CN112969707A - 用于单核苷酸多态性的多重检测的具有多个结合基序的通用尾引物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于鉴定和区分样品内的一种或多种靶核酸的方法和组合物。所公开的方法可用于检测单核苷酸多态性(SNP)。所公开的方法可用于鉴定或检测核苷酸突变的存在或不存在。具有通用尾的突变特异性寡核苷酸探针的使用允许特异性检测样品中存在的SNP靶标。

Description

用于单核苷酸多态性的多重检测的具有多个结合基序的通用 尾引物

交叉引用

本申请要求2018年9月7日提交的第62/728,262号美国临时专利申请和2019年4月4日提交的第62/829,474号美国临时专利申请的权益，所述临时申请中的每一个均为了所有目的通过引用整体并入本文。

背景技术

实时PCR(qPCR)是用于检测单核苷酸多态性(SNP)的广泛使用的方法。SNP是在基因组中的特定位置处发生的单核苷酸的多态性。由于单碱基突变可能会因此增加或降低个体对多种疾病的易感性，因此了解个体是否具有已知的SNP突变是有利的。对SNP突变具有特异性的标记寡核苷酸探针的使用允许特异性检测样品中存在的SNP靶标。

发明内容

在一些方面，本文公开了一种在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：(A)提供包含或可能包含所述靶核酸和所述非靶核酸的样品；(B)形成混合物，其包含：(i)所述样品；(ii)正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及(iii)信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；(C)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及(D)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，所述靶核酸是等位基因。在一些实施方案中，所述靶核酸是突变序列，并且所述非靶核酸是野生型序列。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

在一些实施方案中，所述正向引物对所述靶核酸具有特异性，并且仅选择性地扩增所述靶核酸。在一些实施方案中，所述混合物不使用核酸或肽阻断剂。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含反向引物。在一些实施方案中，所述正向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第一区域杂交，并且所述反向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第二区域杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增所述核酸序列。在一些实施方案中，所述第一区域包含所述核酸序列的3’端。在一些实施方案中，所述第二区域包含所述核酸序列的5’端。在一些实施方案中，所述反向引物包含与靶核酸和非靶核酸上的序列均互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述反向引物是基因座特异性引物。在一些实施方案中，所述反向引物是通用引物。

在一些实施方案中，所述反向引物被配置为使得在所述热循环后，所述信号生成核酸探针被消化。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含核酸酶。在一些实施方案中，所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述PCR是定量聚合酶链反应(qPCR)。在一些实施方案中，所述扩增条件包括：dNTP、盐、缓冲液或其组合。

在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针进一步包含信号标签。在一些实施方案中，所述信号标签生成所述信号。在一些实施方案中，所述信号标签在所述可切割的信号生成核酸探针被所述核酸酶的5’至3’外切核酸酶活性降解时生成所述信号，从而释放所述信号以供通过实时PCR仪器进行检测。

在一些实施方案中，所述扩增条件包括热循环，并且每个热循环在适合于所述正向引物与所述靶核酸退火的退火温度下进行。在一些实施方案中，所述第二区域包含：(A)靶标特异性尾区段；和(B)通用尾区段。在一些实施方案中，所述第一区域位于正向引物的3’端。在一些实施方案中，所述通用尾区段位于所述正向引物的5’端。在一些实施方案中，所述靶标特异性尾区段在3’侧翼为所述靶标特异性区段，并且在5’端侧翼为所述正向引物上的所述通用尾区段。

在一些实施方案中，可以使用多个正向引物。在一些实施方案中，所述多个正向引物的每个第二区域包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个正向引物的每个第二区域包含不相似的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个正向引物的每个第二区域包含独特的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针包含与所述正向引物互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；(B)与所述整个靶标特异性尾互补或同源的序列；和(C)与所述第一区域的一部分互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；和(B)与所靶标特异性尾的一部分互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述核酸探针与由所述扩增反应中引发的第二链合成所生成的扩增子中的所述靶核酸结合。

在一些实施方案中，所述混合物进一步包含第二核酸引物。在一些实施方案中，所述第二核酸引物是靶标特异性引物。在一些实施方案中，所述第二核酸引物被配置为与所述靶核酸或其衍生物杂交，而不被配置为与所述非靶核酸或其衍生物杂交。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶标特异性引物与所述靶核酸的序列同源或互补。在一些实施方案中，所述第二核酸引物是通用引物。在一些实施方案中，所述通用引物与所述第二区域的序列互补或同源。在一些实施方案中，所述第二核酸引物被配置为在热循环时消化所述可切割的信号生成探针。在一些实施方案中，所述信号生成探针包含与所述靶核酸同源或互补的序列。

在一些实施方案中，所述信号生成探针被配置为与所述第二区域和所述第一区域退火。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述第二区域或所述第一区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第一区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第二区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述靶核酸的序列或其互补序列杂交。

在一些实施方案中，所述靶核酸和所述非靶核酸在包含至少一个核苷酸的分歧位置(divergence location)处是不同的，并且所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。在一些实施方案中，所述第二区域包含：(A)通用探针结合基序；和(B)通用引物结合基序。在一些实施方案中，所述信号生成探针被配置为结合所述通用探针结合基序。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含被配置为结合所述通用引物结合基序的通用引物。在一些实施方案中，所述靶标特异性区段位于所述正向引物的3’端。在一些实施方案中，所述通用引物结合基序位于所述通用尾引物的5’端。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序的侧翼为所述第一区域的5’端和所述通用引物结合基序的3’端。

在一些实施方案中，当使用所述多个正向引物时，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个正向引物时，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述第二区域包含第二通用探针结合基序。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含具有与所述第二通用探针结合基序互补或同源的序列的探针。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含相同的序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含不同的序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合相同的探针序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合不同的探针序列。在一些实施方案中，所述第二通用探针结合基序与所述通用结合基序相邻，并且所述第二通用探针结合基序和所述通用结合基序在所述第一区域的3’端，并且在所述通用引物结合基序的5’上。在一些实施方案中，当使用多个所述正向引物时，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个所述正向引物时，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个正向引物时，所述至少两个通用探针结合基序中的每一个包含独特的核苷酸序列。

在一些方面，本文公开了一种在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：(A)提供包含所述靶核酸的样品；(B)形成混合物，其包含：(i)所述样品；(ii)不可延伸的核酸引物，其中所述不可延伸的核酸引物包含被配置为与所述靶核酸杂交并且被配置为不与所述非靶核酸结合的第一区域，和被配置为不与所述靶核酸杂交的第二区域，并且其中所述不可延伸的核酸引物包含靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基，所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基被配置为当所述第一区域与所述靶核酸杂交时在所述靶核酸的靶碱基处形成碱基杂合对，而在所述非靶核酸中的相应碱基处不形成所述碱基杂合对；以及(iii)信号生成核酸探针；(C)使所述混合物经受切割条件，使得包含所述碱基杂合对的核酸被切割，使得所述不可延伸的核酸被切割，从而将所述不可延伸的核酸引物转化为可延伸的引物；(D)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，使得如果所述混合物中存在所述靶核酸，则所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及(E)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

在一些实施方案中，所述扩增反应包括逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述不可延伸的核酸引物的所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基位于与所述靶核酸互补的位置处。在一些实施方案中，所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基有助于所述靶核酸的选择性扩增。在一些实施方案中，所述碱基杂合对是DNA:RNA对、DNA:非天然碱基或RNA:非天然碱基对。

在一些实施方案中，如(C)中所述，所述不可延伸的核酸引物在所述碱基杂合对处或与之相邻的位置处被切割。在一些实施方案中，所述切割条件包括用于切割所述第一不可延伸的核酸引物的另外的试剂或酶。在一些实施方案中，所述另外的酶是核糖核酸酶H。

在一些实施方案中，所述靶核酸是等位基因。在一些实施方案中，所述靶核酸是突变序列，并且所述非靶核酸是野生型序列。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

在一些实施方案中，所述可延伸的引物对所述靶核酸具有特异性，并且仅选择性地扩增所述靶核酸。在一些实施方案中，所述混合物不使用核酸或肽阻断剂。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含反向引物。在一些实施方案中，所述可延伸的引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第一区域杂交，并且所述反向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第二区域杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增所述核酸序列。在一些实施方案中，所述第一区域包含所述核酸序列的3’端。在一些实施方案中，所述第二区域包含所述核酸序列的5’端。在一些实施方案中，所述反向引物包含与靶核酸和非靶核酸上的序列均互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述反向引物是基因座特异性引物。在一些实施方案中，所述反向引物是通用引物。

在一些实施方案中，所述反向引物被配置为使得在所述热循环后，所述信号生成核酸探针被消化。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含核酸酶。在一些实施方案中，所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述PCR是定量聚合酶链反应(qPCR)。在一些实施方案中，所述扩增条件包括：dNTP、盐、缓冲液或其组合。

在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针进一步包含信号标签。在一些实施方案中，所述信号标签生成所述信号。在一些实施方案中，所述信号标签在所述可切割的信号生成核酸探针被所述核酸酶的5’至3’外切核酸酶活性降解时生成所述信号，从而释放所述信号以供通过实时PCR仪器进行检测。

在一些实施方案中，所述扩增条件包括热循环，并且每个热循环在适合于所述可延伸的引物与所述靶核酸退火的退火温度下进行。在一些实施方案中，所述第二区域包含：(A)靶标特异性尾区段；和(B)通用尾区段。在一些实施方案中，所述第一区域位于可延伸的引物的3’端。在一些实施方案中，所述通用尾区段位于所述可延伸的引物的5’端。在一些实施方案中，所述靶标特异性尾区段在3’侧翼为所述靶标特异性区段，并且在5’端侧翼为所述不可延伸的引物上的所述通用尾区段。

在一些实施方案中，使用多个不可延伸的引物。在一些实施方案中，所述多个不可延伸的引物的每个第二区域包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个不可延伸的引物的每个第二区域包含不相似的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个不可延伸的引物的每个第二区域包含独特的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针包含与所述不可延伸的引物互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；(B)与所述整个靶标特异性尾互补或同源的序列；和(C)与所述第一区域的一部分互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；和(B)与所靶标特异性尾的一部分互补或同源的序列。在一些实施方案中，所述核酸探针与由所述扩增反应中引发的第二链合成所生成的扩增子中的所述靶核酸结合。

