、コードの最大数（すなわち、分析対象）は段階あたり5非縮重コードについて15である。この式は1000コードを含んでおらず、それは表6において陽性コントロールのために確保される。分析対象の総数においてコントロールを含めるには、式M=(P*T)+1を提供するために、単純に一が付加される。
この開示において提供される方法は、このコード体系を無限に拡張するために用いることができる。たとえば、異なる強度（すなわち、第一の値）および色（すなわち、第二の値）の組合せを利用することによって、段階あたりの非縮重コードの数（P）および段階の数（T）を変動させることで分析対象の任意の数（M）をエンコードすることができる。たとえば、段階あたりの非縮重コードの数は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、またはそれよりも多い。同様に、段階の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、またはそれよりも多い。
図1の右側は上述の方法の模範的な一実施形態を示す。より一層具体的には、図1の右側はエンコード方法を示し、そこでは、九つまたはそれよりも多くの分析対象（配列1-配列9等）が各々、少なくとも二色によって各色内で強度の変動を伴いコードされる。色はオリゴヌクレオチドプローブに付着したフルオロフォアを表し、それにはまたクエンチャーが含まれる。システムは、各プローブが単一フルオロフォアで標識され、または各プローブが一よりも多くのフルオロフォアで標識されるように設計することができる。たとえば、表6において、分析対象Hのためのコードは1004である。赤のチャネルにおいて4の強度は、4つの赤いフルオロフォアを含むH-特異的プローブを使用することによって、または4H特異的プローブで各々が単一の赤いフルオロフォアを含むものを使用することによってのいずれかで達成することができる。もちろん、プローブおよび赤チャネルにおいて4の結果を生成するフルオロフォアの任意の組合せは、同等に適切であり、たとえば、2つの赤のフルオロフォアを各々有する2つのプローブ、およびの1つの赤のフルオロフォアを有する1つのプローブおよび3つの赤のフルオロフォアを有する1つのプローブ、または単純に1つの赤のフルオロフォアを有するが、反応混合物において4Xの量で存在する一つのプローブのようなものである。
図1の右側に示すコード体系は表7においてのように表すことができる。図1の右側に示す解析の結果は41 12であり、または青のチャネルにおいて4、緑のチャネルにおいて1、黄のチャネルにおいて1、および赤のチャンネルにおいて2の強度である。ここに記載されるように構成されるデコーディングマトリクスを用いると、この結果は、配列1、配列3、配列4、および配列5の存在を示すためにデコードされる。
E．分析対象あたり一つの色および一つの強度であるが、分析対象間で異なる強度を用いるエンコード方法
ここで提供される若干の方法において、各分析対象を単一の色および強度の組合せによってコードする。たとえば、四色系において、第一の四つの分析対象は、1000、2000、4000、および8000によってエンコードされうる。次の四つの分析対象は、0100、0200、0400、および0800によってエンコードされてもよい。分析対象9-12および13-16は、表8に示すように、類似して割り当てられる。
表6に記載のエンコード方法と同様に、このコード体系は、理論的には、無限大で、構成によって非縮重であり、そして信号を測定するために使用される機器の帯域幅によって制限されるだけである。しかし、このコード体系は、表6に記載のエンコード方法よりも帯域幅の単位当たりより一層多くの分析対象が定量化されることを可能にする。その理由としては、信号の利用可能な多重性（multiplicity）は、強度の各レベルがコーディングにおいて利用されるように、最大効率と共に使用されるからである（すなわち、クロマトグラムにおいてギャップはなく；クロマトグラムの説明については以下を参照）。表8は、この方法の一実施形態を示し、四色および強度1、2、4、および8に基づいくエンコードの四つの段階が例証される。コード体系は非縮重であり、および結果は、すべての16の分析対象が存在する場合、15-15-15-15である。このエンコード方法は、上記に提示するエンコード方法よりも帯域幅利用に関して、より一層効率的である。しかし、この方法は、クロマトグラムでのギャップの不存在において、すべての結果が正当な成果をデコードするように、第一の体系のプルーフリーディング（校正）能力を有さない。
上記に提示し、および表8において実証する本方法は、追加の色および/または強度を導入することによって拡張することができる。たとえば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、またはそれよりも多くの色を用いることができる。付加的な強度レベル、たとえば、16、32、64、128、255、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、および等々を使用することもできる。本方法は、一般化され、および分析対象の無限の数をエンコードするために用いることができる。各分析対象は、単一色においてコードで表され、そこでは、その単一色におけるコードの値は、すべての前の値の合計プラス一に等しい。たとえば、第一のコードが特定の色において1を含む場合、次のコードは、2、4、8、16、32、64、128、および等々である。他のプログレッション（進行）は可能であるが、帯域幅の使用の観点から効率的といえるものではない。しかし、この技術における熟練の者は、あるものが値の間の分離を最大にしたいとき、帯域幅のあまり効率的でない使用が望ましいことがありうることを認識するであろう。同様に、値1は、たとえば、第一のエンコードされた値および機器ノイズの間の強度において差を最大にするために、コード体系から排除することができる。たとえば、若干のケースでは、コード体系は、2の値を伴って始まることができ、それは、分析対象のコードのために、2、4、8、16、32、64、128、および等々の進行をもたらし、その一方で、累積的結果の進行は、2、4、6、8、10、12、14、16、および等々である。このアプローチは、可能な累積結果において均一なギャップを生成し、1、2、4、8、16、32、および等々の分析対象コード進行、および1、2、3、4、5、6、7、8、および等々のその対応する累積結果の進行に比べて、ノイズに対するより一層高い耐性が可能になる。この例では、測定において増大したロバスト性は、多重性の固定帯域幅内で使用可能なコードの数での減少のコストになる。たとえば、63の多重状態だけを確実に測定することができれば、1で始まるコード体系は色あたり7つのコードを与えるのに対し、2で始まるコード体系は色あたり6つのコードを与える。4色が利用可能な場合、前者は28のコードを与え、その一方、後者は24のコードを与える。手短には、出発信号強度および進行の双方（すなわち、強度値の間の差）は、機器ノイズにわたって区別される能力を最大化し、および強度値間の差を最大化すためにスケーリングされてもよく、それによって別個の実験的な成果間を区別する能力が高められる。
表8に例示するコード体系は計画的に非縮重である。表8に例示するコード体系は、16の分析対象の各々をエンコードするために強度および色の双方を用いるが、分析対象の各々は単に強度を利用してエンコードすることができる。たとえば、表8（A-P）において提供される16の分析対象を仮定すると、すべての16の分析対象をコードする単一のカラーコード体系は、値1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192、および16384を、分析対象A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、およびP、それぞれに割り当てることができる。そのようなコード体系は、設計によって非縮重であり、そして累積強度結果は分析対象A-Pの存在または不存在を示すためにはっきりとデコードすることができる。このコード体系は、Mの分析対象の存在または不存在を検出することが可能であり、そこで、M=log2(F+1)およびFは信号（例は、信号強度）の最大累積値である。この信号に第二成分を付加することによって（例は、表8に示されるように、色）、このコード体系の容量はM=C*log2(F+1)に増加させることができ、そこでは、Cは、前記コード体系において用いられる色の数である。
この明細書を通じて説明したように、任意の適切な値はCまたはFのために用いることができる。たとえば、Cは、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、またはそれよりも多いことができる。Fは、少なくとも約2、4、8、16、32、64、128、255、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、131072、262144、524288、1048576、および等々であってよい。この開示において別の場所に説明するように、Fの初期開始値およびその進行におけるステップの双方はまた変動させることもできる。
III．分析対象
分析対象は、任意の適切な分析対象であってよく、それは、本発明の方法および組成物を使用して分析することができ、そこでは、測定することができる少なくとも二つの成分を有する信号を生成するために、分析対象を試薬と相互作用することが可能である。分析対象は、自然発生または合成であってもよい。分析対象は、この技術において既知の任意の方法を用いて得られる試料中に存在してもよい。いくつかの場合において、試料は、分析対象のためにそれを分析する前に処理することができる。この開示において提示される方法および組成物は、粒子（たとえば、ビーズなどのようなもの）または固形支持体を必要とせず、溶液相アッセイにおいて使用することができる。
いくつかの場合において、分析対象は、ポリヌクレオチドで、たとえば、DNA、RNA、ペプチド核酸、およびそれらの任意のハイブリッドなどのようなものであってよく、そこでは、ポリヌクレオチドには、デオキシリボ-および/またはリボ-ヌクレオチドの任意の組合せが含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であるか、または双方二本鎖または一本鎖配列の部分を含むことができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは塩基の任意の組合せを含んでもよく、たとえば、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンおよびそれらの任意のヌクレオチド誘導体が含まれる。ここで用いるように、用語「ヌクレオチド」には、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドの類似体、および修飾されたヌクレオチドが含まれてよく、合成および天然に発生する種の双方が含まれる。ポリヌクレオチドは、任意の適切なポリヌクレオチドであることができ、それに対して、ここに記載されるように一以上の試薬（またはプローブ）が生産されてよく、制限されないが、cDNA、ミトコンドリアDNA（mtDNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、核RNA（nRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、カハール体特異的低分子RNA（small Cajal body-specific RNA）（scaRNA）、マイクロRNA（miRNA）、二重鎖（dsRNA）、リボザイム、リボスイッチまたはウイルスRNAが含まれる。ポリヌクレオチドは任意の適切なベクター内に含まれてもよく、たとえば、プラスミド、コスミド、フラグメント（断片）、染色体、またはゲノムのようなものである。
ゲノムDNAは、自然発生または遺伝子改変生物から、または人工的にまたは合成的に作成されたゲノムから得ることができる。ゲノムDNAを含む分析対象は、任意の供給源から、およびこの技術において既知の任意の方法を用いて得られる。たとえば、ゲノムDNAは、増幅を伴うか、または伴わずに分離（単離）することができる。増幅には、PCR増幅、多置換増幅（多重変位増幅）（MDA）、ローリングサークル増幅および他の増幅方法が含まれうる。ゲノムDNAはまた、クローニングまたは組換え法によって得ることができ、たとえば、プラスミドおよび人工染色体または他の慣習的な方法が含まれるようなものである〔Sambrook（サムブルック）およびRussell（ラッセル）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.（分子クローニング：実験室マニュアル）参照、前掲〕。ポリヌクレオチドは、この技術において既知の他の方法を用いて、たとえば、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)〔ゲノム解析：ラボラトリーマニュアルシリーズ（第I-IV巻）〕またはMolecular Cloning: A Laboratory Manualに開示されているように分離することができる。分離したポリヌクレオチドがmRNAである場合、慣習的な技術を使用して、サムブルックおよびラッセル、モレキュラー・クローニング：実験室マニュアル、前掲に記載されるように、cDNAに逆転写させることができる。
分析対象は、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖質、糖、小分子、または任意の他の適切な分子で、ここで提供される方法および組成物を用いて検出することができるものであってもよい。分析対象は酵素または他のタンパク質でよい。分析対象は、薬物または代謝産物〔例は、抗ガン剤（薬）、化学療法薬、抗ウイルス薬、抗生物質、または生物〕であることができる。分析対象は、任意の分子であってもよく、たとえば、補因子、受容体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、血液因子、抗原、ステロイド、または抗体のようなものである。
