JP2023542408A - 核酸を検出する組み合わせ、方法及びキット - Google Patents

核酸を検出する組み合わせ、方法及びキット Download PDF

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Abstract

核酸を検出する組み合わせ、方法及びキットである。当該組み合わせは、３’端に標的配列結合領域が設置され、標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、３’端に標的配列結合領域が設置され、標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、第１検出基及び第２検出基が修飾されており、第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、を含む。【選択図】図１

Description

本発明は分子生物学の分野に関し、具体的には核酸の検出に関する。
従来より、組織病理学的診断は腫瘍診断のゴールドスタンダード及び臨床治療の基礎である。ところが、病理組織を取得しにくく、サンプリングしにくく、かつ連続的にサンプリングして腫瘍患者の遺伝子変異状況を持続的に監視しにくい。したがって患者末梢血中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の遺伝子変異を検出することにより腫瘍患者に対する早期スクリーニング、投薬指導、予後判断及び再発監視を実現することができる。しかし末梢血サンプルはバックグラウンドが複雑で、ｃｔＤＮＡ含有量が少ないため、低存在度及び希少配列の検出に対して、特異性及び感度が極めて高い検出方法及び検出キットを必要とする。
現在、従来の遺伝子変異検出試薬は、多くはＴａｑＭａｎ加水分解プローブ法又は増幅阻止システム（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＲＭＳ）が採用されている。なかでも、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ法の方法は、一対の特異的ＰＣＲプライマー、及び一本のテンプレートに相補的な特異的プローブを設計する必要があり、かつプローブの結合部位が二本のプライマーの間に位置しており、プローブの５’端と３’端にそれぞれ一つの蛍光基（供与体）及び一つのクエンチング基（受容体）が標識され、ＴａｑＭａｎプローブが完全な遊離状態を呈する場合、蛍光基とクエンチング基との距離が近く、クエンチング基が蛍光基の励起光作用での励起蛍光を吸収し、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）が発生し、それにより機器が蛍光シグナルを検出できなくなる。ＰＣＲ増幅過程において、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはその５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を利用して標的配列に結合されたプローブを切断し、蛍光報告基とクエンチング基との距離が遠くなり、それにより蛍光シグナルを放出する。
一方、ＡＲＭＳ法は、ＤＮＡポリメラーゼが３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くという特徴を利用し、プライマーの３’末端塩基が標的核酸配列と正確に相補的にペアリングすることができなければ、標的核酸配列が効果的に増幅されることができない。理論的に、遺伝子変異検出を行う場合、汎用プローブとそれと合わせて変異型プライマー及び野生型プライマーを必要とし、ここで変異型プライマーの３’末端は変異型遺伝子と完全にマッチングするが、野生型遺伝子とマッチングしない。変異遺伝子の検出を行う場合、変異型プライマーと野生型テンプレートは完全にペアリングすることができないため、プライマーの延伸が阻止され、それにより変異遺伝子の検出が図れる。
腫瘍患者の末梢血のｃｔＤＮＡに対して液体生検を行う場合、ｃｔＤＮＡが高度な断片化を呈するため、その断片の長さが９０ｂｐ－１６０ｂｐの間に分布しており、従来の研究により、標的配列の長さが短いほど、ｃｔＤＮＡの検出率が高いことを見出した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかし、現在のｃｔＤＮＡ検出技術は、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ法を採用してもＡＲＭＳ法を採用しても、いずれも標的配列が長すぎるという問題が存在する。特許ＣＮ１０５３４９６５４Ｂに記載されたＥＧＦＲ遺伝子変異を検出するためのプローブ、プライマー、検出系及びキットは、ＥＧＦＲ変異遺伝子を検出するために必要な標的配列の長さは７０ｂｐ－１３４ｂｐの間にあり、ここでエクソン１８上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは１００ｂｐ－１１６ｂｐであり、エクソン１９上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは７０ｂｐ－８４ｂｐであり、エクソン２０上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは８５ｂｐ－１３４ｂｐであり、エクソン２１上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは１０９ｂｐ－１２１ｂｐである。長い増幅標的配列の長さは必ず断片化ｃｔＤＮＡテンプレートの検出率を低下させ、それにより検出感度に影響を与える。
なお、現在ＡＲＭＳ法における変異型プライマーは、常に非特異的なテンプレート増幅を完全に阻止することができず、検出時に偽陽性の結果を生成しやすく、特にエンドポイント検出のシステム、例えばデジタルＰＣＲシステムにおいて、変異型と野生型のエンドポイント増幅時の蛍光シグナルは常に区別しにくいため、検出の特異性が十分ではない。
以上より、遺伝子検出の分野において、核酸検出感度及び特異性をさらに改善する需要が存在する。
上記問題に対して、本発明者らはＡＲＭＳ法に基づいてそのプライマー及びプローブの設計方式を検討したところ、本発明に至った。
一側面においては、本発明は、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、を含み、
前記シグナルオリゴヌクレオチドは、前記上流プライマー及び／又は下流プライマーの一部として設計されかつ前記標的配列結合領域の上流に位置するか、又は、前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にさらにシグナル検出領域を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーから独立しかつ前記シグナル検出領域と同じ配列を有するように設計され、
前記シグナル検出領域は、標的配列と相補ペアリングできないように設計される、核酸を検出するための組み合わせを提供する。
このような設計を採用することにより、本発明は以下の有益な効果を達成した。
一方では、標的配列特異的プローブの代わりにシグナルオリゴヌクレオチドを使用する上で、本発明は上流プライマーと下流プライマーの両方の３’末端がいずれも標的配列上のある特異的検出部位とマッチングする。二種類の方式が互いに協働することにより、標的配列の長さに対する需要が理論上の最低値まで低下することは以下の実施例に実証されるように、標的配列の長さが４０ｂｐを超えないことが可能になる。前記のように、高度な断片化核酸サンプル（例えばｃｔＤＮＡ）の検出において、より短い標的配列の長さはより高い検出率を有し、それにより検出の感度が大幅に向上する。
他方では、本発明の組み合わせ及び反応系は交差反応をよく回避することができ、例えば、変異型標的核酸配列を検出する場合、野生型又は他の近似又は相同性を有する標的核酸の交差反応がない。特に野生型と変異型を同時に検出する場合、両者の交差反応が小さく、希少な変異の検出により有利である。
別の一方では、本発明の組み合わせは１００ｂｐ未満の短い断片ＤＮＡを検出することに用いることができ、様々なサンプルタイプの核酸検出に適用することができる。
さらに一方では、本発明の組み合わせは一つの反応管で同時に変異型及び野生型の標的核酸配列を検出することができ、野生型及び変異型遺伝子を別々の管に分けて定性検出又は定量検出する必要がなく、特に希少サンプル、例えば末梢血ｃｔＤＮＡサンプルの検出に適用される。
いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせの各プライマー対は、異なる遺伝子変異タイプに対するように設計されている。シグナルオリゴヌクレオチドがプライマーの一部として設計される場合、各プライマー対に対応するシグナルオリゴヌクレオチドプローブは互いに同じであってもよいが、それらの標的配列結合領域は異なる変異型遺伝子と相補的である。シグナルオリゴヌクレオチドがプライマーから独立して存在する場合、各プライマー対のシグナル検出領域は互いに同じであってもよいが、それらの標的配列結合領域は異なる変異型遺伝子と相補的である。同様に、本発明の組み合わせはさらに追加の複数組のプライマー対を含むことができる。
