KR20230066614A - 핵산 검출을 위한 조합물, 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
핵산 검출을 위한 조합물, 방법 및 키트. 조합물은 다음을 포함한다: 상류 프라이머, 여기서 표적 서열 결합 영역은 이의 3'-말단에 제공되고, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단은 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다; 하류 프라이머, 여기서 표적 서열 결합 영역은 이의 3'-말단에 제공되고, 표적 서열 결합 영역의 3' 말단은 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다; 및 신호 올리고뉴클레오타이드, 여기서 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리 변화에 의해 신호 변화를 발생시킨다.
Description
본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것으로, 특히 핵산의 검출에 관한 것이다.
조직병리학적 진단은 종양 진단의 황금 표준이며 오랫동안 임상 치료의 기초이다. 그러나, 병리 조직은 입수가 어려워 이의 샘플링이 불편하고, 종양 환자의 유전자 변이 상태를 지속적으로 모니터링하기 위한 지속적인 샘플링이 어렵다. 따라서, 종양 환자의 조기 선별, 투약 지도, 예후 결정 및 재발 모니터링은 환자의 말초 혈액에서 순환하는 종양 DNA(ctDNA)의 유전자 변이를 검출함으로써 실행될 수 있다. 그러나, 말초 혈액 샘플은 복합한 배경과 낮은 함량의 ctDNA를 가지며, 따라서, 미미하고 희귀한 서열의 검출을 위해서, 매우 높은 특이성과 민감도를 갖는 검출 방법 및 키트가 필요하다.
현재, 기존 유전자 변이 검출 시약은 주로 TaqMan 가수분해 프로브 방식이나 증폭 내화 돌연변이 시스템(ARMS)을 사용한다. TaqMan 가수분해 프로브 방법은 한 쌍의 특정 PCR 프라이머와 주형에 상보적인 하나의 특정 프로브 설계가 필요하다. 프로브의 결합 부위는 두 프라이머 사이에 위치하며, 프로브의 5'-말단과 3'-말단은 각각 형광 그룹(공여체)과 소광 그룹(수용체)에 의해 표시된다. TaqMan 프로브가 완전한 자유 상태에 있을 때, 형광 그룹과 소광 그룹은 서로 근접하고, 소광 그룹은 여기광의 작용하에서 형광 그룹의 들뜬 형광을 흡수하고, 형광 공명 에너지 전달(FRET)이 일어나서, 기기가 형광 신호를 감지하지 못한다는 것을 초래한다. PCR 증폭 과정에서, Taq DNA 중합효소는 5'-3'-핵외분해 활성 활성을 사용하여 표적 서열에 결합된 프로브를 절단하고 형광 보고 그룹 유전자와 소광 그룹이 서로 멀어지게 하여 형광 신호를 방출한다.
또한, ARMS 방법은 3'-핵외분해 활성이 결여된 DNA 중합효소의 특징을 사용한다. 프라이머의 3'-말단에 있는 염기가 표적 핵산 서열과 정확히 상보적으로 짝을 이루지 못하면, 표적 핵산 서열은 효과적으로 증폭될 수 없다. 이론적으로, 돌연변이 검출을 수행할 때, 하나의 범용 프로브가 돌연변이형 프라이머와 야생형 프라이머를 일치시키기 위해서 필요하며, 여기서 돌연변이 프라이머의 3'-말단은 돌연변이형 유전자와 완전히 일치하지만, 야생형 유전자와 일치하지 않는다. 돌연변이 유전자 검출이 실행될 때, 변이형 프라이머는 야생형 주형과 완전히 짝을 이룰 수 없기 때문에, 프라이머의 신장이 차단되어 변이 유전자 검출이 가능하다.
종양이 있는 환자의 말초혈액에서 ctDNA에 대해 액체생검을 실행될 때, ctDNA는 고도로 단편화되어 있고 단편의 길이가 90 bp 내지 160 bp에 분포하기 때문에, 선행 연구를 통해 표적 서열의 길이가 짧을수록 ctDNA의 검출률이 높아진다(Anderson et al., 2015). 그러나, 기존의 ctDNA 검출 기술은 TaqMan 가수분해 프로브 방식이나 ARMS 방식을 사용하더라도 표적 염기서열이 너무 길다는 문제가 있다. 특허 CN 105349654 B는 EGFR 유전자 돌연변이를 검출하기 위한 프로브, 프라이머, 검출 시스템 및 키트를 개시한다. EGFR 돌연변이 유전자 검출에 필요한 표적 서열의 길이는 70bp 내지 134bp이고, 엑손 18의 돌연변이 부위 검출에 필요한 증폭 표적 서열의 길이는 100bp 내지 116bp이고, 엑손 19의 돌연변이 부위 검출에 필요한 증폭 표적 서열의 길이는 70bp 내지 84bp이고, 엑손 20의 돌연변이 부위 검출에 필요한 증폭 표적 서열의 길이는 85 bp 내지 134 bp이고, 엑손 21의 돌연변이 부위 검출에 필요한 증폭 표적 서열은 109bp 내지 121bp이다. 증폭 표적 서열의 길이가 길수록 단편화된 ctDNA 주형의 검출률이 필연적으로 감소하므로 검출 민감도에 영향을 미친다.
또한, 기존 ARMS 방식의 돌연변이형 프라이머는 비특이적인 주형의 증폭을 완전히 차단하지 못하는 경우가 많으며, 검출 동안 위양성 결과가 쉽게 나온다. 특히 디지털 PCR 시스템과 같은 종점 검출 시스템에서, 증폭의 종점에서 돌연변이형 프라이머와 야생형 프라이머의 형광 신호는 구분하기 어려운 경우가 많으며, 이는 불충분한 검출 특이성을 초래한다.
이에 따라, 유전자 검출 분야에서, 핵산 검출의 민감성 및 특이성을 더욱 향상시키기 위한 요구사항이 존재한다.
상기 문제점에 대하여, 본 발명자는 ARMS법을 기반으로 프라이머 및 프로브의 설계 방식을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 검출용 조합물을 제공한다:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다; 및
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리의 변화에 의해 신호의 변화를 생성한다.
신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 일부이고, 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치하도록 설계되고, 또는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 추가로 포함하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머와 독립적이고 신호 검출 영역과 동일한 서열을 갖도록 설계된다.
신호 검출 영역은 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이룰 수 없도록 설계된다.
이러한 설계를 사용함으로써, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
한 양태에서, 표적 서열 특이적 프로브를 신호 올리고뉴클레오타이드로 교체하는 것에 기초하여, 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 3'-말단은 둘 다 표적 서열 상의 특정한 특정 검출 부위와 일치한다. 두 가지 방법의 협력을 통해, 표적 서열의 길이에 대한 요구 사항은 이론적 최소값으로 줄어들며, 아래의 예에서 입증된 것처럼, 표적 서열의 길이는 40bp를 초과할 필요가 없다. 전술한 바와 같이, 고도로 단편화된 핵산 샘플(예를 들어, ctDNA)의 검출에 있어서, 표적 서열의 길이가 짧을수록 검출률이 높아 검출 민감성을 크게 향상시킨다.
다른 양태에서, 본 발명의 조합물 및 반응 시스템은 교차 반응을 크게 피할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이형 표적 핵산 서열이 테스트될 때, 야생형 또는 다른 유사하거나 상동성인 표적 핵산과의 교차 반응이 없다. 특히, 야생형 표적 핵산 서열과 돌연변이형 표적 핵산 서열이 동시에 테스트될 경우, 둘은 작은 교차 반응을 나타내어 희귀 돌연변이 검출을 보다 용이하게 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조합물은 100bp 미만의 짧은 단편을 갖는 DNA 검출에 사용될 수 있고, 다양한 샘플 유형의 핵산 검출에 적합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조합물은. 상이한 튜브에서 야생형 유전자 및 돌연변이형 유전자의 정성적 검출 또는 정량적 검출을 수행할 필요 없이, 야생형 표적 핵산 서열과 돌연변이형 표적 핵산 서열을 하나의 반응관에서 동시에, 테스트할 수 있고 특히 말초 혈액의 ctDNA 샘플과 같은 희귀 샘플 검출에 적합하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조합물의 프라이머 쌍은 상이한 유형의 유전적 돌연변이를 위해 설계된다. 신호 올리고뉴클레오타이드가 프라이머의 일부로 설계될 때, 각 프라이머 쌍에 해당하는 시그널 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서로 동일할 수 있으나, 이의 표적 서열 결합 영역은 상이한 돌연변이형 유전자에 대해 상보적이다. 신호 올리고뉴클레오타이드가 프라이머와 독립적으로 존재하도록 설계되는 경우, 각 프라이머 쌍의 신호 검출 영역은 서로 동일할 수 있으나, 이의 표적 서열 결합 영역은 상이한 돌연변이형 유전자에 대해 상보적이다. 유사하게, 본 발명의 조합물은 추가로 다수의 프라이머 쌍 그룹을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 유형의 표적은 여러 그룹의 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 표적 서열 결합 영역을 사용하여 특이적으로 인식되고, 그런 후에 검출은 신호 올리고뉴클레오타이드에 의해 수행된다. 다중 검출에서, 타이핑이 필요하지 않은 유전자 돌연변이 유형의 경우, 상이한 유전자 돌연변이 유형의 검출을 실현하기 위해, 신호 올리고뉴클레오타이드를 공유하면서 상이한 상류 프라이머와 하류 프라이머만 설계하면 되므로, 프로브의 사용량을 감소시킨다. 한 양태에서, 비용이 절감될 수 있으며 이는 임상 사용에 도움이 되며; 다른 양태에서, 너무 많은 프로브에 의해 야기되는 반응 시스템의 배경 간섭도 상당히 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 조합물은 다른 핵산을 특이적으로 표적화할 수 있는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조합물의 상류 프라이머 및 하류 프라이머가 돌연변이형 유전자에 대해 설계된 경우, 즉 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 3'-말단이 모두 표적 서열상의 특정 검출 부위(즉, 돌연변이에 의해 발생되어 검출하고자 하는 돌연변이형 유전자를 다른 유전자와 구별하는 부위)와 일치할 때, 돌연변이형 유전자가 증폭될 수 있다. 또한, 본 발명의 조합물은 야생형 상류 프라이머의 3'-말단에 야생형 유전자와 특이적으로 어닐링되도록 야생형 유전자와 일치하는 부위가 제공되는 야생형 상류 프라이머; 및/또는 야생형 하류 프라이머의 3'-말단에 야생형 유전자와 특이적으로 어닐링되도록 야생형 유전자와 일치하는 부위가 제공되는 야생형 하류 프라이머를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표적 서열 결합 영역은 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이루지 않는 1 내지 5개의 불일치 염기를 제공할 수 있다. 예를 들어, 불일치 염기는 표적 서열 결합 영역의 3'-말단의 끝에서 두 번째 비트 또는 끝에서 두 번째 비트에 제공될 수 있다.