分析対象は、任意の病原体由来の任意の分子であってもよく、たとえば、ウイルス、細菌、寄生体、真菌、またはプリオン〔例は、PrPSc（スクレイピー異常プリオン）〕のようなものである。ウイルスの例には、ファミリーのアデノウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科からのものが含まれる。ウイルスの特定の例には、アデノウイルス、アストロウイルス、ボカウイルス、BKウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネコ白血病ウイルス、肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、HSVタイプ1（HSV1型）、HSV 2型、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、HIV 1型、HIV 2型、ヒトパピローマウイルス（HPV）、HPV1型、HPV2型、HPV3型、HPV4型、HPV6型、HPV10型、HPV11型、HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV27型、HPV28型、HPV29型、HPV30型、HPV31型、HPV33型、HPV34型、HPV35型、HPV39型、HPV40型、HPV41型、HPV42型、HPV43型、HPV44型、HPV45型、HPV49型、HPV51型、HPV52型、HPV54型、HPV55型、HPV56型、HPV57型、HPV58型、HPV59型、HPV68型、HPV69型、インフルエンザウイルス、JCウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、パロウイルス（parovirus）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、レトロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、および黄熱病ウイルスが含まれる。
細菌の例には、属のボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クロストリジウム、コリネバクテリウム、腸球菌、エシェリキア（大腸菌）、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ菌、シゲラ（赤痢菌）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）、ストレプトコッカス（連鎖球菌）、トレポネーマ、ビブリオ、およびエルシニアからのものが含まれる。細菌の特定の例には、パラ百日咳菌（ボルデテラ・パラパータシス、Bordetella par apertussi）、百日咳菌、ライム病菌（ボレリア・ブルグドルフェリ）、ウシ流産菌（ブルセラ・アボルタス）、イヌ流産菌（ブルセラ・カニス）、ヤギ流産菌（マルタ熱菌、ブルセラ・メリテンシス）、ブタ流産菌（ブルセラ・スイス）、ジェジュニ菌（カンピロバクター・ジェジュニ）、肺炎クラミジア（クラミジア・ニューモニエ）、オウム病クラミジア（クラミジア・シタッシ）、トラコーマクラミジア（クラミジア・トラコマティス、Chlamydia trachomatix）、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリヌム）、ディフィシル菌（クロストリジウム・ディフィシル）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス）、破傷風菌（クロストリジウム・テタニ）、ジフテリア菌（コリネバクテリウム・ジフテリエ）、フェカリス菌（エンテロコッカス・フェカリス）、フェシウム菌（エンテロコッカス・フェシウム）、大腸菌（エシェリキア・コリ）、野兎病菌（フランシセラ・ツラレンシス）、インフルエンザ菌（ヘモフィルス・インフルエンザエ）、ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ）、レジオネラ・ニューモフィラ（在郷軍人病菌）、レプトスピラ・インテロガンス（レプトスピラ・インターロガンス）、リステリア菌（リステリア・モノサイトゲネス）、らい菌（マイコバクテリウム・レプラエ）、結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）、マイコバクテリウム・ウルセランス、肺炎マイコプラズマ（マイコプラズマ・ニューモニエ）、淋菌（ナイセリア・ゴノレー）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）、緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（リケッチア・リケッチイ、豚コレラ菌（サルモネラ・コレレスイス）、サルモネラ・ダブリン、腸炎菌（サルモネラ・エンテリティディス）、チフス菌（サルモネラ・チフィ）、ネズミチフス菌（サルモネラ・チフィリウム）、ソンネ菌（シゲラ・ソネイ）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）、表皮ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピデルミデス）、腐性ブドウ球菌（スタフィロコッカス・サプロフィチカス）、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）、化膿連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、梅毒トレポネーマ（トリポネーマ・パリダム）、コレラ菌（ビブリオ・コレラエ）、ペスト菌（エルシニア・ペスチス）、およびエンテロコリチカ菌（エルシニア・エンテロコリチカ）が含まれる。
寄生体の例には、属のアカントアメーバ、バベシア、バラムチア、バランチジウム、ブラストシスチス（Blasocystis）、クリプトスポリジウム、二核アメーバ（ジエントアメーバ）、赤痢アメーバ（エントアメーバ）、ジアルジア、イソスポーラ、リーシュマニア、ネグレリア、アタマジラミ（ペディクルス）、プラスモジウム、リノスポリジウム、内胞子虫（サルコシスティス）、住血吸虫（シストソーマ）、トキソプラズマ、トリコモナス、およびトリパノソーマからのものが含まれる。寄生体の特定の例には、バベシア・ダイバージェンス（Babesia divergens）、バベシア・ビゲニナ（Babesia bigemina）、バベシア・エクイ、バベシア・ミクロフチ（Babesia microfti）、バベシア・ダンカニ（Babesia duncani）、バラムチア・マンドリルリス、大腸バランチジウム、二核アメーバ、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、戦争イソスポーラ（イソスポーラ・ベリ）、ネグレリア・フォーレリ、ヒトジラミ（ペディクルス・ヒューマナス）、熱帯熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫（プラスモディウム・ビバックス）、リノスポリジウム・セーベリ、サルコシスティス・ボビホミニス（Sarcocystis bovihominis）、サルコシスティス・スイホミニス（Sarcocystis suihominis）、マンソン住血吸虫、トキソプラズマ原虫（トキソプラズマ・ゴンディ）、膣トリコモナス（トリコモナス原虫）、ブルセイトリパノソーマ（トリパノソーマ・ブルセイ）、およびトリパノソーマ・クルージ（Trypansoma cruzi）が含まれる。
菌類の例には、属のアポフィソミセス（Apophysomyces）、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ、クラドスポリウム、コディディオイデス（Coddidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcos）、エキセロヒルム（Exserohilum）、フザリウム、ヒストプラズマ、ピキア、ニューモシスチス、サッカロミセス、スポロトリクス、スタキボトリス、および白癬菌（トリコフィトン）からのものが含まれる。真菌の特定の例には、アスペルギルス・フミガーツス、黄色コウジ菌（アスペルギルス・フラバス）、アスペルギルス・クラバタス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Crytptococcus neoformans）、エキセロヒルム・ロストラタム（Exserohilum rostratum）、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ニューモシスチス肺炎菌（ニューモシスチス・ジロベシ）、スポロトリクス・シェンキ（Sporothrix schenckii）、クロカビ（スタキボトリス・チャータラム、Stachybotrys chartarum）、および毛瘡白癬菌（トリコフィトン・メンタグロフィテス）が含まれる。
若干のケースでは、この開示において提供される方法は、上記の、または本明細書における他の箇所で説明される分析対象の任意の一つを検出するために用いることができる。いくつかの場合において、この開示において提供される方法は、上記の、または本明細書における他の箇所で説明される分析対象のパネルを検出するために用いることができる。たとえば、パネルは、上記または本明細書において他の箇所で説明される任意の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれよりも多くの分析対象からなる群より選ばれる分析対象を含むことができる。
分析対象は、任意の生物、組織、細胞、または環境から、生物、細胞全体、細胞調製物および細胞フリー（細胞を含まない）組成物からのものを含め、任意の適切な場所から得ることができる。分析対象は、環境サンプル、生検材料（バイオプシー）、吸引物、ホルマリン固定された包埋組織、空気、農業（農産物）サンプル、土壌サンプル、石油サンプル、水サンプル、または埃（粉塵）サンプルから得ることができる。いくつかの例では、分析対象は、血液、尿、糞便、血清、リンパ液、唾液、粘膜の分泌物、汗、中枢神経系液（central nervous system fluid）、膣液、または精液が含まれうる体液から得ることができる。分析対象はまた、たとえば、化粧品、食物、パーソナルケア製品、および同様の他のものなどのような工業製品から得ることができる。分析対象は、組換えクローニング、ポリヌクレオチド増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、精製方法（たとえば、ゲノムDNAまたはRNAの精製などのようなもの）、および合成反応を含め、実験操作の生成物であってもよい。
分析対象の一よりも多くを、各多重化（multiplexed）アッセイにおいて検出することができる。たとえば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖質（炭水化物）、糖、小分子、または他の任意の適切な分子は、適切な試薬を用いて、同一の多重化アッセイにおいて同時に検出することができる。分析対象の任意の組合せは同時に検出することができる。
分析対象の検出は、研究、臨床、診断、予後（判定）、法医学的、および監視用途を含め、任意の適切な適用のために有用であることができる。代表的なアプリケーションには、遺伝性疾患の検出、遺伝子指紋の識別、感染症の診断、遺伝子のクローニング、親子鑑定（実父確定検査）、犯罪鑑識、系統発生、バイオテロ予防、環境調査、およびDNA計算機による計算が含まれる。たとえば、分析対象は、疾患または状態を示すことができる。分析対象は、治療法の決定を行うために、または疾患の状態を評価するために使用することができる。分析対象の存在は、特定の病原体による感染、または任意の他の疾患、たとえば、癌、自己免疫疾患、心肺疾患、肝疾患、消化器疾患、その他などのようなものを示すことができる。それ故に、ここに提供される方法は、診断を行うために、およびその診断に基づく臨床判断を行うために用いることができる。たとえば、対象体から採取したサンプル中の細菌のポリヌクレオチドの存在を示す結果は、対象体の抗生物質での治療につながる可能性がある。
いくつかの場合において、本発明の方法および組成物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000の分析対象を検出するために使用されうる。いくつかの場合において、本発明の方法および組成物は、7-50、8-40、9-30、10-20、10-15、8-12、または7-12の分析対象を検出するために使用されうる。
若干の場合において、この開示はアッセイを提供し、それは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000の分析対象の各々の存在または不存在を、それぞれの存在または不存在の任意の組合せで、単一のサンプルボリュームにおいて、固定化、分離、質量分析法、または融解曲線解析を伴わずに、はっきりと検出することが可能である。いくつかの場合において、この開示はアッセイを提供し、それは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000の分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在在の任意の組合せで、単一のサンプルボリュームにおいて、固定化、分離、質量分析法、または融解曲線解析を伴わずに、はっきりと検出することが可能である。いくつかの場合において、この開示はアッセイを提供し、それは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000未満の分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一のサンプルボリュームにおいて、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析を伴わずに、はっきりと検出することが可能である。