複数組の上流プライマー及び下流プライマーの標的配列結合領域を利用することにより複数種の標的を特異的に識別し、その後にシグナルオリゴヌクレオチドにより検出する。多重検出において、タイピングを必要としない遺伝子変異タイプに対して、異なる上流プライマー及び下流プライマーを設計すればよく、シグナルオリゴヌクレオチドを共用することができ、異なる遺伝子変異タイプの検出が図られ、プローブの使用量を減少させることができる。一方では、コストを節約することができ、臨床使用に有利である。他方では、反応系内のプローブの数が多すぎることによるバックグラウンド干渉を顕著に低減することができる。
いくつかの実施形態において、前記組み合わせはさらに他の核酸を特異的に標的化することができる上流プライマー及び／又は下流プライマーを含む。例えば、本発明の組み合わせの上流プライマー及び下流プライマーが変異型遺伝子に対するように設計される場合、すなわち、上流プライマー及び下流プライマーの３’末端はいずれも標的配列上の特異的検出部位（すなわち、変異による検出対象の変異型遺伝子が他の遺伝子と区別される部位）とマッチングし、変異型遺伝子を増幅することができる。さらに、本発明の組み合わせは、３’末端に野生型遺伝子とマッチングする部位が設置され、野生型遺伝子と特異的にアニーリングすることができる野生型上流プライマー、及び／又は、３’末端に野生型遺伝子とマッチングする部位が設置され、野生型遺伝子と特異的にアニーリングすることができる野生型下流プライマーをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の標的配列結合領域に１－５個のミスマッチ塩基が設置されてもよく、それは標的配列と相補的にペアリングしない。例えば、標的配列結合領域の３’末端の後ろから数えて第２位又は第３位にミスマッチ塩基が設置されてもよい。
第１形態において、本発明の組み合わせは、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
５’から３’まで順に第１茎（ｓｔｅｍ）領域、ループ（ｌｏｏｐ）領域、第２茎領域及びアンカー（ａｎｃｈｏｒ）領域を含むように設計され、かつ第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基が前記第１茎領域に修飾され、前記第２検出基が前記第２茎領域、前記第２茎領域とアンカー領域との間又は前記アンカー領域の非３’末端に修飾され、前記第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、を含み、
前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にシグナル検出領域を含み、前記シグナル検出領域は標的配列と相補的ペアリングできないように設計され、
前記第１茎領域は第２茎領域と部分的又は完全に相補するように設計され、前記アンカー領域は前記シグナルオリゴヌクレオチドの３’端に位置しかつ前記シグナル検出領域と完全又は部分的に同じになるように設計される。
理解されるように、アンカー領域はシグナル検出領域と完全又は部分的に同じになるように設計されるため、それはシグナル検出領域の相補的な配列とアニーリングして延伸することができ、それにより上流プライマー及び下流プライマーの増幅産物を増幅する。また、第１茎領域は第２茎領域と部分的に又は完全に相補するように設計され、それにより第２茎部と共にステムループの茎部を構成することができる。
第１形態の組み合わせを使用する場合、第１茎領域と第２茎領域は相補的であり、ステムループの茎部を構成し、シグナルオリゴヌクレオチドが完全な「ステムループ」構造を呈する場合、第１検出基と第２検出基との距離が近く、蛍光共鳴エネルギー移動効率が高い。シグナルオリゴヌクレオチドの第１茎領域がＤＮＡポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解され、又はシグナルオリゴヌクレオチドの「ステムループ」構造が開かれた場合、第１検出基と第２検出基との間の距離が遠くなり、蛍光共鳴エネルギー移動効率が低下し、蛍光シグナルの変化を引き起こし、それにより機器により検出される。
いくつかの実施形態において、本発明のシグナルオリゴヌクレオチドは「ステムループ」構造を形成することができ、該ステムループ構造は本発明のプライマーのアニーリング温度（例えば７５℃と高い場合）で依然として安定した構造を有する（即ち、「ステムループ」が開かれない）。
本発明において、第１茎領域の長さは６－２０ｎｔであってもよい。
本発明において、第２茎領域の長さは６－２０ｎｔであってもよい。
本発明において、ループ領域は例えば長さが３－２５ｎｔの塩基配列であってもよく、また例えばＣ３、Ｃ６、Ｃ９及びＣ１２からなる群から選択されるスペーサー修飾であってもよく、さらに例えばポリエチレングリコールから選択されてもよい。
本発明において、第２茎領域とアンカー領域との間に０－５個の塩基間隔が存在してもよい。
具体的な実施形態において、アンカー領域の長さは１５－３０ｎｔであってもよい。
例示的な実施形態において、第１検出基は第１茎領域に位置し、第２検出基は前記第２茎領域に位置するようにされてもよい。第１検出基は第１茎領域に位置し、第２検出基はアンカー領域の非３’末端に位置するようにされてもよい。第１検出基は第１茎領域に位置し、第２検出基は第２茎領域とアンカー領域との間に位置するようにされてもよい。第２検出基は第１茎領域に位置し、第１検出基は第２茎領域に位置するようにされてもよい。第２検出基は第１茎領域に位置し、第１検出基はアンカー領域の非３’末端に位置するようにされてもよい。又は、第２検出基は第１茎領域に位置し、第１検出基は第２茎領域とアンカー領域との間に位置するようにされてもよい。
いくつかの実施形態において、第１検出基又は第２検出基は第１茎領域の５’端に位置するようにされてもよい。
第２形態において、本発明の組み合わせは、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
シグナルオリゴヌクレオチドと、を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドはフレキシブルオリゴヌクレオチドとして設計され、その全部又は一部の配列がシグナル検出領域と同じであり、かつ前記シグナルオリゴヌクレオチドが第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成し、前記第１検出基と第２基が前記シグナルオリゴヌクレオチドの非３’末端に位置し、
前記シグナル検出領域は上流プライマー及び／又は下流プライマーの標的配列結合領域の上流に位置し、かつ前記シグナル検出領域は標的配列と相補的ペアリングできないように設計される。
理解されるように、シグナルオリゴヌクレオチドはシグナル検出領域と完全又は部分的に同じになるように設計されるため、それはシグナル検出領域の相補的配列とアニーリングして延伸することができ、それにより上流プライマー及び下流プライマーの増幅産物を増幅する。
第２形態の組み合わせを使用する場合、上流プライマー及び下流プライマーは標的配列と特異的に結合しかつ延伸して予備増幅産物を生成した後、シグナルオリゴヌクレオチドは予備増幅産物と相補的にペアリングしてＰＣＲ増幅を行うことができ、第１検出基と第２検出基をＰＣＲにより生成された二本鎖増幅産物に組み込み、第１検出基と第２検出基との距離を変化させ、蛍光シグナルの変化を引き起こし、それにより機器により検出される。
具体的な実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドの長さは１５－３０ｎｔであってもよい。
例示的な実施形態において、第１検出基は５’端又は任意の非３’末端の位置に位置し、第２検出基と第１検出基は５－２５ｎｔの間隔を隔てかつ３’末端に位置しない。
第３形態において、本発明の組み合わせは、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
全部又は一部の配列がシグナル検出領域と同じであり、かつ第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基及び第２検出基がシグナルオリゴヌクレオチドの加水分解により生成された距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、
全部又は一部の配列がシグナル検出領域と同じである第２プライマーと、を含み、
前記シグナル検出領域は上流プライマー及び／又は下流プライマーの標的配列結合領域の上流に位置し、前記シグナル検出領域は標的配列と相補的ペアリングできないように設計され、かつ前記シグナル検出領域上の前記シグナルオリゴヌクレオチドと同じ領域は前記第２プライマーと同じ領域の下流に位置する。