제 1 구현예에서, 본 발명의 조합물은 다음을 포함한다:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단도 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다; 및
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3'까지 순차적으로 제 1 스템 영역, 루프 영역, 제 2 스템 영역 및 앵커 영역을 포함하도록 설계되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출로 변형되며, 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역을 변형시키고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역, 제 2 스템 영역과 앵커 영역 사이의 위치, 또는 앵커 영역의 비 3'-말단을 변형시키고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리 변화에 의해 신호 변화를 발생시킨다.
상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 포함하고, 신호 검출 영역은 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이룰 수 없도록 설계된다.
제 1 스템 영역은 제 2 스템 영역과 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 설계되고, 앵커 영역은 신호 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 위치되며 신호 검출 영역과 부분적으로 또는 완전히 동일하게 설계된다.
앵커 영역은 신호 검출 영역과 완전히 또는 부분적으로 동일하도록 설계되었기 때문에, 앵커 영역은 신호 검출 영역의 상보적 서열과 어닐링되고 신장되어 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 증폭된 생성물을 증폭시킬 수 있음을 이해할 수 있다. 또한, 제 1 영역은 제 2 스템 영역과 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 설계되어 제 2 스템 영역과 함께 스템 루프의 스템 부분을 형성한다.
제 1 구현예의 조합물이 사용될 때, 제 1 스템 영역과 제 2 스템 영역은 서로 상보적이며 스템 루프의 스템 부분을 형성한다. 신호 올리고뉴클레오타이드가 완전한 "스템 루프" 구조일 때, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹은 서로 가깝고 형광 공명 에너지 전달 효율이 더 높다. 신호 올리고뉴클레오타이드의 제 1 스템 영역이 DNA 중합효소의 5'-3' 핵외분해 활성에 의해 가수분해되거나 신호 올리고뉴클레오타이드의 "스템 루프" 구조가 개방될 때, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹이 서로 멀어지고 형광 공명 에너지 전달 효율이 감소하여, 형광 신호에 변화가 생기고 이 변화가 기기에 의해 검출된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 신호 올리고뉴클레오타이드는 "스템 루프" 구조를 형성할 수 있으며, 이 스템 루프 구조는 여전히 본 발명의 프라이머의 어닐링 온도(예를 들면, 75℃까지)에서 안정한 구조(즉, "스템 루프"가 개방되지 않는다)를 갖는다.
본 발명에서, 제 1 스템 영역의 길이는 6-20nt일 수 있다.
본 발명에서, 제 2 스템 영역의 길이는 6-20nt일 수 있다.
본 발명에서, 루프 영역은, 예를 들어, 3-25nt 길이를 갖는 염기 서열일 수 있으며, 또한 예를 들어 C3, C6, C9 및 C12로 이루어진 그룹에서 선택되는 스페이서 변형일 수 있으며, 또한, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서, 제 2 스템 영역과 앵커 영역은 1-5염기 간격으로 배치될 수 있다.
특정 구현예에서, 앵커 영역의 길이는 15-30nt일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치될 수 있으며; 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 2 검출 그룹은 앵커 영역의 비 3'-말단에 위치될 수 있으며; 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역과 앵커 영역 사이에 위치될 수 있으며; 제 2 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 1 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치될 수 있으며; 제 2 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 1 검출 그룹은 앵커 영역의 비 3'-말단에 위치될 수 있고; 또는 제 2 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 1 검출 그룹은 제 2 영역과 앵커 영역 사이에 위치될 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 검출 그룹 또는 제 2 검출 그룹은 제 1 스템 영역의 5'-말단에 위치할 수 있다.
제 2 구현예에서, 본 발명의 조합물은 다음을 포함한다:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다; 및
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드는 유연한 올리고뉴클레오타이드로서 설계되며, 신호 검출 영역의 서열의 전체 또는 일부가 신호 검출 영역의 서열의 전체 또는 일부와 동일하며, 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되며, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리 변화에 의해 신호의 변화를 발생시키고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 신호 올리고뉴클레오타이드의 비 3'-말단에 위치된다.
신호 검출 영역은 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치되며, 신호 검출 영역은 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이룰 수 없도록 설계된다.
신호 올리고뉴클레오타이드는 신호 검출 영역과 완전히 또는 부분적으로 동일하도록 설계되었기 때문에, 신호 올리고뉴클레오타이드는 신호 검출 영역의 상보적 서열과 어닐링되고, 신장되어 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 증폭된 생성물을 증폭시킬 수 있음을 이해할 수 있다.
제 2 구현예의 조합물이 사용되는 경우, 상류 프라이머와 하류 프라이머가 표적 서열에 특이적으로 결합되고 신장되어 전증폭된 생성물을 생성한 후, 신호 올리고뉴클레오타이드는 전증폭된 생성물과 상보적으로 쌍을 이루어 PCR 증폭을 실행할 수 있고 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹은 PCR로 생산되는 이중가닥 증폭 생성물로 통합되어, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹 사이의 거리가 변화하여, 형광 신호에 변화가 생기고 이 변화가 기기에 의해 검출된다.
특정 구현예에서, 신호 올리고뉴클레오타이드의 길이는 15-30nt일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 제 1 검출 그룹은 5'-말단 또는 임의의 비 3'-말단의 위치에 위치되고, 제 2 검출 그룹은 제 1 검출 그룹으로부터 5-25nt만큼 이격되고, 3'-말단에 위치하지 않는다.
제 3 구현예에서, 본 발명의 조합물은 다음을 포함한다:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'말단이 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다;
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드의 서열의 전체 또는 일부는 신호 검출 영역의 서열과 동일하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리 변화에 의해 신호 변화를 발생시킨다; 및
제 2 프라이머, 여기서 제 2 프라이머의 서열의 전체 또는 일부는 신호 검출 영역의 서열과 동일하다.
신호 검출 영역은 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치하고, 신호 검출 영역은 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이룰 수 없도록 설계되며, 신호 올리고뉴클레오타이드와 동일한 신호 검출 영역 상의 영역은 제 2 프라이머와 동일한 신호 검출 영역 상의 영역의 하류에 위치된다.
구현예에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 신호 검출 영역의 상보적 서열과 교차 쌍을 이룰 수 있는 TaqMan 프로브이고; 또한, 제 2 프라이머는 신호 검출 영역과 완전히 또는 부분적으로 동일하도록 설계되어 있기 때문에, 제 2 프라이머는 신호 검출 영역의 상보적인 서열과 어닐링되고 신장되어 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 증폭된 생성물을 증폭시킬 수 있다.
제 3 구현예의 조합물이 사용되는 경우, 상류 프라이머와 하류 프라이머가 표적 서열에 특이적으로 결합되고 신장되어 전증폭된 생성물을 생성한 후, 제 2 프라이머와 신호 올리고뉴클레오타이드가 전증폭된 생성물과 상보적으로 쌍을 이룰 수 있으며, 제 2 프라이머가 신장될 때, 신호 올리고뉴클레오타이드가 가수분해되고 제 1 검출 그룹이 해제되어 형광 신호의 변화를 발생시키고 이 변화가 기기에 의해 검출된다.
당업자는 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 전증폭된 생성물을 증폭시키기만 하면 되는 적합한 제 2 프라이머를 설계하고 선택할 수 있었을 것이다.