在一些实施方案中，所述混合物进一步包含第二核酸引物。在一些实施方案中，所述第二核酸引物是靶标特异性引物。在一些实施方案中，所述第二核酸引物被配置为与所述靶核酸或其衍生物杂交，而不与所述非靶核酸或其衍生物杂交。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶核酸的所述序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。在一些实施方案中，所述靶标特异性引物与所述靶核酸的序列同源或互补。在一些实施方案中，所述第二核酸引物是通用引物。在一些实施方案中，所述通用引物与所述第二区域的序列互补或同源。在一些实施方案中，所述第二核酸引物被配置为在热循环时消化所述可切割的信号生成探针。在一些实施方案中，所述信号生成探针包含与所述靶核酸同源或互补的序列。

在一些实施方案中，所述信号生成探针被配置为与所述第二区域和所述第一区域退火。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述第二区域或所述第一区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第一区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第二区域杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述靶核酸的序列或其互补序列杂交。

在一些实施方案中，所述靶核酸和所述非靶核酸在包含至少一个核苷酸的分歧位置处是不同的，并且所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。在一些实施方案中，所述第二区域包含：(A)通用探针结合基序；和(B)通用引物结合基序。在一些实施方案中，所述信号生成探针被配置为结合所述通用探针结合基序。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含被配置为结合所述通用引物结合基序的通用引物。在一些实施方案中，所述靶标特异性区段位于所述不可延伸的引物的3’端。在一些实施方案中，所述通用引物结合基序位于所述通用尾引物的5’端。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序的侧翼为所述第一区域的5’端和所述通用引物结合基序的3’端。

在一些实施方案中，当使用所述多个不可延伸的引物时，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个不可延伸的引物时，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述第二区域包含第二通用探针结合基序。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含具有与所述第二通用探针结合基序互补或同源的序列的探针。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含相同的序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含不同的序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合相同的探针序列。在一些实施方案中，所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合不同的探针序列。在一些实施方案中，所述第二通用探针结合基序与所述通用结合基序相邻，并且所述第二通用探针结合基序和所述通用结合基序在所述第一区域的3’端，并且在所述通用引物结合基序的5’上。在一些实施方案中，当使用多个所述不可延伸的引物时，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个所述不可延伸的引物时，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用所述多个不可延伸的引物时，所述至少两个通用探针结合基序中的每一个包含独特的核苷酸序列。

在一些方面，本文公开了一种用于在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括：(A)正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；(B)信号生成核酸探针，当经受所述扩增条件时，其与所述第二区域或与之互补的区域退火；以及(C)说明书。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针被配置为在引入靶核酸并暴露于适当的条件时降解，并且如果所述混合物中存在所述靶核酸，则生成信号；并且所述信号的存在或不存在被配置为被检测。

在一些方面，本文公开了一种用于在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的系统，所述系统包括：(A)反应容器，其被配置为接收：(i)所述样品；(ii)正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及(iii)信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；(B)热循环仪，其被配置为使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及(C)检测器，其被配置为检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

在一些方面，本文公开了一种系统，其包括控制器，该控制器包括或能够访问包含非暂时性计算机可执行指令的计算机可读介质，所述非暂时性计算机可执行指令在被至少一个电子处理器执行时实现包括以下步骤的方法：(A)提供包含或可能包含所述靶核酸和所述非靶核酸的样品；(B)形成混合物，其包含：(i)所述样品；(ii)正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及(iii)信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；(C)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及(D)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

如本文所公开的系统和试剂盒可被配置或构建为执行如本文所述的方法。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：

图1展示了使用等位基因特异性通用尾引物的PCR如何可以用来选择性地扩增突变等位基因。图1a描绘了DNA样品可含有突变等位基因和野生型等位基因。图1b示出了通用尾引物如何可以特异于并且仅扩增突变等位基因。图1c显示了并入另外的引物可用来切割与通用尾引物互补的

探针。

图2揭示了可用来选择引物和探针位置以报告突变等位基因的存在的各种策略。图2a展示了如何可以将突变体特异性报告探针设计成对突变等位基因为特异性的。图2b建立了可用来消化报告探针的第二突变体特异性引物。图2c公开了与通用尾引物共享同源性的通用引物，其可以类似地用来消化突变体特异性探针。

图3公开了可以将通用尾引物设计成具有多个同源性区域：其(i)对等位基因是特异性的；(ii)对突变报告标签是特异性的；并且(iii)对另外的通用引物是特异性的。

图4示出了如何能够以多种构型读出并入了三个不同同源性区域的通用尾引物(一个对突变等位基因具有特异性，一个被工程改造为标记突变等位基因，而一个对通用引物具有特异性)。

图5A和图5B显示了具有通用探针结合基序的通用加尾引物，其中所述加尾引物序列在3’端含有靶标特异性序列，在5’端含有通用引物结合基序，并且其中该通用探针结合基序处于靶标特异性序列与通用引物结合基序之间。

图6介绍了包含至少两个通用探针结合基序的通用加尾引物。所述加尾引物序列在3’端含有靶标特异性序列，在5’端含有通用引物结合基序，并且其中至少两个通用探针结合基序处于靶标特异性序列与通用引物结合基序之间。

图7显示了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机控制系统。

具体实施方式

以下描述提供了用于全面理解并允许描述本技术的各个实施方案的具体细节。所使用的术语旨在以最广泛的合理方式解释，即使与某些实施方案的详细描述一起使用。

在详细描述本教导之前，应当理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因此可以有所不同。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。此外，就说明书和/或权利要求书中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“如”或其变化形式而言，这些术语并非限制性的，并且旨在以与术语“包含”类似的方式为包含性的。除非明确指出，否则说明书中“包含”各种组分的实施方案也被理解为“由所列举的组分组成”或“基本上由所列举的组分组成”。

聚合酶链反应(PCR)是使用核酸聚合酶和引物指数扩增反应混合物中的特定靶核酸的方法。引物是短的单链寡核苷酸，其显示互补于靶序列的正链和负链的3’序列。该反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链靶核酸变性或分离成单链模板。在冷却循环中，引物与每条模板链上的互补序列结合。在模板被引发后，核酸聚合酶产生原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍；导致靶序列在30个循环中增加大约10亿倍(Saiki等人，1988)。

实时PCR(qPCR)是通过记录每个循环由嵌入染料如SYBR Green或靶标特异性报告探针生成的荧光来监测PCR反应的过程。这通常在实时PCR仪上进行，该PCR仪执行混合物的热循环以完成PCR循环，并且在每个循环中的指定点通过一系列激发/发射滤光器组来测量每个通道中的混合物的荧光。

可以通过将每个靶核酸编码为独特的强度值或数值范围来进行单个测量中的多个靶核酸的多重分析。例如，当使用一次测量来检测样品中的多个靶核酸时，可以以不同的浓度提供寡核苷酸探针，使得由探针生成的每个信号的强度(无论是单独地还是组合地)都是唯一的。

如本文所用的，术语“通道”、“颜色通道”或“光学通道”是指波长范围。可以基于去除或“滤除”特定波长的特定滤波器来设置或确定波长范围。术语“通道”、“颜色通道”和“光学通道”可互换使用。

概述

单核苷酸多态性(SNP)是一种类型的多态性，其涉及DNA分子区段中单个核苷酸——腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)——的变异。SNP可以是多核苷酸序列内单个核苷酸碱基的转换(即，置换)、去除(即，缺失)或添加(即，插入)。SNP可以落入基因的编码或非编码序列内。自然地，基因型改变可能因此影响人对药物的生理反应和/或增加疾病的可能性。因此，鉴定与疾病状态具有已知推论关系和/或关联性的SNP对于诊断目的是有益的。

某些SNP在某些群体中可能更为普遍。在群体和/或地理区域内，可以为SNP分配次要等位基因频率，即，SNP在特定位置出现的频率。由于在一个地理区域或族群中常见的SNP在其他地理区域或族群中可能并不普遍，因此使用SNP进行的比较统计学可提供另外的诊断益处。

区分和/或检测SNP的方法需要高度特异性和灵敏性。聚合酶链反应(PCR)为许多分子分析提供了必要的分析性能。实时PCR(qPCR)是通过记录每个循环由嵌入染料或靶标特异性报告探针生成的荧光来监测PCR反应的过程。在单重(singleplex)PCR中，单个靶标被扩增。在多重PCR中，多个靶标被扩增。在荧光多重PCR中，多个靶核酸序列的检测是通过将每个靶核酸与不同的荧光标签如

探针、FRET探针或分子信标相关联来完成的。

常规的基于PCR的SNP检测方法大致分为两个方法类别：(1)等位基因特异性PCR，其使用与置换的核苷酸相匹配的引物来阻断非靶向模板；或(2)与实时PCR相组合的解链曲线分析。然而，上述用于SNP检测的PCR方法各自具有限制被广泛采用的局限性。例如，等位基因特异性PCR利用核酸或蛋白质阻断剂来选择性抑制野生型等位基因的扩增。这些阻断剂以比引物本身更强的动力学与引发位置结合。重要的是，阻断剂的设计并非简单直接的，通常会阻止它们在许多应用中的使用。另外，虽然可以使用带有末端荧光碱基对的引物来鉴定特定的点突变，但是该方法需要使用电泳柱来分离所得的荧光标记的、不可延伸的产物。

本公开介绍了一种使用靶标特异性引物在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在的新颖手段，该靶标特异性引物可以不使用阻断剂而区分靶标和非靶标。如本文所用的，术语“靶标”和“靶核酸”可以互换使用。如本文所用的，术语“非靶标”和“非靶核酸”可以互换使用。具体而言，可以使用靶标特异性引物——特异于且仅能够扩增靶等位基因——来区分靶扩增子的荧光信号(参见图1和图3)。

具体而言，本公开可用于区分相差少至一个碱基对(例如SNP)的突变型和野生型等位基因。靶核酸和非靶核酸可以仅有一个碱基对或核苷酸不同。靶核酸和非靶核酸可以相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更少的碱基对。靶核酸和非靶核酸可以相差至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更多的碱基对。

本公开的靶标特异性引物可以被构建为包含两个区域：与靶标具有互补性或同源性、被配置为与靶标杂交的第一区域，以及不与靶标互补或同源或者不被配置为与靶标杂交的第二区域。第二区域可包含可以与其他引物共有的序列。第二区域可以由如本文其他地方所述的任何序列构建，该序列不与靶核酸互补或同源，并且不被配置为与靶标杂交或结合。该序列和相应区域可以被称为通用的，因为它是与靶标无关或独立于靶标的序列，并且可以被附加到任何靶标特异性引物序列上，从而是“通用的”，并且在包含靶核酸特异性区域的引物序列的末端(因此是“尾”)。包含该通用尾的引物可被称为通用尾引物。

