CN112041460A - 用于胎儿核酸分析的分子靶标 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了用于评估核酸大小分布和遗传异常的方法和组合物。所公开的方法可用于确定样品中核酸的大小分布,例如血浆样品中的胎儿级分。所公开的方法可用于鉴定或检测来自受试者的遗传异常,例如胎儿非整倍性(例如,21三体)。
Description
交叉引用
本申请要求2018年2月28日提交的美国临时专利申请号62/636,632的权益,该临时申请通过引用全文并入本文。
背景技术
数字PCR(dPCR)是用于检测和定量核酸靶标的有用方法。使用标记的寡核苷酸探针能够对分区(例如,微滴、微孔)中存在的靶标进行特异性检测。dPCR可用于多种核酸检测方法。
发明内容
在一些方面,本文公开了一种用于分析核酸的大小分布的方法,所述方法包括:(A)提供样品,所述样品包括:(i)第一多个核酸和第二多个核酸,其中第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列,并且第二多个核酸各自包含比给定长度更长的第二核酸序列;(ii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组配对寡核苷酸引物;和(iii)被配置为扩增第二核酸序列的第二组配对寡核苷酸引物;(B)对以下项进行扩增反应:(a)第一核酸序列,以生成第一信号,和(b)第二核酸序列,以生成第二信号;以及(C)确定从第一信号得出的第一值与从第二信号得出的第二值的比率,从而分析大小分布。在一些实施方案中,样品还包括(iv)被配置为与第一核酸序列的区域杂交的第一寡核苷酸探针和(v)被配置为与第二核酸序列的区域杂交的第二寡核苷酸探针。在一些实施方案中,第一信号从第一寡核苷酸探针生成,并且第二信号从第二寡核苷酸探针生成。在一些实施方案中,样品还包括嵌入染料。在一些实施方案中,第一信号或第二信号从嵌入染料生成。在一些实施方案中,第一信号和第二信号从嵌入染料生成。在一些实施方案中,嵌入染料是Green或Eva在一些实施方案中,第一信号或第二信号由质谱分析法生成。
在一些方面,本文公开了一种用于分析核酸的大小分布的方法,所述方法包括:(A)提供样品,所述样品包括:(i)第一多个核酸和第二多个核酸,其中第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列,并且第二多个核酸各自包含比给定长度更长的第二核酸序列;(ii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组配对扩增寡聚体;(iii)被配置为扩增第二核酸序列的第二组配对扩增寡聚体;(iv)被配置为退火至第一核酸序列的区域的第一检测探针;和(v)被配置为退火至第二核酸序列的区域的第二检测探针;(B)对以下项进行扩增反应:(a)第一核酸序列,以从第一检测探针生成第一信号,和(b)第二核酸序列,以从第二检测探针生成第二信号;以及(C)确定从第一信号得出的第一值与从第二信号得出的第二值的比率,从而分析大小分布。在一些实施方案中,第一组配对扩增寡聚体包含:第一正向扩增寡聚体;和第一反向扩增寡聚体。在一些实施方案中,第一组配对扩增寡聚体包含:多个第一正向扩增寡聚体;和多个第一反向扩增寡聚体。在一些实施方案中,多个第一正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。在一些实施方案中,多个第一正向扩增寡聚体中的第一正向扩增寡聚体被配置为与第一序列的区域杂交。在一些实施方案中,多个第一反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。在一些实施方案中,多个第一反向扩增寡聚体中的第一反向扩增寡聚体被配置为与第一序列的区域杂交。在一些实施方案中,第二组配对扩增寡聚体包含:第二正向扩增寡聚体;和第二反向扩增寡聚体。在一些实施方案中,第二组配对扩增寡聚体包含:多个第二正向扩增寡聚体;和多个第二反向扩增寡聚体。在一些实施方案中,多个第二正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。在一些实施方案中,多个第二正向扩增寡聚体中的第二正向扩增寡聚体被配置为与第二序列的区域杂交。在一些实施方案中,多个第二反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。在一些实施方案中,多个第二反向扩增寡聚体中的第二反向扩增寡聚体被配置为与第二序列的区域杂交。在一些实施方案中,第一值和第二值提供对应于样品中第一多个核酸和第二多个核酸的丰度的定量比率量度。在一些实施方案中,第一检测探针或第二检测探针包含非靶标杂交序列。在一些实施方案中,第一检测探针或第二检测探针是发夹检测探针。在一些实施方案中,发夹检测探针是分子信标或分子火炬(torch)。在一些实施方案中,样品包括:基因组DNA、mRNA、cDNA或其组合。在一些实施方案中,样品源自孕妇的血浆。在一些实施方案中,样品包括母体核酸和胎儿核酸。在一些实施方案中,第一多个核酸包含胎儿核酸,并且第二多个核酸包含母体核酸。在一些实施方案中,所述比率的确定提供胎儿级分。在一些实施方案中,样品来自患有或疑似患有癌症的个体。
在一些实施方案中,第一信号和第二信号在单个荧光通道中生成。在一些实施方案中,(B)在多个分区中的至少一个分区中进行。在一些实施方案中,多个分区是多个微滴。在一些实施方案中,多个分区是多个孔。在一些实施方案中,第二核酸序列包含第一核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中,第二核酸序列包含第一核酸序列。在一些实施方案中,扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,PCR是定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)。在一些实施方案中,第一检测探针包含第一可检测标记,并且第二检测探针包含第二可检测标记。在一些实施方案中,第一检测探针和第二检测探针各自进一步包含猝灭剂。在一些实施方案中,在扩增反应期间,第一可检测标记从第一检测探针释放,并且第二可检测标记从第二检测探针释放,从而生成第一信号和第二信号。在一些实施方案中,第一可检测标记和第二可检测标记各自选自化学发光标记、荧光标记及其任何组合。在一些实施方案中,第一信号或第二信号是化学发光信号、荧光信号或其任何组合。在一些实施方案中,第一检测探针和第二检测探针是Taq检测探针。在一些实施方案中,所述方法还包括将所述比率与参考值进行比较。在一些实施方案中,所述比较鉴定样品中遗传异常的存在或不存在。在一些实施方案中,参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。在一些实施方案中,第三核酸序列和第四核酸序列各自对应于与遗传异常无关的核酸区域。在一些实施方案中,参考值由从多个第三核酸序列生成的多个第三值和从多个第四核酸序列生成的多个第四值得出。在一些实施方案中,多个第三核酸序列和多个第四核酸序列各自对应于与遗传异常无关的核酸区域。在一些实施方案中,遗传异常是胎儿非整倍性。在一些实施方案中,第二核酸序列包含第一核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中,所述方法还包括将所述比率与参考值进行比较。在一些实施方案中,第一值是第一多个核酸的数量。在一些实施方案中,第二值是第二多个核酸的数量。在一些实施方案中,在不定量第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定所述比率。在一些实施方案中,扩增反应包括qPCR,其中第一值由第一多个核酸的扩增动力学得出。在一些实施方案中,扩增反应包括qPCR,其中第二值由第二多个核酸的扩增动力学得出。在一些实施方案中,扩增反应包括dPCR,其中第一值由含有第一核酸序列的分区的数目得出。在一些实施方案中,扩增反应包括dPCR,其中第二值由含有第二核酸序列的分区的数目得出。
在一些实施方案中,在(A)中,样品包括:(vi)包含一个或多个另外的核酸序列的一种或多种另外的多个核酸;(vii)被配置为扩增所述一个或多个另外的核酸序列的另外一组或多组配对扩增寡聚体;和(viii)被配置为退火至所述一个或多个另外的核酸序列的区域的一种或多种另外的检测探针;在(B)中,对所述一个或多个另外的核酸序列进行扩增反应,以从另外一组或多组检测探针生成一种或多种另外的信号;以及在(C)中,确定第一值或第二值与从所述一种或多种另外的信号得出的一个或多个另外的值的另外的比率,从而分析大小分布。在一些实施方案中,所述另外一组或多组配对扩增寡聚体包含n种扩增寡聚体;并且所述另外一组或多组检测探针包含n种另外的检测探针。在一些实施方案中,n是1至30之间的整数。在一些实施方案中,第一值是第一多个核酸的数量。在一些实施方案中,第二值是第二多个核酸的数量。在一些实施方案中,在不定量第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定所述比率。
在一些方面,本文公开了一种用于鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在的方法,所述方法包括:(A)提供样品,所述样品包括:(i)多个胎儿核酸,每个胎儿核酸包含给定长度的第一核酸序列;(ii)多个母体核酸,每个母体核酸包含比给定长度更长的第二核酸序列;(iii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组寡核苷酸引物;(iv)被配置为扩增第二核酸序列的第二组寡核苷酸引物;(v)被配置为与第一核酸序列杂交的第一寡核苷酸探针;(vi)被配置为与第二核酸序列杂交的第二寡核苷酸探针;(B)扩增(a)第一核酸序列,以从第一寡核苷酸探针生成第一信号,并且扩增(b)第二核酸序列,以从第二寡核苷酸探针生成第二信号;(C)确定从第一信号得出的值与从第二信号得出的第二值的比率;以及(D)将所述比率与参考值进行比较,从而鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在。在一些实施方案中,第一核酸序列对应于潜在与胎儿非整倍性相关的核酸区域。在一些实施方案中,所述区域包含染色体22、染色体21、染色体18、染色体13、染色体9、染色体8或X染色体的区域。在一些实施方案中,所述区域包含染色体21的区域。在一些实施方案中,所述区域包含染色体18的区域。在一些实施方案中,所述区域包含染色体13的区域。在一些实施方案中,所述区域包含X染色体的区域。在一些实施方案中,参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。在一些实施方案中,第三核酸序列和第四核酸序列各自对应于与胎儿非整倍性无关的核酸区域。在一些实施方案中,参考值由从多个第三核酸序列生成的多个第三值和从多个第四核酸序列生成的多个第四值得出。在一些实施方案中,多个第三核酸序列和多个第四核酸序列各自对应于与胎儿非整倍性无关的核酸区域。在一些实施方案中,所述区域是持家基因的区域。在一些实施方案中,持家基因是β-珠蛋白。在一些实施方案中,所述比率大于参考值,从而表明胎儿非整倍性的存在。在一些实施方案中,所述比率小于参考值,从而鉴定胎儿非整倍性的存在。在一些实施方案中,所述多个胎儿核酸和所述多个母体核酸获取自孕妇的血浆。在一些实施方案中,所述多个胎儿核酸包含胎儿脱氧核糖核酸(DNA),并且所述多个母体核酸包含母体DNA。在一些实施方案中,(b)中的扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,PCR是定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)。在一些实施方案中,第一寡核苷酸探针包含第一可检测标记,并且第二寡核苷酸探针包含第二可检测标记。在一些实施方案中,第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针各自进一步包含猝灭剂。在一些实施方案中,在扩增期间,第一可检测标记从第一寡核苷酸探针释放,并且第二可检测标记从第二寡核苷酸探针释放,从而生成第一信号和第二信号。在一些实施方案中,第一可检测标记和第二可检测标记各自选自化学发光标记、荧光标记及其任何组合。在一些实施方案中,第一信号或第二信号是化学发光信号、荧光信号或其任何组合。在一些实施方案中,第一检测探针和第二检测探针是Taq检测探针。在一些实施方案中,第一组寡核苷酸引物包含第一正向引物和第一反向引物。在一些实施方案中,第二组寡核苷酸引物包含第二正向引物和第二反向引物。在一些实施方案中,胎儿非整倍性是21三体、18三体、13三体、9三体或8三体。在一些实施方案中,胎儿非整倍性是21三体。在一些实施方案中,胎儿非整倍性是18三体。在一些实施方案中,胎儿非整倍性是13三体。在一些实施方案中,胎儿非整倍性是性染色体非整倍性。在一些实施方案中,性染色体非整倍性是特纳综合征、克氏综合征、X三体、XXY或XYY。