본 발명의 제 3 구현예에서 신호 올리고뉴클레오타이드의 경우, 당업자는 혼성화 영역이 신호 검출 영역의 상보적 영역에 위치하는 한, 종래의 TaqMan 가수분해 프로브의 설계 원리에 따라 설계할 수 있었을 것이다.
특정 구현예에서, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 각각 신호 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 및 3'-말단에 위치된다.
제 4 구현예에서, 본 발명의 조합물은 다음을 포함한다:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있다;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다; 및
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리의 변화에 의해 신호의 변화를 발생시킨다.
신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 일부로 설계되고 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치된다. 신호 올리고뉴클레오타이드는 5'부터 3'까지 순차적으로 제 1 스템 영역, 루프 영역 및 제 2 스템 영역을 포함한다. 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치되고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치된다.
제 1 스템 영역은 제 2 스템 영역에 부분적으로 또는 완전히 상보적이도록 설계된다.
제 1 스템 영역은 제 2 스템 영역과 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 설계되어 제 2 스템 영역과 함께 스템 루프의 스템 부분을 형성함을 알 수 있다.
제 4 구현예의 조합물이 사용되는 경우, 신호 올리고뉴클레오타이드가 완전한 "스템 루프" 구조일 때, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹은 서로 가깝고 형광 공명 에너지 전달 효율이 더 높다. 제 1 스템 영역이 DNA 중합효소의 5'-3' 핵외분해 활성에 의해 가수분해되거나 신호 올리고뉴클레오타이드의 "스템 루프" 구조가 개방될 때, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹이 서로 멀어지고 형광 공명 에너지 전달 효율이 감소하여, 형광 신호에 변화가 생기고 이 변화가 기기에 의해 검출된다.
본 발명에서, 신호 올리고뉴클레오타이드가 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머에 설계되어, 기존의 ARMS 방식에서 프로브의 사용이 추가로 감소되어, 비용을 절감하면서도 검출 성능을 만족시킨다.
예시적인 구현예에서, 제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치될 수 있고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치될 수 있으며; 또는 제 2 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치되고, 제 1 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치된다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 핵산 검출 방법을 추가로 제공한다:
본 발명의 조합물, 증폭 시약 및 샘플을 혼합하는 단계;
샘플에 존재할 수 있는 표적 서열을 증폭하는 단계;
생성된 신호 변화를 획득하는 단계; 및
획득된 신호 변화에 따라 표적 핵산이 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 표적 핵산이 샘플에 존재하는지 여부가 결정되는 동안 표적 핵산이 정량화된다.
일부 구현예에서, 증폭 단계 전에, 이 방법은 샘플 혼합물을 상이한 반응 단위에 할당하는 단계를 추가로 포함하고, 이중 가닥 핵산은 단일 가닥 핵산으로 변성된다. 선택적으로, 샘플 혼합물을 상이한 반응 단위에 할당하는 단계 전에, 이 방법은 이중 가닥 핵산을 단일 가닥 핵산으로 변성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특히, 획득된 형광 신호에 따라 결정을 실행하는 것은 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹 사이에 형광 공명 에너지 전달이 있는지 여부를 검출하는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 증폭은 PCR에 의한 증폭을 의미하고, 예를 들어 초기 변성 및 변성, 어닐링 및 신장의 복수의 사이클을 포함할 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 테스트될 주형은 ctDNA이고 샘플은 말초 혈액이다.
일부 구현예에서, 샘플은 암에 걸렸거나 암에 걸렸을 것으로 의심되는 대상로부터 나온다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따라 디지털 PCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 엑손 18의 점 돌연변이(c.2156G>C 및 p.G719>A일 때의 돌연변이)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 2는 비교예 1에서 단편 길이가 다른 용액에서 고가 샘플, 중가 샘플 및 저가 샘플의 정량 데이터의 선형 회귀 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구현예에 따라 Q-PCR 테스트 플랫폼에서 EGFR 유전자의 엑손 18의 점 돌연변이(c.2156G>C 및 p.G719>A일 때의 돌연변이)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 또 다른 구현예에 따라 디지털 PCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 점 돌연변이(c.2369C>T 및 p.T790>M)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 5는 비교예 2에서 단편 길이가 다른 용액에서 고가 샘플과 저가 샘플의 정량 데이터의 선형 회귀 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 비교예 1에서 단편 길이가 다른 용액에서 고가 샘플, 중가 샘플 및 저가 샘플의 정량 데이터의 선형 회귀 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구현예에 따라 Q-PCR 테스트 플랫폼에서 EGFR 유전자의 엑손 18의 점 돌연변이(c.2156G>C 및 p.G719>A일 때의 돌연변이)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 또 다른 구현예에 따라 디지털 PCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 점 돌연변이(c.2369C>T 및 p.T790>M)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 5는 비교예 2에서 단편 길이가 다른 용액에서 고가 샘플과 저가 샘플의 정량 데이터의 선형 회귀 분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 특정한 구현예 및 실시예와 관련하여 아래에서 구체적으로 설명될 것이며, 따라서 본 발명의 장점 및 다양한 효과가 보다 명확하게 제시될 것이다. 당업자는 이러한 특정한 구현예 및 실시예가 본 발명을 제한하기보다는 본 발명을 설명하기 위해 사용된다는 것을 이해해야 한다. 독창적인 노력 없이 본 발명의 구현에 기초하여 당업자에 의해 획득된 다른 모든 구현예는 본 발명의 보호 범위에 속한다.
명세서 전체에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미로 이해되어야 한다. 따라서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모순이 발생하면, 설명이 우선한다.
본 명세서에서 "핵산"이라는 용어는 뉴클레오타이드 사이의 인산염 다이에스터 결합 또는 뉴클레오타이드 사이의 유사체에 의해 연결된 2'-데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하나 이에 제한되지 않는 뉴클레오타이드 모노머의 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 폴리머를 의미한다. 핵산 내의 뉴클레오타이드 모노머는 "뉴클레오타이드 잔기"로 지칭될 수 있다. 핵산은 완전히 데옥시리보핵산으로 형성되거나, 완전히 리보핵산으로 형성되거나 키메라 혼합물로 형성될 수 있으며, 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 모노머 단위는 본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 중 임의의 하나를 포함할 수 있고, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 핵산의 크기는 일반적으로 몇 개의 뉴클레오타이드 잔기에서 수천 개의 뉴클레오타이드 잔기까지 다양하다. "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 비교적 짧은 길이(예를 들어, 80 미만)를 갖는 뉴클레오타이드 폴리머를 지칭한다. 달리 지적되지 않는 한, 핵산 서열이 제시될 때마다, 핵산은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 순서로 되어 있음을 이해해야 한다. 달리 지적하지 않는 한, "A"는 아데닌, "C"는 시토신, "G"는 구아닌, "T"는 티민, "U"는 우라실을 나타낸다.
당업계의 관례적인 용어에 따르면, 핵산의 길이는 염기쌍("bp"로 약칭), 뉴클레오타이드("nt"로 약칭) 또는 킬로베이스("kb"로 약칭)로 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 "염기 상보적 짝짓기"란 A와 T, A와 U, G와 C가 수소 결합에 의한 상호 연결을 의미한다. 이에 따라, "불일치 염기"는 "염기 상보적 짝짓기"에 명시된 것 이외의 모든 짝짓기 상황을 말하며, 예를 들어 A와 C, A와 G, T와 G, 또는 T와 C가 짝을 이룬다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 표적 서열 결합 영역에 1 내지 5개의 불일치 염기가 제공될 수 있고, 불일치 염기 및 3'-말단의 염기가 공동으로 기능할 수 있어, 3'-말단에서 프라이머에 상보적이지 않은 주형에서 프라이머의 증폭률은 상당히 감소된다. 이러한 불일치 염기의 구성은 당업자의 능력 범위 내에 속한다. 일부 구현예에서, 불일치가 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 끝에서 두 번째 비트에 도입된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 핵산 돌연변이를 검출하는 것이다.
본 발명에서, "돌연변이"는 다음 항목: 염기 치환 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이로부터 선택될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 돌연변이는 염기 치환 돌연변이, 즉 검출될 두 유형의 표적 서열(야생형 표적 서열 및 돌연변이형 표적 서열)은 염기 수에는 차이가 없지만, 하나 이상의 염기 유형이 다르다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 돌연변이이다.
본 발명에서, 용어 "특정 검출 부위"는 표적 핵산을 다른 핵산과 구별할 수 있는 염기 부위를 의미한다. 예를 들어, 점 돌연변이 상황의 경우, 야생형 핵산과 돌연변이형 핵산 사이 또는 상이한 돌연변이형 핵산 사이에 돌연변이 염기가 있는 경우, "특정 검출 부위"는 돌연변이 염기이고; 핵산 분류 상황(예를 들어, 일부 바이러스에 대해 분류 수행)의 경우, 돌연변이 상황과 유사하게, 상이한 유형의 핵산 사이에 하나 또는 여러 개의 염기 차이가 있는 경우, "특정 검출 부위"는 상이한 염기 중 하나이다.