理解されるように、当該形態において、シグナルオリゴヌクレオチドはＴａｑＭａｎプローブとされており、それはシグナル検出領域の相補的配列とハイブリダイズしてペアリングすることができる。また、第２プライマーはシグナル検出領域と完全又は部分的に同じになるように設計されるため、それはシグナル検出領域の相補的配列とアニーリングして延伸することができ、それにより上流プライマー及び下流プライマーの増幅産物を増幅する。
第３形態の組み合わせを使用する場合、上流プライマー及び下流プライマーは標的配列と特異的に結合しかつ延伸して予備増幅産物を生成した後、第２プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドは予備増幅産物と相補的にペアリングすることができ、第２プライマーにより延伸される場合、シグナルオリゴヌクレオチドを加水分解して第１検出基を放出し、蛍光シグナルの変化を引き起こし、それにより機器により検出される。
当業者であれば、適切な第２プライマーを設計して選択することができ、上流プライマー及び下流プライマーの予備増幅産物を増幅することができればよい。
本発明の第３形態におけるシグナルオリゴヌクレオチドに対して、当業者は一般的なＴａｑＭａｎ加水分解プローブの設計原則に応じて設計することができ、ハイブリダイゼーション領域がシグナル検出領域の相補領域に位置すればよい。
一つの具体的な実施形態において、第１検出基と第２検出基はそれぞれシグナルオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端に位置する。
第４形態において、本発明の組み合わせは、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、を含み、
前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーの一部として設計されかつ標的配列結合領域の上流に位置し、前記シグナルオリゴヌクレオチドは５’から３’まで順に第１茎領域、ループ領域及び第２茎領域を含み、前記第１検出基は前記第１茎領域に位置し、前記第２検出基は前記第２茎領域に位置し、
前記第１茎領域は第２茎領域と部分的に又は完全に相補するように設計される。
理解されるように、第１茎領域は第２茎領域と部分的又は完全に相補するように設計され、それにより第２茎部と共にステムループの茎部を構成することができる。
第４形態の組み合わせを使用する場合、シグナルオリゴヌクレオチドが完全な「ステムループ」構造を呈する場合、第１検出基と第２検出基との距離が近く、蛍光共鳴エネルギー移動効率が高い。第１茎領域がＤＮＡポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解されるか、又はシグナルオリゴヌクレオチドの「ステムループ」構造が開かれた場合、第１検出基と第２検出基との間の距離が遠くなり、蛍光共鳴エネルギー移動効率が低下し、蛍光シグナルの変化を引き起こし、それにより機器により検出される。
シグナルオリゴヌクレオチドを上流プライマー及び／又は下流プライマー内に設計することにより、本発明はさらに従来のＡＲＭＳ法におけるプローブの使用を節約し、検出性能を満たすと同時にコストを低減する。
例示的な実施形態において、第１検出基は第１茎領域に位置し、第２検出基は前記第２茎領域に位置するようにされてもよい。又は、第２検出基は第１茎領域に位置し、第１検出基は第２茎領域に位置する。
なお、本発明は、
本発明の組み合わせ、増幅試薬をサンプルと混合するステップと、
サンプルに存在する可能性のある標的配列を増幅するステップと、
生成されたシグナル変化を取得するステップと、
得られたシグナルの変化から、サンプル中に標的核酸が存在するか否かを判断するステップと、を含む、核酸を検出する方法をさらに提供する。
具体的な実施形態において、サンプルに標的核酸が存在するか否かを判断すると同時に標的核酸を定量する。
いくつかの実施形態において、増幅ステップの前に、サンプル混合物を異なる反応ユニットに割り当てるステップにおいて二本鎖核酸を一本鎖に変性することをさらに含む。任意選択的に、異なる反応ユニットに割り当てる前に、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性するステップをさらに含んでもよい。
具体的には、得られた蛍光シグナルに基づいて判断することは、第１検出基と第２検出基との間の蛍光共鳴エネルギー移動が存在するか又は存在しないかを検出することを指す。
具体的な実施形態において、増幅はＰＣＲによる増幅を含み、例えば、予備変性，変性、アニーリング及び延伸の複数のサイクルを含むことができる。
好ましい実施形態において、前記測定対象テンプレートはｃｔＤＮＡでありかつ前記サンプルは末梢血である。
いくつかの実施形態において、前記サンプルは癌に罹患しているか又は癌に罹患している疑いがある被験者に由来する。
本発明の一形態でデジタルＰＣＲプラットフォームにおいてＥＧＦＲ遺伝子１８エクソンの点突然変異（ｃ．２１５６Ｇ＞Ｃ、ｐ．Ｇ７１９＞Ａ変異）を検出する場合の結果を示す。 比較例１において異なる断片長さの方案の、高値、中央値及び低値のサンプル定量データに対する線形回帰分析結果を示す。 本発明の他の形態でＱ－ＰＣＲ検出プラットフォームにおいてＥＧＦＲ遺伝子１８エクソンの点突然変異（ｃ．２１５６Ｇ＞Ｃ、ｐ．Ｇ７１９＞Ａ変異）を検出する場合の結果を示す。 本発明の別の形態でデジタルＰＣＲプラットフォームにおいてＥＧＦＲ遺伝子点突然変異（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ｔ７９０＞Ｍ）を検出する場合の結果を示す。 比較例２において異なる断片長さの方案の、高値及び低値サンプル定量データに対する線形回帰分析結果を示す。
以下に具体的な実施形態及び実施例を参照しながら、本発明を具体的に説明し、本発明の利点及び様々な効果はこれにより明らかになる。当業者に理解されるように、これらの具体的な実施形態及び実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。本発明の実施形態に基づいて、当業者が創造的な労力を要さずに想到し得る他の実施形態は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
明細書全体において、特に説明しない限り、本明細書で使用される用語は本分野で一般的に使用される意味であると理解されるべきである。したがって、別の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は本発明の属する分野の当業者の一般的な理解と同じ意味を有する。矛盾が存在する場合、本明細書は優先的である。
本明細書において、用語「核酸」はヌクレオチドモノマーの一本鎖及び／又は二本鎖ポリマーを指し、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合又はヌクレオチド間類似体により接続された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むがそれらに限定されない。核酸中のヌクレオチドモノマーは、「ヌクレオチド残基」と呼ばれてもよい。核酸は完全にデオキシリボヌクレオチドで構成され、完全にリボヌクレオチドで構成されるか又はその嵌合混合物で構成され、かつヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド単量体単位は、本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれか一つを含むことができ、ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチド類似体（例えば修飾ヌクレオチド）を含むがそれらに限定されない。核酸の大きさは通常、数ヌクレオチド残基から数千ヌクレオチド残基まで異なっている。ここで、「オリゴヌクレオチド」は通常、長さが相対的に短い（例えば８０未満）ヌクレオチド重合体を指す。特に指摘しない限り、核酸配列を呈するたびに、だれでも分かるように、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’までの順序となっている。特に指摘しない限り、「Ａ」はアデニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｔ」はチミン、「Ｕ」はウラシルを表す。
本分野の慣用用語によれば、核酸の長さは塩基対（「ｂｐ」と略称される）、ヌクレオチド（「ｎｔ」と略称される）又はキロベース（「ｋｂ」と略称される）で表すことができる。
本明細書において、「塩基相補的ペアリング」とは、ＡとＴ、ＡとＵ及びＧとＣの対応関係が互いに水素結合で接続される現象を指す。それに応じて、「ミスマッチ塩基」とは、「塩基相補的ペアリング」に規定された以外の他の全てのペアリング状況、例えばＡとＣ、ＡとＧ、ＴとＧ、又はＴとＣがペアリングすることを指す。
前記のように、本発明の標的配列結合領域に１－５個のミスマッチ塩基を設置することができ、ミスマッチは３’末端の塩基と共同作用することができ、プライマーのその３’末端の相補しないテンプレートでの増幅率を顕著に低下させる。このようなミスマッチ塩基を設けることは当業者の能力範囲内に属する。いくつかの実施形態において、上流プライマー及び／又は下流プライマーの後ろから第３位にミスマッチを導入する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は核酸変異を検出することである。