在一些实施方案中,第二核酸序列不包含任何第一核酸序列。在一些实施方案中,第二核酸序列包含第一核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中,第二核酸序列包含第一核酸序列。在一些实施方案中,参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。在一些实施方案中,第二核酸包含第一核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中,第一值是第一多个核酸的数量。在一些实施方案中,第二值是第二多个核酸的数量。在一些实施方案中,在不定量第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定所述比率。在一些实施方案中,扩增反应包括qPCR,其中第一值由第一多个核酸的扩增动力学得出。在一些实施方案中,扩增反应包括qPCR,其中第二值由第二多个核酸的扩增动力学得出。在一些实施方案中,扩增反应包括dPCR,其中第一值由含有第一核酸序列的分区的数目得出。在一些实施方案中,扩增反应包括dPCR,其中第二值由含有第二核酸序列的分区的数目得出。
在一些实施方案中,在(A)中,样品包括:(vi)包含给定长度的一个或多个另外的第一核酸序列的一种或多种另外的多个胎儿核酸;(vii)包含比给定长度更长的一个或多个另外的第二核酸序列的一种或多种另外的多个母体核酸;(viii)被配置为扩增所述一个或多个另外的第一核酸序列的一种或多种另外的第一组寡核苷酸引物;(xi)被配置为扩增所述一个或多个另外的第二核酸序列的一种或多种另外的第二组寡核苷酸引物;(x)被配置为退火至所述一个或多个另外的第一核酸序列的区域的一种或多种另外的第一寡核苷酸探针;和(xi)被配置为退火至所述一个或多个另外的第二核酸序列的区域的一种或多种另外的第二寡核苷酸探针;在(B)中,对以下项进行扩增反应:所述一个或多个另外的第一核酸序列,以从所述一种或多种另外的第一寡核苷酸探针生成一种或多种另外的第一信号;和所述一个或多个另外的第二核酸序列,以从所述一种或多种另外的第二寡核苷酸探针生成一种或多种另外的第二信号;在(C)中,确定从所述一种或多种另外的第一信号得出的一个或多个另外的第一值与从所述一种或多种另外的第二信号得出的一个或多个另外的第二值的另外的比率;以及在(D)中,将所述另外的比率与参考值进行比较。在一些实施方案中,所述一种或多种另外的第一组寡核苷酸引物包含n种寡核苷酸引物;并且所述一种或多种另外的第一寡核苷酸探针包含n种另外的检测探针。在一些实施方案中,所述一种或多种另外的第二组寡核苷酸引物包含n种寡核苷酸引物;并且所述一种或多种另外的第二寡核苷酸探针包含n种另外的检测探针。在一些实施方案中,n是1至30之间的整数。在一些实施方案中,第一值是第一多个核酸的数量。在一些实施方案中,第二值是第二多个核酸的数量。在一些实施方案中,在不定量第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定所述比率。在一些实施方案中,使血浆经受足以富集胎儿核酸的条件。在一些实施方案中,血浆不经受足以富集胎儿核酸的条件。在一些实施方案中,使血浆经受足以富集胎儿核酸的条件。在一些实施方案中,血浆不经受足以富集胎儿核酸的条件。在一些实施方案中,第一多个核酸和第二多个核酸源自相同来源。在一些实施方案中,第一多个核酸和第二多个核酸源自不同来源。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及附图,将会获得对本发明特征和优点的更好的理解,在这些附图中:
图1A和图1B示出了用于扩增不同长度的核酸序列以鉴定核酸大小分布中的差异的示例方法。
图2A和图2B示出了用于扩增不同长度的核酸序列以鉴定核酸大小分布中的差异的另一示例方法。
图3A显示了在无细胞脱氧核糖核酸(DNA)方面,胎儿级分的模拟分布。图3B显示了模拟的数字聚合酶链式反应(dPCR)测定法的接受者操作特征(ROC)曲线。图3C显示了相对于样品中的胎儿级分,模拟dPCR测定法的真阳性(TP)率。
图4显示了模拟数字PCR测定法的ROC曲线,其中靶标胎儿DNA比母体DNA富集了70%(图4A)或20%(图4B)。
具体实施方式
聚合酶链式反应(PCR)是用核酸聚合酶和引物在反应混合物中指数扩增特定靶核酸的方法。引物是短的单链寡核苷酸,其与靶标序列的正链和负链的3’序列互补。反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链核酸靶标变性或分解成单链模板。在冷却循环中,引物与模板上的互补序列结合。在模板被引发后,核酸聚合酶产生了原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍,导致靶标序列在30个循环中增加约10亿倍。
数字PCR是这样的过程,也就是将包含一个或多个靶标的样品分成多个分区(例如,孔、微滴等),在每个分区中进行PCR反应,并记录由例如靶标特异性报告探针产生的荧光。这通常在数字PCR仪上进行,该PCR仪通过一个或多个激发/发射滤波器组测量光通道中来自每个分区的荧光。
通常,靶标特异性核酸探针是与扩增靶标的一条链互补的短寡核苷酸。所述探针缺少3’羟基,并且因此不可通过DNA聚合酶延伸。Taq(ThermoFisher Scientific)化学法是常见的用于多重实时PCR的报告探针方法。Taq寡核苷酸探针用荧光团和猝灭标签(即猝灭剂)共价修饰。在这种结构中,荧光团产生的荧光被猝灭,并且无法被实时PCR仪检测到。当感兴趣的靶标存在时,探针寡核苷酸碱基与扩增靶标配对。当结合时,其被Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性消化,从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号以供实时PCR仪检测。
一种用于诊断胎儿非整倍性(例如,21三体)的工具是使用分离自母体血液样品的无细胞胎儿DNA序列的基于数字PCR的无创性产前筛查(NIPS)测试。标准NIPS经常会报告假阴性,并且根据靶标的不同,其敏感性和/或特异性可能会有所不同。此外,由于母体血浆中只有4-10%的DNA是胎儿来源的,所以检测胎儿非整倍性的现有方法可能会受到样品中胎儿DNA量的限制。本文认识到需要一种准确地检测、测量和评估母体血浆中痕量胎儿DNA的无创性手段。
定义
在本文中可互换使用的术语“引物”或“扩增寡聚体”可以指被配置为与另一种核酸结合并促进一个或多个反应(例如,转录、核酸合成和核酸扩增)的寡核苷酸或核酸。引物可以是双链的。引物可以是单链的。引物可以是正向引物或反向引物。正向引物和反向引物可以是与双链核酸的相反链结合的引物。例如,正向引物可以与来自核酸的第一链(例如,沃森链)的区域结合,并且反向引物可以与来自核酸的第二链(例如,克里克链)的区域结合。相对于反向引物,正向引物可以与更靠近基因的起始位点的区域结合,或者相对于反向引物,其可以与更靠近基因的末端位点的区域结合。正向引物可以与核酸的编码链结合,或者可以与核酸的非编码链结合。反向引物可以与核酸的编码链结合,或者可以与核酸的非编码链结合。
概述
基于长度的核酸靶向扩增和随后的区分是分子诊断中的有用工具,尤其是在样品中存在的靶核酸序列为痕量的情况下。核酸短片段的存在可以指示各种状况,包括由病毒、移植和/或癌性疾病引起的病症。因此,扩增已知的靶核酸序列可以确定循环的短片段核酸的存在。源自相同来源的核酸可以用于例如确认病毒和/或癌性突变的存在。来自多个个体的核酸可以用于例如移植和/或妊娠诊断。本文描述了用于区分不同长度的核酸片段,用于检测和分析样品中低丰度核酸(例如,血浆样品中的胎儿核酸)的方法。
一方面,本公开内容提供了一种用于检测胎儿非整倍性的方法。从孕妇获取的血浆将包含胎儿和母体核酸(例如,DNA)的无细胞片段。来自孕妇的无细胞样品中的母体核酸与来自相同样品的胎儿核酸相比具有更长的平均片段长度。此差异可以用于以高精度检测胎儿非整倍性。通常,所公开的方法包括使用多组寡核苷酸引物,每组寡核苷酸引物被配置为扩增不同长度的核酸片段。例如,一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增较短长度的核酸片段(例如,胎儿核酸),并且另一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度更长的片段(例如,母体核酸)。每组寡核苷酸引物可以与寡核苷酸探针配对以生成与每组引物相关的信号。通过鉴定与每组引物相关的信号之间的差异,以此方式设计的寡核苷酸引物和探针可用于鉴定片段大小分布中的差异(例如,胎儿核酸与母体核酸)。例如,在几乎没有或没有胎儿核酸级分的样品中,从两组寡核苷酸引物生成的信号将大致相同。相比之下,在具有高胎儿核酸级分的样品中,与胎儿(即,较短)核酸片段相关的信号将显著大于与母体(即,较长)核酸片段相关的信号。另外,此信号差异或比率可用于通过比较测试受试者的比率与参考值(如来自健康受试者的比率)来鉴定胎儿非整倍性。测得的比率与这样的参考值相比的显著差异(例如,增加或减少)可以肯定地将受试者鉴定为具有胎儿非整倍性。
图1A和图1B示出了用于靶向不同大小的核酸序列以用于核酸分析的示例方法。图1A显示了正向引物101、反向引物102、寡核苷酸探针103和核酸104。正向引物101和反向引物102被设计为扩增核酸104,如图所示。如图所示,寡核苷酸探针103被设计为与核酸104的区域杂交,并且被配置为在用正向引物101和反向引物102扩增核酸104之后生成信号。核酸104可以是核酸片段。核酸104可以是无细胞核酸。核酸104可以是胎儿核酸。核酸104具有给定长度。例如,核酸104可以是给定长度的无细胞胎儿核酸片段。图1B显示了正向引物111、反向引物112、寡核苷酸探针113和核酸114。正向引物111和反向引物112被设计为扩增核酸114,如图所示。如图所示,寡核苷酸探针113被设计为与核酸114的区域杂交,并且被配置为在用正向引物111和反向引物112扩增核酸114之后生成信号。核酸114可以是核酸片段。核酸114可以是无细胞的核酸。核酸114可以是母体核酸。核酸114的长度比核酸104长。核酸114可以包含核酸104的序列的一部分。核酸114可以包含核酸104的所有序列。核酸114可以与核酸104具有不同的序列。核酸104和核酸114可以通过在核酸扩增后检测分别由寡核苷酸探针103和寡核苷酸探针113生成的信号来鉴定。可以将由核酸104生成的信号得出的值(例如,循环阈值、分区计数等)与由核酸114生成的信号得出的值(例如,循环阈值、分区计数等)进行比较,从而生成比率。此信号比率的分析可用于,例如,区分核酸104与核酸114和/或估计不同长度的核酸片段(例如,胎儿级分)的大小分布。可以将此比率与参考值进行比较,从而鉴定遗传异常(例如,非整倍性)。例如,可以将从疑似患有遗传异常的受试者获得的比率与从健康受试者获得的比率进行比较,使得比率的显著差异将受试者鉴定为患有遗传异常。
在一些情况下,可以使用本公开内容的方法分析多种不同的核酸。例如,第一组配对寡核苷酸引物可以包含多个正向引物和多个反向引物,每个引物均被配置为扩增给定长度的核酸序列。第一组配对寡核苷酸引物可以被配置为扩增例如胎儿核酸。第二组配对寡核苷酸引物可以包含多个正向引物和多个反向引物,每个引物均被配置为比第一组配对寡核苷酸引物扩增长度更长的核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物可以被配置为扩增例如母体核酸。可以检测和分析使用第一组配对寡核苷酸引物和第二组配对寡核苷酸引物扩增胎儿核酸和母体核酸所生成的信号,从而评估胎儿级分或鉴定胎儿非整倍性。