在一些实施方案中，通用尾引物可包含：与靶核酸互补的靶标特异性区段；不与靶核酸互补的靶标特异性尾区段；和不与靶标互补的通用尾区段。与等位基因靶标互补的靶标特异性区段可位于引物的3’端，而通用尾区段可位于引物的5’端。靶标特异性尾区段可处于3’靶标特异性区段与5’通用尾区段之间。通用尾引物可被设计为具有多个同源性区域：一个对等位基因具有特异性，一个对突变报告标签具有特异性，一个对另外的通用引物具有特异性。

附接至靶标特异性引物序列的通用尾提供若干优点。首先，通用尾将信号生成与靶序列断开，从而减少所需的扩增子长度和包含性靶标(inclusivity targets)之间的同源性。其次，通用尾允许多个靶标具有相同的通用尾，从而从非同源序列生成相同的信号(对于分歧序列是理想的)。第三，通用尾增加了对靶序列的特异性，因为需要在加尾引物中有显著较低的靶标特异性引物浓度。最后，通用尾缩短了测定设计时间，因为通用引物和探针独立于测定。

在一些实施方案中，通用加尾引物可以进一步并入多个探针结合基序。在通用加尾引物的简化示例中，将具有合成序列尾的靶标特异性“正向”引物与靶标特异性反义“反向”引物配对，以允许指数扩增。通用探针与尾的反义结合，而通用正向引物可以与加尾引物的反义结合。加尾引物序列包含位于3’端的靶标特异性序列、与生成信号的TaqMan探针同义(in the same sense)的探针结合基序以及位于5’端的与通用引物同义的通用引物结合基序(参见图5)。当将尾并入PCR扩增子中时，反向引物生成可以结合通用引物和探针的反义链。因此，通用引物而不是加尾引物成为靶序列扩增的主要驱动物，并水解通用探针。

在通用加尾引物中包含至少两个探针结合基序提供了另外的新的优点(参见图6)。包含另外的结合基序允许对单个或成组靶标进行广泛的条形码化以用于HDPCR或弹性编码方案，从而增强通用报告系统。在一些实施方案中，探针结合基序可以是不同的。包含多个探针结合基序允许跨多个颜色通道以相同或不同的水平检测靶标，而在探针之间没有竞争。多个探针信号将在检测通道之间同步，因为它们是由模板生成的，允许使用曲线匹配算法来提高判定置信度，而如果通道包含多个不同的探针，则可以用相同的染料在同一通道内以非主要水平检测单个靶标。在一些实施方案中，探针结合基序可以是重复。相同探针结合基序的重复允许每个扩增子在每个循环中添加的荧光的整数倍增加；从而在不改变终点强度水平的情况下，探针结合基序每增加2倍，就减少循环阈值交叉点1个循环。

在一些实施方案中，报告探针可以被设计成对靶标是特异性的。(参见图2)。在一些实施方案中，所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针。在一些实施方案中，靶标特异性探针与靶标特异性引物同义，并且包含通用尾的3’端的区段、整个靶标特异性尾以及与靶标特异性区段互补的部分。在其他实施方案中，靶标特异性探针包含通用尾的3’端的区段和靶标特异性尾的一部分。在一些实施方案中，探针与由靶基因座共同的引物通过第二链合成生成的扩增反应产物结合。在其他实施方案中，所述信号生成核酸探针是通用探针。通用探针可以结合通用尾。通用探针可以结合通用尾，而与靶标的序列无关。

在单个反应中消化信号生成探针(不使用阻断剂)比常规等位基因特异性PCR方法检测SNP具有更高的特异性，该常规方法使用与置换的核苷酸相匹配的引物来阻断非靶向模板。在一些实施方案中，第二靶标特异性引物可用来消化报告探针。在其他实施方案中，与通用尾引物共享同源性的通用引物可用来消化靶标特异性探针。在一些实施方案中，通用引物具有通用尾的全部或5’部分的相同序列，并且存在于针对基于

的qPCR探针的反应中。

值得注意的是，通用尾方法可以与其他靶标特异性方法结合使用，以增加靶标相对于非靶标的竞争性扩增。例如，在一个实施方案中，可以将RNA、DNA或非天然碱基置换为不可延伸的靶标特异性通用加尾引物。不可延伸的核酸引物可包含靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基，所述碱基被配置为当所述第一区域与所述靶核酸杂交时，在所述靶核酸的靶碱基处形成碱基杂合对，而在非靶核酸中的相应碱基处不形成所述碱基杂合对。碱基杂合对可以是RNA:DNA对、DNA:非天然碱基对或RNA:非天然碱基对。例如，在一个实施方案中，可以在与突变或SNP互补的位置处将RNA、DNA或非天然碱基置换为不可延伸的靶标特异性通用加尾引物。当通用尾引物与突变等位基因结合(由于碱基对同源性)时，它将在突变的位置或靶标与非靶标之间的序列分歧处形成RNA:DNA杂交。然后可以用另外的酶——核糖核酸酶H切割该键。切割后，通用尾引物可以用DNA聚合酶延伸。在其他实施方案中，靶核酸可以是RNA，例如mRNA。引物可包含DNA，以生成RNA:DNA碱基杂合对。

通用尾引物的使用进一步允许在单色通道中检测多个突变。例如，单个通用尾可以与多个SNP特异性尾结合使用，或者多个通用尾可以与多个SNP特异性尾结合使用。

图1显示了含有突变等位基因(靶核酸)和野生型(非靶核酸)的DNA样品的检测。图1B显示了包含通用尾的引物和等位基因特异性引物(靶标特异性引物)，后者与突变等位基因(靶标)而非野生型(非靶标)退火。在使用引物延伸或扩增后，形成具有通用尾的核酸链。然后可以使用多种方法检测该链。图1C显示了被配置为与新链结合的探针的使用，其中该探针与通用尾的一部分以及靶标特异性引物序列的一部分互补。具体而言，该探针可包含与靶核酸中的SNP或突变同源或互补的序列。使用基因座特异性引物(其可以结合野生型和突变体两者)，进行延伸反应，并且可以通过探针的消化生成信号。由于未扩增，野生型(非靶标)不产生任何信号，因此探针对包含通用尾和突变的扩增靶标具有特异性。

图2显示了在靶标或突变核酸延伸后生成信号的其他实施方案。图2A显示了图1C中描述的类似实施方案。图2B显示了一个实施方案，其中将突变体特异性引物(即含有SNP或突变的引物)与探针一起使用，该探针被配置为结合通用尾的一部分以及靶标特异性引物序列的一部分。图2C显示了可以与通用尾的一部分杂交的通用引物的使用，并且该探针是与靶核酸的区域同源或互补的突变体特异性探针。

图3显示了与图1B类似的实施方案，其具有额外的突变靶标标签(靶标特异性尾区段)。该实施方案可以如图1B-C所示类似地操作。突变标签或靶标特异性尾区段的添加可以充当用于观察靶核酸的附加标识符。

图4A-C显示了与图2A-C类似的实施方案，不同之处在于添加了突变靶标标签(靶标特异性尾区段)，并且如针对图2A-C所述类似地操作。

图5A-B显示了具有通用引物结合基序和通用探针结合基序的引物的使用。循环1显示引物的延伸，以生成具有通用尾的扩增子。循环2使用具有通用尾的延伸的扩增子，并使用靶标特异性反向引物生成反义扩增子。图5B显示了反应的第三循环，其中可以使用图5A的反义扩增子生成信号。使用与通用探针结合基序结合或杂交的通用探针，以及与通用引物基序结合或杂交的通用引物。然后通过延伸反应生成来自探针的信号。

图6显示了一个实施方案，其中引物具有两个通用探针结合基序(通用探针结合基序A和通用探针结合基序B)。两个相同或不同的探针可以与这些基序结合，使信号可以在多个通道中展示。图6中示出的引物可以如图5A-B所示使用。

测定

在一些方面，本公开提供了用于明确检测混合物中多个靶核酸的存在或不存在的测定。靶核酸的检测可以通过使用两个或更多个反应来完成。例如，用于测量多个靶核酸的测定可包括第一反应和第二反应。第一和第二反应的结果可以一起明确地检测每个靶核酸的存在或不存在。

可以使用本公开的测定来检测任何数目的靶核酸。在一些情况下，测定可以明确地检测至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更多个靶核酸。在一些情况下，测定可以明确地检测至多50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个靶核酸。测定可以包括任何数目的反应，其中这些反应的结果一起确定多个靶核酸的存在或不存在的任何组合。测定可包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个反应。

反应可以在相同的混合物溶液体积中进行。例如，第一反应可以在第一颜色通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。或者，反应可以在不同的混合物溶液体积中进行。例如，第一反应可以在第一混合物溶液体积中进行，并在给定的颜色通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二混合物溶液体积中进行，并在相同的颜色通道或不同的颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。

如本文所述的测定反应可以平行进行。通常，平行测定反应是在相同反应容器中同时发生的反应。例如，平行核酸扩增反应可以如下进行：在反应容器中包括用于每个核酸扩增反应的试剂来获得反应混合物，并使该反应混合物经受用于每个核酸扩增反应的条件。任何合适数目的核酸扩增反应可以平行进行。在一些情况下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸扩增反应平行进行。

在一些方面，所公开的方法利用了可以用荧光团标记的寡核苷酸探针的使用。可以在另一波长下发光的波长下激发荧光分子。荧光分子可以是人肉眼可见的。荧光分子可以是通过光谱方法可见或可鉴定的，以分析由包含荧光分子的溶液透射或吸收的光的波长。荧光团可能能够在单个光学通道中被检测到(例如，荧光团可以各自包括相似的发射波长谱，使得它们可以在单个光学通道中被检测到)。荧光团可能能够在超过一个光学通道中被检测到(例如，荧光团可以各自包括发射波长谱，使得它们可以在一个或多个光学通道中被检测到)。荧光分子可具有电磁辐射的激发或发射波长的独特或已知的特征。荧光分子特征的检测可包括确定信号在不同波长下的一个或多个振幅。荧光分子特征可包括在一定波长下的信号，该波长与化学组合物中的试剂可生成的波长不重叠。在一些情况下，该分子的激发波长可包括与化学组合物中的试剂可生成的波长不重叠的信号。在一些情况下，可以同时检测该反应和荧光分子的信号。在一些情况下，可以由寡核酸探针生成N个信号。这N个信号中的每个信号可以对应于靶核酸的独特组合的存在。