IV．シグナル
この開示において提示される方法は、任意の定量化可能なシグナル（信号）と共に使用することができる。若干の場合において、この開示は、信号（例は、強度）の単一成分を使用して、縮重を伴わずに標的の無限数をエンコードするためにコード体系および方法を提供する。たとえば、上記および例3に記載のように、コード体系は、色を考慮せずに信号強度の多様性に依存してもよい。蛍光プローブは、この原理を説明するために使用されてきたが、この開示の別の場所で説明されるように、コード体系は、電気化学信号および化学ルミネセンス信号を含む定量可能な信号を提供する任意の他の方法にも等しく適用可能である。
この開示において提示される方法は、少なくとも二次元における信号の測定を利用することができ、また信号の少なくとも二つの成分の測定と称される。上記の段落で説明したコード体系で、たとえば、分析対象の間を区別するために信号強度に依存するものと比較して、信号の少なくとも二つの成分（例は、色および強度）の利用は、信号強度帯域幅のユニットあたりでより一層多くの特有なコードの生成を可能にする。信号の少なくとも二つの成分が利用されるとき、少なくとも二つの成分の累積測定は、単一のサンプルボリュームのために得ることができる。表5に記載するコード体系において、各分析対象の存在は、たとえば、特定の強度（信号の一成分）を、四つの色（信号の第二成分）の各々においてもたらす。これらの成分信号の組合せは、各波長または波長範囲での強度を測定することによって測定することができる累積信号をもたらす。対応するコード体系またはデコードマトリクスは、その後、累積測定値を分析対象の存在または不存在の決定に変換するために用いることができる。
いくつかのケースでは、定量化可能な信号は、周波数（波長）および振幅（強度）の双方を有する波形を含む。信号は電磁信号でありうる。電磁信号は、音（サウンド）、無線信号、マイクロ波信号、赤外線信号、可視光信号、紫外光信号、X線信号、またはガンマ線信号であってもよい。いくつかの場合において、電磁信号は、蛍光信号、たとえば、波長および強度の観点から特徴付けることができる蛍光発光スペクトルであってもよい。
この開示の一定の部分では、信号は蛍光信号に関して記載され、および例示される。これは、制限することを意味するものではなく、そしてこの技術において通常の技能の者は蛍光信号の測定に適用可能な原理が、他の信号にも適用可能であることを容易に認識するであろう。たとえば、蛍光信号のように、上述した電磁信号のいずれも、波長および強度の観点から特徴付けることができる。蛍光信号の波長はまた、色の観点から説明することができる。色は、たとえば、異なる波長での蛍光強度の分布を決定することによって、および/または波長の特定範囲内で蛍光強度を測定するために帯域（通過）（バンドパス）フィルターを利用することによって、特定の波長または波長範囲での強度を測定することに基づいて決定することができる。そのような帯域フィルターは、普通に、定量的PCR機械を含む多種多様な実験室計測機器において採用される。強度は光検出器で測定することができる。波長の範囲は「チャネル」と称されることもある。
いくつかのケースでは、この開示において提供される方法は、任意の信号と共に用いることができ、そこでは、累積信号が、同じ色、周波数、吸収帯、およびその他の成分信号に対応する。しかし、累積信号は、デジタルでも、または成分信号の数および強度と線状に対応することも必要はない。たとえば、測定の物理的原理が吸収である場合、累積減衰は成分減衰の産物であり、その一方、成分濃度は、ランベルト・ベールの法則の指数関数的な性質のため、付加的である。累積減衰の対数は、各吸収帯において成分濃度に伴って直線的に拡張する（蛍光検出が使用される場合、色の同等性）。したがって、本発明の方法は適用可能である。本発明の方法はまた、化学ルミネセンス信号および電気化学信号と共に用いることができる。
信号の数、および測定された次元または構成要素（成分）の数はまた、本発明の模範的な実施形態に示される数値を超えて拡張することができ、多重化能力における拡張につながる。本開示において提供される模範的な実施形態は、測定された一または二の成分：波長および/または強度と共に、蛍光信号を利用して構成されるコード体系を利用する。エンコードすることができる分析対象の数は、波長および/または強度の数を増やすことによって増加させることができる。エンコードされうる分析対象の数はまた、信号の数を増やすことによって、たとえば、蛍光シグナルを電気化学信号またはFRETシグナル（蛍光共鳴エネルギー移動）と組み合わせることによって増加させることができる。
若干のケースにおいて、信号の二つよりも多くの成分を測定しうる。たとえば、信号の3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20またはそれよりも多くの成分を測定することができる。信号の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、または20の成分を測定することができる。信号の少なくとも2つであるが、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、または20より少ない成分を測定することができる。いくつかのケースでは、信号の2-3、2-4、2-5、2-6、3-5、3-6、3-8、または5-10の成分を測定することができる。これらの追加成分には、信号減衰の割合および光退色の割合のような動的構成要素が含まれうる。
蛍光信号が使用される場合、エンコードされることができる分析対象の数は、追加的なフルオロフォアを利用することによってさらに拡張することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのフルオロフォアを使用することができる。いくつかの場合には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のフルオロフォアを使用することができる。いくつかの場合には、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないフルオロフォアを使用することができる。いくつかの場合には、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、または10-20のフルオロフォアを使用することができる。
概して、エンコードされることができる分析対象の数は、信号の第一の成分からの値またはその値の範囲である追加的な第一の値（例は、強度）を利用して、さらに拡張することができる。たとえば、信号の第一の成分からの値またはその値の範囲である1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの第一の値を使用することができる。いくつかの場合には、信号の第一の成分からの値またはその値の範囲である少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの第一の値が使用されてもよい。いくつかの場合には、信号の第一の成分からの値またはその値の範囲である1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ない第一の値が使用されてもよい。いくつかの場合には、信号の第一の成分からの値またはその値の範囲である4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、または10-20の第一の値が使用されてもよい。
この強度が、蛍光シグナルを利用するときのように、定量化される信号の成分である例では、分析対象の存在は様々な強度または強度の範囲を使ってエンコードすることができる。たとえば、コード体系は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの強度または強度の範囲を利用することができる。コード体系は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの強度または強度の範囲を利用することができる。コード体系は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ない強度または強度の範囲を利用することができる。いくつかのケースでは、コード体系は、2-20、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、または5-10の強度または強度の範囲を利用することができる。
エンコードされることができる分析対象の数は、信号の第二の成分からの値またはその値の範囲である追加的な第二の値（例は、波長）を利用してさらに拡張することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの第二の値で、信号の第二の成分からの値またはその値の範囲であるものを使用することができる。いくつかのケースでは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの第二の値で、信号の第二の成分からの値またはその値の範囲であるものを使用することができる。若干のケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ない第二の値で、信号の第二の成分からの値またはその値の範囲であるものを使用することができる。若干のケースでは、4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、または10-20の第二の値で、信号の第二の成分からの値またはその値の範囲であるものを使用することができる。
波長が、蛍光シグナルを利用するときのように、定量化される信号の成分である例において、分析対象の存在は、様々な波長または波長の範囲を使ってエンコードすることができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの波長または波長の範囲を使用することができる。いくつかの場合には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの波長または波長の範囲が使用されてもよい。場合によっては、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ない波長または波長の範囲が使用されてもよい。場合によっては、4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、または10-20の波長または波長の範囲が使用されてもよい。
いくつかの場合において、縮重が排除されるとき、本発明の方法は、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの分析対象の存在または不存在を、シングルボリュームにおいて、そのボリュームで信号を生成するために使用される各試薬が一つの第二の値だけを生成するときに検出することができる（例は、各試薬で、唯一の波長で発光する）。
他の場合では、縮重が排除されるとき、本発明の方法は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの分析対象の存在または不存在を、シングルボリュームにおいて、そのボリュームで四つの第二の値の合計を使用して検出することができる（例は、四つの波長または範囲または波長の合計で、四つのスペクトル的に分解可能なフルオロフォアを用いることによって実現されることがある）。
本明細書を通じて説明されるように、ここに提供されるアッセイは、サンプル上の累積測定を利用する。累積測定は、たとえば、強度値の単一測定、または一以上の波長または波長の範囲での強度値の測定であることができる。複数の累積的な測定を得ることができる。たとえば、強度は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの波長または波長の範囲で測定することができる。強度は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの波長または波長の範囲で測定することができる。強度は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50未満の波長または波長の範囲で測定することができる。
より一層普通に、累積的な測定は、信号の任意の定量化可能な成分のため、および信号の別の定量化可能な成分での信号の任意の定量化可能な成分のために得ることができる。たとえば、信号の少なくとも第一の成分は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの、信号の第二の成分で測定することができる。信号の少なくとも第一の成分は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの、信号の第二の成分で測定することができる。信号の少なくとも第一の成分は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50未満の、信号の第二の成分で測定することができる。