"상류 프라이머와 하류 프라이머 모두의 3'-말단의 표현은 표적 서열의 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있다"는 표현은 상류 프라이머와 하류 프라이머의 3'-말단이 표적 서열의 동일한 특정 검출 부위에 모두 상보적일 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 점 돌연변이 상황의 경우, 본 발명의 조합물에서 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 3'-말단은 돌연변이 염기에 대해 상보적이며; 핵산 타이핑 상황의 경우, 본 발명의 조합물에서 상류 프라이머의 3'-말단은 상이한 염기에 대해 상보적이고, 하류 프라이머의 3'-말단은 또한 상이한 염기에 대해 상보적이다. 이러한 설계를 사용함으로써, 프라이머의 3'-말단이 특정 검출 부위에 상보적이지 않을 때, 프라이머의 신장이 차단되어, 표적 서열의 검출을 실현한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다: 올리고뉴클레오타이드는 주형 의존성 DNA 중합효소에 의해 DNA 합성을 "개시"하며, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단은 유리 3'-OH 염기를 제공하며 더 많은 "뉴클레오타이드"가 주형 의존 DNA 중합효소에 의해 3'-OH 염기에 연결되어 3'-5'-포스포다이에스터 결합을 확립하여 데옥시리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트가 사용되고 따라서 피로인산이 해제된다.
용어 "표적 서열", "표적 핵산", "표적 핵산 서열" 또는 "표적"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 증폭될, 검출될, 또는 증폭되고 검출될 핵산 서열 부분을 지칭한다. 핵산 서열 부분은 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링되거나 혼성화될 수 있다.
용어 "혼성화"는 두 핵산의 염기가 서로 쌍을 이루어 이중 가닥 구조를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화를 실현하기 위해 전체 길이를 따라 서로 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 이해될 수 있다.
본 명세서에서 정방향 프라이머로도 알려진 "상류 프라이머"의 용어는 음성 가닥을 따라 연속적으로 신장되는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명에서 사용되는 역방향 프라이머로도 알려진 "하류 프라이머"라는 용어는 양성 가닥을 따라 연속적으로 신장되는 올리고뉴클레오타이드이다. 양성 가닥은 센스 가닥 또는 양성 센스 가닥이며 암호화 가닥이라고도 한다. 양성 가닥은 일반적으로 이중 가닥 DNA의 상단에 위치하며, 그 방향은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3'이고, 양성 가닥의 염기 서열은 기본적으로 유전자의 mRNA와 동일하다. 가닥에 결합된 프라이머는 역방향 프라이머이다. 음성 가닥은 넌센스 가닥을 포함하며, 비암호화 가닥이라고도 한다. 음성 가닥은 양성 가닥과 상보적이며, 음성 가닥에 결합된 프라이머는 정방향 프라이머이다. 양성 센스 가닥과 안티센스 가닥의 명칭이 서로 바뀔 때, 상응하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 명칭도 함께 바뀔 수 있음을 이해해야 한다.
핵산 서열을 기술하는 맥락에서, 본 명세서에서 "의 상류", "...의 상류에 위치된", "...상류가 있다" 등의 표현은 각각 동일한 핵산 서열에서 참조되는 영역보다 5'-말단에 더 가까운 핵산 서열의 일부를 나타낸다. 예를 들어, 일부는 참조되는 영역에 매우 인접할 수 있고, 또한 하나 이상의 염기에 의해 참조되는 영역으로부터 이격될 수 있다. 상응하게, 핵산 서열을 기술하는 맥락에서, 본 명세서에서 사용된 "하류", "...의 하류에 위치된", "...하류가 있다" 등의 용어는 각각 동일한 핵산 서열에서 참조되는 영역보다 3'-말단에 더 가까운 핵산 서열의 일부를 나타낸다. 예를 들어, 일부는 참조되는 영역에 매우 인접할 수 있고, 또한 하나 이상의 염기에 의해 참조되는 영역으로부터 이격될 수 있다. 기술된 핵산이 이중 가닥 핵산인 경우, "상류" 및 "하류"의 표현은 별도의 규정이 없는 종종 양성-센스 가닥의 5'-말단 및 3'-말단을 참조로 취함을 이해해야 한다.
용어 "TaqMan 프로브" 및 "가수분해 프로브"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. TaqMan 프로브는 실시간 PCR 기술 플랫폼에서 개발된 형광 검출 기술이고, 프로브의 5'-말단은 제 1 검출 그룹을 함유하고 이의 3'-말단은 제 2 검출 그룹을 함유한다. 프로브가 완료되면, 제 1 검출 그룹에 의해 방출된 형광 신호가 제 2 검출 그룹에 의해 수신된다. PCR 증폭이 수행될 때, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'-말단에서 3'-말단로 핵외분해성 활성에 의해 효소 절단 및 분해되어, 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹이 분리되고 형광 신호가 방출되어, 형광 신호 축적과 PCR 생성물 형성의 완전한 동기화를 실현한다.
본 명세서에서 "엄격한 조건"의 표현은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건 및 높은 엄격한 조건 중 어느 하나일 수 있다. "낮은 엄격한 조건"은 예를 들어 5x SSC 용액, 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드 및 32℃를 포함하는 조건이다. 또한, "중간 엄격한 조건"은 예를 들어 5x SSC 용액, 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드 및 42℃를 포함하는 조건이며, "높은 엄격한 조건"은 예를 들어 5x SSC 용액, 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드 및 50℃를 포함하는 조건이다. 이러한 조건하에서 온도가 높을수록 상동성이 높은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 DNA)를 보다 효과적으로 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 강도, 시간 및 염 농도와 같이 혼성화 엄격도에 영향을 미치는 다양한 요인이 있지만, 당업자는 이러한 요인을 적절히 선택함으로써 유사한 엄격도에 도달할 수 있었을 것이다.
본 명세서에서 용어 "유연한 올리고뉴클레오타이드"는 단일 가닥 상태에서 분자적 유연성으로 인해 나선 모양이 되고 혼성화되거나 어닐링된 후 신장되어 이중 가닥 상태가 된 올리고뉴클레오타이드를 의미하고, 올리고뉴클레오타이드가 수소 결합의 작용으로 인해 상대적으로 단단한 이중 나선 구조로 고정되고, 유연한 올리고뉴클레오타이드에 표시된 제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹 사이의 거리가 변화하여 검출 가능한 신호를 발생시킨다. 예를 들어, 유연한 올리고뉴클레오타이드는 US 9845492 B2의 개시를 참조하여 얻을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹 중 하나는 형광 그룹일 수 있고, 다른 하나는 소광 그룹 또는 형광 공명 에너지 전달에 의해 형광 그룹에 의해 신호의 변화를 생성할 수 있는 다른 그룹일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 형광 공명 에너지 전달에 의해 신호 변화를 발생시키는 그룹은 FRET의 작용에 의해 형광 신호 변화를 발생시킬 수 있으므로 Cy3 또는 Cy5일 수 있다.
본 발명에서, 형광 그룹은 예를 들어 다음 항목: FAM, HEX, VIC, ROX, Cy3, Cy5 및 Cy5.5로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서, 소광 그룹은 예를 들어 다음 항목: TAMRA, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL, QXL 및 DDQI 항목으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 신호 올리고뉴클레오타이드 및 상류 프라이머 및 하류 프라이머의 전증폭된 생성물은 어닐링되고 신장되며, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 신장에 의해 생성되는 이중 가닥 증폭 산물에 통합되어 거리의 변화(증가)를 발생시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조합물은 증폭 시약을 추가로 포함하는 키트일 수 있다.
본 발명에서 용어 "증폭 시약"은 dNTP, DNA 중합효소를 포함하나 이에 제한되지 않는 PCR을 위한 시약 및 PCR을 촉진하는 일부 시약, 예를 들어 KCl, MgCl2, Tris-HCl 및 다이티오쓰레이톨(DTT)을 의미한다.
본 발명에서, 키트 내 조합물 및 다양한 구성요소는 별도로 포장된 형태로 존재할 수도 있고, 미리 혼합된 형태로 존재할 수도 있다.
본 발명에서 "초기 변성" 및 "변성"의 목적은 이중 가닥 DNA의 쌍을 이루는 상보적인 염기 사이의 수소 결합을 파괴하여 이중 가닥이 2개의 개별 가닥으로 분리되도록 하는 것이다. 예를 들어, 개별 가닥은 이중 가닥 DNA를 함유하는 혼합물을 가열함으로써 형성될 수 있는데, 예를 들어, 혼합물은 90℃, 92℃, 95℃ 또는 98℃로 가열되어 이중 가닥 DNA를 해리시킨다. 해리가 완료된 후, 혼합물은 실온 또는 실온 이하로 냉각된다. 다른 예의 경우, 개별 가닥은 용액의 이온 강도를 변경(예를 들어, 산, 알칼리, 염 등 추가)하여 이중 가닥 DNA 사이의 수소 결합을 끊음으로써 형성될 수 있고 이중 가닥 DNA의 단일 가닥 DNA로의 해리는 효소(예를 들어, 헬리카제)를 사용하여 실현할 수도 있다. 또한, 핫 스타트 중합효소를 필요로하는 반응에서, "초기 변성" 단계는 중합효소에 대한 열 활성화를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 디지털 PCR 플랫폼이 필요한 경우, 이중 가닥 DNA가 단일 가닥 DNA로 변성된 후, "초기 변성"은 개별 가닥을 미세 방울/미세 구멍에 할당하여 반응에 참여하는 유효 표적의 수를 증가시켜, 반응 감도를 향상시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭은 두 개의 순환 증폭 단계로 나눌 수 있다. 제 1 순환 증폭 단계는 3-15 사이클을 가질 수 있고, 제 2 순환 증폭 단계는 30-50 사이클을 가질 수 있다.