反应可以包括生成累积信号测量值。本公开的测定可包括比较两个或更多个累积信号测量值，以明确地检测混合物中靶核酸的任何组合。累积信号测量值可包括从提供给混合物溶液的一个或多个探针生成的一种或多种信号。累积信号测量值可以是信号强度水平，其对应于从多个寡核苷酸探针生成的信号的总和。

扩增

在一些方面，所公开的方法包括核酸扩增。扩增条件可包括热循环条件，其包括每个热循环的温度和时间长度。扩增反应可以是PCR反应。扩增反应可以是RT-PCR反应。扩增反应可以是数字PCR反应。特定扩增条件的使用可用来修改每个信号的信号强度，从而使每个信号能够对应于靶核酸的独特组合。扩增可包括生成具有附加序列的扩增子，例如添加通用尾区段或靶标特异性尾区段。扩增可包括使用酶来产生核酸的额外拷贝。扩增反应可包括使用如本文其他地方所述的引物。引物可以使用特定序列来扩增特定序列。引物可通过与引物上游和下游的序列杂交来扩增特定序列，并导致在上游引物与下游引物之间包含的序列的扩增。扩增反应可包括使用核苷酸三磷酸试剂。核苷酸三磷酸试剂可包括使用脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。核苷酸三磷酸试剂可以用作扩增的核酸的前体。扩增反应可包括使用如本文其他地方所述的寡核苷酸探针。扩增反应可包括使用酶。酶的非限制性实例包括热稳定酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。扩增反应可包括生成不同核苷酸类型的核酸分子。例如，靶核酸可包含DNA，并且可以生成RNA分子。在另一个实例中，可以使RNA分子经历扩增反应，并且可以生成cDNA分子。

热循环

本公开的方法可以包括热循环。热循环可以包括一个或多个热循环。热循环可以在适合于用PCR扩增模板核酸的反应条件下进行。模板核酸的扩增可能需要引物与模板核酸结合或退火。适当的反应条件可以包括适当的温度条件、适当的缓冲液条件和适当试剂的存在。在一些情况下，适当的温度条件可以使得每个热循环在所需的退火温度下进行。所需的退火温度可能足以使寡核苷酸探针与靶核酸退火。在一些情况下，适当的缓冲液条件可以使得在热循环过程中使用的缓冲液中存在适当的盐。适当的盐可以包括镁盐、钾盐、铵盐。适当的缓冲液条件可以使得适当的盐以适当的浓度存在。用于通过PCR扩增多个靶核酸的每个成员的适当试剂可以包括脱氧三磷酸(dNTP)。dNTP可包括天然或非天然dNTP，包括例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其变体。

在各个方面，利用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。在各个方面中的任一方面，可以进行引物延伸反应的多个循环。可以进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以小于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可以取决于，例如，用来获得可检测的扩增产物(例如，可检测量的扩增DNA产物，其指示核酸样品中存在靶DNA)的循环数(例如，循环阈值(Ct))。例如，用来获得可检测的扩增产物(例如，可检测量的DNA产物，其指示核酸样品中存在靶DNA)的循环数可以小于约或约为100个循环、75个循环、70个循环、65个循环、60个循环、55个循环、50个循环、40个循环、35个循环、30个循环、25个循环、20个循环、15个循环、10个循环或5个循环。此外，在一些实施方案中，可检测量的可扩增产物(例如，可检测量的DNA产物，其指示核酸样品中存在靶DNA)可以在小于100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的循环阈值(Ct)下获得。

扩增反应产生可检测量的扩增核酸的时间可以根据核酸样品、靶核酸的序列、引物的序列、进行的特定核酸扩增反应和扩增的特定循环数、反应温度、反应pH值而不同。例如，靶核酸的扩增可以在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短或者5分钟或更短的时间段产生指示存在靶核酸的可检测量的产物。

在一些实施方案中，核酸的扩增可以在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短或者5分钟或更短的时间段产生可检测量的扩增DNA。

靶核酸

在一些情况下，靶核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA，包括基因组DNA。靶核酸可以是病毒DNA。靶核酸可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。靶核酸可包括其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于确定受试者中是否存在病原体的病毒基因或细菌基因。

靶核酸可具有任何长度。靶核酸可以是，例如，至多1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、50000或100000个或更多个核苷酸。在一些情况下，靶核酸可以是基因。靶核酸可以是等位基因。靶核酸可以是野生型等位基因的突变体。靶核酸可以是突变体，而非靶核酸可以是相应的野生型序列。靶核酸可包含SNP。靶核酸可包括其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于确定受试者中是否存在病原体的病毒基因或细菌基因。在一些情况下，本公开的方法可用于检测受试者中是否存在一种或多种感染原(例如，病毒)。

靶核酸在反应中可以是各种浓度。可以将核酸样品稀释或浓缩，以获得不同浓度的核酸。核酸样品中核酸的浓度可以是至少0.1纳克/微升(ng/μL)、0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40、ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、1000ng/μL、10000ng/μL或更高。在一些情况下，核酸样品中核酸的浓度可以是至多ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40、ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、1000ng/μL、10000ng/μL或更低。

样品

本公开的靶核酸可以来源于生物样品。生物样品可以是来源于受试者的样品。生物样品可以包含任何数目的大分子，例如细胞大分子。生物样品可以来源于另一样品。生物样品可以是组织样品，如活检物、针芯活检物、针抽吸物或细针抽吸物。生物样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。生物样品可以是皮肤样品。生物样品可以是颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可以包含一个或多个细胞。生物样品可以是无细胞样品。无细胞样品可以包含细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品分离，该身体样品可选自血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。

样品处理

可以与本公开的方法同时、在其之前或之后处理样品。可以处理样品以纯化或富集核酸(例如，从血浆样品中纯化核酸)。可以处理包含核酸的样品，以纯化或富集目的核酸。

核酸酶

本公开的混合物和组合物可以包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以具有外切核酸酶活性。核酸酶可以具有内切核酸酶活性。核酸酶可以具有RNA酶活性。核酸酶可能能够降解包含一个或多个核糖核苷酸碱基的核酸。核酸酶可以是例如RNA酶H或RNA酶III。RNA酶III可以是例如切酶。核酸酶可以是内切核酸酶I，例如T7内切核酸酶I。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是内切核酸酶V，例如大肠杆菌内切核酸酶V。

核酸酶可以是聚合酶(例如，DNA聚合酶)。聚合酶可以是Taq聚合酶或其变体。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热曲线。核酸酶在适当条件下可能能够降解寡核苷酸探针。例如，核酸酶可以是聚合酶，并且具有外切活性并降解探针，从而产生可检测的信号。核酸酶在适当条件下可能能够从寡核苷酸探针释放猝灭剂。

反应

反应可包括使靶核酸与一个或多个寡核苷酸探针接触。反应可包括使用嵌入染料，从而不需要探针。反应可包括使混合物溶液体积(例如，小液滴、孔、管等)与多个寡核苷酸探针接触，每个寡核苷酸探针对应于多个靶核酸之一，以生成由所述多个寡核苷酸探针生成的多个信号。反应可包括扩增反应。反应可包括延伸反应。反应可包括聚合酶链反应(PCR)。反应可包括逆转录酶-聚合酶链反应(PCR)。反应可包括定量PCR反应(qPCR)。

可以通过使混合物经受足以发生反应的条件来进行反应。例如，可以通过使混合物经受包括热循环的扩增条件来发生扩增反应。扩增条件可包括热循环，每个热循环在适合于所述正向引物与所述靶核酸退火的退火温度下进行。扩增条件可包括添加酶、盐、缓冲液、dNTP或其他底物。条件可包括pH。条件可包括温度。pH可以适合于允许反应进行。反应条件可包括改变pH，使得反应可以进行或以其他方式引发。反应条件可包括改变温度，使得反应可以进行或以其他方式引发。

引物

在本文其他地方公开的各个方面，使用引物。引物在本文中也可以称为“扩增寡聚物”、“寡核苷酸引物”或“核酸引物”。该引物可以是脱氧核糖核酸。引物可以是核糖核酸。引物可包含一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以是，例如，脱氧肌苷。

引物可以是正向引物。引物可以是反向引物。引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。引物的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基对。

一对引物可包含正向引物和反向引物。正向引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，3’端)杂交，而反向引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，5’端)杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增该核酸序列。不同对引物可以被配置为扩增不同靶核酸序列。

混合物可包含多个正向引物。多个正向引物可以是脱氧核糖核酸。或者，多个正向引物可以是核糖核酸。多个正向引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。多个正向引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。多个正向引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。

混合物可包含多个反向引物。多个反向引物可以是脱氧核糖核酸。或者，多个反向引物可以是核糖核酸。多个反向引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。多个反向引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。多个反向引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。

在一些方面，可以使混合物经历足以使引物与核酸分子退火的条件。在一些方面，可以使混合物经历足以使多个引物与核酸分子退火的条件。在一些方面，可以使混合物经受足以使多个引物与多个靶核酸退火的条件。可以使混合物经历足以使核酸分子变性的条件。使混合物经受足以使引物与靶核酸退火的条件可包括在适合于扩增靶核酸的反应条件下通过例如聚合酶链反应(PCR)使混合物发生热循环。

条件可以使得引物对(例如，正向引物和反向引物)被核酸酶降解。引物对可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。引物对可以被核酸酶的RNA酶活性降解。引物对的降解可导致引物的释放。一旦释放，引物对就可以与模板核酸结合或退火。

引物可以与多种序列互补或同源、结合或杂交。例如，引物与特定基因座互补或同源或结合或杂交，并允许基因座的扩增。引物与包含突变或SNP的特定序列互补或同源或结合或杂交。引物与通用尾序列互补或同源或结合或杂交。引物与靶标特异性尾区段序列互补或同源或结合或杂交。引物可以互补于或同源于或者能够结合或杂交靶序列和非靶序列两者。例如，引物可以结合靶标和非靶标之间相同的区域，从而允许扩增非靶标和靶标。尽管引物可能能够与靶标和非靶标的序列均杂交，但是存在或缺乏相应的正向或反向引物可以允许或阻止靶标或非靶标的扩增。