この開示から明らかなように、検出されるべき各分析対象は、信号または信号の任意の数の適切な成分の任意の数を利用するコードとしてエンコードすることができる。たとえば、検出されるべき各分析対象は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くの信号または信号群の成分においてエンコードすることができる。いくつかの場合において、検出されるべき各分析対象は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの信号または信号群の成分においてエンコードすることができる。いくつかの場合において、検出されるべき各分析対象は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないで信号または信号群の成分においてエンコードすることができる。いくつかのケースでは、1-4、4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、または10-20の、信号または信号群の成分は、各分析対象をエンコードするために使用することができる。コード体系における各分析対象は、信号または信号群の成分の同じ数、または信号、または信号群の成分の異なる数によってエンコードされてよい。
A．プローブ、プライマー、フルオロフォア、およびクエンチャー
この開示において提供される方法のいくつかは、分析対象の存在下で信号を発生する試薬を利用する。任意の適切な試薬は本発明と共に使用することができる。概して、試薬は、分析対象特異的成分および分析対象の存在下で信号を生成する成分を有することになる。いくつかの場合において、これらの試薬は、プローブと呼ばれる。プローブはハイブリダイゼーションプローブであってもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーに結合したオリゴヌクレオチドプローブであってもよい（例は、TAQMANプローブ）。
本発明の方法は、各分析対象の存在または不存在を検出するために一以上の試薬またはプローブを使用することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのものまたはプローブ群を、各分対象の存在または不存在を検出するために使用することができる。いくつかの場合には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50のプローブを、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用することができる。若干のケースでは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50より少ないプローブを、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用することができる。いくつかの場合において、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用されるプローブの数は、1-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、1-3、または1-4である。
いくつかのケースにおいて、サンプルは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれよりも多くのプローブと、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために、接触させる。いくつかの場合において、サンプルは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのプローブと、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために、接触させる。いくつかの場合において、サンプルは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないプローブと、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために、接触させる。いくつかの場合において、サンプルは、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために接触させるプローブの数は、4-50、4-40、4-30、4-20、5-15、5-10、または3-10である。
上述したように、フルオロフォアおよびクエンチャーに結合したオリゴヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチド増幅アッセイにおいて分析対象の存在を検出するために使用することができる。クエンチャーとフルオロフォアは近接している限り、クエンチャーは、光源によって励起される際、フルオロフォアによって放出される蛍光を消光する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は分析対象において存在するポリヌクレオチド配列に相補的であり、そして従って分析対象において存在するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なように設計される。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、プライマーを含む核酸増幅反応（例は、ポリメラーゼ連鎖反応）において実行することができる。DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長の際に、ポリメラーゼの5'ないし3'のエキソヌクレアーゼ活性は、プローブを分解し、フルオロフォアおよびクエンチャーが媒体中に放出される。フルオロフォアおよびクエンチャーとの間の近接は壊れ、そしてフルオロフォアからの信号はもはや消光されない。そのため、検出される蛍光の量は、存在する分析対象の量の関数である。分析対象が存在しない場合、プローブは、分析対象にハイブリダイズせず、およびフルオロフォアおよびクエンチャーは近接したまま留まる。ほとんどまたはまったく信号は生成されない。
オリゴヌクレオチドプローブは、プローブごとに一または複数のフルオロフォアおよびクエンチャーを有することができる。たとえば、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのフルオロフォアを備えることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のフルオロフォアを含みうる。オリゴヌクレオチドプローブは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないフルオロフォアを含むことができる。
オリゴヌクレオチドプローブは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのクエンチャーを備えることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のクエンチャーを備えることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないクエンチャーを含むことができる。
プローブに対するプローブおよびクエンチャーの結合は、同じ反応において、または連続反応において実行することができる。一連の反応は、少なくとも一つのフルオロフォアでプローブを標識するために実行することができ、および反応生成物は、異なるフルオロフォアを有するプローブの混合物を生成するために混合することができる。
オリゴヌクレオチドプローブが二以上のフルオロフォアを含む場合、これらのフルオロフォアは、フォスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（FRET）がフルオロフォアの間で起こることを可能にするように配置されてもよい。簡単に説明すると、FRETはフルオロフォア間のエネルギー移動の機構である。FRETベースのプローブを用いることは、一つの励起源が、単一のフルオロフォアの励起によって二つの異なる蛍光発光シグナルを生成することを可能にさせる。たとえば、ここに記載される方法は、対をなすプローブを使用することができ、そこでは、対になった一方のプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーに結合し、および第二のプローブは、二つのフルオロフォア（FRETが起こるのに十分に近接近して）およびクエンチャーに結合する。FRETを提供するフルオロフォアおよびクエンチャーの任意の組合せを使用することができる。このようなアプローチは、単一励起源が二つの信号を生成するために使用することができるので、励起源と共に使用することができる蛍光プローブの数を倍増し、すなわち、一つのフルオロフォアを有するプローブからの一つ、および二つのフルオロフォアがFRETを提供するために十分に近接近して伴われるプローブからの一つである。たとえば、表8に記載のエンコード方法を用いることで、はっきりと検出可能な分析対象の数は、表8に記載の各々のプローブを、対応するFRETプローブとペアにすることによって16から32まで増加させることができた。
プライマーは、特定の分析対象に特異的であってよく、そしてプローブに相補的な領域を増幅することが可能である。若干のケースにおいて、用いられるプライマーの対の数はプローブの数と同等である。他のケースでは、用いるプローブの数は用いるプライマー対の数を超えることがある。さらに他の場合において、使用されるプライマー対の数は、使用されるプローブの数を超えることがある。若干のケースでは、分析されるサンプルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのプライマーのペアに接触させる。いくつかのケースでは、分析されるサンプルは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50よりも多くのプライマーペアに接触させる。いくつかのケースでは、分析されるサンプルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないプライマー対に接触させる。いくつかの場合において、プライマーの対の数は2-10、3-15、4-20、3-10、4-10、5-10、6-8、または6-10である。
プライマーは、ハイブリダイゼーションプローブの異なる数がハイブリダイズするヌクレオチドの領域を増幅することができる。たとえば、プライマーの少なくとも一対は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のハイブリダイゼーションプローブに相補的な領域を増幅することができる。いくつかの場合において、プライマーの前記対のすべてが、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のハイブリダイゼーションプローブと相補的な領域を増幅することができる。
一例において、第一のプローブは、フルオロフォア、5'-フルオレセインアミダイト（5'-FAM）およびクエンチャーブラックホールクエンチャー1（BHQ-1）で標識することができる。第2のプローブは、シアニン5.5（Cy5.5）に近接近して（例は、取り付けられる）5'-FAMおよびクエンチャーブラックホールクエンチャー3（BHQ-3）により標識することができる。プローブの消化により、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を介して、二つの蛍光シグナルは、単一励起波長（例は、470nm）から生成される。第一のプローブからのフルオロフォアは約520nmで蛍光を発する。第二プローブ上のフルオロフォアはFRETを受ける。ドナーフルオロフォア、FAMは、励起光源（例は、470 nm）により励起され、そしてアクセプターフルオロフォア、Cy5.5にそのエネルギーを伝達する。アクセプターフルオロフォアは、約705 nmで発光する。これらのフルオロフォアおよびクエンチャーは単なる例示である。FRETを受けることができる任意のフルオロフォアおよび蛍光を消光することができる任意のクエンチャーは、本発明と共に使用するのに適している。FRETベースのプローブを生産するための方法は、Jothikumar（ジョーシクマー）ら、BioTechniques（バイオテクニック）、2009、46（7）：519-524頁に記載されている。
いくつかの例では、単一のハイブリダイゼーションプローブを、各分析対象のために使用することができる。マルチカラーエンコードを利用するために（例は、表3に示すように）、各プローブは、予め決められた比で複数のフルオロフォアにより標識されることができる。正のコントロール信号が、同じ強度の他の正のコントロール信号と同じ強度を、同じ色において提供するように、比率を決定することができる。このアプローチはプローブの数を減少させ、それは、合成されなければならず、そして複合的プローブを利用する方法よりも展開するのにあまり高価でないようにすることができる。また、ハイブリダイゼーションプローブの場合には、分析対象の配列に一つのハイブリダイゼーションプローブを適合させることは、複合的プローブよりも容易である。
本発明の多くの態様は、核酸に基づくプローブを用いて例示されるが、この技術において通常の技能を有する者は、プローブの他の形態が、この開示において記載された発明と同様に良好に機能することを容易に認識するであろう。たとえば、分析対象に対して特異的な結合分子をプローブとして使用することができる。制限されない模範的な結合分子には、分析対象を認識し、および分析対象の存在下で信号を発生させる抗体が含まれる。