图2A和图2B示出了用于靶向不同大小的核酸序列以用于核酸分析的示例方法。图2A显示了核酸204、核酸208和核酸212;正向引物201、正向引物205和正向引物209;以及反向引物203、反向引物207和反向引物211。正向和反向引物各自被配置为扩增给定的核酸,如图所示。图2A还显示了寡核苷酸探针202、寡核苷酸探针206和寡核苷酸探针210,其各自被配置为与给定的核酸杂交并在扩增后生成信号。核酸204、核酸208和核酸212各自具有给定的长度。核酸204、核酸208和核酸212可以是胎儿核酸片段。图2B显示了核酸224、核酸228和核酸232;正向引物221、正向引物225和正向引物229;以及反向引物223、反向引物227和反向引物211。正向和反向引物各自被配置为扩增给定的核酸,如图所示。图2B还显示了寡核苷酸探针222、寡核苷酸探针226和寡核苷酸探针230,其各自被配置为与给定的核酸杂交并在扩增后生成信号。核酸224、核酸228和核酸232各自的长度比核酸204、核酸208和核酸212的长度更长。核酸224、核酸228和核酸232可以是母体核酸片段。核酸202、核酸206、核酸210、核酸222、核酸226和核酸230可以通过检测从寡核苷酸探针222、寡核苷酸探针226和寡核苷酸探针230各自生成的信号来鉴定。可以将由核酸224、核酸228和核酸232生成的信号(例如,信号强度)与由核酸204、核酸208和核酸212生成的信号(例如信号强度)进行比较,从而生成比率。此信号比率的分析可用于,例如,估计不同长度的核酸片段(例如,胎儿级分)的大小分布。可以将此比率与参考值进行比较,从而鉴定遗传异常(例如,非整倍性)。例如,可以将从疑似患有遗传异常的受试者获得的比率与从健康受试者获得的比率进行比较,使得比率的显著差异将受试者鉴定为患有遗传异常。
分析核酸大小分布
在一些方面,本文公开了用于分析核酸大小分布的方法。首先,可以提供样品,所述样品包括:(i)第一多个核酸和第二多个核酸,其中第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列,并且第二多个核酸各自包含比给定长度更长的第二核酸序列;(ii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组配对扩增寡聚体;(iii)被配置为扩增第二核酸序列的第二组配对扩增寡聚体;(iv)被配置为退火至第一核酸序列的区域的第一检测探针;和(v)被配置为退火至第二核酸序列的区域的第二检测探针。在一些情况下,不提供第一检测探针和第二检测探针。接下来,可以对第一核酸序列和第二核酸序列进行扩增。扩增可生成来自第一检测探针的第一信号和来自第二检测探针的第二信号。替代地,在未提供第一检测探针和第二检测探针的情况下,扩增可从嵌入染料(例如,Green和Eva)和/或质谱分析法生成第一信号和/或第二信号。接下来,可以确定从第一信号得出的值与从第二信号得出的值的比率,从而分析核酸大小分布。
第一组配对寡核苷酸引物可以包含第一正向引物和第一反向引物(即,第一对寡核苷酸引物)。第一对寡核苷酸引物(例如,第一正向引物和第一反向引物)可以被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如,可以与相距给定距离的核酸序列区域杂交)。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少50个碱基对(bp)、至少75bp、至少100bp、至少125bp、至少150bp、至少175bp、至少200bp、至少225bp、至少250bp、至少275bp或至少300bp或更长的核酸序列。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多300bp、至多275bp、至多250bp、至多225bp、至多200bp、至多175bp、至多150bp、至多125bp、至多100bp、至多75bp或至多50bp或更短的核酸序列。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约50bp、约75bp、约100bp、约125bp、约150bp、约175bp、约200bp、约225bp、约250bp、约275bp或约300bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约150bp的核酸序列。第一组配对寡核苷酸引物可以包含多个第一正向引物和多个第一反向引物(即,第一多个配对寡核苷酸引物)。第一组配对寡核苷酸引物可以包含至少2对、至少3对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对或至少10对寡核苷酸引物或更多。第一组配对寡核苷酸引物可以包含约2对、约3对、约3对、约4对、约5对、约6对、约7对、约8对、约9对或约10对寡核苷酸引物。第一组配对寡核苷酸引物可以包含n对寡核苷酸引物。n可以是整数。n可以是2-30的整数。n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。n可以是大于30的整数。第一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。在一些情况下,第一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物被配置为扩增大约相同长度(例如,约70bp、约100bp、约150bp或更长)的核酸序列。在一些情况下,第一组配对寡核苷酸引物中的一些或全部对寡核苷酸引物被配置为扩增不同长度的核酸序列。例如,第一组寡核苷酸引物中的一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列,并且第一组寡核苷酸引物中的另一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。
第二组配对寡核苷酸引物可以包含第二正向引物和第二反向引物(即,第二对寡核苷酸引物)。第二对寡核苷酸引物(例如,第二正向引物和第二反向引物)可以被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如,可以与相距给定距离的核酸序列区域杂交)。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一对寡核苷酸引物扩增的核酸序列长的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少300个碱基对(bp)、至少325bp、至少350bp、至少375bp、至少400bp、至少425bp、至少450bp、至少500bp、至少550bp、至少600bp、至少650bp、至少700bp或至少750bp或更长的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多750bp、至多700bp、至多650bp、至多600bp、至多550bp、至多500bp、至多750bp、至多425bp、至多400bp、至多375bp、至多350bp、至多325bp、至多350bp、至多325bp或至多300bp或更短的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约300bp、约325bp、约350bp、约375bp、约400bp、约425bp、约450bp、约500bp、约550bp、约600bp、约650bp、约700bp或约750bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约300bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约500bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约750bp的核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物可以包含多个第二正向引物和多个第二反向引物(即,第二多个配对寡核苷酸引物)。第二组配对寡核苷酸引物可以包含至少2对、至少3对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对或至少10对寡核苷酸引物或更多。第二组配对寡核苷酸引物可以包含约2对、约3对、约3对、约4对、约5对、约6对、约7对、约8对、约9对或约10对寡核苷酸引物。第二组配对寡核苷酸引物可以包含n对寡核苷酸引物。n可以是整数。n可以是2-30的整数。n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。n可以是大于30的整数。第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一组配对寡核苷酸引物扩增的核酸序列长的核酸序列。在一些情况下,第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物被配置为扩增大约相同长度(例如,约300bp、约500bp、约750bp或更长)的核酸序列。在一些情况下,第二组配对寡核苷酸引物中的一些或全部对寡核苷酸引物各自被配置为扩增不同长度的核酸序列。例如,第二组寡核苷酸引物中的一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约300bp的核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物中的另一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约500bp的核酸序列。
第一检测探针或第二检测探针可以包含非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是与任何靶核酸不互补的区域。第一检测探针或第二检测探针可以是分子信标。第一检测探针或第二检测探针可以是分子火炬。第一检测探针或第二检测探针可以是分子信标。第一检测探针或第二检测探针可以包含可检测标记。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可以是荧光标记。第一检测探针和第二检测探针可以各自包含不同的可检测标记。例如,第一检测探针可以包括第一颜色的荧光团,并且第二检测探针可以包括第二颜色的荧光团。第一检测探针和第二检测探针可以各自包含相同的可检测标记。第一检测探针和第二检测探针可以各自包含猝灭剂。第一检测探针和第二检测探针可以是Taq检测探针。
扩增可以是线性扩增。扩增可以包括聚合酶链式反应(PCR)。扩增可以是数字PCR。扩增可以是定量PCR。扩增可以在多个分区中的分区中进行。扩增可以在乳液中的微滴中进行。扩增可以在微孔中进行。
确定第一值与第二值的比率可以提供胎儿级分。可以将比率与参考值进行比较。将比率与参考值进行比较可以确定样品中的估计的胎儿级分。将比率与参考值进行比较可以鉴定样品中遗传异常(例如,非整倍性)的存在或不存在。参考值可以对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。第三核酸序列和第四核酸序列可以各自对应于与遗传异常无关的核酸区域。
第一多个核酸可以是多个胎儿核酸。第二多个核酸可以是多个母体核酸。第一核酸序列可以对应于与胎儿非整倍性相关的胎儿核酸区域。与胎儿非整倍性相关的区域可以是例如染色体21的区域、染色体18的区域、染色体13的区域或X染色体的区域。
用于分析核酸大小分布的方法可以包括提供一种或多种另外的多个核酸,所述一种或多种另外的多个核酸包含一个或多个另外的核酸序列、另外一组或多组扩增寡聚体和一种或多种另外的检测探针。另外一组或多组扩增寡聚体可以是另外1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30组的扩增寡聚体。另外一组或多组扩增寡聚体可以是另外n组的扩增寡聚体。一种或多种另外的多个核酸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种另外的多个核酸。一种或多种另外的多个核酸可以是n种另外的多个核酸。一种或多种另外的检测探针可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种另外的检测探针。一种或多种另外的检测探针可以是n种另外的检测探针。n可以是整数。n可以是1至30之间的整数。n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。n可以是大于30的整数。