本発明において、「変異」は、塩基置換変異、挿入変異及び欠失変異から選択することができる。例示的な実施形態では、変異は塩基置換変異であり、すなわち検出対象の二種類の標的配列（野生型及び変異型）の間に塩基数の差がなく、一つ又は複数の塩基のタイプが異なる。
いくつかの実施形態において、本発明の変異はモノヌクレオチド変異である。
本発明において、「特異的検出部位」とは、標的核酸を他の核酸と区別することができる塩基部位を指し、例えば、点突然変異の状況に対して、野生型核酸と変異型核酸との間又は異なる変異型核酸の間に変異塩基が存在すると、「特異的検出部位」は即ち当該変異塩基となる。核酸タイピング（例えばいくつかのウイルスをタイピングする）状況に対して、変異と類似して、異なる型の核酸の間に一つ又は複数の塩基差異が存在すると、「特異的検出部位」は即ちそのうちのある差異塩基となる。
「上流プライマー及び下流プライマーの３’末端は標的配列の特異的検出部位と相補することができる」とは、すなわち上流プライマー及び下流プライマーの３’末端はいずれも標的核酸の同一の特異的検出部位と相補する。例えば、点突然変異の状況に対して、本発明の組み合わせにおいて、上流プライマー及び下流プライマーの３’末端はいずれも該変異塩基と相補する。核酸タイピングの状況に対して、本発明の組み合わせにおいて、上流プライマーの３’末端はある差異塩基と相補し、下流プライマーの３’末端も該差異塩基と相補する。このような設計を採用するため、プライマーの３’末端が特異的検出部位と相補しない場合、プライマーの延伸が阻止され、それにより標的配列の検出が図れる。
本明細書において、用語「プライマー」はこのようなオリゴヌクレオチドを表す。それはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を「開始」することができ、すなわち例えばオリゴヌクレオチドの３’－端が遊離の３’－ＯＨ基を提供し、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより多くの「ヌクレオチド」を前記３’－ＯＨ基に連結し、３’から５’のリン酸ジエステル結合を確立し、これによりデオキシヌクレオシド三リン酸を使用すると共に、これによりピロリン酸を放出する。
本明細書において、用語「標的配列」、「標的核酸」、「標的核酸配列」又は「標的」は交換して使用することができ、かつ増幅、検出又は増幅して検出しようとする核酸配列部分を意味し、それはハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下で、プローブ又はプライマーとアニーリング又はハイブリダイゼーションを行うことができる。
用語「ハイブリダイゼーション」は二つの核酸の間の塩基対合相互作用を表し、それは二本鎖の形成に繋がる。理解されるように、ハイブリダイゼーションを実現するにはそれらが全長において１００％の相補性を有することを要求しない。
本明細書において、用語「上流プライマー」は、順方向プライマーとも呼ばれ、負鎖に沿って途切れずに延長するオリゴヌクレオチドである。本発明で使用される用語「下流プライマー」は、逆方向プライマーとも呼ばれ、正鎖に沿って途切れずに延長するオリゴヌクレオチドである。ここで、正鎖はすなわちＳｅｎｓｅ Ｓｔｒａｎｄ、センス鎖であり、コード鎖とも呼ばれ、一般的に二本鎖ＤＮＡの上端に位置し、方向は左から右へ５’－３’となり、塩基配列は該遺伝子ｍＲＮＡと基本的に同じである。該鎖と結合するプライマーは逆方向プライマーとなる。負鎖はすなわちアンチセンス鎖であり、非コード鎖とも呼ばれ、正鎖と相補し、該鎖と結合するプライマーは順方向プライマーとなる。理解すべきことは、センス鎖とアンチセンス鎖の指定が交換する場合、対応する順方向及び逆方向プライマーの命名もそれに伴って交換することができる。
本明細書において、「上流」、「…上流に位置する／にある」、「上流に…を有する」等は、核酸配列を説明するコンテキストでは同一核酸配列において指示領域よりも５’端に近い部分を示し、例えば指示領域に隣接してもよく、指示領域と一つ又は複数の塩基の間隔を有してもよい。それに応じて、本明細書で使用される用語「下流」、「…下流に位置する／にある」、「下流は…を有する」等は、核酸配列を説明するコンテキストでは同一の核酸配列において指示領域よりも３’端に近い部分を示し、例えば指示領域に隣接してもよく、指示領域と一つ又は複数の塩基の間隔を有してもよい。理解すべきことは、別途に説明しない限り、説明された核酸が二本鎖核酸である場合、「上流」及び「下流」の表現は通常、センス鎖の５’端及び３’端を基準とする。
本明細書において、用語「Ｔａｑｍａｎプローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）」と「加水分解プローブ（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ）」は交換して使用することができる。ＴａｑｍａｎプローブはＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ技術プラットフォームで開発された蛍光検出技術であり、プローブの５’端は第１検出基を含み、３’端は第２検出基を含む。プローブが完全である場合、第１検出基から放射された蛍光シグナルは第２検出基に吸収され、ＰＣＲ増幅を行うと、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’端から３’端までのエキソヌクレアーゼ活性はプローブを酵素切断して分解し、第１検出基と第２検出基を分離させ、蛍光シグナルを発させ、それにより蛍光シグナルの蓄積とＰＣＲ産物の完全な同期を達成する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のうちのいずれか一種であってもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件下で、所望温度が高いほど相同性の高いポリヌクレオチド、例えばＤＮＡを効果的に得ることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェント度に影響を与える要因は様々であり、例えば温度、プローブ濃度、プローブ長さ、イオン強度、時間、塩濃度などであるが、当業者はこれらの要素を適切に選択することにより類似するストリンジェント度を得ることができる。
本明細書において、「フレキシブルオリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドが一本鎖状態で分子のフレキシブル性によりそれをカール状にし、ハイブリダイゼーション又はアニーリング延伸により二本鎖状態になった後、水素結合作用によりそれを比較的剛性の二重螺旋構造に固定し、フレキシブルオリゴヌクレオチドに標識された第１検出基と第２検出基との間の距離を変化させ、それにより検出可能なシグナルを生成することを指す。例えば、ＵＳ９８４５４９２Ｂ２の記載を参照してフレキシブルオリゴヌクレオチドを獲得することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の第１検出基及び第２検出基の一方は蛍光基であってもよく、他方は消光基又は蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動によりシグナル変化を生成できる他の基であってもよい。
例示的な実施形態において、蛍光共鳴エネルギー移動によりシグナル変化を生成する基はＣｙ３又はＣｙ５であってもよく、これはそれらの間がＦＲＥＴ作用により蛍光シグナル変化を生成することができるためである。
本発明において、蛍光基は例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ５．５からなる群から選択することができる。
本発明において、消光基は例えばＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＸＬ及びＤＤＱＩからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドと上流プライマー及び下流プライマーの予備増幅産物はアニーリングして延伸し、第１検出基及び第２検出基は延伸により生成された二本鎖増幅産物に組み込まれ、これにより距離の変化（増加）が発生する。
いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせはキットであってもよく、前記キットはさらに増幅試薬を含む。
本発明において、用語「増幅試薬」はＰＣＲに用いられる試薬を指し、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びいくつかのＰＣＲ反応を促進する試薬、例えばＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等を含むが、それらに限定されない。