蛍光ラベルを利用する本発明の実施形態では、任意の適切な蛍光ラベルを用いることができる。本発明で使用するのに適した模範的な蛍光ラベルとしては、ローダミン、ロドール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロードル（aminorhodol）、カルボキシロードル、クロロロードル、メチルロードル、スルホロードル、アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、メチルローダミン、およびチオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン2、シアニン3、シアニン3.5、シアニン5、シアニン5.5、シアニン7、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィン、フタロシアニン（phtalocyanine）、およびビリルビンが含まれる。模範的なクエンチャーには、たとえば、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3などのようなブラックホールクエンチャー、たとえば、ATTO 540Q、ATTO580Q、およびATT0612QなどのようなATTOクエンチャー、および同様の他のものが含まれる。
本発明と共に使用することができるフルオロフォアは、ここに記載のフルオロフォアのいずれにも制限されるものではない。たとえば、改善された特性を有するフルオロフォアが絶えず開発されており、そしてこれらのフルオロフォアは、この開示において提供される方法で、容易に使用することができる。そのような改良されたフルオロフォアには、量子ドットが含まれ、それは、単一波長で励起された後、異なる波長でエネルギーを放出することができる。そのようなフルオロフォアを使用することの利点は、単一の励起源だけが必要であることであるが、多くの異なる信号は、たとえば、色および強度の点で定量化することができる。また、狭い発光スペクトルを有するフルオロフォアは、そのようなフルオロフォアがそれらの発光スペクトルの間の最小しか、またはまったくオーバーラップを有さないマルチプレックスアッセイにおいて含めることができ、それによって、はるかに多くの「色」が提供され、およびコード化された分析対象の全体的な数がブーストされるものとして、ここに記載の方法と共に特に有用であった。
若干のケースでは、一以上の試薬が凍結乾燥される。任意の適切な試薬は凍結乾燥されてよい。たとえば、プローブ、プライマー、酵素、抗体、または検出のために使用される任意の他の試薬は、凍結乾燥してもよい。いくつかのケースでは、分析対象を含むサンプルはまた、凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、開発途上地域での試薬および/またはサンプルを配布するときなど、冷蔵へのアクセスが、高価で、容易に入手できない、あるいは確実には利用できない場合、有用である可能性がある。一例では、凍結乾燥された試薬は、この開示において記載される任意のプローブまたは分析対象に特異的な試薬を含み、またはさもなければ本発明と共に使用するのに適している。別の例では、凍結乾燥される試薬はPCRプライマーを含む。さらに別の例では、凍結乾燥される試薬は、PCR反応を行うのに適した試薬を含む。
V．分析技術および器具類
ここにおいて提供される方法は、多様な検出方法と共に使用するのに適する。たとえば、本方法は、蛍光信号の波長および強度を測定する分析技術を用いて適用することができる。これは、波長のスペクトルにわたって信号の強度を測定することによって、または光の一定の波長の通過を制限するバンドパスフィルター（帯域フィルター）を用い、それによって特定の波長の光のみが光検出器に到達することを可能にすることによって達成することができる。多くのリアルタイムPCRおよび定量的PCR装置は、励起光源および帯域フィルターを含み、それは四色での蛍光信号の検出を可能にする（例は、緑、黄、赤、および青）。したがって、本発明の方法は、この技術において広く使用される機器を用いて容易に適用することができる。重要なことには、ここに提供される方法および組成物は、単一溶液での累積測定値を取得することによって複合的分析対象を検出するために使用することができる。分離は必要ない。本発明は、ビーズまたは固相の使用を必要としない。もちろん、当業者は、所望であれば、本発明を、分離、ビーズ、または固相と共に用いることができることを理解するであろう。
図5は、本発明の方法に有用な累積的測定値を得るために使用することができる機器の構成の二つの例を示す。図5を参照すると、双方の波長および強度を検出するように構成された検出器を有する機器（例は、蛍光光度計）が501において示される。501を参照すると、少なくとも一つの励起光源502がチャンバ503中に向けられ、それには、分析対象504の存在下で信号を生成する分析対象および試薬が含まれる。他の箇所に記載したように、分析対象は核酸であってよく、そして信号を発生する試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むハイブリダイゼーションプローブであってもよい。分析対象が存在する場合、発光信号505が生成される。501に示す構成では、この放出信号の波長および強度は、蛍光発光スペクトル506を生成することが可能な検出器によってスペクトルにわたって測定される。
波長および強度はまた、光検出器および帯域フィルターの組合せを用いて決定することができる。この構成は、当該分野で既知のいくつかのサーマルサイクラーにおいて使用される。図5を参照すると、帯域フィルターおよび光検出器を有する装置は、507に示されている。507を参照すると、少なくとも一つの励起光源508はチャンバ509内に向けられ、そこには、分析対象510の存在下で信号を発生させる分析対象および試薬が含まれる。他の場所で説明したように、分析対象は核酸であってよく、信号を発生する試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むハイブリダイゼーションプローブであってもよい。分析対象が存在する場合、発光信号511が生成される。507において示す構成では、帯域フィルター512、513、および514が、波長の一定範囲内の光に光の通過を制限するために使用される。たとえば、帯域フィルター512は、光の通過を波長範囲1内の光へ制限することができる。帯域フィルター513は、光の通過を波長範囲2内の光へ制限することができる。帯域フィルター514は、光の通過を波長範囲3内の光へ制限することができる。帯域フィルターの任意の数（例は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれよりも多く）を、本発明とともに使用することができる。加えてまた、507において帯域フィルターの位置は制限されることは意図しない。いくつかのケースでは、放射された光はいつでも一よりも多くの帯域フィルターを通過させることができる。他の場合には、帯域フィルターは、すべての光が、1回に一つだけの帯域フィルターを通過するように構成されてもよい。帯域フィルターを通過した後、フィルター処理された光515、516、および517は光検出器によって検出される。たとえば、フィルタリングされた光515は、波長範囲1内の光であってもよく、フィルタリングされた光516は、波長範囲2内の光であってよく、およびフィルタリングされた光517は、波長範囲3内の光であってもよい。フィルタリングされた光515、516、および517の各々の強度は、次いで、光検出器518によって定量することができる。
本開示に記載される方法は、多種多様な増幅方法に適合し、それには、定量的PCR（qPCR）法、エンドポイントPCR法、逆転写酵素PCR、およびデジタルPCR法が含まれる。デジタルPCR法〔例は、DROPLET（液滴）DIGITAL（BIORAD）およびDYNAMIC ARRAY（動的アレイ）（FLUIDIGM）〕は、ポリヌクレオチドのコピー数の高感度の定量化を生み出す。ここで提供される方法は、小滴または動的アレイにおいて多重化を可能にすることによって、それらのスループット（処理能力）を有意に拡大するために、これらのシステムに容易に統合することができる。
同様に、本開示において記載される方法は、リアルタイムPCRアッセイにおいて適用されてもよい。たとえば、PCRが完了するまで実行されると、リアルタイムデータは完全に記録することができる。次いでエンドポイントの値は、分析対象の存在または不存在を示すためにデコードされてもよい。個別のサイクル閾（CT）値は、各色についてその色のリアルタイム曲線の二次導関数の最大値を検出することによって分析することができる。特定の分析対象が増幅されるように、フルオロフォアは、その配列のコードにおいて色の多重度と同じ比率でその対応するプローブから放出される。そのため、例として、1100のコードは、青および緑において同じCtを有することになるが、その一方、1400のコードは、その緑のCtが2サイクルだけ青のCtの前にあるようになる。この追加データは、同一性の決定および各分析対象の出発量を可能にする。
ここに記載する方法はまた、組織試料において直接使用することができる。たとえば、組織試料は得られ、そしてフォトリソグラフィ法は、組織試料上に直接ウェルを構築するために使用することができる。組織試料はウェルを構築する前に固定してもよい。組織試料は、次に、組織試料においてウェル中に適切な試薬を分注することによって分析することができる。この開示で説明するエンコードおよびデコード方法は、組織中にエッチングされたウェル内での分析対象の多重化検出のために使用されうる。各ウェルは、単一細胞または少数の細胞に対応することができ、分析対象のための組織の異なる部分を分析する際に、優れた空間分解能が提供される。この方法は、同じ組織の異なる領域において分析対象を検出するために使用されうる。
いくつかのケースでは、機器は、たとえば、追加の励起光源を、複数の波長で提供するために、および/または追加の帯域フィルターまたは完全なスペクトルを決定する能力を提供するために、修飾され、または構築することができる。追加の励起源を含むことは、フルオロフォアのより一層多様な励起を可能にするであろう。付加的な帯域フィルターを含めること、または全体のスペクトルを決定することができる器具を修飾または構築することは、フルオロフォアからの放出のより一層広く多様な検出を可能にする。これらの技術は、この開示において説明する方法と共に使用することができるフルオロフォアの数を増加させるために、そして、従って、同時に検出される分析対象の数を増加させるために使用することができる。
若干のケースでは、この開示に記載される方法はエンドポイントPCR法を利用する。しかし、いくつかのケースにおいては、結果はエンドポイントの前に得ることができる。このことは、たとえば、結果ができるだけ早く必要なとき、有利でありうる。たとえば、ある場合には、較正実験が実行され、そこでは、分析対象の異なる出発濃度は、分析対象の出発量の関数として、信号が飽和となるサイクル数を決定するために分析される。このデータを使用して、リアルタイムにおいてPCR反応を監視するコンピュータは、特定のシステムの検出限界（LOD）に応じて、最大サイクル数まで飽和度（saturation、彩度）を検索するようにプログラムすることができる。分析対象の増幅が存在しない場合（例えば、存在するなら、陽性コントロール以外）、最大サイクル数によって、その分析対象のための結果が否定的である。最大サイクル数による分析対象の増幅がある場合、その分析対象のための結果が正であり、各色において飽和強度は、コード体系を使用して結果をデコードするために使用することができる。双方の場合において、その機器のためのLODによって設定されたサイクルの数を超えてPCR反応を実行する必要はないであろう。PCRは、この定量的な方法を説明するために使用されてきたが、この技術での通常の熟練者によって、同様の原理が任意の触媒系において適用されることができ、そこでは、分析対象の出発量は反応速度を制限し、そして反応速度を測定し、そして信号強度において経時的な進展によって報告されることができることを容易に認識されるであろう。
VI．組成物およびキット
この開示はまた、ここに記載する方法と共に使用するための組成物およびキットを提供する。組成物は、ここに記載される任意成分、反応混合物および/または中間体、ならびに任意の組合せを含むことができる。たとえば、本開示は、ここで提供される方法と共に使用するための検出試薬を提供する。本明細書の他の箇所に記載されるように、任意の好適な検出試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識されたハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを含めて提供することができる。
いくつかの場合において、組成物は、四つのフルオロフォアを使用して少なくとも七つの分析対象の検出のための試薬を含む。いくつかの場合において、組成物は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50の分析対象を四つのフルオロフォアを使用して検出するための試薬を含む。いくつかの場合において、組成物は、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象を、五つのフルオロフォアを使用して検出するための試薬を含む。いくつかの場合では、組成物は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象を、六つのフルオロフォアを使用して検出するための試薬を含む。いくつかの場合において、組成物は、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象を、七つのフルオロフォアを使用して検出するための試薬を含む。
いくつかのケースでは、組成物はプライマーを含む。組成物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のプライマーの対を含むことができる。