检测胎儿非整倍性
在一些方面,本文公开了用于鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在的方法。首先,可以提供样品,所述样品包括:(i)包含给定长度的序列的多个胎儿核酸;(ii)包含比给定长度更长的序列的多个母体核酸;(iii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组寡核苷酸引物;(iv)被配置为扩增第二核酸序列的第二组寡核苷酸引物;(v)被配置为退火至第一核酸序列的区域的第一寡核苷酸探针;和(vi)被配置为退火至第二核酸序列的区域的第二寡核苷酸探针。在一些情况下,不提供第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针。接下来,可以对第一核酸序列和第二核酸序列进行扩增。扩增可生成来自第一寡核苷酸探针的第一信号和来自第二寡核苷酸探针的第二信号。替代地,在未提供第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针的情况下,扩增可从嵌入染料(例如,Green和Eva)和/或质谱分析法生成第一信号和/或第二信号。接下来,可以确定从第一信号得出的值与从第二信号得出的值的比率。接下来,可以将比率与参考值进行比较,从而鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在。
第一组配对寡核苷酸引物可以包含第一正向引物和第一反向引物(即,第一对寡核苷酸引物)。第一对寡核苷酸引物(例如,第一正向引物和第一反向引物)可以被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如,可以与相距给定距离的核酸序列区域杂交)。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少50个碱基对(bp)、至少75bp、至少100bp、至少125bp、至少150bp、至少175bp、至少200bp、至少225bp、至少250bp、至少275bp或至少300bp或更长的核酸序列。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多300bp、至多275bp、至多250bp、至多225bp、至多200bp、至多175bp、至多150bp、至多125bp、至多100bp、至多75bp或至多50bp或更短的核酸序列。第一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约50bp、约75bp、约100bp、约125bp、约150bp、约175bp、约200bp、约225bp、约250bp、约275bp或约300bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。在一些情况下,第一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约150bp的核酸序列。第一组配对寡核苷酸引物可以包含多个第一正向引物和多个第一反向引物(即,第一多个配对寡核苷酸引物)。第一组配对寡核苷酸引物可以包含至少2对、至少3对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对或至少10对寡核苷酸引物或更多。第一组配对寡核苷酸引物可以包含约2对、约3对、约3对、约4对、约5对、约6对、约7对、约8对、约9对或约10对寡核苷酸引物。第一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。在一些情况下,第一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物被配置为扩增大约相同长度(例如,约70bp、约100bp、约150bp或更长)的核酸序列。在一些情况下,第一组配对寡核苷酸引物中的一些或全部对寡核苷酸引物各自被配置为扩增不同长度的核酸序列。例如,第一组寡核苷酸引物中的一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列,并且第一组寡核苷酸引物中的另一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。
第二组配对寡核苷酸引物可以包含第二正向引物和第二反向引物(即,第二对寡核苷酸引物)。第二对寡核苷酸引物(例如,第二正向引物和第二反向引物)可以被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如,可以与相距给定距离的核酸序列区域杂交)。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一对寡核苷酸引物扩增的核酸序列长的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少300个碱基对(bp)、至少325bp、至少350bp、至少375bp、至少400bp、至少425bp、至少450bp、至少500bp、至少550bp、至少600bp、至少650bp、至少700bp或至少750bp或更长的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多750bp、至多700bp、至多650bp、至多600bp、至多550bp、至多500bp、至多750bp、至多425bp、至多400bp、至多375bp、至多350bp、至多325bp、至多350bp、至多325bp或至多300bp或更短的核酸序列。第二对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约300bp、约325bp、约350bp、约375bp、约400bp、约425bp、约450bp、约500bp、约550bp、约600bp、约650bp、约700bp或约750bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约300bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约500bp的核酸序列。在一些情况下,第二对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约750bp的核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物可以包含多个第二正向引物和多个第二反向引物(即,第二多个配对寡核苷酸引物)。第二组配对寡核苷酸引物可以包含至少2对、至少3对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对或至少10对寡核苷酸引物或更多。第二组配对寡核苷酸引物可以包含约2对、约3对、约3对、约4对、约5对、约6对、约7对、约8对、约9对或约10对寡核苷酸引物。第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一组配对寡核苷酸引物扩增的核酸序列长的核酸序列。在一些情况下,第二组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物被配置为扩增大约相同长度(例如,约300bp、约500bp、约750bp或更长)的核酸序列。在一些情况下,第二组配对寡核苷酸引物中的一些或全部对寡核苷酸引物被配置为扩增不同长度的核酸序列。例如,第二组寡核苷酸引物中的一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约300bp的核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物中的另一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约500bp的核酸序列。
所述多个胎儿核酸和所述多个母体核酸获取自孕妇的血浆。胎儿核酸可以是胎儿脱氧核糖核酸(DNA)。母体核酸可以是母体DNA。第一核酸序列可以对应于与胎儿非整倍性相关的胎儿核酸的区域。与胎儿非整倍性相关的区域可以是例如染色体21的区域、染色体18的区域、染色体13的区域或X染色体的区域。
所述比率可以大于参考值,从而表明胎儿非整倍性的存在。所述比率可以小于参考值,从而表明胎儿非整倍性的存在。所述比率可以与参考值大约相同,从而表明胎儿非整倍性不存在。参考值可以对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。第三核酸序列和第四核酸序列可以各自对应于与胎儿非整倍性不相关的核酸区域。与胎儿非整倍性不相关的核酸区域可以是持家基因的区域。持家基因可以是例如β-珠蛋白。
第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针可以包含非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是与任何靶核酸不互补的区域。第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针可以是分子信标。第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针可以是分子火炬。第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针可以是分子信标。第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针可以包含可检测标记。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可以是荧光标记。第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针可以各自包含不同的可检测标记。例如,第一寡核苷酸探针可以包括第一颜色的荧光团,并且第二寡核苷酸探针可以包括第二颜色的荧光团。第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针可以各自包含相同的可检测标记。第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针可以各自包含猝灭剂。第一检测探针和第二寡核苷酸探针可以是Taq寡核苷酸探针。
扩增可以是线性扩增。扩增可以包括聚合酶链式反应(PCR)。扩增可以是数字PCR。扩增可以是定量PCR。扩增可以在多个分区中的分区中进行。扩增可以在乳液中的微滴中进行。扩增可以在微孔中进行。
胎儿非整倍性可以是染色体数目异常。胎儿非整倍性可以是三体。三体可以是21三体。三体可以是18三体。三体可以是13三体。胎儿非整倍性可以是单体。单体可能是特纳综合征。胎儿非整倍性可以是性染色体非整倍性。性染色体非整倍性可以是例如XO、XXX、XXY或XYY。
用于分析核酸大小分布的方法可以包括提供一种或多种另外的多个核酸,所述一种或多种另外的多个核酸包含一个或多个另外的核酸序列、另外一组或多组扩增寡聚体和一种或多种另外的检测探针。另外一组或多组扩增寡聚体可以是另外1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30组的扩增寡聚体。另外一组或多组扩增寡聚体可以是另外n组的扩增寡聚体。一种或多种另外的多个核酸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种另外的多个核酸。一种或多种另外的多个核酸可以是n种另外的多个核酸。一种或多种另外的检测探针可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种另外的检测探针。一种或多种另外的检测探针可以是n种另外的检测探针。n可以是整数。n可以是1至30之间的整数。n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。n可以是大于30的整数。
遗传异常