증폭에 적용 가능한 프로그램 및 증폭을 위한 일반적인 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 구체적인 반응 조건은 92℃ 내지 96℃에서 5분-15분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 92℃ 내지 96℃에서 10-60초 동안 변성을 수행하는 단계; 55℃ 내지 75℃에서 어닐링 및 30-90초 동안 신장을 수행하고 총 3-15 사이클을 실시하는 단계, 및 92℃ 내지 96℃에서 10-60초 동안 변성을 수행하는 단계, 45℃ 내지 65℃에서 어닐링 및 30-90초 동안 신장을 수행하고 35-50 사이클을 실시하는 단계; 및 4℃ 내지 15℃에서 반응을 종결시키는 단계일 수 있다. 선택적으로, 열 순환 단계 이후에, 방법은, 예를 들어, 94℃ 내지 98℃에서 5-15분 동안 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 다른 예시적인 구현예에서, 증폭은 90℃ 내지 96℃에서 5-15분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 90 내지 95℃에서 10-60초간 변성을 수행하는 단계, 50 내지 75℃에서 어닐링 및 30-90초 동안 신장을 수행하고 35-50 사이클을 실시하는 단계; 및 4℃ 내지 15℃에서 반응을 종결시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 열 순환 단계 이후에, 방법은, 예를 들어 94℃ 내지 98℃에서 5-15분 동안 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭은 95℃에서 10분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 및 55℃에서 어닐링 및 60초 동안 신장을 수행하고 총 45 사이클을 실시하는 단계; 10℃에서 반응을 종료하는 단계를 포함한다.
샘플에서 표적 서열에 대한 전증폭을 수행하기 위해서만 사용되는 경우, 반응 시스템에서 상류 프라이머 또는 하류 프라이머의 농도는 예를 들어 15nM 내지 150nM일 수 있으며, 바람직하게는 30nM 내지 90nM, 보다 바람직하게는 45nM일 수 있으며; 그렇지 않으면, 반응 시스템에서 상류 프라이머 또는 하류 프라이머의 농도는 150nM 내지 1800nM, 바람직하게는 300nM 내지 900nM, 보다 바람직하게는 450nM일 수 있다.
신호 올리고뉴클레오타이드가 독립적으로 존재하는 경우, 반응 시스템에서 이의 농도는, 예를 들어 150nM 내지 1500nM, 바람직하게는 300nM 내지 600nM, 보다 바람직하게는 450nM이다.
본 발명에서, "제 1", "제 2" 등의 표현은 단지 설명의 목적이고 정의된 물질을 구별하기 위해 사용되며, 어떠한 방식으로든 순서나 우선순위를 정의하지 않는다.
본 발명에서, 테스트 중인 샘플은 유리 말초 혈액 샘플, 인간 또는 미생물의 기타 유리 핵산 샘플, 포르말린 고정 및 파라핀 내장 조직(FFPE) 샘플, 신선한 조직 샘플, 소변 샘플, 세척액 샘플, 뇌척수액 샘플, 배양 세포주 샘플 및 인공적으로 합성된 플라스미드 샘플 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 특정 실시예에 의해 보다 상세하게 설명될 것이지만, 본 발명은 실시예에 제한되지 않는다.
실시예 1: ddPCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 엑손 18의 c.2156G>C 및 p.G719>A의 점 돌연변이 검출
샘플 준비:
QIAGEN 컴퍼니의 QIAamp DNA Mini와 Blood Mini 키트는 HEK-293T 세포 DNA를 각각 추출하기 위해 키트를 위한 작동 지침에 따라 사용하며, 상하이 상곤 바이오텍에 의해 제공되는 HEK-293T 세포 DNA와 G719A 플라스미드 DNA를 각각 초음파 처리하고 자성 비드로 스크리닝 정제하여, 야생형 주형(HEK-293T 세포주 DNA)과 돌연변이형 주형(G719A 플라스미드 DNA)을 얻었다. 두 유형의 주형을 일정한 비율에 따라 혼합하여 EGFR 유전자의 G719A 점돌연변이를 포함하는 모의 임상 샘플을 얻는다. 또한, 단편화된 야생형 DNA를 사용하여 음성 대조군(Neg)을 준비하고, TE 버퍼를 무주형 대조군(NTC)으로 사용하였다.
프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드의 설계: EGFR 엑손 18의 점 돌연변이를 위해 상류 프라이머, 하류 프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드를 설계하였으며, 이들의 서열은 표 1에 도시된 바와 같다.
| 명칭 | 번호 | 뉴클레오타이드 서열 (5'-3') | 변형 |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | SEQ ID NO:1 | CCGACTGCTGACAAAGTATAAAAAAGATCAAAGTGCTGGC | |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | SEQ ID NO:2 | GCCGAACGCACCGGAGG | |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | SEQ ID NO:3 | CCGCCTGT-C9-ACAGGCGGTACCGACTGCTGACAAAGTAT | 5'FAM, BHQ1 (17), C9 스페이서 (8) |
돌연변이형 상류 프라이머(SEQ ID NO:1)는 전체 길이가 40bp이고, 이의 3'-말단의 1번째 염기 내지 20번째 염기가 표적 서열 결합 영역이며, 이의 5'-말단의 1번째 염기 내지 20번째 염기가 신호 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO: 3)의 3'-말단의 1번째 염기 내지 20번째 염기와 동일하다. 돌연변이형 하류 프라이머(SEQ ID NO:2)는 전체 길이가 17bp이고 표적 서열에 결합되어 있다. 신호 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO: 3)는 전체 길이가 37bp이고, 이의 3'-말단의 1번째 염기 내지 20번째 염기가 앵커 영역이고, 이의 5'-말단의 8개 염기가 이의 제 1 스템 영역이고, 이의 5'-말단의 9번째 염기 내지 16번째 염기가 이의 제 2 스템 영역이다.
반응 시스템은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 제제화된다.
| 시약 구성요소 | 농도 |
| 2x ddPCR 프로브용 수퍼믹스 | 1x |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | 45 nM |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | 450 nM |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | 450 nM |
| DNA 샘플 | 15 ng |
| 초순수 | 20 μL에 도달할 때까지 초순수 첨가 |
제제화 완료 후, 검출될 주형을 함유하는 20μL의 반응 용액을 금속 욕조에 넣고 95℃에서 1분간 변성을 수행한 후, 반응 용액을 즉시 2℃ 내지 8℃ 냉장고에 넣어 2-3분 동안 식힌다.
20μL의 냉각된 PCR 반응 용액을 미세 방울 발생기 카트리지의 샘플 구멍에 넣고, 70μL의 미세 방울 발생기 오일(Bio-Rad, 1863005)을 미세 방울 발생기 카트리지의 오일 구멍에 첨가하고 마지막으로 미세 방울 발생기 카트리지를 밀봉 스트립(Bio-Rad, 1863009)을 사용하여 밀봉한다.
준비된 미세 방울 생성기 카트리지를 미세 방울 생성기에 배치하여 미세 방울 생성을 시작한다. 약 2분 후, 미세 방울의 준비가 완료되고, 카트리지를 꺼내고 40μL의 미세 방울을 구멍의 최상단 열에서 조심스럽게 96-구멍 PCR 플레이트(Bio-Rad, 1200192)로 옮긴다.
증폭 판독:
필름 밀봉 처리를 96-구멍 플레이트에 실행한 후, 96-구멍 플레이트를 PCR 열 순환기(Bio-Rad, PX1 PCR Plate Sealer)에 넣고 특이적 농축, 농축된 주형의 특이적 증폭 및 형광 신호의 검출을 표적 핵산 서열에 순차적으로 수행한다. 반응 프로그램은 다음을 필요로 한다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 65℃에서 어닐링 및 60초 동안 신장을 수행하고 총 45 사이클을 실시하는 단계; 98℃에서 10분 동안 불활성화시키는 단계; 및 10℃에서 반응을 종료하는 단계.
반응 과정 동안, PCR의 제 1 사이클에서, 돌연변이형 상류 프라이머와 돌연변이형 하류 프라이머는 표적 핵산 서열을 특수하게 증폭한다. 증폭 후, 상류 프라이머의 "신호 검출 영역"에 상보적인 서열이 새로 추가되어 이후에 신호 올리고뉴클레오타이드와 쌍을 이루고 신호 올리고뉴클레오타이드에 의해 인식될 것이다.