本発明はまた、本発明の方法を遂行するためのキットを提供する。したがって、多様なキットは適切な包装で提供される。キットは、ここに記載の用途の任意の一以上に使用することができ、およびそれに応じて、複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するための説明（指示）書を含むことができる。キットは、累積測定値を複数の分析対象のそれぞれの存在または不存在を示す結果に変換する際にユーザを支援するために、コード体系、またはデコードマトリクスを含んでもよい。キットは、診断キットは、たとえば、ここに規定する分析対象を含め、任意の分析対象の検出に適した診断キットであってもよい。キットは、上記に規定のものを含め、この開示において提供される組成物の任意のものを含むことができる。
図6は、本発明の模範的なキットの概略図を示す。図6を参照して、キット本体601を含むキットを示し、それは、分析対象の検出のための試薬（例は、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むポリヌクレオチドプローブ）602および核酸の増幅のためのプライマー603を含む。キットはまた、たとえば、増幅反応を実行するのに適した試薬604などのような任意の他の試薬をむことができる。601に示される実施形態では、分析対象の検出のための試薬およびプライマーは、それぞれ、単一ボリュームにおいて含まれる（例は、チューブまたはボトル）。しかし、これらの試薬はまた、605に示されるキット本体で描かれるように、別のボリュームで提供されてもよい。キット本体605は、七つの別々のボリュームを含む。三つのボリューム（606、607、および608）は、分析対象の検出のための試薬（またはそのような試薬の混合物）が含まれ、および三つのボリューム（609、610、および611）は、プライマー（またはプライマーの混合物）を含む。キットはまた、増幅反応を実行するのに適した試薬604を含むことができる。
図6は例示の目的のみに提供される。分析対象の検出のための試薬（例は、プローブ）の任意の数および任意の数のプライマーは、適用に応じて、単一のチューブまたはボトル（瓶）に含まれていてもよい。たとえば、いくつかの実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの、分析対象の検出のための試薬は、単一のボトル内に含まれてもよい。他の場合には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くの、増幅のためのプライマーは、単一のボトルまたはチューブに含まれていてよい。いくつかの場合において、プライマーおよびプローブは、同じ瓶またはチューブで提供されてもよい。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのプローブは、プライマーの対ごとに提供されてもよい。他の場合には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのプライマーは、プローブ対ごとに設けられてもよい。キットは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれよりも多くのボトルまたはチューブを含んでいてもよい。コントロール分析対象、およびそれらに関連する検出試薬およびプライマーはまた、キットに含まれることができる。これらは、別のボトルまたはチューブに含まれてもよく、またはたとえば、増幅反応604のために試薬を提供するボトルまたはチューブ内に含まれる。本明細書の他の箇所で説明したように、キットでは任意の試薬が凍結乾燥されることができる。
VII．システムおよびソフトウェア
この開示の方法はまた、システムの一部として実行されてもよい。たとえば、本明細書に記載の方法の一以上のステップは、コンピュータ可読媒体に含まれるソフトウェアによって実行することができる。ソフトウェアは、分析対象をエンコードし、縮重をチェックし、縮重を減少または排除し、および/またはデコードマトリクスを生成するために使用されうる。ソフトウェアはまた、機器（例は、PCR機械）上で行われた累積測定値を分析対象の存在または不存在に関する情報に変換するために使用されうる。たとえば、図4を参照して、コンピュータ401は、入力装置403、ディスプレイ402、およびプリンタ404に接続することができる。このコンピュータは、この開示に記載される方法の任意のステップの一以上、たとえば、エンコード方法410、分析方法420、およびデコード方法430を含めて実行することができる。コンピュータは、たとえば、エンコード方法410の一部として、縮重を減少または排除することができる。同様に、コンピュータは、コード体系を生成することができ、それはたとえば、数学的反復を用いる設計によって非縮退である。コンピュータはまた、ネットワーク405に接続することができる。ネットワークは、ローカルネットワークおよび/またはインターネットであってよい。ネットワークは、異なる場所において複数のコンピュータ上で本発明の方法を実行するために使用することができる。たとえば、あるコンピュータはエンコードを実行することができ、別のコンピュータは測定を実行することができ、さらに別のコンピュータはデコードを実行することができる。コンピュータはこれらの方法のいずれかまたはすべてを実行することができる。ネットワークは、たとえば、国境を越えて、世界全体的に、本開示で記載した方法を用いて得られた情報を送信するために使用することができる。
一例では、ソフトウェアは、たとえば、サーマルサイクラーのような測定を行う機器に埋め込まれる。別の例では、ソフトウェアは、測定を行う器具に取り付けられたコンピュータ、たとえば、サーマルサイクラーに接続されたコンピュータのようなものにインストールされる。別の例では、ソフトウェアは「クラウド」、すなわち、コンピュータ上で、別のコンピュータがネットワークを介して通信するものにおいて存在する。
上記の各々の構成要素は、各々の要素と通信し、そしてそれらの動作を調整するコントローラに接続されてもよい。たとえば、コントローラは、一連の分析対象の色および強度の値へのエンコードを開始することができる。この開示全体にわたって説明したように、コントローラは、エンコードマトリクスから一以上の潜在的な分析対象コードを除去することによって縮重を減少または排除するためにソフトウェアを実行することができる。次いで、コントローラは自動的にプローブの製造業者からのこのコードに対応するプローブを命ずることができる。代替的に、コントローラは、適当なプローブを合成することができるオリゴヌクレオチド合成機器を操作することができる。機器上での試料の分析後（それはまた、自動化することができ）、コントローラは、デコードマトリクスを用いて分析した結果を処理することができる。次いで、コントローラは、ユーザにこれらの結果を提供することができる。
VIII．サービス
ここに提供される方法はまた、サービスとして実行されてもよい。たとえば、サービスプロバイダー（サービス提供者）は、顧客が分析されるのを希望する複数の分析対象の識別情報を取得することができる。サービスプロバイダーは、ここに記載する方法のいずれかによって検出されるべき各分析対象をエンコードし、そしてアッセイのために顧客に適切な試薬を提供することができる。顧客は、アッセイを実行し、そしてデコードのためにサービスプロバイダーに結果を提供することができる。次いで、サービスプロバイダーは顧客にデコード結果を提供することができる。また、顧客は、ローカルに（顧客の場所で）、またはリモートで（例は、ネットワークを介して到達可能なサーバ上）インストールされるソフトウェアと相互作用することにより、分析対象をエンコードし、プローブを生成させ、および/または結果をデコードすることができる。模範的な顧客には、臨床検査研究所、医師、食物および消費者製品の製造者、工業製品製造業者（例は、石油会社）および同様の他の者などが挙げられる。顧客または関係者（パーティ）は、本発明の方法、システム、組成物、およびキットを使用ために必要性または要望を有する任意の適切な顧客または関係者であってもよい。
例
例1：一般的材料および方法
1．一般試薬
TEバッファー、pH7〔LIFE TECHNOLOGIES（ライフテクノロジーズ社）、Carlsbad（カールスバッド）、CA（カリフォルニア州）；UltraPure RNAse-free Water（超高純度RNAseフリー水）（ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州）；Taq 5x Master Mix（マスターミックス）〔FISHER SCIENTIFIC COMPANY（フィッシャー・サイエンティフィック社）、Tustin（タスティン）、カリフォルニア州〕。
2．DNA配列、プライマー、およびプローブ
臨床的に適切な生物から五つの核酸を、模範的な研究のために選定した：（1）ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）；（2）熱帯熱マラリア原虫（マラリア）；（3）単純ヘルペスウイルス-2（HSV-2）；（4）結核菌（TB）；（5）およびデング熱ウイルス3型（デング熱）。
HIV-1ゲノム、p17およびポリプロテアーゼからの診断的に適切な二つの領域を、Los Alamos National Laboratory（ロスアラモス国立研究所）のHIV-1参照配列から選定した。熱帯熱マラリア原虫ChR 7遺伝子からの診断上の配列を、UCSC熱帯熱マラリア原虫Genome Browser（ゲノムブラウザ）から取得した。Herpes Simplex Virus-2（単純ヘルペスウイルス-2）の配列は、the European Molecular Biology Library（欧州分子生物学ライブラリ）から得られる配列から合成した。同様に、結核菌におけるrpoB遺伝子のための診断上の配列を、欧州分子生物学ライブラリから得られる配列から合成した。Dengue Virus Type 3（デング熱ウイルス3型）のためのPCR診断上の配列を、National Institute of Health genetic sequence database（国立衛生研究所遺伝子配列データベース）から入手した。
オリゴヌクレオチドは、INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES（インテグレーテッド・DNAテクノロジーズ）(IDT)によって合成された。プローブおよびプライマー対は、OLIGOANALYZER（オリゴアナライザー）、IDTからのものを使用して、各分析対象のために選定した。5'端のフルオロフォアおよび3'端のクエンチャーを含むセンスプローブは、すべての分析対象のために合成した。すべてのオリゴヌクレオチドを、凍結乾燥し、そして使用前にTE緩衝液において再構成した。表9-14は、六分析物のそれぞれについて、配列情報、標的配列、プライマー、およびプローブを示す。
3．ポリメラーゼ連鎖反応
すべてのPCR反応は、ROCHE 480 LIGHTCYCLER（ロッシュ480ライトサイクラー）機器において行った。四十五回の熱サイクルは、95℃で60秒、ホットスタートにより実行した。変性、アニーリング、および伸長のためのサイクル条件は、それぞれ、95°C、65°C、70°Cで45秒、50秒、60秒であった。各実験は、15μlの反応容量を用い、5重で実行した。蛍光測定は、あらゆるアニーリング工程の後に次のチャネルにおいて取得した：483nm ないし533nm（FAM）、523nmないし568nm（Cy3）、558nmないし610nm（ROX）、615nmないし670nm（Cy5）。蛍光測定はまた、ホットスタート、45熱サイクルの終了後に得られた。これら二つの測定（ホットスタートの後および45サイクルの終了時）の間の蛍光強度における変化は、エンドポイント蛍光シグナルを決定した。
例2：分析対象あたり一よりも多くの色を用いエンコード方法に基づき病原体からのポリヌクレオチドマーカーの同時検出
この例は、HIV（2ポリヌクレオチド）、HSV-2、マイコバクテリウム、プラスモジウム、およびデングウイルスから選定された最大で四つのポリヌクレオチドの同時検出を説明する。十四PCR反応は、表15に記載する試薬を用いて組み立てた。
表15を参照し、反応1、3、5、7、および9（それぞれ、HIVポリプロテアーゼ、プラスモジウム、HSV、マイコバクテリウム、およびデングの分析対象を含む）は、他の分析対象の不存在下で、各ポリヌクレオチド分析対象単独についてのベースラインの蛍光強度を提供する陽性コントロールであった。各色での蛍光強度における変化は、以下でより一層詳細に説明するように、クロマトグラムでの各色についての予測された累積強度レベルを提供するために使用した（図3）。反応2、4、6、8、および10は非特異的増幅の程度を決定するために使用する陰性コントロールであった。これらの反応において、提供されるプライマーは提供される分析対象に特異的ではなかった。
実験11、12、13、および14は多重検出実験であった。表16に示すようにエンコードを行った。各アッセイについて測定された蛍光強度を、各色において、図3のクロマトグラムにおいて黒丸としてプロットした。
クロマトグラムを構築するために、陽性コントロールのシグナル（反応1、3、5、
7、および9）を、各色において、本配列のあらゆる可能な組合せを構築するために使用した。累積シグナルを図にプロットし、「クロマトグラム」と称した（図3）。同じ色での同じランクのすべての可能な組合せに対応する累積シグナルを、それらの独自「バンド」に組織化した。すべての四つの色のためにこれを行うことは、各組合せの実験結果（反応11、12、13、および14）を評価することができるのに対して、レベルおよびバンド構造を作り出した。図3は、陽性コントロールサンプルを、クロマトグラムに重ね合わせた実験結果4112、3121、および3102と共に使用して構築するクロマトグラムの三回の反復を示す。実験結果は黒丸で示されている。