引物可包含尾序列或区域。尾序列或区域可以是通用尾。引物可包含靶标特异性尾区段。靶标特异性尾序列在本文其他地方可以称为如图3和图4所述的“突变靶标标签”。例如，靶标特异性尾区段可以不与靶核酸互补或同源，但是当扩增时可以附加对应于靶标的附加序列。靶标特异性尾区段可用来鉴定靶核酸而无需针对靶核酸的探针，而是可通过探针或与靶标特异性尾区段互补或同源的序列的识别来鉴定。引物可包含通用引物结合基序。该通用引物结合基序可以是通用尾。在已经生成包含通用结合基序的扩增子之后，可以使用通用引物结合基序来扩增靶核酸。通用引物可与通用引物结合基序结合，并允许用通用引物结合基序扩增任何核酸。例如，可以使用包含通用引物结合基序的引物扩增具有不同序列的多种靶核酸。然后，不管靶核酸的原始序列如何，可以使用通用引物扩增衍生自靶核酸的所有生成的扩增子。引物可包含通用探针结合基序。该通用探针结合基序可以是通用尾。在已经生成包含通用探针结合基序的扩增子之后，可以使用通用探针结合基序来检测靶核酸。通用探针可与通用探针[引物]结合基序结合，并允许用通用探针结合基序检测任何核酸。例如，可以使用包含通用探针基序的引物扩增具有不同序列的多种靶核酸，从而将通用探针结合基序附加到衍生自靶核酸的扩增子上。然后可以使用被配置为结合通用探针结合基序的探针来检测靶标。然后，不管靶核酸的原始序列如何，可以使用通用探针检测衍生自靶核酸的所有生成的扩增子。引物可包含超过一个通用探针结合基序。例如，引物可包含2个通用探针结合基序。引物可包含超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个或更多个通用探针结合基序。通用探针结合基序可包含相同的序列或不同的序列。例如，引物可包含2个均结合相同通用探针的通用探针结合基序。例如，引物可包含2个结合不同通用探针的通用探针结合基序。不同的通用探针可生成不同的信号。多个通用结合探针结合基序的使用可以允许基于通用探针结合基序对样品核酸进行编码或分类。多个通用结合探针结合基序的使用可以允许样品核酸在多个颜色通道中或多个波长下产生信号。

引物可包含特定或具体排列的各种序列。例如，通用尾区段可以在引物的5’端。靶标特异性序列可以在引物的3’端。靶标特异性尾区段序列可以在5’端的通用尾区段与3’端的被配置为结合靶标的靶标特异性序列之间。引物可在5’端包含通用引物结合基序。引物可在5’端的通用探针结合基序与3’端的靶标特异性序列之间包含通用探针结合基序。

在一些情况下，引物可以是不可延伸的引物。该不可延伸的引物可在3’端包含不可延伸的碱基，该碱基不能与另一核苷酸聚合，从而防止其被延伸。例如，该碱基可能缺少3’羟基，而具有3’氢。该不可延伸的引物可以经受使其转化成可延伸的引物的条件。不可延伸的引物的转化可以通过除去不可延伸的碱基来进行。不可延伸的碱基可以如下除去：在不可延伸的碱基的位点处或不可延伸的碱基的5’侧切割引物，以使该引物的新的3’端不再是不可延伸的碱基。不可延伸的核酸引物可包含靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基，所述碱基被配置为当所述第一区域与所述靶核酸杂交时，在所述靶核酸的靶碱基处形成碱基杂合对，而在非靶核酸中的相应碱基处不形成所述碱基杂合对。碱基杂合对可以是RNA:DNA对、DNA:非天然碱基对或RNA:非天然碱基对。例如，在一个实施方案中，可以在与突变或SNP互补的位置处将RNA、DNA或非天然碱基置换为不可延伸的靶标特异性通用加尾引物。当通用尾引物与突变等位基因结合(由于碱基对同源性)时，它将在突变的位置或靶标与非靶标之间的序列分歧处形成RNA:DNA杂交。然后可以通过使引物经受切割条件来切割该键。切割条件可以是添加另外的酶。例如，另外的酶可以是核糖核酸酶H，并且识别RNA:DNA双链体或碱基杂合对。切割后，通用尾引物可以用DNA聚合酶延伸。在其他实施方案中，靶核酸可以是RNA，例如mRNA。引物可包含DNA，以生成RNA:DNA碱基杂合对。

引物可以被配置为退火，并且允许延伸或扩增反应进行并消化核酸探针。例如，引物可以被配置为与已经与探针杂交的另一序列的5’侧的序列退火或杂交。引物可允许募集可消化探针的酶。

在各个方面，可以使用多种引物或多个引物。所述多个引物可以具有相同的序列或具有包含相同序列的区域。所述多个引物可以具有不同的序列或具有包含不同序列的区域。所述多个引物可以具有序列相同的区域和序列不同的其他区域。例如，多个引物可包含其中每个第二区域与另一引物相同或不相似的引物。例如，多个引物可包含其中每个通用尾区段与另一引物相同或不相似的引物。例如，多个引物可包含其中每个靶标特异性区段与另一引物相同或不相似的引物。例如，多个引物可包含其中每个通用引物结合基序与另一引物相同或不相似的引物。例如，多个引物可包含其中每个通用探针结合基序与另一引物相同或不相似的引物。例如，多个引物可包含其中每个第二区域与另一引物相同或不相似的引物。多个引物可具有对每个引物为唯一的序列。例如，被配置为不与靶标互补的区域可以全部是多个引物中的每个引物的独特序列，并且充当用于观察、监测或检测靶标的替代标识符。这样的区域之一可以是靶标特异性尾区段。

寡核苷酸探针

在本文其他地方公开的各个方面，使用寡核苷酸探针。本公开的混合物、试剂盒和组合物可包含靶标特异性寡核苷酸探针，在本文中也称为“检测探针”或“探针”。寡核苷酸探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。寡核苷酸探针可包含与靶核酸的区域互补的区域。寡核苷酸探针的浓度可以使其相对于混合物中的其他组分过量。寡核苷酸探针可以是信号生成核酸探针。信号生成核酸探针可包含如本文所述的寡核苷酸探针的特征，以及在施加刺激、修饰探针或水解探针后生成信号的特征。例如，探针可以被聚合酶的外切核酸酶活性水解，从而生成信号。信号生成核酸探针可以生成如本文其他地方所述的任何信号。例如，所述信号生成探针可以生成荧光信号。信号生成探针可包含信号标签。信号标签可以生成信号。信号标签可以响应于反应或刺激而生成信号。例如，信号标签可以在通过外切核酸酶活性降解后生成信号。

在一些方面，混合物可包含超过一个寡核苷酸探针。多个寡核苷酸探针可以相同，或者可以不同。寡核苷酸探针的长度可以是至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少30个或更多个核苷酸。寡核苷酸探针的长度可以是至多30个、至多20个、至多15个、至多10个或至多5个核苷酸。在一些实例中，混合物包含第一寡核苷酸探针和一个或多个另外的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个或更多个核苷酸。寡核苷酸探针的长度可以是至多50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。

在一些情况下，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个不同的寡核苷酸探针。每个寡核苷酸探针可以对应于(例如，能够结合)样品中靶核酸(例如，染色体)的给定区域。在一个实例中，第一寡核苷酸探针对第一靶核酸的第一区域具有特异性，第二寡核苷酸探针对第一靶核酸的第二区域具有特异性，第三寡核苷酸探针对第一靶核酸的第三区域具有特异性。每个寡核苷酸探针可包含具有大致相等的发射波长的信号标签。在一些情况下，每个寡核苷酸探针包含相同的荧光团。在一些情况下，每个寡核苷酸探针包含不同的荧光团，其中每个荧光团能够在单个光学通道中被检测到。在一些情况下，每个寡核苷酸探针包含不同的荧光团，其中每个荧光团能够在至少一个光学通道中被检测到。

探针可以对应于靶核酸的区域。例如，探针可以与靶核酸的区域具有互补性和/或同源性。探针可包含与靶核酸的区域互补或同源的区域。对应于靶核酸的区域的探针可能能够在适当条件(例如，温度条件、缓冲液条件等)下与靶核酸的区域结合。例如，探针可能能够在适合于聚合酶链反应的条件下与靶核酸的区域结合。寡核苷酸探针可以与多个靶核酸的任何成员具有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的互补性。寡核苷酸探针可以与所述多个靶核酸的任何成员不具有互补性。寡核苷酸探针可以与靶核酸或其衍生物特异性杂交，但不与非靶核酸或其衍生物杂交。例如，靶核酸和非靶核酸可以在包含至少一个核苷酸的分歧位置处是不同的，并且探针可以被配置为与靶标杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。例如，靶核酸和非靶核酸可以在包含至少一个核苷酸的分歧位置处是不同的，并且探针可以被配置为与靶标特异性尾区段杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。

在一些方面，寡核苷酸探针可包含非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是与靶核酸序列的任何区域都不互补的序列。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是发夹检测探针。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子信标探针。分子信标探针的实例在例如美国专利7,671,184中提供，该专利通过引用整体并入本文。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子火炬(molecular torch)。分子火炬的实例在例如美国专利6,534,274中提供，该专利通过引用整体并入本文。

探针可以具有可以结合或被配置为在多个区域处杂交的多种序列。探针可以与靶核酸互补或同源。探针可以仅与靶核酸互补或同源。探针可以与靶核酸的一部分和通用尾的一部分互补或同源。探针可以与通用尾的一部分互补或同源。探针可以仅与通用尾的一部分互补或同源。探针可以与靶标特异性尾区段互补或同源。探针可以与通用探针结合基序互补或同源。探针可以被配置为与靶核酸结合或杂交。探针可以被配置为仅与靶核酸结合或杂交。探针可以被配置为与靶核酸的一部分和通用尾的一部分结合或杂交。探针可以被配置为与通用尾的一部分结合或杂交。探针可以被配置为仅与通用尾的一部分结合或杂交。探针可以被配置为与靶标特异性尾区段结合或杂交。探针可以被配置为与通用探针结合基序结合或杂交。探针可以被配置为与通用尾、靶标特异性尾区段或靶核酸的一部分的任何组合结合或杂交。