반응이 완료된 후 신호 올리고뉴클레오타이드와 돌연변이형 하류 프라이머는 상응하는 농축된 주형과 쌍을 이루어 증폭시킬 수 있으며, 돌연변이형 하류 프라이머가 앵커 영역으로 증폭되면, 제 1 스템 영역은 이의 5'-3'-핵외분해성 활성을 사용하여 DNA 중합효소에 의해 가수분해되어, 형광 그룹이 소광 그룹으로부터 분리되고, 형광 신호가 방출되어, 돌연변이형 주형을 검출한다.
데이터 분석:
데이터 분석은 BIO-RAD 컴퍼니의 Quantasoft 디지털 PCR 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며 결과는 도 1에 도시된 바와 같다. "E02"는 무주형 대조군(NTC)의 테스트 결과이고, "F02"는 음성 대조군(Neg)의 테스트 결과이고, "H02"는 모의 임상 샘플의 결과이다. 도 1에서 음성 대조군과 무주형 대조군 모두에서 비특이적 증폭이 없음을 알 수 있으며, c.2156G>C 및 p.G719>A의 돌연변이는 모의 임상 샘플에서 특이적으로 인식될 수 있다.
비교예 1
실시예 1에서, 상류 프라이머와 하류 프라이머는 모두 EGFR 유전자의 엑손 18의 점 돌연변이를 특이적으로 인식한다. 변이 유전자를 특이적으로 인식하는 두 개의 프라이머 용액과 변이 유전자를 특이적으로 인식하는 하나의 프라이머만을 사용한 용액의 검출 효과 차이를 조사하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
샘플 준비:
야생형 주형(HEK-293T 세포주 DNA)과 돌연변이형 주형(G719A 플라스미드 DNA)의 준비 과정은 실시예 1과 동일하다. 두 유형의 주형을 상이한 비율에 따라 혼합하여 고가 샘플(이론 농도 393 복제물/μL), 중가 샘플(이론 농도 44 복제물/μL) 및 저가 샘플(이론 농도 4 복제물/μL)을 얻었고, 이의 각각은 EGFR 유전자의 G719A 점 돌연변이를 함유한다. 또한, 단편화된 야생형 DNA를 사용하여 음성 대조군(Neg)을 준비하고, TE 버퍼를 무주형 대조군(NTC)으로 사용하였다.
프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드의 설계:
돌연변이 유전자를 특이적으로 인식하는 두 개의 프라이머의 용액은 표 1의 설계를 사용하는 반면, 돌연변이 유전자를 특이적으로 인식하는 단일 프라이머의 용액은 표 3의 설계를 사용한다.
| 프라이머의 명칭 | 번호 | 뉴클레오타이드 서열 (5'-3') | 변형 |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | SEQ ID NO:2 | GCCGAACGCACCGGAGG | |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | SEQ ID NO:3 | CCGCCTGT-C9-ACAGGCGGTACCGACTGCTGACAAAGTAT | 5'FAM, BHQ1 (17), C9 스페이서 (8) |
| 상류 프라이머 1 | SEQ ID NO:7 | CCGACTGCTGACAAAGTATAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG | |
| 상류 프라이머 2 | SEQ ID NO:8 | CCGACTGCTGACAAAGTATAGGATCTTGAAGGAAACTGA | |
| 상류 프라이머 3 | SEQ ID NO:9 | CCGACTGCTGACAAAGTATAGCTCCCAACCAAACTCTCTTG | |
| 상류 프라이머 4 | SEQ ID NO:10 | CCGACTGCTGACAAAGTATATCTTACACCCAGTGGAGAAG | |
| 상류 프라이머 5 | SEQ ID NO:11 | CCGACTGCTGACAAAGTATACAGCTTGTGGAGCTTCTTACA |
표 3의 하류 프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드는 표 1과 동일하다. 또한, 상류 프라이머 그룹이 설계되어 있으며, 이러한 상류 프라이머는 특별히 점 돌연변이를 인식하지 않는다.
두 용액은 동일한 돌연변이형 하류 프라이머와 상이한 돌연변이형 상류 프라이머/상류 프라이머를 사용하여, 이의 상응하는 표적 서열은 길이가 상이하다. 자세한 내용은 도 4를 참조.
| 프라이머의 명칭 | 번호 | 상응하는 표적 서열의 길이 |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | SEQ ID NO:1 | 36 bp |
| 상류 프라이머 1 | SEQ ID NO:7 | 41 bp |
| 상류 프라이머 2 | SEQ ID NO:8 | 60 bp |
| 상류 프라이머 3 | SEQ ID NO:9 | 82 bp |
| 상류 프라이머 4 | SEQ ID NO:10 | 100 bp |
| 상류 프라이머 5 | SEQ ID NO:11 | 114 bp |
반응 시스템은 아래 표 5에 도시된 바와 같이 제제화한다.
| 시약 | 농도 |
| 2x ddPCR 프로브용 수퍼믹스 | 1x |
| 돌연변이형 상류 프라이머 or 상류 프라이머 1/2/3/4/5 | 45 nM |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | 450 nM |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | 450 nM |
| DNA 샘플 | 15 ng |
| 초순수 | 20 μL에 도달할 때까지 초순수 첨가 |
미세 방울이 생성되기 전에, 테스트 중인 주형을 함유하는 20μL의 반응 용액을 금속 욕조에 넣고 95℃에서 1분간 변성을 수행한 후, 반응 용액을 즉시 2℃ 내지 8℃ 냉장고에 넣어 2-3분 동안 식힌다.
20μL의 냉각된 PCR 반응 용액을 미세 방울 발생기 카트리지의 샘플 구멍에 넣고, 70μL의 미세 방울 발생기 오일을 미세 방울 발생기 카트리지의 오일 구멍에 첨가하고 마지막으로 미세 방울 발생기 카트리지를 밀봉 스트립을 사용하여 밀봉한다.
준비된 미세 방울 생성기 카트리지를 미세 방울 생성기에 배치하여 미세 방울 생성을 시작한다. 약 2분 후, 미세 방울의 준비가 완료되고, 카트리지를 꺼내고 40μL의 미세 방울을 구멍의 최상단 열에서 조심스럽게 96-구멍 PCR 플레이트로 옮긴다.
증폭 판독:
필름 밀봉 처리를 96-구멍 플레이트에 실행한 후, 96-구멍 플레이트를 PCR 열 순환기에 넣는다. 사용된 프로그램은 다음을 필요로 한다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 55℃에서 어닐링 및 60초 동안 신장을 수행하고 총 48 사이클을 실시하는 단계; 98℃에서 10분 동안 불활성화시키는 단계; 및 10℃에서 반응을 종료하는 단계.
PCR 증폭이 끝난 후, 96-구멍 플레이트를 미세 방울 분석기에 넣고 FAM/HEX 채널을 선택하여 신호 판독을 실행한다.
통계 분석:
QuantaSoft 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 신호의 강도와 수를 분석하여 EGFR 유전자의 엑손 18의 점 돌연변이 변이형의 복제 수와 농도를 얻었으며, 결과는 표 6에 도시된 바와 같다.
| 정량 평균 (단위: 복제물/μL) | |||
| 단편의 길이 | 고가 샘플 | 중가 샘플 | 저가 샘플 |
| 36 bp | 308.1 | 36.5 | 3.1 |
| 41 bp | 293.5 | 31.9 | 3.4 |
| 60 bp | 207.7 | 26.3 | 2.8 |
| 82 bp | 141.9 | 18.2 | 1.4 |
| 100 bp | 145.5 | 15.6 | 1.8 |
| 114 bp | 64.4 | 11.9 | 1.4 |
표 6으로부터 표적 서열의 단편이 짧을수록, 샘플 정량 능력, 즉 G719A 변이형 절편 검출 능력이 높음을 알 수 있다.
표 6의 데이터에 대하여 선형 회귀 분석을 실행하였으며, 분석 결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 돌연변이형 고가 샘플, 중가 샘플 및 저가 샘플이 검출될 때, 검출 능력은 표적 서열의 길이와 음의 상관관계가 있다는 것을 알 수 있다. 표적 서열이 짧을수록, 돌연변이형 단편이 더 많이 검출되고 검출 능력이 높아진다; 그렇지 않으면, 검출 능력이 낮아진다.
실시예 2: Q-PCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A의 점 돌연변이 검출
샘플 준비:
QIAGEN 컴퍼니의 QIAamp DNA Mini와 Blood Mini 키트는 HEK-293T 세포 DNA를 각각 추출하기 위해 키트를 위한 작업 지침에 따라 사용하며, 상하이 상곤 바이오텍에 의해 제공되는 HEK-293T 세포 DNA와 G719A 플라스미드 DNA를 각각 초음파 처리하고 자성 비드로 스크리닝 정제하여, 야생형 주형(HEK-293T 세포주 DNA)과 돌연변이형 주형(G719A 플라스미드 DNA)을 얻었다. 두 유형의 주형을 일정한 비율에 따라 혼합하여 EGFR 유전자의 G719A 점돌연변이를 포함하는 모의 임상 샘플을 얻는다. 또한, 단편화된 야생형 DNA를 사용하여 음성 대조군(Neg)을 준비하고, TE 버퍼를 무주형 대조군(NTC)으로 사용하였다.
