KR20120042100A - 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 - Google Patents

이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 Download PDF

Info

Publication number
KR20120042100A
KR20120042100A KR1020100103599A KR20100103599A KR20120042100A KR 20120042100 A KR20120042100 A KR 20120042100A KR 1020100103599 A KR1020100103599 A KR 1020100103599A KR 20100103599 A KR20100103599 A KR 20100103599A KR 20120042100 A KR20120042100 A KR 20120042100A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
label
nucleic acid
probe
target nucleic
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020100103599A
Other languages
English (en)
Inventor
천종윤
Original Assignee
주식회사 씨젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨젠 filed Critical 주식회사 씨젠
Priority to KR1020100103599A priority Critical patent/KR20120042100A/ko
Priority to EP11834650.1A priority patent/EP2630262B1/en
Priority to PCT/KR2011/007855 priority patent/WO2012053850A2/en
Priority to US13/880,199 priority patent/US9885081B2/en
Priority to KR1020137010497A priority patent/KR101607662B1/ko
Priority to CN201180050984.9A priority patent/CN103228797B/zh
Priority to JP2013534825A priority patent/JP2013544079A/ja
Publication of KR20120042100A publication Critical patent/KR20120042100A/ko
Priority to JP2016014466A priority patent/JP6228242B2/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Abstract

본 발명은 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에 관한 것이다. 본 발명은 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 저항성에 의하여 고상에 표지가 잔류하게 되므로, 절단과정에서 표지가 고상에 잔류하도록 반응조건 등을 고려하여 표지가 결합되는 뉴클레오타이드의 위치를 조절할 필요가 없다. 또한, 본 발명은 내부 표지의 결합위치를 자유로이 결정할 수 있으므로, 이중 표지간의 퀀칭 효율을 최대화할 수 있도록 표지의 위치를 조절하여 background signal을 최소화할 수 있다.