探针可以以特定浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以至少约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X或更高的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以至多约8X、约7X、约6X、约5X、约4X、约3X或约2X的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X或约8X的浓度提供。X可以是所公开的方法中提供的核酸探针的浓度。在一些情况下，X为至少50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM或更高。在一些情况下，X为至多500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM或50nM。X可以是能够被分区的核酸探针的任何浓度。

寡核苷酸探针可包含可检测标记。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可包含化学发光标记。可检测标记可包含荧光标记。可检测标记可包含荧光团。荧光团可以是，例如，FAM、TET、HEX、JOE、Cy3或Cy5。荧光团可以是FAM。在本公开的方法和测定中使用的每个寡核苷酸探针可包含至少一个荧光团。在一些方面，在单个反应中使用的一个或多个寡核苷酸探针可包含相同的荧光团。在一些方面，在单个反应中使用的一个或多个寡核苷酸探针可包含不相似的荧光团。每个探针在被激发并与其对应的靶核酸接触时可生成荧光信号。单个集合信号可包含可以由一个或多个探针生成的多个信号。

在一些方面，寡核苷酸探针可以进一步包含一种或多种猝灭剂。猝灭剂可以抑制从荧光团生成信号。猝灭剂可以是，例如，TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。猝灭剂可以是BHQ-1。猝灭剂可以是BHQ-2。

通常，探针缺少3’羟基，因此无法被DNA聚合酶延伸。

(ThermoFisherScientific)化学法是用于多重实时PCR的常见的报告探针(Holland等人，1991)。

寡核苷酸探针用荧光团和猝灭标签(即，猝灭剂)共价修饰。在这种构造中，由荧光团生成的荧光被猝灭，并且无法被实时PCR仪检测到。当存在目的靶标时，探针寡核苷酸与扩增的靶标发生碱基退火。当结合时，

寡核苷酸探针被Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性消化，从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号以供实时PCR仪检测。

信号生成

可以进行热循环，使得一个或多个寡核苷酸探针被核酸酶降解。寡核苷酸探针可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。寡核苷酸探针可以在降解时生成信号。在一些情况下，只有在混合物中存在多个靶核酸的至少一个成员时，寡核苷酸探针才可以生成信号。

反应可以生成一个或多个信号。反应可以生成包含多个信号的和集的累积强度信号。信号可以是化学发光信号。信号可以是荧光信号。信号可以由寡核苷酸探针生成。和信号(sum signal)可以由至少一个寡核苷酸探针生成。例如，激发包含发光信号标签的杂交探针可以生成信号。信号可以由荧光团生成。荧光团可以在从杂交探针上释放时生成信号。反应可以包括荧光团的激发。反应可以包括信号检测。反应可以包括检测来自荧光团的发射。

信号可以是荧光信号。信号可以对应于荧光强度水平。在本公开的方法中测量的每个信号可以具有不同的荧光强度值，从而对应于存在靶核酸的独特组合。信号可以由一个或多个寡核苷酸探针生成。测定中生成的信号数可对应于存在的寡核苷酸探针和靶核酸的数目。

N可以是在本公开的测定中在单个光学通道中检测到的信号的数目。N可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或更多。N可以是至多50、40、30、24、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2。N可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50。

如将会认识到并在本文其他地方描述的，可以在多个不同的光学通道中生成成组信号，其中在单个光学通道中检测每组信号，从而显著增加在单个反应中能够测得的靶核酸的数目。在一些情况下，在单个反应中检测两组信号。反应中检测到的每组信号可以包含相同数目的信号或不同数目的信号。

在一些情况下，可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交的同时生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，分子信标探针或分子火炬)可以在与核酸杂交后生成信号(例如，荧光信号)。在一些情况下，可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交之后，在寡核苷酸探针被核酸酶降解之后生成信号。

在寡核苷酸探针包含信号标签的情况下，该寡核苷酸探针当与引物的区域结合时可以被降解，从而生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，

探针)可以在寡核苷酸探针与核酸杂交并且随后被聚合酶降解(例如，在扩增如PCR扩增过程中)之后生成信号。寡核苷酸探针可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。

寡核苷酸探针可包含猝灭剂和荧光团，使得猝灭剂在寡核苷酸探针降解时释放，从而生成荧光信号。可以利用热循环生成一种或多种信号。热循环可生成至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个信号。热循环可生成至多十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个信号。

多个信号可以是相同的类型或不同的类型。不同类型的信号可以是具有不同荧光波长的荧光信号。不同类型的信号可以由包含不同荧光团的可检测标记生成。相同类型的信号可以具有不同的强度(例如，相同荧光波长的不同强度)。相同类型的信号可以是在相同颜色通道中可检测的信号。相同类型的信号可以由包含相同荧光团的可检测标记生成。包含相同荧光团的可检测标记可以通过处于不同浓度的性质而生成不同的信号，从而生成相同信号类型的不同强度。

本公开呈现的方法可以与任何可定量的信号一起使用。在一些情况下，本公开提供了使用信号的单个分量(例如，强度)对靶标进行定量的方法。例如，分析可依赖于多个信号强度，而不考虑颜色。尽管已经使用荧光探针来阐释该原理，但是所公开的方法同样适用于提供包括电化学信号和化学发光信号在内的可定量信号的其他任何方法。

本文描述的信号并非意味着是限制性的，并且本领域普通技术人员将容易认识到，适用于荧光信号测量的原理也适用于其他信号。例如，在本公开中提出的方法还可以利用在至少两个维度(例如，颜色和强度)上对信号的测量。在一些情况下，可定量信号具有频率(波长)和振幅(强度)两者。信号可以是电磁信号。电磁信号可以是声音、无线电信号、微波信号、红外信号、可见光信号、紫外线信号、X射线信号或伽马射线信号。荧光信号的波长也可以就颜色来描述。可以基于在特定波长或波长范围内测量强度来确定颜色，例如，通过确定不同波长处的荧光强度分布和/或通过使用带通滤波器确定特定波长范围内的荧光强度来确定颜色。强度可以用光电探测器来测量。波长范围可以被称为“通道”、“颜色通道”或“光学通道”。

检测

可以检测一个或多个信号的存在或不存在。可以在单通道或多通道中检测信号。可以在单通道检测器或多通道检测器中检测信号。可以通过荧光计检测信号。可以通过实时PCR仪器检测信号。可以检测一个信号，或者可以检测多个信号。可以同时检测多个信号。或者，可以依次检测多个信号。信号的存在可以与靶核酸的存在相关联。至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个信号的存在可以与至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶核酸中的至少一个的存在相关联。信号的不存在可以与相应靶核酸的不存在相关联。至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个信号的不存在可以与至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶核酸分子中的每一个的不存在相关联。

鉴定至少一种靶核酸

在一些方面，本文描述了一种鉴定样品中的至少一种靶核酸的方法。首先，可以提供包含多个核酸分子的样品。接下来，可以通过添加多个寡核苷酸探针来形成混合物。所述多个核酸分子可以衍生自和/或可以对应于样品中的至少一种靶核酸。所述多个寡核苷酸探针可以各自对应于靶核酸的不同区域。该混合物可以进一步包含其他试剂(例如，扩增试剂)，包括例如引物、dNTP、核酸酶(例如，聚合酶)、缓冲液和盐(例如，Ca²⁺、Mg²⁺等)。一对引物可被配置为扩增长度为至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300个碱基对(bp)或更长的核酸序列。接下来，可以扩增所述混合物，从而生成多个信号。所述多个信号在一个颜色通道中可以是可检测的。所述多个信号在多个颜色通道中可以是可检测的。

所述多个信号可以由来自混合物的所述多个探针中的一个或多个探针生成。可以通过所述多个核酸分子的核酸扩增(例如，PCR)来生成所述多个信号。核酸扩增可以降解所述多个寡核苷酸探针(例如，通过核酸酶的活性)，从而生成所述多个信号。多个信号可以是多个荧光信号、多个化学发光信号或其组合。

至少一种靶核酸的定量可包括确定靶核酸与参考标准之比(例如，靶核酸相对于已知参考物的量)。至少一种靶核酸的定量可包括确定样品中靶核酸的绝对量。至少一种靶核酸的定量可包括确定靶核酸相对于参考物的相对量。

样品可以是生物样品。样品可以来源于生物样品。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便或泪液。生物样品可以是流体样品。流体样品可以是血液或血浆。生物样品可包含无细胞核酸(例如，无细胞RNA、无细胞DNA等)。

确定比率

在一些方面，本文描述了一种相对于样品中的第二靶核酸确定靶标的存在或不存在的方法。首先，可以提供包含第一多个核酸分子和第二多个核酸分子的样品。所述第一多个核酸分子可以衍生自和/或可以对应于样品中的第一靶核酸。所述第二多个核酸分子可以衍生自和/或可以对应于样品中的第二靶核酸。除了所述第一和第二多个核酸分子外，还可以在样品中提供其他试剂(例如，扩增试剂)，包括，例如，引物、寡核苷酸探针、dNTP、核酸酶(例如，聚合酶)和盐(例如，Ca²⁺、Mg²⁺等)。接下来，可以扩增所述第一多个核酸分子和所述第二多个核酸分子，从而生成多个信号；所述多个信号在一个颜色通道中可以是可检测的。所述多个信号在多个颜色通道中可以是可检测的。接下来，可以检测所述多个信号。可以在单个颜色通道中检测所述多个信号。可以在多个颜色通道中检测所述多个信号。接下来，基于所述检测，可以确定代表样品中第一靶核酸的量相对于第二靶核酸的量的比率。

试剂盒

本公开还提供了用于在非靶标的存在下分析确定靶标的存在的试剂盒。该试剂盒还可用于多重分析。试剂盒可包含一个或多个如本文所述的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以被冻干。不同的寡核苷酸探针可以以不同的浓度存在于试剂盒中。寡核苷酸探针可包含荧光团和/或一种或多种猝灭剂。

试剂盒可包含一组或多组如本文所述的引物(或“扩增寡聚物”)。一组引物可包含配对的引物。配对的引物可包含正向引物和反向引物。一组引物可以被配置为扩增与特定靶标相对应的核酸序列。例如，正向引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，3’端)杂交，而反向引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，5’端)杂交，从而被配置为扩增该核酸序列。不同组引物可以被配置为扩增核酸序列。在一个实例中，第一组引物可以被配置为扩增第一核酸序列，并且第二组引物可以被配置为扩增第二核酸序列。被配置为扩增核酸分子的引物可以在进行所公开的方法中使用。在一些情况下，试剂盒中的所有引物都被冻干。