所公开的方法可以用于诊断、检测或以其他方式鉴定来自核酸样品的一种或多种遗传异常。所公开的方法可以用于诊断、检测或以其他方式鉴定来自核酸样品的一种或多种遗传异常的测试,其中从本文描述的方法获得的数据(例如,核酸大小分布、估计胎儿级分等)用于辅助检测或滤除不太可能产生准确结果的样品。遗传异常可以是例如染色体异常(例如,染色体易位、非整倍性等)、遗传突变(例如,插入、缺失等)或核酸变体(例如,单核苷酸多态性)。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的遗传异常是非整倍性。非整倍性可以是胎儿非整倍性。在一些情况下,所公开的方法包括从与胎儿非整倍性相关的染色体扩增核酸序列。与胎儿非整倍性相关的染色体包括例如染色体21(例如,与21三体相关)、染色体18(例如,与18三体相关)、染色体13(例如,与13三体相关)和X染色体(例如,与性染色体非整倍性相关,例如,特纳综合征、克氏综合征、X三体、XXY和XYY等)。
非整倍性可以描述样品或受试者(例如,胎儿)中染色体数目异常的存在。非整倍性可以是三体。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是21三体(即唐氏综合征)。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是13三体。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是13三体。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是X三体。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是XYY。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的三体是克氏综合征。非整倍性可以是单体。在一些情况下,通过所公开的方法鉴定的单体是X单体(即特纳综合征)。
寡核苷酸引物
本公开内容的寡核苷酸引物(或“扩增寡聚体”)可以是脱氧核糖核酸。寡核苷酸引物可以是核糖核酸。寡核苷酸引物可包含一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以是例如脱氧肌苷。寡核苷酸引物可以是正向引物。寡核苷酸引物可以是反向引物。寡核苷酸引物的长度可以在约5至约50个核苷酸之间。寡核苷酸引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基对,或更长。寡核苷酸引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。寡核苷酸引物的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基对。
一组寡核苷酸引物可包含配对寡核苷酸引物。配对寡核苷酸引物可包含正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。例如,正向寡核苷酸引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如,3’末端)杂交,而反向寡核苷酸引物可以被配置为与所述核酸序列的第二区域(例如,5’末端)杂交,从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增给定长度的所述核酸序列。不同组寡核苷酸引物可以被配置为扩增不同长度的核酸序列。在一个实例中,第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增比第一核酸序列长度更短的第二核酸序列。在另一个实例中,第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增比第一核酸序列长度更长的第二核酸序列。
一组配对寡核苷酸引物可以包含正向引物和反向引物(即,第一对寡核苷酸引物)。一对寡核苷酸引物(例如,正向引物和反向引物)可以被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如,可以与相距给定距离的核酸序列区域杂交)。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少50个碱基对(bp)、至少75bp、至少100bp、至少125bp、至少150bp、至少175bp、至少200bp、至少225bp、至少250bp、至少275bp或至少300bp或更长的核酸序列。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多300bp、至多275bp、至多250bp、至多225bp、至多200bp、至多175bp、至多150bp、至多125bp、至多100bp、至多75bp或至多50bp或更短的核酸序列。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约50bp、约75bp、约100bp、约125bp、约150bp、约175bp、约200bp、约225bp、约250bp、约275bp或约300bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约150bp的核酸序列。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至少300个碱基对(bp)、至少325bp、至少350bp、至少375bp、至少400bp、至少425bp、至少450bp、至少500bp、至少550bp、至少600bp、至少650bp、至少700bp或至少750bp或更长的核酸序列。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为至多750bp、至多700bp、至多650bp、至多600bp、至多550bp、至多500bp、至多750bp、至多425bp、至多400bp、至多375bp、至多350bp、至多325bp、至多350bp、至多325bp或至多300bp或更短的核酸序列。一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约300bp、约325bp、约350bp、约375bp、约400bp、约425bp、约450bp、约500bp、约550bp、约600bp、约650bp、约700bp或约750bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约300bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约500bp的核酸序列。在一些情况下,一对寡核苷酸引物被配置为扩增长度为约750bp的核酸序列。一组配对寡核苷酸引物可以包含多个正向引物和多个反向引物(即,多个配对寡核苷酸引物)。一组配对寡核苷酸引物可以包含至少2对、至少3对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对或至少10对寡核苷酸引物或更多。一组配对寡核苷酸引物可以包含约2对、约3对、约3对、约4对、约5对、约6对、约7对、约8对、约9对或约10对寡核苷酸引物。一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。在一些情况下,一组配对寡核苷酸引物中的每对寡核苷酸引物被配置为扩增大约相同长度(例如,约70bp、约100bp、约150bp、约300bp、约500bp、约750bp或更长)的核酸序列。在一些情况下,一组配对寡核苷酸引物中的一些或全部对寡核苷酸引物各自被配置为扩增不同长度的核酸序列。例如,一组寡核苷酸引物中的一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约70bp的核酸序列,并且一组寡核苷酸引物中的另一对寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度为约100bp的核酸序列。核酸酶
本公开内容的混合物和组合物可以包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以具有核酸外切酶活性。核酸酶可以具有核酸内切酶活性。核酸酶可以具有RNA酶活性。核酸酶可能能够降解包含一个或多个核糖核苷酸碱基的核酸。核酸酶可以是例如RNA酶H或RNA酶III。RNA酶III可以是例如切酶。核酸可以是核酸内切酶I,如举例而言,T7核酸内切酶I。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是核酸内切酶V,如举例而言,大肠杆菌核酸内切酶V。核酸酶可以是聚合酶(例如,DNA聚合酶)。聚合酶可以是Taq聚合酶或其变体。在适当条件下,核酸酶可能能够降解寡核苷酸探针。在适当条件下,核酸酶可能能够从寡核苷酸探针释放猝灭剂。
热循环和扩增
本公开内容的方法可以包括热循环。热循环可以包括一个或多个热循环。热循环可以在足够扩增一种或多种核酸的反应条件下进行。足够的反应条件可以包括足够的温度条件、足够的缓冲条件和存在足够的试剂。足够的温度条件可以使得每个热循环在期望的退火温度下进行。期望的退火温度可足以使寡核苷酸引物的区域退火至靶核酸。期望的退火温度可足以使寡核苷酸探针的区域退火至靶核酸。足够的缓冲条件可以使得所需的盐存在于热循环期间使用的缓冲液中。所需的盐可以包括镁盐、钾盐和/或铵盐。足够的缓冲条件可以使得适当的盐以所需的浓度存在。用于通过PCR扩增核酸的足够的试剂可以包括脱氧三磷酸(dNTP)。dNTP可以包括天然或非天然dNTP,包括例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其变体。
可以使用合适的扩增方法进行核酸靶标的扩增。扩增可以包括线性扩增。扩增可以包括聚合酶链式反应(PCR)。扩增可以包括核酸延伸反应。扩增可以在核酸分区前或分区后进行。在一些情况下,核酸的扩增在多个分区中进行。例如,可以将核酸靶标划分为多个微滴,并且在每个微滴内进行扩增。
信号生成与检测
在一些情况下,可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交的同时生成信号。例如,寡核苷酸探针(例如,分子信标探针或分子火炬)可以在与核酸杂交后生成信号(例如,荧光信号)。在一些情况下,可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交之后,随着寡核苷酸探针由核酸酶降解而生成信号。例如,寡核苷酸探针(例如,Taq探针)可以在寡核苷酸探针与核酸杂交并且随后由聚合酶降解(例如,在扩增期间,如PCR扩增)之后生成信号。寡核苷酸探针可由核酸酶的核酸外切酶活性降解。信号可以是化学发光信号。信号可以是荧光信号。可检测标记可包含猝灭剂和荧光团,使得在寡核苷酸探针降解时猝灭剂从可检测标记释放,从而生成荧光信号。本公开内容的热循环可以生成信号。热循环可以生成至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个信号,或更多。热循环可以生成至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个信号。多个信号可以是相同类型或不同类型。不同类型的信号可以是具有不同荧光波长的荧光信号。不同类型的信号可由包含不同荧光团的可检测标记生成。相同类型的信号可以具有不同的强度(例如,相同荧光波长的不同强度)。相同类型的信号可以由包含相同荧光团的可检测标记生成。包含相同荧光团的可检测标记可以由于处于不同浓度而生成不同的信号,从而生成不同强度的相同信号类型。信号可以由嵌入染料(例如,Green和Eva)生成。信号可以由质谱分析法(例如,可以是对应于核酸的质谱)生成。
可以检测一个或多个信号的存在或不存在。可以检测一个信号,或者可以检测多个信号。可以同时检测多个信号。替代地,可以顺序地检测多个信号。可以在整个热循环过程中,例如在每个热循环结束时检测信号。在一些情况下,信号强度随每个热循环而增加。信号强度可以以S形的方式增加。信号可以被生成并用于得出(例如,计算)循环阈值。信号可以被生成并用于得出(例如,计算)分区计数。
分区
本公开内容的方法可以包含将核酸、寡核苷酸探针并且在一些情况下将附加试剂划分到多个分区中。分区可以是微滴(例如,乳液中的微滴)。分区可以是孔。分区可以是微孔。可使用微流体装置进行分区。在一些情况下,使用微滴生成器进行分区。分区可包括将样品或混合物分到油包水微滴中。微滴可包含一个或多个核酸。微滴可包含单个核酸。微滴可包含两个或更多个核酸。微滴可不包含核酸。
寡核苷酸探针