反応11-14での各色についての強度値は、任意の蛍光単位（AFU）においての尺度であり、そのクロマトグラム上にプロットし、そして2つの基準に基づいてバンドに割り当てた。まず、実験の結果がバンド内であった場合、それにより、その結果をバンドの多様性に割り当てた（例は、図3の一番左のクロマトグラムにおいて1のCy3値）。第二に、実験結果が二つのバンドの間であった場合、二段階分析を採用した。実験結果が二つの正当な結果の間であった場合、実験結果を最も近いバンドに割り当てた。（例は、図3の右端のクロマトグラムの2のCy5値）。実験結果が正当な結果および非正統な結果の間であった場合、結果を正当結果と共にバンドに割り当てた（例は、図3の中央のクロマトグラムにおける3のFAM値）。図8は、HIVポリプロテアーゼ、プラスモジウム、単純ヘルペス、およびマイコバクテリウムの存在を示す4112（上部）の正当結果および4110（下部）の非正統結果を示し、それはデコードされることができず、そしてアッセイで機能不良を示す。
これらの基準を使用して、実験12の出力が4112に指定され、それは正しい答えであった。実験14の出力は、2121または3121に指定されることもできたが、2121は非正統であり、そのため、結果は3121でなければならず、それが正しい答えである。実験13の出力は、3102または3101として指定することができ、それらの双方が正当であるが、結果はCy5チャネルにおいて1よりも2に近いことが明らかで、そのため、3102は、正しい答えで、結果として指定した。これらの結果は、ここに提供する方法の実験的検証を提供する。
これらの結果は、ポジティブコントロール信号の単純な和から予想される複合信号よりもわずかに低い複合信号の傾向を示す。これは信号の組合せが完全に線形ではないからかもしれない。これは追加の効果の結果でありえ、それに対してクロマトグラムの構築は現時点では考慮しない。これらの効果は、クエンチャーの絶対濃度に関連しうる。クエンチャーの絶対濃度が高いほど、それらがクエンチする反応容量の割合が大きく、その結果、放出されるフルオロフォアの同じ割合が累積信号に期待されるだけ貢献することができない。この問題に対する一つの解決策は、どのくらいのクエンチャーの放出されるかに関係なく、信号中のパーセンタイル値損失が無視できるようにプローブの低濃度を使用することである。
図3は、複合的組合せを含む各ランクが比較的広いバンドを有することを示す。バンドの幅は、最終的に、陽性コントロールサンプルについての最高および最低累積信号の間の差である。特定の色でのすべての陽性コントロールが正確に同じ蛍光信号を生成した場合、各バンドの幅はゼロであろう。代わりに、それらの信号が多少異なるため、結果として得られるバンドは比較的広い。しかし、バンドをタイトにするための簡単な手段が存在する。同じ濃度ですべてのプローブをロードする代わりに、上記の実験のために行ったように、各プローブの濃度を、結果として得られる陽性コントロール信号の各々が同じ色での他のものと同じであるように調整することができる。このアプローチは、著しくバンドをタイトにし、それが分析対象を含む試料のための信号の多重度の決定をより一層簡単にする。
例3：一つの色を分析対象毎に用いるエンコード方法および異なる強度に基づく病原体からのポリヌクレオチドマーカーの同時検出
この例は、デングウイルス、HIVp17、およびHIVポリプロテアーゼから選定する最大三つのポリヌクレオチドの同時検出を説明する。コード体系は表11に示すようなものであった。表17に示すように、各分析対象を単一色での蛍光強度の単一値としてエンコードした。このケースでは、この本開示の別の場所で説明したように、コード体系は設計によって非縮重である。これは、各分析対象に強度値を割り当てることによって達成され、それは前の分析対象の累積強度値に一を加えたものに等しい。もちろん、本明細書の他の箇所に記載されるように、たとえば、ノイズにわたってより一層良好に区別するために、初期割り当て値は1よりも大きくすることができる。同様に、各分析対象に割り当てられる値は、たとえば、これらの強度間の分離を高め、そして強度のより一層単純な割り当てを可能にするために、前の分析対象プラス1についての累積強度値よりも大きくすることができる。
例2で用いたのと同じ試薬（例は、テンプレート、プライマー、およびプローブ）をここで使用した。陽性コントロールエンドポイントPCR反応におけるそれぞれのプローブによって生成される蛍光信号を測定し、1x（倍）、2倍、および4倍の信号強度を生成するであろうプローブ濃度を計算するのに用いた。次いで、実験を、分析対象の発生の七つのノンヌル組合せ（non-null combinations）を検出するように設定した。表18-24は、これらの混合物の各々について、PCR反応成分を提供する。
各実験の総蛍光信号は、クロマトグラム上にプロットし（図7）、それを上記のように構成した。各陽性コントロール測定の周りのバンドの幅は1X測定の伝播不確実性（propagated uncertainty）である。その不確実性は、飽和での最後の五つのPCRサイクルの蛍光信号の標準偏差に等しかった。
図7はこの実験の結果を示す。三つの一番右の結果は、デングウイルス単独（DEN）、HIV p17単独（P17）、およびHIVポリプロテアーゼ（TPP）について測定された強度を示す。これらの分析対象の各々に割り当てられた強度は、表11に示すようであり、そして図7は三つの分析対象について単独のとき予想される強度の結果が得られたことを確認する（DEN、P17、およびTPP）。アッセイの終了時に、本質的にすべてのプローブは加水分解され、本質的にすべてのフルオロフォアを解放し、それが信号を発する。フルオロフォアの固定量は、信号の一定の予測可能な量を生成する。それ故、存在するターゲットは、通常、信号の一定量を、反応容量に添加されるプローブの量によって決定されるように生成する必要がある。
期待されるように、分析対象の組合せに対する強度値は、割り当てられた強度の和と同等である。このコード体系は、非縮重であるように設計されているので、各結果は特定の分析対象の存在または不存在中にはっきりとデコードすることができる。たとえば、図7の左側から始まり、7の結果はすべての三つの分析対象の存在を示す。3の結果は、デングウイルスおよびHIV p17分析対象の存在、およびHIVポリプロテアーゼの不存在を示す。5の結果は、デングウイルスおよびHIVポリプロテアーゼの存在、およびHIV p17の不存在を示す。最後に6の結果は、HIV p17およびHIVポリプロテアーゼの存在、およびデングウイルスの不存在を示す。この開示の別の場所で説明したように、このコード体系は追加的分析対象をエンコード化するために拡張することができる。

Claims (61)

  1. 少なくとも7つの分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一試料容量において、固定化、分離、質量分析、または融解曲線解析なしに、非縮重により検出することが可能であり、
    前記分析対象の各々は信号の一成分の値としてエンコードされ、それによりコード体系が生成され、
    Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重により検出することが可能であり、そこでは、M=log2(F+1)であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは前記信号の前記一成分の最大累積値であり、
    a．前記分析対象の各々を前記信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、
    b．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、
    c．前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、
    d．前記試料の範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めることを含む、方法。
  2. 前記分析対象の各々は、前記信号の第一の成分において少なくとも一つの第一の値および前記信号の第二の成分において少なくとも一つの第二の値としてエンコードされる、請求項1の方法。
  3. 前記分析対象の各々は、前記信号の第二の成分における複数の第二の値の各々にて前記信号の第一の成分における第一の値としてエンコードされる、請求項２の方法。
  4. 前記方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重により検出することが可能であり、そこでは、M=C*log2(F+1)であり、式中、Cは前記分析対象をエンコードするのに用いられる前記第二の値の数であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、前記信号の前記第一の成分の最大累積値である、請求項２の方法。
  5. 前記方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重により検出することが可能であり、そこでは、M=(P*T)+1であり、式中、Pは前記コード体系において段階あたりのコード数であり、およびTは段階の数である、請求項２の方法。
  6. 段階の数T=log4(F+1)であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、前記信号の前記第一の成分の最大累積値である、請求項５の方法。
  7. 前記第一の値は強度または強度群の範囲である、請求項２の方法。
  8. 前記コード体系には、少なくとも三つの強度または強度群の範囲群が含まれる、請求項７の方法。
  9. 前記第二の値は波長または波長群の範囲である、請求項２の方法。
  10. 前記コード体系には、少なくとも五つの波長または波長群の範囲群が含まれる、請求項９の方法。
  11. 前記信号は電磁信号である、請求項1の方法。
  12. 前記電磁信号は蛍光発光信号である、請求項11の方法。
  13. 前記蛍光発光信号の強度は、少なくとも四つの波長または波長群の範囲群で測定される、請求項12の方法。
  14. 前記検出することは使用前に凍結乾燥される試薬を用いて行われる、請求項1の方法。
  15. 前記検出することは、ハイブリダイゼーションプローブが含まれる試薬を用いて行われる、請求項1の方法。
  16. 前記ハイブリダイゼーションプローブの数は前記分析対象の数よりも多い、請求項15の方法。
  17. 前記ハイブリダイゼーションプローブには、異なる分析対象群に対して特異的な一以上のハイブリダイゼーションプローブが含まれ、および同一のフルオロフォアまたはフルオロフォア群の組合せが含まれる、請求項15の方法。
  18. 前記試薬にはさらに、前記ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも三つに対して相補的な領域を増幅することが可能なプライマーの少なくとも一対が含まれる、請求項15の方法。
  19. 前記信号はポリメラーゼ連鎖反応の間に生成される、請求項18の方法。
  20. 前記ポリメラーゼ連鎖反応は、エンドポイントポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、およびデジタルポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選ばれる、請求項19の方法。
  21. 前記試料の範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することは溶液で実行される、請求項1の方法。
  22. 前記分析対象の少なくとも一つは、前記信号の少なくとも一つの追加の成分からの値、その他の信号の少なくとも一つの成分からの値、またはそれらの組合せによりエンコードされる、請求項1の方法。
  23. 前記少なくとも一つの追加の値は、蛍光発光強度、蛍光発光波長、フォースター共鳴エネルギー移動（FRET）発光強度、FRET発光波長、電気化学的シグナル、化学ルミネセンス波長、化学ルミネセンス強度、蛍光漂白率、化学ルミネセンス漂白率、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項22の方法。
  24. さらに、クロマトグラムを構築することが含まれる、請求項2の方法。
  25. 前記クロマトグラムは、陽性コントロール試料について、前記第一の値および前記第二の値のすべての潜在的組合せをプロットすることによって構築される、請求項24の方法。
  26. 前記分析対象の少なくとも一つには、ポリヌクレオチドが含まれる、請求項1の方法。
  27. 前記ポリヌクレオチドは、動物、植物、細菌、真菌、寄生体、およびウイルスからなる群より選ばれる供給源からのものである、請求項26の方法。
  28. 前記ポリヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、プラスモジウム、マイコバクテリウム、デングウイルス、肝炎ウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群より選ばれる供給源からのものである、請求項26の方法。
  29. 前記ポリヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルスポリプロテアーゼ、ヒト免疫不全ウイルスp17、ヒトパピローマウイルスE6、およびヒトパピローマウイルスE7からなる群より選ばれる、請求項28の方法。
  30. 前記試料は、臨床サンプル、食物サンプル、環境サンプル、製薬サンプル、および消費者製品からのサンプルからなる群より選ばれる、請求項1の方法。