试剂盒可包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶(DNA酶)。DNA酶可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶可以是核糖核酸聚合酶(RNA酶)。RNA酶可以是RNA酶III。RNA酶III可以是切酶。核酸酶可以是内切核酸酶。内切核酸酶可以是内切核酸酶I。内切核酸酶I可以是T7内切核酸酶I。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是内切核酸酶V，例如大肠杆菌内切核酸酶V。核酸酶可以是聚合酶(例如，DNA聚合酶)。聚合酶可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶在适当条件下可能能够降解寡核苷酸探针。核酸酶在适当条件下可能能够从寡核苷酸探针释放猝灭剂。试剂盒可以包含关于在本文所述的方法中使用任何前述物质的说明书。

本文提供的试剂盒可用于例如计算至少第一和第二总和，每个总和是与第一和第二靶核酸相对应的多个靶信号的总和。

系统

本公开还提供了用于在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在的系统。该系统可包括执行本文其他地方描述的方法的步骤的其他设备。例如，该系统可包括用于检测信号的检测器。该系统可包括热循环仪或其他设备，以使靶核酸、混合物或样品经受条件，如适合于通过扩增反应来扩增靶核酸的扩增条件。该系统还可包括容纳混合物、核酸和样品的设备。

本公开提供了计算机控制系统，其被编程用于实现本公开的方法。图7显示了计算机系统701，其被编程或以其他方式配置为执行方法、检测信号、使混合物经受适当的条件。计算机系统701可以调节本公开的各个方面，例如，控制热循环的温度和时间、检测特定通道中的信号、滤除特定通道中的波长。计算机系统701可以是用户的电子设备，或者是相对于该电子设备位于远程的计算机系统。该电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统701包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)705，中央处理单元705可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统701还包括存储器或存储器位置710(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元715(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口720(例如，网络适配器)和外围设备725，如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器710、存储单元715、接口720和外围设备725通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU 705通信。存储单元715可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统701可以借助于通信接口720可操作地耦合至计算机网络(“网络”)730。网络730可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。网络730在一些情况下是电信和/或数据网络。网络730可以包括能够实现分布式计算如云计算的一个或多个计算机服务器。在一些情况下，网络730借助于计算机系统701可以实现对等网络，这可以使得耦合至计算机系统701的设备能够起到客户端或服务器的作用。

CPU 705可以执行一系列可以在程序或软件中体现的机器可读指令。所述指令可以存储在诸如存储器710的存储器位置中。所述指令可被导向CPU 705，其随后可对CPU 705进行编程或以其他方式进行配置，以实现本公开的方法。由CPU 705执行的操作的实例可以包括获取、解码、执行和写回。

CPU 705可以是电路如集成电路的一部分。系统701中的一个或多个其他组件可被包括在该电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元715可以存储文件，如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元715可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统701可以包括位于计算机系统701外部(诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统701通信的远程服务器上)的一个或多个附加数据存储单元。

计算机系统701可以通过网络730与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统701可与用户的远程计算机系统进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板PC(例如，

iPad、

Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，

iPhone、支持Android的设备、

或个人数字助理。用户可以通过网络730访问计算机系统701。

如本文所述的方法可通过存储在计算机系统701的电子存储位置上(例如存储器710或电子存储单元715上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。该机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可以由处理器705执行。在一些情况下，该代码可从存储单元715中检索并存储在存储器710上，以备处理器705访问。在一些情况下，可以不包括电子存储单元715，而将机器可执行指令存储在存储器710上。

可将该代码预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行过程中对其进行编译。该代码可以以编程语言的形式提供，该编程语言可以被选择为使得该代码能够以预编译或实时编译的方式执行。

本文提供的系统和方法的各方面，如计算机系统701，可以在编程中体现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其一般为在某种类型的机器可读介质中携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或全部有形存储器，或其相关模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分可以不时地通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨越本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及经由各种空中链路所使用的。携带这类波的物理元件，如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。除非局限于非暂时性有形“存储”介质，否则如本文所用的诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质，如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等，例如可用来实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外线(IR)数据通信期间生成的那些信号或波。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、其他任何磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、其他任何光学介质、穿孔卡片纸带、其他任何具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、其他任何存储器芯片或匣盒、传输数据或指令的载波、传输这类载波的线缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的其他任何介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列运载到处理器以供执行。

计算机系统701可包括电子显示器735或与电子显示器735通信，电子显示器735包括用于提供例如继续进行方法的下一步的提示、用于作图和操作的信号曲线图的用户界面(UI)740。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一个或多个算法来实现。算法可以通过软件在由中央处理单元705执行时实现。例如，该算法可以基于阈值确定信号的存在或减少信号的噪声。

虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。并非打算用本说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参照上述说明书对本发明进行了描述，但并不意味着对本文实施方案的描述和说明以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此可以预期，本发明还应涵盖任何这类替代、改变、变化或等同物。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (154)

1.一种在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(A)提供包含或可能包含所述靶核酸和所述非靶核酸的样品；

(B)形成混合物，其包含：

i.所述样品；

ii.正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及

iii.信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；

(C)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及

(D)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是等位基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是突变序列，并且所述非靶核酸是野生型序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向引物对所述靶核酸具有特异性，并且仅选择性地扩增所述靶核酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物不使用核酸或肽阻断剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物进一步包含反向引物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述正向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第一区域杂交，并且所述反向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第二区域杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增所述核酸序列。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一区域包含所述核酸序列的3’端。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二区域包含所述核酸序列的5’端。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述反向引物包含与靶核酸和非靶核酸上的序列均互补或同源的序列。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述反向引物是基因座特异性引物。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述反向引物是通用引物。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述反向引物被配置为使得在所述热循环后，所述信号生成核酸探针被消化。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物进一步包含核酸酶。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述PCR是定量聚合酶链反应(qPCR)。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增条件包括：dNTP、盐、缓冲液或其组合。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针进一步包含信号标签。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述信号标签生成所述信号。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述信号标签在所述可切割的信号生成核酸探针被所述核酸酶的5’至3’外切核酸酶活性降解时生成所述信号，从而释放所述信号以供通过实时PCR仪器进行检测。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述扩增条件包括热循环，并且每个热循环在适合于所述正向引物与所述靶核酸退火的退火温度下进行。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二区域包含：

(A)靶标特异性尾区段；和

(B)通用尾区段。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一区域位于正向引物的3’端。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述通用尾区段位于所述正向引物的5’端。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述靶标特异性尾区段在3’侧翼为所述靶标特异性区段，并且在5’端侧翼为所述正向引物上的所述通用尾区段。

29.根据权利要求25所述的方法，其中使用多个正向引物，其中所述正向引物的每个第二区域包含相同的核苷酸序列。

30.根据权利要求25所述的方法，其中使用多个正向引物，其中所述正向引物的每个第二区域包含不相似的核苷酸序列。

31.根据权利要求25所述的方法，其中使用多个正向引物，其中所述正向引物的每个第二区域包含独特的核苷酸序列。

32.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针包含与所述正向引物互补或同源的序列。

33.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针。

34.根据权利要求25所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：

(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；

(B)与所述整个靶标特异性尾互补或同源的序列；和

(C)与所述第一区域的一部分互补或同源的序列。

35.根据权利要求25所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：

(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；和

(B)与所述靶标特异性尾的一部分互补或同源的序列。

36.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针与由所述扩增反应中引发的第二链合成所生成的扩增子中的所述靶核酸结合。

37.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物进一步包含第二核酸引物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二核酸引物是靶标特异性引物。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二核酸引物被配置为与所述靶核酸或其衍生物杂交，而不与所述非靶核酸或其衍生物杂交。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。

42.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

43.根据权利要求38所述的方法，其中所述靶标特异性引物与所述靶核酸的序列同源或互补。

44.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二核酸引物是通用引物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述通用引物与所述第二区域的序列互补或同源。

46.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二核酸引物被配置为在热循环时消化所述可切割的信号生成探针。

47.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针包含与所述靶核酸同源或互补的序列。

48.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成探针被配置为与所述第二区域和所述第一区域退火。

49.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述第二区域或所述第一区域杂交。

50.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第一区域杂交。

51.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第二区域杂交。

52.根据权利要求25所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交。

53.根据权利要求25所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述靶核酸的序列或其互补序列杂交。

54.根据权利要求25所述的方法，其中所述靶核酸和所述非靶核酸在包含至少一个核苷酸的分歧位置处是不同的，并且所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。

55.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二区域包含：

(A)通用探针结合基序；和

(B)通用引物结合基序。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述信号生成探针被配置为结合所述通用探针结合基序。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述混合物进一步包含被配置为结合所述通用引物结合基序的通用引物。

58.根据权利要求55所述的方法，其中所述靶标特异性区段位于所述正向引物的3’端。

59.根据权利要求55所述的方法，其中所述通用引物结合基序位于所述通用尾引物的5’端。

60.根据权利要求55所述的方法，其中所述通用探针结合基序的侧翼为所述第一区域的5’端和所述通用引物结合基序的3’端。

61.根据权利要求55所述的方法，其中使用多个正向引物，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。

62.根据权利要求55所述的方法，其中使用多个正向引物，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

63.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二区域包含第二通用探针结合基序。

64.根据权利要求55所述的方法，其中所述混合物进一步包含具有与所述第二通用探针结合基序互补或同源的序列的探针。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含相同的序列。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含不同的序列。

67.根据权利要求63所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合相同的探针序列。

68.根据权利要求63所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合不同的探针序列。

69.根据权利要求63所述的方法，其中所述第二通用探针结合基序与所述通用结合基序相邻，并且所述第二通用探针结合基序和所述通用结合基序在所述第一区域的3’端，并且在所述通用引物结合基序的5’上。

70.根据权利要求63所述的方法，其中使用多个所述正向引物，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。

71.根据权利要求63所述的方法，其中使用所述多个所述正向引物，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

72.根据权利要求63所述的方法，其中使用所述多个正向引物，每个通用探针结合基序包含独特的核苷酸序列。

73.一种在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(A)提供包含所述靶核酸的样品；

(B)形成混合物，其包含：

i.所述样品；

ii.不可延伸的核酸引物，其中所述不可延伸的核酸引物包含被配置为与所述靶核酸杂交并且被配置为不与所述非靶核酸结合的第一区域，和被配置为不与所述靶核酸杂交的第二区域，并且其中所述不可延伸的核酸引物包含靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基，所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基被配置为当所述第一区域与所述靶核酸杂交时在所述靶核酸的靶碱基处形成碱基杂合对，而在所述非靶核酸中的相应碱基处不形成所述碱基杂合对；以及

iii.信号生成核酸探针；

(C)使所述混合物经受切割条件，使得包含所述碱基杂合对的核酸被切割，使得所述不可延伸的核酸被切割，从而将所述不可延伸的核酸引物转化为可延伸的引物；

(D)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，使得如果所述混合物中存在所述靶核酸，则所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及