本公开内容的样品、混合物、试剂盒和组合物可包含寡核苷酸探针,在本文中也称为检测探针。寡核苷酸探针可以是核酸(例如,DNA、RNA等)。寡核苷酸探针可以包含与靶核酸区域互补的区域。寡核苷酸探针的浓度可以使得它相对于样品中的其他组分而言过量。样品可包含一个以上的寡核苷酸探针。多个寡核苷酸探针可以相同或不同。寡核苷酸探针的长度可以是至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少30个核苷酸或更长。寡核苷酸探针的长度可以是至多30个、至多20个、至多15个、至多10个或至多5个核苷酸。
寡核苷酸探针可包含非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是与靶核酸序列的任何区域都不互补的序列。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是发夹检测探针。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子信标探针。分子信标探针的示例在例如美国专利7,671,184中提供,该专利通过引用全文并入本文。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子火炬。分子火炬的示例在例如美国专利6,534,274中提供,该专利通过引用全文并入本文。
寡核苷酸探针可包含可检测标签。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可以包括荧光标记。可检测标记可以包括荧光团。荧光团可以是例如FAM、TET、HEX、JOE、Cy3或Cy5。荧光团可以是FAM。荧光团可以是HEX。寡核苷酸探针可以进一步包含一个或多个猝灭剂。猝灭剂可以抑制荧光团的信号生成。猝灭剂可以是例如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。猝灭剂可以是BHQ-1。猝灭剂可以是BHQ-2。
靶核酸
本公开内容的核酸可以源自任何来源,包括例如,病毒、细菌细胞和真核细胞。核酸可以源自一个或多个细胞。细胞可以是肿瘤细胞。细胞可以是疑似包含病毒病原体的细胞。在一些情况下,核酸源自无细胞样品(例如,血清、血浆)。核酸可以源自受试者的血浆。例如,核酸(例如,母体核酸和胎儿核酸)可以源自孕妇的血浆样品。核酸可以是无细胞核酸。无细胞核酸可以是例如无细胞肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA、无细胞RNA等。核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA,包括基因组DNA。核酸可以是病毒DNA。核酸可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA,包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。核酸可包含其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于鉴定受试者中病原体的存在或不存在的病毒基因或细菌基因。
核酸可以是胎儿核酸。核酸可以是母体核酸。核酸可包含可通过本公开内容的方法检测或扩增的一个或多个核酸序列。核酸序列可以对应于潜在与非整倍性相关的核酸区域。例如,胎儿核酸的核酸序列可能与胎儿非整倍性相关。核酸序列可以是与胎儿非整倍性相关的染色体的区域。与胎儿非整倍性相关的染色体包括例如染色体21(例如,与21三体相关)、染色体18(例如,与18三体相关)、染色体13(例如,与13三体相关)和X染色体(例如,与性染色体非整倍性相关,例如,特纳综合征、克氏综合征和X三体)。在一些情况下,本公开内容的方法可用于鉴定和估计样品中的胎儿级分。在一些情况下,本公开内容的方法可用于鉴定样品中胎儿非整倍性的存在或不存在。在一些情况下,本公开内容的方法可用于检测受试者中一种或多种感染剂(例如,病毒)的存在或不存在。在一些情况下,本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中胎儿核酸的相对量,从而诊断胎儿的一种或多种遗传异常(例如,胎儿非整倍性)。在一些情况下,本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中肿瘤DNA的存在或不存在,从而诊断受试者的癌症。
可以在本公开内容的方法同时、之前或之后处理样品。可以处理样品以纯化或富集核酸(例如,从血浆样品中纯化核酸)。可以处理包含核酸的样品以纯化或富集感兴趣的核酸。可以处理包含核酸的样品以富集胎儿核酸。可以处理包含核酸的样品以富集小于给定大小的核酸片段。可以通过多种方法富集样品中感兴趣的核酸(例如,胎儿核酸),包括例如通过大小排除过滤、序列特异性富集(例如,通过使用捕获序列)、表观遗传特异性富集(例如,通过使用甲基化特异性捕获部分,如抗体)。富集可包括分离感兴趣的核酸和/或去除不感兴趣的核酸。在一些情况下,在进行本公开内容的方法之前,没有为了纯化或富集感兴趣的核酸而处理样品(例如,扩增来自样品的核酸)。例如,如本文中其他地方所述,在将样品与寡核苷酸引物和寡核苷酸探针混合之前,可以不为了富集胎儿核酸而处理样品。所公开的方法可能能够例如鉴定胎儿级分和/或鉴定胎儿非整倍性,而无论是否已经纯化或富集了样品中的胎儿核酸。
试剂盒
本文还提供了试剂盒,所述试剂盒可用于例如分析核酸大小分布(例如,胎儿级分)和/或鉴定样品中胎儿非整倍性的存在或不存在。试剂盒可包含一种或多种寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以被冷冻干燥。试剂盒中可存在不同浓度的不同寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以包含可检测标记,所述可检测标记可以包含例如荧光团和一种或多种猝灭剂。
试剂盒可包含如本文所述的一组或多组寡核苷酸引物(或“扩增寡聚体”)。一组寡核苷酸引物可包含配对寡核苷酸引物。配对寡核苷酸引物可包含正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的核酸序列。例如,正向寡核苷酸引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如,3’末端)杂交,而反向寡核苷酸引物可以被配置为与所述核酸序列的第二区域(例如,5’末端)杂交,从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增给定长度的所述核酸序列。不同组寡核苷酸引物可以被配置为扩增不同长度的核酸序列。在一个实例中,第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增比第一核酸序列长度更短的第二核酸序列。在另一个实例中,第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列,并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增比第一核酸序列长度更长的第二核酸序列。可以在试剂盒中一并提供被配置为扩增不同长度的序列的寡核苷酸引物,所述试剂盒可用于进行所公开的方法(例如,大小分布分析、胎儿非整倍性检测等)。寡核苷酸引物可以被冷冻干燥。在一些情况下,所有寡核苷酸探针都可以被冷冻干燥。
试剂盒可包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶(DNA酶)。DNA酶可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶可以是核糖核酸聚合酶(RNA酶)。RNA酶可以是RNA酶III。RNA酶III可以是切酶。核酸酶可以是核酸内切酶。核酸内切酶可以是核酸内切酶I。核酸内切酶I可以是T7核酸内切酶I。试剂盒可以包括用于使用本文所述的方法中的任何前述项的说明。
实施例
实施例1-用于胎儿核酸分析的模拟数字PCR测定法
目前使用数字PCR检测胎儿非整倍性(例如,21三体)或其他胎儿状况的尝试可能受到样品中存在的胎儿DNA量的限制。图3A显示了在无细胞脱氧核糖核酸(DNA)方面,胎儿级分的模拟分布。为了评估数字PCR测定法的灵敏度和特异性,产生了用于检测胎儿非整倍性的模拟数字PCR。该模拟测定法含有8个孔、平均4,125个母体DNA计数、每个染色体两个靶标且平均胎儿级分为0.16,标准偏差为0.06。图3B显示了模拟测定法的接受者操作特征(ROC)曲线,其显示了真阳性(TP)率与假阳性(FP)率。虚线内的区域代表真阳性率>90%和假阳性率<5%的区域。实线内的区域代表真阳性率>99%和假阳性率<1%的区域。该数据表明灵敏度有限,这主要是由具有低胎儿级分的样品引起的。图3C示出了相对于样品中的胎儿级分,图3B的模拟数字PCR测定法的真阳性(TP)率。这些数据表明,用于检测胎儿非整倍性的模拟数字PCR测定法的成功率高度依赖于样品中的胎儿级分。
实施例2-使用截止过滤器的用于胎儿核酸分析的模拟数字PCR测定法
为了评估用于低胎儿级分样品的使用截止过滤器的数字PCR测定法的灵敏度和特异性,产生了用于检测胎儿非整倍性的模拟数字PCR。所述模拟包括蒙特卡洛方法,该方法包括根据以下分布分配输入的母体DNA计数和随机选择的胎儿级分的试验。然后将DNA计数随机划分到两个孔中的20,000个虚拟分区中,以模拟数字PCR仪器的性能。该模拟测定法含有2个孔、平均4,125个母体DNA计数、每个染色体十个靶标且平均胎儿级分为0.16,标准偏差为0.06。图4A显示了模拟测定法的ROC曲线,其中相对于持家基因,靶标在母体DNA中富集了70%。此处,截止过滤器被用来过滤掉具有低胎儿级分的低精度样品。改变截止过滤器,使得它排除给定百分比的模拟试验,如图4A和图4B所示。通过使用这种过滤器增加“无判定(No Calls)”的量,可以观察到模拟测定法的灵敏度和特异性显著提高。图4B显示了使用如图4A中的截止过滤器的模拟测定法的ROC曲线,其中相对于持家基因,靶标在母体DNA中富集了20%。即使胎儿DNA的差异只有20%,使用过滤器增加“无呼叫”的量也可以显著提高模拟测定法的特异性和灵敏度。
实施例3-使用两对寡核苷酸引物确定胎儿级分
获取来自孕妇的血浆样品。血浆样品包括胎儿无细胞核酸和母体无细胞核酸。将胎儿和母体核酸与各自对染色体21上的序列具有特异性的一对寡核苷酸引物和第二对寡核苷酸引物混合。第一对寡核苷酸引物被设计为扩增来自染色体21的长度为约100个碱基对(bp)的核酸序列。第二对寡核苷酸引物被设计为扩增来自染色体21的长度为约300bp的核酸序列。还提供了对应于第一和第二对寡核苷酸引物的第一和第二Taq寡核苷酸探针,它们被设计用于检测各个核酸序列。
使胎儿和母体核酸经受使用所提供的寡核苷酸引物和探针的微滴数字聚合酶链式反应。检测对应于来自染色体21的各个核酸序列的信号。从各个信号得出核酸的数量。计算从第一对寡核苷酸引物生成的信号得出的数量与从第二对寡核苷酸引物生成的信号得出的数量的比率。将该比率与从通过扩增来自β-珠蛋白的核酸序列而类似地生成的信号获得的参考比率进行比较。从染色体21生成的信号比率高于参考比率,从而将样品鉴定为含有胎儿级分。将所述比较用于计算样品中的估计胎儿级分。
实施例4-使用各自包含两对寡核苷酸引物的两组寡核苷酸引物确定胎儿级分
获取来自孕妇的血浆样品。血浆样品包括胎儿无细胞核酸和母体无细胞核酸。将胎儿和母体核酸与第一组配对寡核苷酸引物和第二组配对寡核苷酸引物混合。每组包含两对寡核苷酸引物(即两个正向引物,各自与反向引物配对)。第一组和第二组中的每对寡核苷酸引物对染色体21上的不同序列具有特异性。第一组配对寡核苷酸引物包含两对寡核苷酸引物,其各自被设计为扩增来自染色体21的长度为约70个碱基对(bp)的不同核酸序列。第二组配对寡核苷酸引物包含两对寡核苷酸引物,其各自被设计为扩增来自染色体21的长度为约500bp的不同核酸序列。还提供了被设计用于检测每个核酸序列的第一组Taq寡核苷酸探针和第二组Taq寡核苷酸探针。每组Taq寡核苷酸探针包含对应于第一和第二组寡核苷酸引物各自的两个引物对的两个寡核苷酸探针。
使胎儿和母体核酸经受使用所提供的寡核苷酸引物和探针的微滴数字聚合酶链式反应。检测对应于来自染色体21的各个核酸序列的信号。从各个信号得出核酸的数量。计算从第一组寡核苷酸引物生成的信号得出的数量与从第二组寡核苷酸引物生成的信号得出的数量的比率。将该比率与从通过扩增来自β-珠蛋白的核酸序列而类似地生成的信号获得的参考比率进行比较。从染色体21生成的信号比率高于参考比率,从而将样品鉴定为含有胎儿级分。将所述比较用于计算样品中的估计胎儿级分。