本発明において、組み合わせ及びキット中の各成分は個別に分けて包装する形式で存在してもよく、又は予め混合する形式で存在してもよい。
本発明において、「予備変性」及び「変性」の目的は二本鎖ＤＮＡで対をなす相補的な塩基の間の水素結合を破壊し、それにより二本鎖が二本の一本鎖に分離することを可能にすることである。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む混合物を加熱する方法により一本鎖を形成することができ、例えば混合物を９０℃、９２℃、９５℃又は９８℃に加熱して二本鎖ＤＮＡを解離する。解離が完了した後、それを室温又は室温以下に冷却する。また例えば、一本鎖の形成はさらに溶液イオン強度（例えば、酸、塩基、塩等を添加する）を変更することにより二本鎖ＤＮＡの間の水素結合を破壊することができ、酵素（例えば、ヘリカーゼ）を用いて二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することを実現することができる。また、ホットスタートポリメラーゼに関する反応において、「予備変性」ステップではさらに該ポリメラーゼに対して熱活性化を行う。デジタルＰＣＲプラットフォームに関する場合に、一本鎖に変性した後、「予備変性」はさらに該一本鎖をドップレット／マイクロウェルに割り当てることにより、反応に関与する有効な標的数を増加させ、それにより反応感度を向上させる操作を含む。
いくつかの実施形態において、増幅は二つのサイクル増幅段階に分けることができ、第１サイクル段階のサイクル数は３－１５個のサイクルであってもよい。第２サイクル増幅段階のサイクル数は３０－５０個のサイクルであってもよい。
増幅に適用される手順及び一般的な反応条件（例えば温度、時間）は当業者によく知られている。いくつかの例示的な実施形態において、具体的な反応条件は以下のとおりであってもよい。９２℃－９６℃で５－１５分間予備変性する。９２℃－９５℃で１０－６０秒変性し、５５℃－７５℃でアニーリングして３０－９０秒延伸し、合計で３－１５個のサイクルを行う。９２℃－９５℃で１０－６０秒変性し、４５℃－６５℃でアニーリングして３０－９０秒延伸し、合計で３５－５０個のサイクルを行う。４℃－１５℃で反応を終了する。選択可能に、熱サイクルステップの後に不活性化ステップをさらに含むことができ、例えば９４℃－９８℃、５－１５分間である。別の例示的な実施形態において、増幅は９０℃－９６℃で５－１５分間予備変性すること、９０℃－９５℃で１０－６０秒変性し、５０℃－７５℃でアニーリングして３０－９０秒延伸し、３５－５０個のサイクルを行うこと、４℃－１５℃で反応を終了することを含む。選択可能に、熱サイクルステップの後に不活性化ステップをさらに含むことができ、例えば９４℃－９８℃、５－１５分間である。具体的な実施形態において、増幅は９５℃で１０分間予備変性すること、９４℃で３０秒間変性し、５５℃でアニーリングして６０秒間延伸し、合計で４５個のサイクルを行うこと、１０℃で反応を終了することを含む。
サンプル中の標的配列のみを予備増幅する場合、上流プライマー又は下流プライマーの反応系における濃度は例えば１５ｎＭ－１５０ｎＭであってもよく、好ましくは３０ｎＭ－９０ｎＭであり、より好ましくは４５ｎＭである。そうでなければ、上流プライマー又は下流プライマーの反応系における濃度は例えば１５０ｎＭ－１８００ｎＭであってもよく、好ましくは３００ｎＭ－９００ｎＭであり、より好ましくは４５０ｎＭである。
シグナルオリゴヌクレオチドが独立して存在する場合、その反応系における濃度は例えば１５０ｎＭ－１５００ｎＭであってもよく、好ましくは３００ｎＭ－６００ｎＭであり、より好ましくは４５０ｎＭである。
本発明において、「第１」及び「第２」などの表現は単に目的を説明するために用いられ、限定された物質を区別するために用いられ、いかなる方式で順序又は主従を限定するものではない。
本発明において、測定対象サンプルは末梢血サンプル、他のヒト由来又は微生物由来の遊離核酸サンプル、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）サンプル、新鮮組織サンプル、尿サンプル、灌流液サンプル、脳脊髄液サンプル、人工培養の細胞株サンプル、人工合成のプラスミドサンプル及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
以下に具体的な実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ｄｄＰＣＲプラットフォームでＥＧＦＲ遺伝子１８エクソン点突然変異ｃ．２１５６Ｇ＞Ｃ、ｐ．Ｇ７１９＞Ａを検出する
サンプルの作製
ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して該キットの取り扱い説明書に従ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞ＤＮＡを抽出し、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞ＤＮＡと上海生工により提供されたＧ７１９ＡプラスミドＤＮＡをそれぞれ超音波で切断して磁気ビーズでスクリーニングして精製し、野生型テンプレート（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞系ＤＮＡ）と変異型テンプレート（Ｇ７１９ＡプラスミドＤＮＡ）を得て、二種類のテンプレートを一定の割合で混合し、ＥＧＦＲ遺伝子Ｇ７１９Ａ点突然変異を含有する擬似臨床サンプルを得る。同時に断片化野生型ＤＮＡを使用して陰性対照（Ｎｅｇ）を作製し、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを使用してテンプレートなし対照（ＮＴＣ）とする。
プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドの設計
ＥＧＦＲ １８エクソン点突然変異に対して上流プライマー、下流プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドを設計し、その配列は表１に示すとおりである。
Figure 2023542408000002
ここで、変異型上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の全長は４０ｂｐであり、その３’端の第１個から第２０個までの塩基は標的配列結合領域となり、その５’端の第１個から第２０個までの塩基はシグナルオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の３’端の第１個から第２０個までの塩基（アンカー領域）と同じである。変異型下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）プライマーの全長は１７ｂｐであり、標的配列と結合する。シグナルオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）プライマーの全長は３７ｂｐであり、その３’端の第１個から第２０個までの塩基はアンカー領域となり、５’端の８個の塩基はその第１茎領域となり、５’端の第９個の塩基から第１６個の塩基まではその第２茎領域となる。
反応系の作製は下記表２に示すとおりである。
Figure 2023542408000003
配置が完了した後、測定対象テンプレートを含有する２０μＬの反応液を金属浴に置き、９５℃で１ｍｉｎ変性し、次に直ちに２～８℃の冷蔵庫に置いて２～３ｍｉｎ冷却する。
冷却後の２０μＬのＰＣＲ反応液をドップレット発生カードのサンプル孔に添加し、次に７０μＬのドップレット発生オイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６３００５）をドップレット発生カード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６４００８）のオイル孔に添加し、最後にシールストリップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６３００９）を用いてドップレット発生カードをシールする。
作製されたドップレット発生カードをドップレット発生器に入れ、ドップレットの生成を開始する。約２分間後、ドップレットの作製が完了し、カードスロットを取り出し、最上列の孔から約４０μＬのドップレットを９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１２００１９２）に注意深く移動する。
増幅読み取り
９６ウェルプレートを膜封止処理した後、ＰＣＲサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＰＸ１ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ）に置き、標的核酸配列の特異的富化、富化後のテンプレートの特異的増幅及び蛍光シグナルの検出を順に行う。反応手順は以下のとおりである。９５℃で１０分間予備変性する。９４℃で３０秒間変性し、６５℃でアニーリングして６０秒間延伸し、合計で４５個のサイクルを行う。９８℃で１０分間不活化する。１０℃で反応を終了する。