  31. さらに、コンピュータネットワークにより前記分析対象の存在または不存在に関する情報を提供することが含まれる、請求項1の方法。
  32. さらに、医師に対して前記分析対象の存在または不存在に関する情報を提供することが含まれる、請求項1の方法。
  33. 前記方法の少なくとも一つのステップはコンピュータ可読媒体上の命令を用いて実行される、請求項1の方法。
  34. 前記命令はリモートサーバ上に位置する、請求項33の方法。
  35. 前記命令はサーマルサイクラー上に位置する、請求項33の方法。
  36. 前記命令はサーマルサイクラーに連通するコンピュータ上に位置する、請求項33の方法。
  37. 前記分析対象の少なくとも一つは陽性コントロール分析対象である、請求項1の方法。
  38. 前記コード体系は非縮重である、請求項1の方法。
  39. 前記コード体系は非縮重であるように設計される、請求項38の方法。
  40. 前記コード体系は、前記コード体系から得ることができるあらゆる正当結果を列挙すること、縮重される各正当結果を識別すること、および縮重を排除するために前記コード体系から少なくとも一つの潜在的分析対象コードを排除することによって非縮重を行う、請求項38の方法。
  41. 前記方法はエンドポイントアッセイである、請求項1の方法。
  42. 前記方法は機器の検出限界によって設定されるサイクルの閾値数で終了される、請求項1の方法。
  43. 前記方法は液相アッセイである、請求項1の方法。
  44. 前記方法は定量的アッセイである、請求項1の方法。
  45. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法であって、
    a．前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、
    b．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、
    c．前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、
    d．前記試料の範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること
    を含み、さらに、
    少なくとも7つの分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一試料容量において、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析なしに、非縮重により検出することが可能である、方法。
  46. 前記方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重で検出可能であり、そこでは、M=log2(F+1)であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは前記第一の値の最大累積値である、請求項45の方法。
  47. 前記第一の値は強度または強度群の範囲である、請求項45の方法。
  48. 前記第一の値は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも8、少なくとも16、少なくとも32、および少なくとも64からなる群より選ばれる前記コード体系において最小値を有する、請求項45の方法。
  49. 前記第一の値は、前記コード体系において前記先行する第一の値プラス1の累積最大値に等しい量だけインクリメントされる、請求項45の方法。
  50. 前記第一の値は、前記コード体系において前記先行する第一の値プラス1の累積最大値よりも多くの量だけインクリメントされる、請求項45の方法。
  51. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法であって、
    a．前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、
    b．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、
    c．前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの前記第二の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、
    d．前記試料の範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること
    を含み、
    縮重が排除されるとき、前記方法は、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないときに、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析なしに、非縮重で検出することが可能である、方法。
  52. 前記分析対象の各々は、前記信号の第二の成分における複数の第二の値の各々にて、前記信号の第一の成分における第一の値としてエンコードされる、請求項51の方法。
  53. 縮重が排除されるとき、前記方法は、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一容量において、四つの第二の値を用いて非縮重により検出することが可能である、請求項51の方法。
  54. 縮重が排除されるとき、前記コード体系にはT非縮重段階が含まれ、そこでは、T=log4(F+1)であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、前記信号の前記第一の成分の最大累積値である、請求項51の方法。
  55. 縮重が排除されるとき、前記方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重により検出することが可能であり、そこでは、M=(P*T)+1であり、およびPは段階あたりのコード数である、請求項52の方法。
  56. 縮重が排除されるとき、前記方法は、Mの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重により検出することが可能であり、そこでは、M=C*log2(F+1)であり、Cは前記コード体系において第二の値の数であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは任意の第二の値について、前記信号の前記第一の成分の最大累積値である、請求項51の方法。
  57. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのシステムであって、
    a．前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、
    b．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、
    c．前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、
    d．前記試料の範囲内で前記信号の前記第一の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること
    を含み、さらに、
    少なくとも7つの分析対象の各々の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せで、単一試料容量において、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析なしに、非縮重により検出することが可能である、システム。
  58. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するためのシステムであって、
    a．前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、
    b．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料を提供すること、
    c．前記試料を分析対象に特異的な試薬と接触させることであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記少なくとも一つの第一の値および前記少なくとも一つの第二の値を、前記コード体系において表されるように生じさせること、
    d．前記試料の範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定することであり、それによって累積測定値が提供されること、および
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること
    を含み、
    縮重が排除されるとき、前記システムは、少なくとも六つの分析対象の各々の存在または不存在を、前記試薬の各々が一つの第二の値しか生成しないときに、単一容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析なしに、非縮重で検出することが可能である、システム。
  59. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法であって、
    a．前記分析対象の各々の識別情報をパーティから取得すること、
    b．前記分析対象の各々を信号の第一の値としてエンコードすることであり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記第一の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を排除する形で実行されること、
    c．分析対象に特異的な試薬を前記パーティに提供することであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値が前記コード体系において表されるように生じることであり、前記パーティは、
    i．前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料と前記試薬とが接触され、および
    ii．前記試料の範囲内で前記第一の値を累積的に測定し、それによって累積測定値が提供され、および
    d．前記累積測定値を前記パーティから得ること、
    e．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること、および
    f．前記分析対象の各々の存在または不存在についての情報を前記パーティに提供することを含み、
    前記複数の分析対象は、少なくとも６つの分析対象を含み、且つ、前記ｅ．にて、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析を行うことなく、前記分析対象の存否を定める、方法。
  60. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出する方法であって、
    ａ．前記分析対象の各々の識別情報をパーティから取得すること、
    ｂ．前記分析対象の各々を少なくとも一つの第一の値および少なくとも一つの第二の値としてエンコードすることであり、そこでは、前記第一の値は信号の第一の成分からの値であり、および前記第二の値は前記信号の第二の成分からの値であり、それによってコード体系が生成され、そこでは、前記分析対象の各々は前記コード体系において前記少なくとも一つの第一の値および前記少なくとも一つの第二の値によって表され、そこでは、前記エンコードは縮重を低減または排除する形で実行されること、
    ｃ．分析対象に特異的な試薬を前記パーティに提供することであり、それで、前記分析対象の各々が存在するとき、前記第一の値が前記コード体系において表されるように生じることであり、前記パーティは、
    （i）前記分析対象の少なくとも一つを含むか、または含むかもしれない試料と前記試薬とが接触され、および
    （ii）前記試料の範囲内で前記第一の値および前記第二の値を累積的に測定し、それによって累積測定値が提供され、および
    ｄ．前記累積測定値を前記パーティから得ること、
    ｅ．前記分析対象の各々が存在するか、または不存在かどうかを前記累積測定値および前記コード体系に基づいて定めること、および
    ｆ．前記分析対象の各々の存在または不存在についての情報を前記パーティに提供すること
    を含み、
    前記複数の分析対象は、少なくとも６つの分析対象を含み、且つ、前記ｅ．にて、前記分析対象の固定化、前記分析対象の物理的な分離、または質量分析を行うことなく、前記分析対象の存否を定める、方法。
  61. 複数の分析対象の各分析対象の存在または不存在を検出するための組成物であって、分析対象特異的試薬が含まれ、各試薬は第一の値が含まれる信号を生成し、そこでは、前記試薬は、少なくとも七つの分析対象の各々の存在または不存在を、単一試料容量で、存在または不存在の任意の組合せにおいて、固定化、分離、または融解曲線解析なしに、非縮重で検出することが可能であり、 前記分析対象の各々は信号の一成分の値としてエンコードされ、前記試薬は、単一試料容量におけるMの分析対象の存在または不存在を、存在または不存在の任意の組合せにおいて、非縮重で検出することが可能であり、そこでは、M=log2(F+1)であり、および前記分析対象のすべてが存在するとき、Fは前記信号の前記一成分の最大累積値である、
    組成物。
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