当提及可测量值诸如量、持续时间等时,术语“约”旨在涵盖指定值的±20%变化,或在一些情况下为±10%,或在一些情况下为±5%,或在一些情况下为±1%,或在一些情况下为±0.1%,因此这样的变化适于进行所公开的方法。此外,“约”可意指正负小于1%或1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或大于30%,这取决于情况并且是本领域技术人员已知或可知的。约还包括确切的量。因此,“约200nM”意指“约200nM”以及“200nM”。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案,但对于本领域技术人员显而易见的是,这些实施方案仅以示例的方式提供。说明书中提供的具体示例不意在限制本发明。虽然本发明已经参考前述说明书进行了描述,但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不偏离本发明的情况下,本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外,应当理解,本发明的所有方面不限于本文阐述的依赖于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解,本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此,考虑到本发明还将覆盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下权利要求旨在限定本发明的范围,并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。
Claims (125)
1.一种用于分析核酸的大小分布的方法,所述方法包括:
(A)提供样品,所述样品包括:
(i)第一多个核酸和第二多个核酸,其中所述第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列,并且所述第二多个核酸各自包含比所述给定长度更长的第二核酸序列;
(ii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组配对扩增寡聚体;
(iii)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组配对扩增寡聚体;
(iv)被配置为退火至所述第一核酸序列的区域的第一检测探针;和
(v)被配置为退火至所述第二核酸序列的区域的第二检测探针;
(B)对以下项进行扩增反应:(a)所述第一核酸序列,以从所述第一检测探针生成第一信号,和(b)所述第二核酸序列,以从所述第二检测探针生成第二信号;以及
(C)确定从所述第一信号得出的第一值与从所述第二信号得出的第二值的比率,从而分析所述大小分布。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述第一组配对扩增寡聚体包含:第一正向扩增寡聚体;和第一反向扩增寡聚体。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述第一组配对扩增寡聚体包含:多个第一正向扩增寡聚体;和多个第一反向扩增寡聚体。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述多个第一正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述多个第一正向扩增寡聚体中的第一正向扩增寡聚体被配置为与所述第一序列的区域杂交。
6.如权利要求3所述的方法,其中所述多个第一反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述多个第一反向扩增寡聚体中的第一反向扩增寡聚体被配置为与所述第一序列的区域杂交。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述第二组配对扩增寡聚体包含:第二正向扩增寡聚体;和第二反向扩增寡聚体。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述第二组配对扩增寡聚体包含:多个第二正向扩增寡聚体;和多个第二反向扩增寡聚体。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述多个第二正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述多个第二正向扩增寡聚体中的第二正向扩增寡聚体被配置为与所述第二序列的区域杂交。
12.如权利要求9所述的方法,其中所述多个第二反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述多个第二反向扩增寡聚体中的第二反向扩增寡聚体被配置为与所述第二序列的区域杂交。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述第一值和所述第二值提供对应于所述样品中所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的丰度的定量比率量度。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述第一检测探针或所述第二检测探针包含非靶标杂交序列。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述第一检测探针或所述第二检测探针是发夹检测探针。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述发夹检测探针是分子信标或分子火炬。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述样品包括:基因组DNA、mRNA、cDNA或其组合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述样品源自孕妇的血浆。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述样品包括母体核酸和胎儿核酸。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述第一多个核酸包含所述胎儿核酸,并且其中所述第二多个核酸包含所述母体核酸。
22.如权利要求20或21所述的方法,其中所述比率的所述确定提供胎儿级分。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述样品来自患有或疑似患有癌症的个体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中所述第一信号和所述第二信号在单个荧光通道中生成。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法,其中(B)在多个分区中的至少一个分区中进行。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述多个分区是多个微滴。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述多个分区是多个孔。
28.如权利要求1所述的方法,其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列的至少一部分。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述PCR是定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述第一检测探针包含第一可检测标记,并且所述第二检测探针包含第二可检测标记。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述第一检测探针和所述第二检测探针各自进一步包含猝灭剂。
34.如权利要求32或33所述的方法,其中在所述扩增反应期间,所述第一可检测标记从所述第一检测探针释放,并且所述第二可检测标记从所述第二检测探针释放,从而生成所述第一信号和所述第二信号。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法,其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记各自选自化学发光标记、荧光标记及其任何组合。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述第一信号或所述第二信号是化学发光信号、荧光信号或其任何组合。
38.如权利要求1所述的方法,还包括将所述比率与参考值进行比较。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述比较鉴定所述样品中遗传异常的存在或不存在。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列各自对应于与所述遗传异常无关的核酸区域。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述参考值由从多个第三核酸序列生成的多个第三值和从多个第四核酸序列生成的多个第四值得出。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述多个第三核酸序列和所述多个第四核酸序列各自对应于与所述遗传异常无关的核酸区域。
44.如权利要求39-43中任一项所述的方法,其中所述遗传异常是胎儿非整倍性。
45.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列的至少一部分。
46.如权利要求1-38中任一项所述的方法,还包括将所述比率与参考值进行比较。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法,其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
49.如权利要求1-46中任一项所述的方法,其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括qPCR,其中所述第一值由所述第一多个核酸的扩增动力学得出。
51.如权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括qPCR,其中所述第二值由所述第二多个核酸的扩增动力学得出。
52.如权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括dPCR,其中所述第一值由含有所述第一核酸序列的分区的数目得出。
53.如权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括dPCR,其中所述第二值由含有所述第二核酸序列的分区的数目得出。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中:
在(A)中,所述样品包括:
(vi)包含一个或多个另外的核酸序列的一种或多种另外的多个核酸;
(vii)被配置为扩增所述一个或多个另外的核酸序列的另外一组或多组配对扩增寡聚体;和
(viii)被配置为退火至所述一个或多个另外的核酸序列的区域的一种或多种另外的检测探针;
在(B)中,对所述一个或多个另外的核酸序列进行所述扩增反应,以从所述另外一组或多组检测探针生成一种或多种另外的信号;以及
在(C)中,确定所述第一值或所述第二值与从所述一种或多种另外的信号得出的一个或多个另外的值的另外的比率,从而分析所述大小分布。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述另外一组或多组配对扩增寡聚体包含n种扩增寡聚体;并且所述另外一组或多组检测探针包含n种另外的检测探针。
56.如权利要求55所述的方法,其中n是1至30之间的整数。
57.如权利要求1所述的方法,其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