反応過程において、まずＰＣＲ反応の最初のいくつかのサイクルにおいて、変異型上流プライマー及び変異型下流プライマーにより標的核酸配列が特異的に増幅される。増幅後、上流プライマーの「シグナル検出領域」と相補的な配列が追加され、後続のシグナルオリゴヌクレオチドがペアリング識別を行うために用いられる。
上記反応が完了した後、シグナルオリゴヌクレオチド及び変異型下流プライマーは対応する富化後のテンプレートとペアリングして増幅することができ、変異型下流プライマーがアンカー領域に増幅する時、ＤＮＡポリメラーゼはその５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を利用して第１茎領域を加水分解し、蛍光基と消光基を分離させ、蛍光シグナルを発させ、それにより変異型テンプレートを検出する。
データ分析
Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＱｕａｎｔａＳｏｆｔデジタルＰＣＲ分析ソフトウェアを用いてデータ分析を行い、結果を図１に示す。ここで、「Ｅ０２」はテンプレートなし対照（ＮＴＣ）の検出結果であり、「Ｆ０２」は陰性対照（Ｎｅｇ）の検出結果であり、「Ｈ０２」は擬似臨床サンプルの結果である。図１から分かるように、陰性対照及びテンプレートなし対照においていずれも非特異的増幅がなく、擬似臨床サンプルにおいてｃ．２１５６Ｇ＞Ｃ、ｐ．Ｇ７１９＞Ａ変異を特異的に識別することができる。
比較例１
前述した実施例１において、上流プライマーと下流プライマーはいずれもＥＧＦＲ遺伝子１８エクソン点突然変異を特異的に識別した。二つのプライマーがいずれも変異遺伝子を特異的に識別する方案と単一のプライマーのみが変異遺伝子を特異的に識別する方案の検出効果上の区別を考察するために、以下の実験を行った。
サンプルの作製
野生型テンプレート（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株ＤＮＡ）と変異型テンプレート（Ｇ７１９ＡプラスミドＤＮＡ）の作製過程は実施例１と同じである。二種類のテンプレートを異なる割合で混合し、ＥＧＦＲ遺伝子Ｇ７１９Ａ点突然変異を含有する高値サンプル（理論濃度３９３コピー／μＬ）、中央値サンプル（理論濃度４４コピー数／μＬ）、低値サンプル（理論濃度４コピー／μＬ）を得る。同時に断片化野生型ＤＮＡを使用して陰性対照（Ｎｅｇ）を作製し、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを使用してテンプレートなし対照（ＮＴＣ）とする。
プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドの設計
二つのプライマーがいずれも変異遺伝子を特異的に識別する方案は表１の設計を採用する。単一のプライマーが変異遺伝子を特異的に識別する方案は表３に示す設計を採用する。
Figure 2023542408000004
表３における下流プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドは、表１と同様である。また、一組の上流プライマーを設計しており、これらの上流プライマーは点突然変異を特異的に識別しない。
二種類の方案はいずれも同じ変異型下流プライマーを採用しているが、異なる変異型上流プライマー／上流プライマーにより、対応する標的配列の長さが異なり、具体的には表４に示すとおりである。
Figure 2023542408000005
反応系の作製は下記の表５に示すとおりである。
Figure 2023542408000006
ドップレットを生成する前に、作製された測定対象テンプレートを含有する２０μＬの反応液を金属浴に置き、９５℃で１ｍｉｎ変性した後、直ちに２～８冷蔵庫に２～３ｍｉｎ置く。
冷却された２０μＬのＰＣＲ反応液をドップレット発生カードのサンプル孔に添加し、次にドップレット発生カードのオイル孔に７０μＬのドップレット発生オイルを添加し、最後にシールストリップを用いてドップレット発生カードをシールする。
作製されたドップレット発生カードをドップレット発生器に入れ、ドップレットの生成を開始する。約２分間後、ドップレットの作製が完了し、カードスロットを取り出し、最上列の孔から約４０μＬのドップレットを９６ウェルＰＣＲプレートに注意深く移動する。
増幅読み取り
９６ウェルプレートに膜封止処理を行った後、ＰＣＲサーマルサイクラーに置いてＰＣＲ増幅を行う。使用される手順は以下のとおりである。９５℃で１０分間予備変性する。９４℃で３０秒変性し、５５℃でアニーリングして６０秒延伸し、合計で４８個のサイクルを行う。９８℃で１０分間不活化する。１０℃で反応を終了する。
ＰＣＲ増幅が終了した後、９６ウェルプレートをドップレット分析装置に置いてＦＡＭ／ＨＥＸチャネルを選択してシグナルを読み取る。
統計分析
ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェアを用いて蛍光シグナルの強度、数を分析し、ＥＧＦＲ遺伝子１８エクソン点突然変異型のコピー数及び濃度を得て、結果を表６に示す。
Figure 2023542408000007
表６から分かるように、標的配列の断片が短いほど、サンプル定量に対する能力が高くなり、すなわちＧ７１９Ａ変異型断片を検出する能力が高くなる。
表６におけるデータを線形回帰分析し、分析結果は図２に示すとおりである。変異型高値サンプル、中央値サンプル、低値サンプルを検出する場合、その検出能力は標的配列の長さと負の相関を呈することが分かる。標的配列が短いほど、変異型の断片が多く検出され、検出能力が高くなり、逆に、検出能力が低くなる。
実施例２ Ｑ－ＰＣＲプラットフォームでＥＧＦＲ遺伝子１８エクソン点突然変異Ｇ７１９Ａを検出する
サンプルの作製
ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して該キットの取り扱い説明書に従ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞ＤＮＡを抽出し、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞ＤＮＡと上海生工により提供されたＧ７１９ＡプラスミドＤＮＡをそれぞれ超音波で切断して磁気ビーズでスクリーニングして精製し、野生型テンプレート（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞系ＤＮＡ）と変異型テンプレート（Ｇ７１９ＡプラスミドＤＮＡ）を得て、二種類のテンプレートを一定の割合で混合し、ＥＧＦＲ遺伝子Ｇ７１９Ａ点突然変異を含有する擬似臨床サンプルを得る。同時に断片化野生型ＤＮＡを使用して陰性対照（Ｎｅｇ）を作製し、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを使用してテンプレートなし対照（ＮＴＣ）とする。
反応の作製
プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドの設計
ＥＧＦＲ １８エクソン点突然変異に対して上流プライマー、下流プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドを設計し、その配列は表７に示すとおりである。
Figure 2023542408000008
反応系の作製は下記表８に示すとおりである。
Figure 2023542408000009
増幅読み取り
ＰＣＲ管に蓋をした後にサンプルを軽く均一に混合し、その後に一旦遠心分離した後に室温に置いて５ｍｉｎ静置する。再びＰＣＲ管をミニ遠心機に置き、一旦遠心分離した後に蛍光定量ＰＣＲ装置（ＡＢＩ ７５００リアルタイム蛍光定量ＰＣＲシステム）のトレイに移す。使用される手順は以下のとおりである。９５℃で５分間予備変性する。９４℃で３０秒変性し、６０℃でアニーリングして３０秒延伸し、合計で１０個のサイクルを行い、採光しない。５６℃でアニーリングして３０秒延伸し、合計で３０個のサイクルを行い、採光し、１０℃で反応を終了する。
データ分析
Ｑ－ＰＣＲ検出プラットフォームを用いてデータ分析を行い、結果は図３に示すとおりである。図３から分かるように、陰性対照及びテンプレートなし対照においていずれも非特異的増幅がなく、擬似臨床サンプルにおいてＧ７１９Ａフラグメントを特異的に識別することができる。
実施例３ ｄｄＰＣＲプラットフォームでＥＧＦＲ遺伝子点突然変異ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｔ７９０＞Ｍを検出する
サンプルの作製
ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して該キットの取り扱い説明書に従ってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞ＤＮＡ及びＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞系ＤＮＡを抽出し、二種類の細胞系ＤＮＡをそれぞれ超音波で切断して磁気ビーズでスクリーニングして精製し、ＥＧＦＲ野生型テンプレート（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞系ＤＮＡ）及びＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異型テンプレート（ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞系ＤＮＡ）を得て、二種類のテンプレートを一定の割合で混合し、ＥＧＦＲ遺伝子Ｔ７９０Ｍ点突然変異を含有する擬似臨床サンプルを得る。同時に断片化野生型ＤＮＡを使用して陰性対照（Ｎｅｇ）を作製し、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを使用してテンプレートなし対照（ＮＴＣ）とする。
プライマー配列は表９に示すとおりである。
Figure 2023542408000010
反応系の作製は下記の表１０に示すとおりである。
Figure 2023542408000011
配置が完了した後、測定対象テンプレートを含有する２０μＬの反応液を金属浴に置き、９５℃で１ｍｉｎ変性し、次に直ちに２～８℃の冷蔵庫に置いて２～３ｍｉｎ冷却する。
冷却された２０μＬのＰＣＲ反応液をドップレット発生カードのサンプル孔に添加し、次にドップレット発生カードのオイル孔に７０μＬのドップレット発生オイルを添加し、最後にシールストリップを用いてドップレット発生カードをシールする。
作製されたドップレット発生カードをドップレット発生器に入れ、ドップレットの生成を開始する。約２分間後、ドップレットの作製が完了し、カードスロットを取り出し、最上列の孔から約４０μＬのドップレットを９６ウェルＰＣＲプレートに注意深く移動する。
増幅読み取り
９６ウェルプレートに膜封止処理を行った後、ＰＣＲサーマルサイクラーに置いてＰＣＲ増幅を行う。使用される手順は以下のとおりである。９５℃で１０分間予備変性する。９４℃で３０秒変性し、５６℃でアニーリングして６０秒延伸し、合計で４８個のサイクルを行う。９８℃で１０分間不活化する。１０℃で反応を終了する。
ＰＣＲ増幅が終了した後、９６ウェルプレートをドップレット分析装置に置いてＦＡＭ／ＨＥＸチャネルを選択してシグナルを読み取る。
データ分析
Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＱｕａｎｔａＳｏｆｔデジタルＰＣＲ分析ソフトウェアを用いてデータ分析を行い、結果を図４に示す。ここで、「Ａ０２」はテンプレートなし対照（ＮＴＣ）の検出結果であり、「Ａ０３」は陰性対照（Ｎｅｇ）の検出結果であり、「Ｆ０１」は擬似臨床サンプルの結果である。本発明の方案はｄｄＰＣＲ検出プラットフォームで陰性対照及びテンプレートなし対照においていずれも非特異的増幅がなく、Ｈ１９７５サンプルにおいてＴ７９０Ｍフラグメントを特異的に識別することができる。
比較例２
前述した実施例３において、上流プライマー及び下流プライマーはいずれもＥＧＦＲ遺伝子２０エクソン点突然変異を特異的に識別する。本発明の方案の変異型Ｆ、変異型Ｒはいずれも該変異部位を特異的に識別する。二つのプライマーがいずれも変異遺伝子を特異的に識別する場合及び単一のプライマーのみが点突然変異遺伝子を特異的に識別する場合の検出効果上の区別を考察するために、以下の実験を行った。
サンプルの作製
野生型テンプレート（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株ＤＮＡ）及び変異型テンプレート（ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株ＤＮＡ）の作製過程は実施例３と同じである。二種類のテンプレートを異なる割合で混合し、ＥＧＦＲ遺伝子Ｔ７９０Ｍ点突然変異を含有する高値サンプル（理論濃度１５０コピー／μＬ）、低値サンプル（理論濃度１５コピー／μＬ）を得る。同時に断片化野生型ＤＮＡを使用して陰性対照（Ｎｅｇ）を作製し、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを使用してテンプレートなし対照（ＮＴＣ）とする。
プライマーの設計
二つのプライマーがいずれも点突然変異を特異的に識別する方案は表１０の設計を採用する。単一のプライマーが点突然変異を特異的に識別する方案は表１１に示す設計を採用する。
Figure 2023542408000012
表１１における変異型上流プライマー及び野生型上流プライマーは、表１０と同様である。なお、一組の下流プライマーを設計しており、これらの下流プライマーは点突然変異を特異的に識別しない。
二種類の方案はいずれも同様の変異型上流プライマー及び野生型上流プライマーを採用しているが、異なる変異型下流プライマー／下流プライマーにより、対応する標的配列の長さが異なり、具体的には表１２に示すとおりである。
Figure 2023542408000013
反応系の作製は表１３に示すとおりである。
Figure 2023542408000014
作製された測定対象テンプレートを含有する２０μＬの反応液を金属浴に置き、９５℃で１ｍｉｎ変性した後、直ちに２～８℃の冷蔵庫に２～３ｍｉｎ置く。
冷却された２０μＬのＰＣＲ反応液をドップレット発生カードのサンプル孔に添加し、次にドップレット発生カードのオイル孔に７０μＬのドップレット発生オイルを添加し、最後にシールストリップを用いてドップレット発生カードをシールする。
作製されたドップレット発生カードをドップレット発生器に入れ、ドップレットの生成を開始する。約２分間後、ドップレットの作製が完了し、カードスロットを取り出し、最上列の孔から約４０μＬのドップレットを９６ウェルＰＣＲプレートに注意深く移動する。
増幅読み取り
９６ウェルプレートに膜封止処理を行った後、ＰＣＲサーマルサイクラーに置いてＰＣＲ増幅を行う。使用される手順は以下のとおりである。９５℃で１０分間予備変性する。９４℃で３０秒変性し、５６℃でアニーリングして６０秒延伸し、合計で４８個のサイクルを行う。９８℃で１０分間不活化する。１０℃で反応を終了する。
ＰＣＲ増幅が終了した後、９６ウェルプレートをドップレット分析装置に置いてＦＡＭ／ＨＥＸチャネルを選択してシグナルを読み取る。
データ分析
ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェアを用いて蛍光シグナルの強度、数を分析し、ＥＧＦＲ遺伝子２０エクソンＴ７９０Ｍ変異型のコピー数及び濃度を得て、結果は表１４に示すとおりである。
Figure 2023542408000015
表１４から分かるように、標的配列の断片が短いほど、サンプル定量に対する能力が高くなり、すなわちＴ７９０Ｍ変異型断片を検出する能力が高くなる。
表１４におけるデータを線形回帰分析し、分析結果は図５に示すとおりである。変異型高値サンプル、低値サンプルを検出する場合、その検出能力は標的配列の長さと負の相関を呈することが分かる。標的配列が短いほど、変異型断片が多く検出され、検出能力が高くなり、逆に、検出能力が低くなる。
腫瘍患者の末梢血のｃｔＤＮＡに対して液体生検を行う場合、ｃｔＤＮＡが高度な断片化を呈するため、その断片の長さが９０ｂｐ－１６０ｂｐの間に分布しており、従来の研究により、標的配列の長さが短いほど、ｃｔＤＮＡの検出率が高いことを見出した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかし、現在のｃｔＤＮＡ検出技術は、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ法を採用してもＡＲＭＳ法を採用しても、いずれも標的配列が長すぎるという問題が存在する。特許ＣＮ１０５３４９６５４Ｂに記載されたＥＧＦＲ遺伝子変異を検出するためのプローブ、プライマー、検出系及びキットは、ＥＧＦＲ変異遺伝子を検出するために必要な標的配列の長さは７０ｂｐ－１３４ｂｐの間にあり、ここでエクソン１８上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは１００ｂｐ－１１６ｂｐであり、エクソン１９上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは７０ｂｐ－８４ｂｐであり、エクソン２０上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは８５ｂｐ－１３４ｂｐであり、エクソン２１上の変異部位の検出に必要な増幅標的配列の長さは１０９ｂｐ－１２１ｂｐである。長い増幅標的配列の長さは必ず断片化ｃｔＤＮＡテンプレートの検出率を低下させ、それにより検出感度に影響を与える。
いくつかの実施形態において、増幅ステップの前に、サンプル混合物を異なる反応ユニットに割り当てるステップをさらに含む。任意選択的に、異なる反応ユニットに割り当てる前に、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性するステップをさらに含んでもよい。