반응용 제제:
프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드의 설계: EGFR 엑손 18의 점 돌연변이를 위해 상류 프라이머, 하류 프라이머 및 신호 올리고뉴클레오타이드를 설계하였으며, 이들의 서열은 표 7에 도시된 바와 같다.
| 명칭 | 번호 | 뉴클레오타이드 서열 (5'-3') | 변형 |
| 하류 프라이머 | SEQ ID NO:2 | CAAAGCAGAAACTCACATCG | |
| 상류 프라이머 | SEQ ID NO:4 | CGACGGCTGACACGATAACTCTGACTCACCACAACGAGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC | |
| 제 2 프라이머 | SEQ ID NO:5 | CGACGGCTGACACGATA | |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | SEQ ID NO:6 | CTCTGACTCACCACAACG | 5'FAM3'BHQ1 |
반응 시스템은 아래 표 8에 도시된 바와 같이 제제화한다.
| 시약 구성요소 | 농도 |
| MgCl2 | 3.8 mM |
| Taq 효소 | 2 U |
| dNTP | 0.8 mM |
| 상류 프라이머 | 45 nM |
| 제 2 프라이머 | 450 nM |
| 하류 프라이머 | 450 nM |
| 신호 올리고뉴클레오타이드 | 450 nM |
| DNA 샘플 | 15 ng |
| 초순수 | 20 μL에 도달할 때까지 초순수 첨가 |
증폭 판독:
PCR 튜브를 덮고 밀봉한 후 샘플을 가볍게 균일하게 혼합한 후 순간적으로 원심분리한 후 실온에 5분간 방치한다. PCR 튜브를 다시 휴대용 원심분리기에 넣고 순간적으로 원심분리한 후 형광 정량 PCR 기기(ABI 7500 실시간 형광 정량 PCR 시스템)의 트레이로 옮긴다. 사용된 프로그램은 다음을 필요로 한다: 95℃에서 5분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 60℃에서 어닐링 및 30초 동안 신장을 수행하고 조명 없이 총 10 사이클을 실시하는 단계; 56℃에서 어닐링 및 30초 동안 신장을 수행하고 조명과 함께 총 30 사이클을 실시하는 단계; 및 10℃에서 반응을 종료하는 단계.
데이터 분석:
데이터 분석은 Q-PCR 테스트 플랫폼을 이용하여 수행하였으며, 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 도 3으로부터 음성 대조군과 무주형 대조군 모두에서 비특이적 증폭이 없다는 것과 G719A 단편은 모의 임상 샘플로부터 특별히 인식될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: ddPCR 플랫폼에서 EGFR 유전자의 c.2369C>C 및 p.G719>A의 점 돌연변이 검출
샘플 준비:
QIAGEN 컴퍼니의 QIAamp DNA Mini와 Blood Mini 키트는 HEK-293T 세포 DNA 및 NCI-H1975 세포주 DNA를 추출하기 위해 키트를 위한 작업 지침에 따라 사용하며, 두 유형의 세포주 DNA를 각각 초음파 처리하고 자성 비드로 스크리닝 정제하여, 야생형 EGFR 주형(HEK-293T 세포주 DNA)과 돌연변이형 EGFR T790M 주형(NCI-H1975 세포주 DNA)을 얻었다. 두 유형의 주형을 일정한 비율에 따라 혼합하여 EGFR 유전자의 T790M 점돌연변이를 포함하는 모의 임상 샘플을 얻는다. 또한, 단편화된 야생형 DNA를 사용하여 음성 대조군(Neg)을 준비하고, TE 버퍼를 무주형 대조군(NTC)으로 사용하였다.
프라이머의 서열은 표 9에 도시된 바와 같다.
| 프라이머의 명칭 | 번호 | 뉴클레오타이드 서열 (5'-3') | 변형 |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | SEQ ID NO:12 | CCGCTGC-C9-GCAGCGGTCCACCGTGCARCTCATAAT | 5'FAM,C9(7), BHQ1(15) |
| 야생형 상류 프라이머 (차단 올리고뉴클레오타이드) | SEQ ID NO:13 | CACCGTGCARCTCATCAC | 3' 스페이서 C3 |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | SEQ ID NO:14 | CAGCCGAAGGGCATGAGCTGCA |
반응 시스템은 아래 표 10에 도시된 바와 같이 제제화한다.
| 시약 구성요소 | 농도 |
| 2x ddPCR 프로브용 수퍼믹스 | 1x |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | 360 nM |
| 야생형 상류 프라이머 | 360 nM |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | 360 nM |
| DNA 샘플 | 15 ng |
| 초순수 | 20 μL에 도달할 때까지 초순수 첨가 |
제제가 완성된 후, 테스트 중인 주형을 함유하는 20μL의 반응 용액을 금속 욕조에 넣고 95℃에서 1분간 변성을 수행한 후, 반응 용액을 즉시 2℃ 내지 8℃ 냉장고에 넣어 2-3분 동안 식힌다.
20μL의 냉각된 PCR 반응 용액을 미세 방울 발생기 카트리지의 샘플 구멍에 넣고, 70μL의 미세 방울 발생기 오일을 미세 방울 발생기 카트리지의 오일 구멍에 첨가하고 마지막으로 미세 방울 발생기 카트리지를 밀봉 스트립을 사용하여 밀봉한다.
준비된 미세 방울 생성기 카트리지를 미세 방울 생성기에 배치하여 미세 방울 생성을 시작한다. 약 2분 후, 미세 방울의 준비가 완료되고, 카트리지를 꺼내고 40μL의 미세 방울을 구멍의 최상단 열에서 조심스럽게 96-구멍 PCR 플레이트로 옮긴다.
증폭 판독:
필름 밀봉 처리를 96-구멍 플레이트에 실행한 후, 96-구멍 플레이트를 PCR 열 순환기에 넣는다. 사용된 프로그램은 다음을 필요로 한다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 56℃에서 어닐링 및 60초 동안 신장을 수행하고 총 48 사이클을 실시하는 단계; 98℃에서 10분 동안 불활성화시키는 단계; 및 10℃에서 반응을 종료하는 단계.
PCR 증폭이 끝난 후, 96-구멍 플레이트를 미세 방울 분석기에 넣고 FAM/HEX 채널을 선택하여 신호 판독을 실행한다.
데이터 분석:
데이터 분석은 BIO-RAD 컴퍼니의 Quantasoft 디지털 PCR 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며 결과는 도 4에 도시된 바와 같다. "A02"는 무주형 대조군(NTC)의 테스트 결과이고, "A03"는 음성 대조군(Neg)의 테스트 결과이고 "F01"은 모의 임상 샘플의 결과이다. 본 발명의 용액에서, ddPCR 테스트 플랫폼에서 음성 대조군과 무주형 대조군 모두에서 비특이적 증폭이 없으며, T790M 단편은 H1975 샘플로부터 특별히 인식할 수 있다.
비교예 2
실시예 3에서, 상류 프라이머 및 하류 프라이머 모두 EGFR 유전자의 엑손 20에서의 점 돌연변이를 특이적으로 인식한다. 본 발명의 용액에서, 돌연변이형 F 및 돌연변이형 R 모두 돌연변이 부위를 특이적으로 인식한다. 돌연변이 유전자를 특이적으로 인식하는 두 개의 프라이머 용액과 돌연변이 유전자를 특이적으로 인식하는 하나의 프라이머만을 사용한 용액의 검출 효과 차이를 조사하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 샘플 준비:
야생형 주형(HEK-293T 세포주 DNA)과 돌연변이형 주형(NCI-H1975 세포주 DNA)의 준비 과정은 실시예 3과 동일하다. 두 유형의 주형을 상이한 비율에 따라 혼합하여 고가 샘플(이론 농도 150 복제물/μL) 및 저가 샘플(이론 농도 15 복제물/μL)을 얻었고, 이의 각각은 EGFR 유전자의 T790M 점 돌연변이를 함유한다. 또한, 단편화된 야생형 DNA를 사용하여 음성 대조군(Neg)을 준비하고, TE 버퍼를 무주형 대조군(NTC)으로 사용하였다.
프라이머 디자인:
점 돌연변이를 특이적으로 인식하는 2개의 프라이머의 용액은 표 10의 설계를 사용하는 반면, 점 돌연변이를 특이적으로 인식하는 단일 프라이머의 용액은 표 11의 설계를 사용한다.
| 프라이머의 명칭 | 번호 | 뉴클레오타이드 서열 (5'-3') | 변형 |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | SEQ ID NO:12 | CCGCTGC-C9-GCAGCGGTCCACCGTGCARCTCATAAT | 5'FAM,C9(7), BHQ1(15) |
| 야생형 상류 프라이머 (차단 올리고뉴클레오타이드) | SEQ ID NO:13 | CACCGTGCARCTCATCAC | 3' 스페이서 C3 |
| 하류 프라이머 1 | SEQ ID NO:15 | CCCGGACATAGTCCAGGA | |
| 하류 프라이머 2 | SEQ ID NO:16 | TGAGCAGGTACTGGGAGC | |
| 하류 프라이머 3 | SEQ ID NO:17 | CTGATTACCTTTGCGATC |
표 11의 돌연변이형 상류 프라이머와 야생형 상류 프라이머는 표 10과 동일하다. 또한, 하류 프라이머 그룹이 설계되어 있으며, 이들 하류 프라이머는 점 돌연변이를 특이적으로 인식하지 않는다.