58.如权利要求1所述的方法,其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
59.如权利要求1所述的方法,其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
60.一种用于鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在的方法,所述方法包括:
(A)提供样品,所述样品包括:
(i)多个胎儿核酸,每个胎儿核酸包含给定长度的第一核酸序列;
(ii)多个母体核酸,每个母体核酸包含比所述给定长度更长的第二核酸序列;
(iii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组寡核苷酸引物;
(iv)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组寡核苷酸引物;
(v)被配置为与所述第一核酸序列杂交的第一寡核苷酸探针;
(vi)被配置为与所述第二核酸序列杂交的第二寡核苷酸探针;
(B)扩增(a)所述第一核酸序列,以从所述第一寡核苷酸探针生成第一信号,并且扩增(b)所述第二核酸序列,以从所述第二寡核苷酸探针生成第二信号;
(C)确定从所述第一信号得出的值与从所述第二信号得出的第二值的比率;以及
(D)将所述比率与参考值进行比较,从而鉴定所述胎儿非整倍性的所述存在或不存在。
61.如权利要求60所述的方法,其中所述第一核酸序列对应于潜在与所述胎儿非整倍性相关的核酸区域。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述区域包含染色体22、染色体21、染色体18、染色体13、染色体9、染色体8或X染色体的区域。
63.如权利要求61所述的方法,其中所述区域包含染色体21的区域。
64.如权利要求62所述的方法,其中所述区域包含染色体18的区域。
65.如权利要求62所述的方法,其中所述区域包含染色体13的区域。
66.如权利要求62所述的方法,其中所述区域包含X染色体的区域。
67.如权利要求60所述的方法,其中所述参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。
68.如权利要求67所述的方法,其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列各自对应于与所述胎儿非整倍性无关的核酸区域。
69.如权利要求60所述的方法,其中所述参考值由从多个第三核酸序列生成的多个第三值和从多个第四核酸序列生成的多个第四值得出。
70.如权利要求69所述的方法,其中所述多个第三核酸序列和所述多个第四核酸序列各自对应于与所述胎儿非整倍性无关的核酸区域。
71.如权利要求67-70所述的方法,其中所述区域是持家基因的区域。
72.如权利要求71所述的方法,其中所述持家基因是β-珠蛋白。
73.如权利要求60-72中任一项所述的方法,其中所述比率大于所述参考值,从而表明所述胎儿非整倍性的存在。
74.如权利要求60-72中任一项所述的方法,其中所述比率小于所述参考值,从而鉴定所述胎儿非整倍性的存在。
75.如权利要求60-74中任一项所述的方法,其中所述多个胎儿核酸和所述多个母体核酸获取自孕妇的血浆。
76.如权利要求60-75中任一项所述的方法,其中所述多个胎儿核酸包含胎儿脱氧核糖核酸(DNA),并且所述多个母体核酸包含母体DNA。
77.如权利要求60-76中任一项所述的方法,其中(b)中的所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。
78.如权利要求77所述的方法,其中所述PCR是定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)。
79.如权利要求60-78中任一项所述的方法,其中所述第一寡核苷酸探针包含第一可检测标记,并且所述第二寡核苷酸探针包含第二可检测标记。
80.如权利要求79所述的方法,其中所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针各自进一步包含猝灭剂。
81.如权利要求79或80所述的方法,其中在所述扩增反应期间,所述第一可检测标记从所述第一寡核苷酸探针释放,并且所述第二可检测标记从所述第二寡核苷酸探针释放,从而生成所述第一信号和所述第二信号。
82.如权利要求79-81中任一项所述的方法,其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记各自选自化学发光标记、荧光标记及其任何组合。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述第一信号或所述第二信号是化学发光信号、荧光信号或其任何组合。
85.如权利要求60-84中任一项所述的方法,其中所述第一组寡核苷酸引物包含第一正向引物和第一反向引物。
86.如权利要求60-85中任一项所述的方法,其中所述第二组寡核苷酸引物包含第二正向引物和第二反向引物。
87.如权利要求60-86中任一项所述的方法,其中所述胎儿非整倍性是21三体、18三体、13三体、9三体或8三体。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述胎儿非整倍性是21三体。
89.如权利要求87所述的方法,其中所述胎儿非整倍性是18三体。
90.如权利要求87所述的方法,其中所述胎儿非整倍性是13三体。
91.如权利要求87所述的方法,其中所述胎儿非整倍性是性染色体非整倍性。
92.如权利要求91所述的方法,其中所述性染色体非整倍性是特纳综合征、克氏综合征、X三体、XXY或XYY。
93.如权利要求60-92中任一项所述的方法,其中所述第二核酸序列不包含任何所述第一核酸序列。
94.如权利要求60所述的方法,其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列的至少一部分。
95.如权利要求94所述的方法,其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列。
96.如权利要求60-66中任一项所述的方法,其中所述参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。
97.如权利要求60-92中任一项所述的方法,其中所述第二核酸包含所述第一核酸序列的至少一部分。
98.如权利要求60-97中任一项所述的方法,其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
99.如权利要求60-98中任一项所述的方法,其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
100.如权利要求60-97中任一项所述的方法,其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
101.如权利要求60-100中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括qPCR,其中所述第一值由所述第一多个核酸的扩增动力学得出。
102.如权利要求60-100中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括qPCR,其中所述第二值由所述第二多个核酸的扩增动力学得出。
103.如权利要求60-100中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括dPCR,其中所述第一值由含有所述第一核酸序列的分区的数目得出。
104.如权利要求60-100中任一项所述的方法,其中所述扩增反应包括dPCR,其中所述第二值由含有所述第二核酸序列的分区的数目得出。
105.如权利要求60-104中任一项所述的方法,其中:
在(A)中,所述样品包括:
(vi)包含给定长度的一个或多个另外的第一核酸序列的一种或多种另外的多个胎儿核酸;
(vii)包含比所述给定长度更长的一个或多个另外的第二核酸序列的一种或多种另外的多个母体核酸;
(viii)被配置为扩增所述一个或多个另外的第一核酸序列的一种或多种另外的第一组寡核苷酸引物;
(xi)被配置为扩增所述一个或多个另外的第二核酸序列的一种或多种另外的第二组寡核苷酸引物;
(x)被配置为退火至所述一个或多个另外的第一核酸序列的区域的一种或多种另外的第一寡核苷酸探针;和
(xi)被配置为退火至所述一个或多个另外的第二核酸序列的区域的一种或多种另外的第二寡核苷酸探针;
在(B)中,对以下项进行所述扩增反应:所述一个或多个另外的第一核酸序列,以从所述一种或多种另外的第一寡核苷酸探针生成一种或多种另外的第一信号;和所述一个或多个另外的第二核酸序列,以从所述一种或多种另外的第二寡核苷酸探针生成一种或多种另外的第二信号;
在(C)中,确定从所述一种或多种另外的第一信号得出的一个或多个另外的第一值与从所述一种或多种另外的第二信号得出的一个或多个另外的第二值的另外的比率;以及
在(D)中,将所述另外的比率与所述参考值进行比较。
106.如权利要求105所述的方法,其中所述一种或多种另外的第一组寡核苷酸引物包含n种寡核苷酸引物;并且所述一种或多种另外的第一寡核苷酸探针包含n种另外的检测探针。
107.如权利要求105所述的方法,其中所述一种或多种另外的第二组寡核苷酸引物包含n种寡核苷酸引物;并且所述一种或多种另外的第二寡核苷酸探针包含n种另外的检测探针。
108.如权利要求106或107所述的方法,其中n是1至30之间的整数。
109.如权利要求60所述的方法,其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
110.如权利要求60所述的方法,其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
111.如权利要求60所述的方法,其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
112.如权利要求19所述的方法,其中使所述血浆经受足以富集胎儿核酸的条件。
113.如权利要求19所述的方法,其中所述血浆不经受足以富集胎儿核酸的条件。
114.如权利要求59所述的方法,其中使所述血浆经受足以富集胎儿核酸的条件。
115.如权利要求59所述的方法,其中所述血浆不经受足以富集胎儿核酸的条件。
116.如权利要求1-60中任一项所述的方法,其中所述第一多个核酸和所述第二多个核酸源自相同来源。
117.如权利要求1-60中任一项所述的方法,其中所述第一多个核酸和所述第二多个核酸源自不同来源。
118.一种用于分析核酸的大小分布的方法,所述方法包括:
(A)提供样品,所述样品包括:
(i)第一多个核酸和第二多个核酸,其中所述第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列,并且所述第二多个核酸各自包含比所述给定长度更长的第二核酸序列;
(ii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组配对寡核苷酸引物;和
(iii)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组配对寡核苷酸引物;
(B)对以下项进行扩增反应:(a)所述第一核酸序列,以生成第一信号,和(b)所述第二核酸序列,以生成第二信号;以及
(C)确定从所述第一信号得出的第一值与从所述第二信号得出的第二值的比率,从而分析所述大小分布。
119.如权利要求118所述的方法,其中所述样品还包括(iv)被配置为与所述第一核酸序列的区域杂交的第一寡核苷酸探针和(v)被配置为与所述第二核酸序列的区域杂交的第二寡核苷酸探针。
120.如权利要求119所述的方法,其中所述第一信号从所述第一寡核苷酸探针生成,并且所述第二信号从所述第二寡核苷酸探针生成。
121.如权利要求118所述的方法,其中所述样品还包括嵌入染料。
122.如权利要求121所述的方法,其中所述第一信号或所述第二信号从所述嵌入染料生成。
123.如权利要求121所述的方法,其中所述第一信号和所述第二信号从所述嵌入染料生成。
125.如权利要求118所述的方法,其中所述第一信号或所述第二信号由质谱分析法生成。
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