(E)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述扩增反应包括逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或聚合酶链反应(PCR)。

75.根据权利要求73所述的方法，其中所述不可延伸的核酸引物的所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基位于与所述靶核酸互补的位置处。

76.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶标特异性RNA碱基、DNA碱基或非天然碱基有助于所述靶核酸的选择性扩增。

77.根据权利要求73所述的方法，其中所述碱基杂合对是DNA:RNA对、DNA:非天然碱基或RNA:非天然碱基对。

78.根据权利要求73所述的方法，其中在c)中，所述不可延伸的核酸引物在所述碱基杂合对处或与之相邻的位置处被切割。

79.根据权利要求73所述的方法，其中所述切割条件包括用于切割所述第一不可延伸的核酸引物的另外的试剂或酶。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述另外的酶是核糖核酸酶H。

81.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶核酸是等位基因。

82.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶核酸是突变序列，并且所述非靶核酸是野生型序列。

83.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。

84.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。

85.根据权利要求73所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

86.根据权利要求73所述的方法，其中所述可延伸的引物对所述靶核酸具有特异性，并且仅选择性地扩增所述靶核酸。

87.根据权利要求73所述的方法，其中所述混合物不使用核酸或肽阻断剂。

88.根据权利要求73所述的方法，其中所述混合物进一步包含反向引物。

89.根据权利要求73-88中任一项所述的方法，其中所述可延伸的引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第一区域杂交，并且所述反向引物被配置为与所述靶核酸的核酸序列的第二区域杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增所述核酸序列。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述第一区域包含所述核酸序列的3’端。

91.根据权利要求89所述的方法，其中所述第二区域包含所述核酸序列的5’端。

92.根据权利要求88所述的方法，其中所述反向引物包含与靶核酸和非靶核酸上的序列均互补或同源的序列。

93.根据权利要求88所述的方法，其中所述反向引物是基因座特异性引物。

94.根据权利要求88所述的方法，其中所述反向引物是通用引物。

95.根据权利要求88所述的方法，其中所述反向引物被配置为使得在所述热循环后，所述信号生成核酸探针被消化。

96.根据权利要求73所述的方法，其中所述混合物进一步包含核酸酶。

97.根据权利要求73所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述PCR是定量聚合酶链反应(qPCR)。

99.根据权利要求73所述的方法，其中所述扩增条件包括：dNTP、盐、缓冲液或其组合。

100.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针进一步包含信号标签。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述信号标签生成所述信号。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述信号标签在所述信号生成核酸探针被所述核酸酶的5’至3’外切核酸酶活性降解时生成所述信号，从而释放所述信号以供通过实时PCR仪器进行检测。

103.根据权利要求73-102中任一项所述的方法，其中所述扩增条件包括热循环，并且每个热循环在适合于所述可延伸的引物与所述靶核酸退火的退火温度下进行。

104.根据权利要求73所述的方法，其中所述第二区域包含：

(A)靶标特异性尾区段；和

(B)通用尾区段。

105.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一区域位于可延伸的引物的3’端。

106.根据权利要求104所述的方法，其中所述通用尾区段位于所述可延伸的引物的5’端。

107.根据权利要求104所述的方法，其中所述靶标特异性尾区段在3’侧翼为所述靶标特异性区段，并且在5’端侧翼为所述不可延伸的引物上的所述通用尾区段。

108.根据权利要求104所述的方法，其中使用多个不可延伸的引物，其中所述不可延伸的引物的每个第二区域包含相同的核苷酸序列。

109.根据权利要求104所述的方法，其中使用多个不可延伸的引物，其中所述不可延伸的引物的每个第二区域包含不相似的核苷酸序列。

110.根据权利要求104所述的方法，其中使用多个不可延伸的引物，其中所述不可延伸的引物的每个第二区域包含独特的核苷酸序列。

111.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针包含与所述不可延伸的引物互补或同源的序列。

112.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针。

113.根据权利要求104所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：

(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；

(B)与所述整个靶标特异性尾互补或同源的序列；和

(C)与所述第一区域的一部分互补或同源的序列。

114.根据权利要求104所述的方法，其中所述信号生成核酸探针是靶标特异性探针，其包含：

(A)与所述通用尾的所述3’端互补或同源的序列；和

(B)与所述靶标特异性尾的一部分互补或同源的序列。

115.根据权利要求73所述的方法，其中所述探针与由所述扩增反应中引发的第二链合成所生成的扩增子中的所述靶核酸结合。

116.根据权利要求73所述的方法，其中所述混合物进一步包含第二核酸引物。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述第二核酸引物是靶标特异性引物。

118.根据权利要求116所述的方法，其中所述第二核酸引物被配置为与所述靶核酸或其衍生物杂交，而不与所述非靶核酸或其衍生物杂交。

119.根据权利要求116所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有至少一个核苷酸不同。

120.根据权利要求116所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列仅有一个核苷酸不同。

121.根据权利要求116所述的方法，其中所述靶核酸的序列与所述非靶核酸的序列有不超过五个核苷酸不同。

122.根据权利要求117所述的方法，其中所述靶标特异性引物与所述靶核酸的序列同源或互补。

123.根据权利要求116所述的方法，其中所述第二核酸引物是通用引物。

124.根据权利要求123所述的方法，其中所述通用引物与所述第二区域的序列互补或同源。

125.根据权利要求116所述的方法，其中所述第二核酸引物被配置为在热循环时消化所述可切割的信号生成探针。

126.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成探针包含与所述靶核酸同源或互补的序列。

127.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成探针被配置为与所述第二区域和所述第一区域退火。

128.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述第二区域或所述第一区域杂交。

129.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第一区域杂交。

130.根据权利要求73所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为仅与所述第二区域杂交。

131.根据权利要求104所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交。

132.根据权利要求104所述的方法，其中所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述靶核酸的序列或其互补序列杂交。

133.根据权利要求104所述的方法，其中所述靶核酸和所述非靶核酸在包含至少一个核苷酸的分歧位置处是不同的，并且所述信号生成核酸探针被配置为与所述靶标特异性尾区段杂交，而不与所述包含至少一个核苷酸的分歧位置或其互补体杂交。

134.根据权利要求73所述的方法，其中所述第二区域包含：

(A)通用探针结合基序；和

(B)通用引物结合基序。

135.根据权利要求134所述的方法，其中所述信号生成探针被配置为结合所述通用探针结合基序。

136.根据权利要求134所述的方法，其中所述混合物进一步包含被配置为结合所述通用引物结合基序的通用引物。

137.根据权利要求134所述的方法，其中所述靶标特异性区段位于所述不可延伸的引物的3’端。

138.根据权利要求134所述的方法，其中所述通用引物结合基序位于所述通用尾引物的5’端。

139.根据权利要求134所述的方法，其中所述通用探针结合基序的侧翼为所述第一区域的5’端和所述通用引物结合基序的3’端。

140.根据权利要求134所述的方法，其中使用多个不可延伸的引物，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。

141.根据权利要求134所述的方法，其中使用多个不可延伸的引物，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

142.根据权利要求134所述的方法，其中所述第二区域包含第二通用探针结合基序。

143.根据权利要求134所述的方法，其中所述混合物进一步包含具有与所述第二通用探针结合基序互补或同源的序列的探针。

144.根据权利要求143所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含相同的序列。

145.根据权利要求143所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序包含不同的序列。

146.根据权利要求143所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合相同的探针序列。

147.根据权利要求143所述的方法，其中所述通用探针结合基序和所述第二通用探针结合基序被配置为结合不同的探针序列。

148.根据权利要求143所述的方法，其中所述第二通用探针结合基序与所述通用结合基序相邻，并且所述第二通用探针结合基序和所述通用结合基序在所述第一区域的3’端，并且在所述通用引物结合基序的5’上。

149.根据权利要求143所述的方法，其中使用多个所述不可延伸的引物，每个通用引物结合基序包含相同的核苷酸序列。

150.根据权利要求143所述的方法，其中使用所述多个所述不可延伸的引物，每个通用引物结合基序包含不相似的核苷酸序列。

151.根据权利要求143所述的方法，其中使用所述多个不可延伸的引物，所述至少两个通用探针结合基序中的每一个包含独特的核苷酸序列。

152.一种用于在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括：

(A)正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；

(B)信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火，并且其中所述信号生成核酸探针被配置为在引入靶核酸并暴露于适当的条件时降解，并且如果所述混合物中存在所述靶核酸，则生成信号；并且所述信号的存在或不存在被配置为被检测；以及

(C)说明书。

153.一种用于在非靶核酸的存在下确定靶核酸的存在或不存在的系统，所述系统包括：

(A)反应容器，其被配置为接收：

i.所述样品；

ii.正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及

iii.信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；

(B)热循环仪，其被配置为使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及

(C)检测器，其被配置为检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

154.一种系统，其包括控制器，该控制器包括或能够访问包含非暂时性计算机可执行指令的计算机可读介质，所述非暂时性计算机可执行指令在被至少一个电子处理器执行时实现包括以下步骤的方法：

(A)提供包含或可能包含所述靶核酸和所述非靶核酸的样品；

(B)形成混合物，其包含：

i.所述样品；

ii.正向引物，其包含被配置为在扩增条件下与所述靶核酸杂交并且被配置为在所述扩增条件下不与所述非靶核酸杂交的第一区域，和被配置为在所述扩增条件下不与所述靶核酸杂交的第二区域；以及

iii.信号生成核酸探针，其中所述信号生成核酸探针当经受所述扩增条件时与所述第二区域或与之互补的区域退火；

(C)使所述混合物经受所述扩增条件，所述扩增条件适合于通过扩增反应扩增所述靶核酸，从而如果所述混合物中存在所述靶核酸，则扩增所述靶核酸，使得所述信号生成核酸探针被降解，并且生成信号；以及

(D)检测所述信号的存在或不存在，从而在所述非靶核酸的存在下确定所述靶核酸的存在或不存在。

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