두 용액은 동일한 돌연변이형 상류 프라이머와 야생형 상류 프라이머, 및 상이한 돌연변이형 하류 프라이머/하류 프라이머를 사용하여, 이의 상응하는 표적 서열은 길이가 상이하다. 자세한 내용은 표 12를 참조.
| 프라이머의 명칭 | 번호 | 상응하는 표적 서열의 길이 |
| 돌연변이형 하류 프라이머 | SEQ ID NO:14 | 41 bp |
| 하류 프라이머 1 | SEQ ID NO:15 | 61 bp |
| 하류 프라이머 2 | SEQ ID NO:16 | 97 bp |
| 하류 프라이머 3 | SEQ ID NO:17 | 128 bp |
반응 시스템은 아래 표 13에 도시된 바와 같이 제제화한다.
| 시약 | 농도 |
| 2x ddPCR 프로브용 수퍼믹스 | 1x |
| 돌연변이형 상류 프라이머 | 360 nM |
| 야생형 상류 프라이머 | 360 nM |
| 돌연변이형 하류 프라이머 또는 하류 프라이머 1/2/3 | 360 nM |
| DNA 샘플 | 15 ng |
| 초순수 | 20 μL에 도달할 때까지 초순수 첨가 |
테스트 중인 주형을 함유하는 20μL의 제제화된 반응 용액을 금속 욕조에 넣고 95℃에서 1분간 변성을 수행한 후, 반응 용액을 즉시 2℃ 내지 8℃ 냉장고에 넣어 2-3분 동안 식힌다.
20μL의 냉각된 PCR 반응 용액을 미세 방울 발생기 카트리지의 샘플 구멍에 넣고, 70μL의 미세 방울 발생기 오일을 미세 방울 발생기 카트리지의 오일 구멍에 첨가하고 마지막으로 미세 방울 발생기 카트리지를 밀봉 스트립을 사용하여 밀봉한다.
준비된 미세 방울 생성기 카트리지를 미세 방울 생성기에 배치하여 미세 방울 생성을 시작한다. 약 2분 후, 미세 방울의 준비가 완료되고, 카트리지를 꺼내고 40μL의 미세 방울을 구멍의 최상단 열에서 조심스럽게 96-구멍 PCR 플레이트로 옮긴다.
증폭 판독:
필름 밀봉 처리를 96-구멍 플레이트에 실행한 후, 96-구멍 플레이트를 PCR 열 순환기에 넣는다. 사용된 프로그램은 다음을 필요로 한다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성을 수행하는 단계; 94℃에서 30초 동안 변성을 수행하는 단계, 56℃에서 어닐링 및 60초 동안 신장을 수행하고 총 48 사이클을 실시하는 단계; 98℃에서 10분 동안 불활성화시키는 단계; 및 10℃에서 반응을 종료하는 단계.
PCR 증폭이 끝난 후, 96-구멍 플레이트를 미세 방울 분석기에 넣고 FAM/HEX 채널을 선택하여 신호 판독을 실행한다.
데이터 분석:
QuantaSoft 분석 소프트웨어를 이용하여 형광 신호의 강도와 수를 분석하여 EGFR 유전자의 T790M 돌연변이형 엑손 20의 복제 수와 농도를 구하였으며 결과는 표 14에 도시된 바와 같다.
| 정량 평균 (단위: 복제물/μL) | ||
| 단편의 길이 | 고가 샘플 | 저가 샘플 |
| 41 bp | 109 | 11.7 |
| 61 bp | 86.2 | 8.4 |
| 97 bp | 50.9 | 5.7 |
| 128 bp | 27.5 | 3.0 |
표 14로부터 표적 서열의 단편이 짧을수록 샘플 정량 능력, 즉 T790M 돌연변이형 단편 검출 능력이 높음을 알 수 있다.
표 14의 데이터에 대하여 선형 회귀 분석을 하였으며, 분석 결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 돌연변이형 고가 샘플 및 저가 샘플이 검출될 때, 검출 능력은 표적 서열의 길이와 음의 상관관계가 있다는 것을 알 수 있다. 표적 서열이 짧을수록, 돌연변이형 단편이 더 많이 검출되고 검출 능력이 높아진다; 그렇지 않으면, 검출 능력이 낮아진다.
Claims (15)
- 다음을 포함하는 핵산 검출용 조합물:
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 상류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 표적 서열의 특정 검출 부위에 상보적일 수 있으며;
3'-말단에 표적 서열 결합 영역이 제공되는 하류 프라이머, 표적 서열 결합 영역의 3'-말단이 동일한 특정 검출 부위에 대해 상보적일 수 있으며; 및
신호 올리고뉴클레오타이드, 신호 올리고뉴클레오타이드는 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹으로 변형되고, 제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 거리의 변화에 의해 신호의 변화를 생성하며; 및
신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 일부이고, 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치하도록 설계되고; 또는상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 추가로 포함하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머와 독립적이고 신호 검출 영역과 동일한 서열을 갖도록 설계되며; 및
신호 검출 영역은 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치되며 표적 서열과 상보적으로 쌍을 이룰 수 없도록 설계되는 것인 핵산 검출용 조합물. - 제 1 항에 있어서,
상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 추가로 포함하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머와 독립적으로 설계되며; 및
신호 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3'으로 순차적으로 제 1 스템 영역, 루프 영역, 제 2 스템 영역 및 앵커 영역을 포함하도록 설계되며,
제 1 스템 영역은 제 2 스템 영역에 부분적으로 또는 완전히 상보적이도록 설계되고, 앵커 영역은 신호 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 위치하며 신호 검출 영역과 부분적으로 또는 완전히 동일하도록 설계되며; 및
제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역을 변형시키고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역, 제 2 스템 영역과 앵커 영역 사이의 위치, 또는 앵커 영역의 비 3'-말단을 변형시키는 것인 조합물. - 제 2 항에 있어서,
제 2 스템 영역과 앵커 영역은 1 내지 5개 염기 간격으로 존재하는 것인 조합물. - 제 2 항에 있어서,
제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치하고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역과 앵커 영역 사이에 위치하는 것인 조합물. - 제 1 항에 있어서,
상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 추가로 포함하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머와 독립적으로 설계되며,
신호 올리고뉴클레오타이드는 유연한 올리고뉴클레오타이드로 설계되며,
제 1 검출 그룹 및 제 2 검출 그룹은 신호 올리고뉴클레오타이드의 비 3'-말단에 위치되는 것인 조합물. - 제 5 항에 있어서,
제 1 검출 그룹과 제 2 검출 그룹은 서로 5-25nt 이격되어 있는 것인 조합물. - 제 1 항에 있어서,
상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머는 표적 서열 결합 영역의 상류에 신호 검출 영역을 추가로 포함하고, 신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머와 독립적으로 설계되며; 및
조합물은 제 2 프라이머를 추가로 포함하고, 제 2 프라이머의 서열의 전부 또는 일부는 신호 검출 영역의 서열과 동일하며;
신호 올리고뉴클레오타이드와 동일한 신호 검출 영역 상의 영역은 제 2 프라이머와 동일한 영역의 하류에 위치되며; 및
거리의 변화는 신호 올리고뉴클레오타이드의 가수분해에 의해 이루어지는 것인 조합물. - 제 1 항에 있어서,
신호 올리고뉴클레오타이드는 상류 프라이머 및/또는 하류 프라이머의 일부로 설계되고, 표적 서열 결합 영역의 상류에 위치되며,
신호 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3'으로 순차적으로 제 1 스템 영역, 루프 영역 및 제 2 스템 영역을 포함하며,
제 1 스템 영역은 제 2 스템 영역에 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 설계되며,
제 1 검출 그룹은 제 1 스템 영역에 위치되고, 제 2 검출 그룹은 제 2 스템 영역에 위치되는 것인 조합물. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
특정 검출 부위는 돌연변이 부위인 조합물. - 다음 단계를 포함하는 핵산 검출 방법:
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조합물, 증폭 시약 및 대상으로부터의 샘플을 혼합하는 단계;
샘플에 존재할 수 있는 표적 서열을 증폭하는 단계;
생성된 신호 변화를 획득하는 단계; 및
획득된 신호 변화에 따라 표적 핵산이 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계. - 제 10 항에 있어서,
표적 핵산이 샘플에 존재하는 지를 결정하면서 표적 핵산이 정량화되는 것인 방법. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
샘플은 말초 혈액 또는 단편화된 핵산 표적을 포함하는 다른 유형의 샘플인 방법. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
대상은 암을 앓고 있거나 암이 의심되는 대상인 방법. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
핵산은 ctDNA인 방법. - 상류 프라이머, 하류 프라이머 및 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 정의된 신호 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
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