本明細書において、用語「核酸」はヌクレオチドモノマーの一本鎖及び／又は二本鎖ポリマーを指し、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合又はヌクレオチド間類似体により接続された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むがそれらに限定されない。核酸中のヌクレオチドモノマーは、「ヌクレオチド残基」と呼ばれてもよい。核酸は完全にデオキシリボヌクレオチドで構成され、完全にリボヌクレオチドで構成されるか又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの嵌合混合物で構成され、かつヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド単量体単位は、本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれか一つを含むことができ、ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチド類似体（例えば修飾ヌクレオチド）を含むがそれらに限定されない。核酸の大きさは通常、数ヌクレオチド残基から数千ヌクレオチド残基まで異なっている。ここで、「オリゴヌクレオチド」は通常、長さが相対的に短い（例えば８０未満）ヌクレオチド重合体を指す。特に指摘しない限り、核酸配列を呈するたびに、だれでも分かるように、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’までの順序となっている。特に指摘しない限り、「Ａ」はアデニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｔ」はチミン、「Ｕ」はウラシルを表す。
ここで、変異型上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の全長は４０ｂｐであり、その３’端の第１個から第２０個までの塩基は標的配列結合領域となり、その５’端の第１個から第２０個までの塩基はシグナルオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の３’端の第１個から第２０個までの塩基（アンカー領域）と同じである。変異型下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）プライマーの全長は１７ｂｐであり、標的配列と結合する。シグナルオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）プライマーの全長は３７ｂｐであり、その３’端の第１個から第２０個までの塩基はアンカー領域となり、５’端の第１個から第８個までの塩基はその第１茎領域となり、５’端の第９個から第１６個までの塩基はその第２茎領域となる。
反応の作製
プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドの設計
ＥＧＦＲ １８エクソン点突然変異に対して上流プライマー、下流プライマー、第２プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドを設計し、その配列は表７に示すとおりである。

Claims (15)

  1. ３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端が標的配列の特異的検出部位と相補することができる上流プライマーと、
    ３’端に標的配列結合領域が設置され、前記標的配列結合領域の３’末端も同一の特異的検出部位と相補することができる下流プライマーと、
    第１検出基及び第２検出基が修飾されており、前記第１検出基と第２検出基が距離の変化によりシグナルの変化を生成するシグナルオリゴヌクレオチドと、を含み、
    前記シグナルオリゴヌクレオチドは、前記上流プライマー及び／又は下流プライマーの一部として設計されかつ前記標的配列結合領域の上流に位置するか、又は、前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にさらにシグナル検出領域を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーから独立しかつ前記シグナル検出領域と同じ配列を有するように設計され、
    前記シグナル検出領域は、前記上流プライマー及び／又は下流プライマーの標的配列結合領域の上流に位置し、標的配列と相補ペアリングできないように設計される、核酸を検出するための組み合わせ。
  2. 前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にさらにシグナル検出領域を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーから独立するように設計され、
    前記シグナルオリゴヌクレオチドは、５’から３’まで順に第１茎領域、ループ領域、第２茎領域及びアンカー領域を含むように設計され、
    前記第１茎領域は第２茎領域と部分的又は完全に相補するように設計され、前記アンカー領域は前記シグナルオリゴヌクレオチドの３’端に位置しかつ前記シグナル検出領域と完全又は部分的に同じになるように設計され、
    前記第１検出基は前記第１茎領域に修飾され、前記第２検出基は前記第２茎領域、前記第２茎領域とアンカー領域との間又は前記アンカー領域の非３’末端に修飾される、
    請求項１に記載の組み合わせ。
  3. 前記第２茎領域とアンカー領域との間に１－５個の塩基間隔が存在する、
    請求項２に記載の組み合わせ。
  4. 前記第１検出基は前記第１茎領域に位置し、前記第２検出基は前記第２茎領域とアンカー領域との間に位置する、
    請求項２に記載の組み合わせ。
  5. 前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にさらにシグナル検出領域を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーから独立するように設計され、
    前記シグナルオリゴヌクレオチドはフレキシブルオリゴヌクレオチドとして設計され、
    前記第１検出基及び第２検出基は前記シグナルオリゴヌクレオチドの非３’末端に位置する、
    請求項１に記載の組み合わせ。
  6. 前記第１検出基と第２検出基との距離は５－２５ｎｔである、
    請求項５に記載の組み合わせ。
  7. 前記上流プライマー及び／又は下流プライマーは標的配列結合領域の上流にさらにシグナル検出領域を含み、前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーから独立するように設計され、
    前記組み合わせはさらに第２プライマーを含み、前記第２プライマーの全部又は一部の配列は前記シグナル検出領域と同じであり、
    前記シグナル検出領域上の前記シグナルオリゴヌクレオチドと同じ領域は前記第２プライマーと同じ領域の下流に位置し、
    前記シグナルオリゴヌクレオチドの加水分解により前記距離の変化を生成する、
    請求項１に記載の組み合わせ。
  8. 前記シグナルオリゴヌクレオチドは前記上流プライマー及び／又は下流プライマーの一部として設計されかつ前記標的配列結合領域の上流に位置し、
    前記シグナルオリゴヌクレオチドは５’から３’まで順に第１茎領域、ループ領域及び第２茎領域を含み、
    前記第１茎領域は第２茎領域と部分的に又は完全に相補するように設計され、
    前記第１検出基は第１茎領域に位置し、前記第２検出基は前記第２茎領域に位置する、
    請求項１に記載の組み合わせ。
  9. 前記特異的検出部位は変異部位である、
    請求項１～８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の組み合わせ、増幅試薬を被験者からのサンプルと混合するステップと、
    前記サンプルに存在する可能性のある標的配列を増幅するステップと、
    生成されたシグナル変化を取得するステップと、
    得られたシグナルの変化から、サンプル中に標的核酸が存在するか否かを判断するステップと、を含む、
    核酸を検出する方法。
  11. 前記サンプル中に標的核酸が存在するか否かを判断すると同時に標的核酸を定量する、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 前記サンプルは末梢血又は他の断片化核酸標的を含むサンプルタイプである、
    請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記被験者は癌に罹患しているか又は癌に罹患している疑いがある被験者である、
    請求項１０又は１１に記載の方法。
  14. 前記核酸はｃｔＤＮＡである、
    請求項１０又は１１に記載の方法。
  15. 請求項１～９のいずれか一項に定義された上流プライマー、下流プライマー及びシグナルオリゴヌクレオチドを含むキット。
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