Description

이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequences Using Dual-Labeled Immobilized Probes on Solid Phase}
본 발명은 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에 관한 것이다.
DNA-기반 마이크로어레이 기술은 특정 유전자 또는 유전자군의 존재, 양 또는 발현패턴을 분석할 수 있는 간단한 방법으로서 큰 각광을 받고 있다 (Schena et al., Science, 270:467-470(1995); DeRisi et al., Nature Genetics 14:457-460(1996)).
종래의 DNA 마이크로어레이 기술은 표지된 핵산 서열을 고상에 고정되어 있는 특정 DNA oligonucleotides (probe)와 혼성화시키고 표지로 부터의 시그널을 검출함으로써 타겟 서열을 검출한다. 하지만, 타겟 핵산 서열에 직접 표지를 하는 것은 시간적 비용적면에서 효율적이지 않으며 원래 존재하는 타겟 핵산 서열의 양 (level)을 변화시킬 수 있는 문제가 있다.
타겟 핵산 서열에 표지를 하는 대신 이중 표지를 갖는 molecular beacon probe를 고상에 고정하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이 보고되었다 (Steemers et al., Nat Biotechnol, 18:91-94(2000); Kim et al., Biosensors Bioelectronics, 22:1041-1047(2007)). 이중 표지간의 FRET 현상을 이용하는 molecular beacon probe는 타겟 핵산 서열에 혼성화되는 경우 형광시그널을 제공하므로 타겟 핵산 서열을 실시간으로 검출할 수 있게 한다.
다만, 혼성화에 의해서 타겟 서열을 검출하는 DNA 마이크로로어레이 방법은 cross reaction에 의한 false positives 문제가 발생되어, 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다.
최근에는 고정화된 이중 표지 프로브를 사용하면서 혼성화 여부에만 의존하지 않고, exonuclease 활성을 이용하는 TaqMan probe 방법에 의한 타겟 핵산 서열 검출 방법이 소개되었다 (Liu et al., Nucleic Acid Res. 34:e4 (2006)). Liu 등은 프로브의 5’말단에 퀀처 분자, 3’말단에 형광 리포터 분자를 위치시킨 이중 표지 프로브를 고상에 고정시키고, 프로브의 upstream에 위치한 프라이머의 연장과정 동안 DNA 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의하여 프로브가 절단되도록 하였다. 이 절단 과정에서 퀀처 분자는 해리되고 형광 리포터 분자는 고상에 잔류되며, 고상에서 발생하는 형광 시그널에 의하여 타겟 핵산 서열을 검출한다. 혼성화 이외에 5’to 3' nuclease activity를 이용하여 시그널을 발생시키는 TaqMan probe array 방법은 고상에서 특이도를 높이면서 실시간으로 타겟 서열을 검출 할 수 있도록 하는 장점이 있다.
다만, 상기 방법에서 프라이머의 연장 반응에 동반한 DNA 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성은 형광 리포터 분자가 표지된 뉴클레오타이드까지 절단할 수 있으므로 고상에 형광 리포터 분자가 잔류하지 못 할 수 있다. 이에 대하여, 절단과정에서 짧아지는 프로브는 반응조건에 따라 일정 길이에서 타겟 핵산 서열에서 분리되므로 절단이 되지 않는 부위가 존재할 수 있는 데, 상기 비절단 부위에 형광 리포터 분자를 위치시킴으로써 고상에 잔류시킬 수 있으며, 통상 3’ 말단 부위에 형광 리포터 분자를 위치시킴으로써 표지를 고상에 잔류시킨다. 하지만, 이와 같은 경우, 퀀처 분자와 형광 리포터 분자와의 거리가 상당히 멀어 지게 되고, 두 분자의 위치가 멀면 멀수록 퀀칭 효율이 떨어질 뿐만 아니라 불안정한 퀀칭으로 인하여 spot에 따라 서로 다른 back ground 시그널이 발생할 수 있는 문제점이 있다.
또한, TaqMan probe 방법은 upstream 프라이머 의존적인 DNA 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 이용하므로 upstream 프라이머가 필수 구성요소가 된다. 이와 같은 추가적인 올리고뉴클레오타이드를 사용해야 하는 제한은 다수의 타겟 핵산 검출에 사용되는 microarray에서 반응조건 설정 등에 어려움을 주고, 위양성 시그널을 발생시킬 수 있는 요인이 될 수 있다.
따라서, 상술한 종래의 DNA 마이크로어레이 기술의 문제점을 극복하여, 타겟 서열, 바람직하게는 다수의 타겟 서열을 하나의 DNA 마이크로어레이 상에서 보다 간편하면서도 개선된 신뢰도 및 재현성으로 검출할 수 있는 DNA 마이크로어레이 기술에 대한 요구가 대두되고 있다. 나아가, DNA 마이크로어레이 상에서 반응이 진행되면서 실시간으로 시그널의 변화를 검출하는 real-time 마이크로어레이 방법은 타겟 핵산 서열의 정량적 분석 등에서 DNA 마이크로어레이의 유용성을 보다 증대시킬 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 타겟 핵산을 보다 간편하면서도 위양성 및 위음성 결과 없이 고상에서 이중표지-프로브를 이용하여 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자들은 이중표지-프로브에서 표지의 결합 방식을 조절하여 하나의 표지는 5‘-말단에 또 다른 표지는 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합시키는 이중 표지 방식을 채택하고, 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합된 표지는 시그널 발생뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성에도 갖도록 하였다. 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에 있어서, 이러한 본 발명의 내적 블록킹 이중표지-프로브(internally blocked dual-labeled probe)는 내부 표지의 결합위치를 자유로이 결정할 수 있도록 하고, 재현성 있게 고상에 최종적으로 잔류된 표지로부터 위양성 및 위음성 데이터가 완벽하게 제거된 시그널을 얻을 수 있도록 한다. 본 발명은 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 방법에서, 가장 최적화된 프로토콜을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다음을 포함하는 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출을 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 고정화 프로브에 혼성화 시키는 단계로서; 상기 고정화 프로브는 3’-말단을 통하여 고상 기질에 고정화 되어 있고 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5‘-말단에 있고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물을 상기 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소와 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 고정화 프로브는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소의 exonucleolytic 반응에 의해 절단되어 상기 고정화 프로브로부터 상기 제1표지가 해리되어 상기 고상 기질 상의 고정화 프로브 상의 시그널 변화를 야기하며;
(c) 상기 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의한 exonucleolytic 반응이 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드에서 종결되는 단계로서; 상기 exonucleolytic 반응의 종결은 상기 제2표지가 결합된 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 이루어지며, 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 그리고
(d) 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화를 검출하는 단계로서; 상기 고정화 프로브의 절단에 의한 상기 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 타겟 핵산을 보다 간편하면서도 위양성 및 위음성 결과 없이 고상에서 이중표지-프로브를 이용하여 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자들은 이중표지-프로브에서 표지의 결합 방식을 조절하여 하나의 표지는 5‘-말단에 또 다른 표지는 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합시키는 이중 표지 방식을 채택하고, 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합된 표지는 시그널 발생뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성에도 갖도록 하였다. 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에 있어서, 이러한 본 발명의 내적 블록킹 이중표지-프로브(internally blocked dual-labeled probe)는 내부 표지의 결합위치를 자유로이 결정할 수 있도록 하고, 재현성 있게 고상에 최종적으로 잔류된 표지로부터 위양성 및 위음성 데이터가 완벽하게 제거된 시그널을 얻을 수 있도록 한다. 본 발명은 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 방법에서, 가장 최적화된 프로토콜을 제공한다.
종래 고상에서의 이중 표지의 절단 반응을 통하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법에서 절단 과정에서 이중 표지 중 내부 뉴클레오타이드에 연결된 표지는 고상에 잔류하여야 고상에서의 시그널 변화를 통하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 절단 과정에서 점차 짧아지는 프로브는 서열 및 반응 조건에 따라 일정한 길이가 되면 타겟 핵산 서열에서 denaturation되므로, 프로브 상에 비절단 부위가 존재할 수 있다. 따라서, 상기 비절단 부위에 표지를 위치시키면 상기 표지는 절단 반응에도 불구하고 고상에 잔류할 수 있다. 다만, 상기 현상을 이용하는 경우, 내부 표지는 반응 조건을 고려하여 비절단 부위에 위치시켜야 하는 제한이 발생한다. 이와 같은 제한은 결국, 이중 표지간의 거리를 상당히 떨어지도록 디자인하게 하는데 이중 표지의 위치가 멀면 멀수록 퀀칭 효율이 떨어질 뿐만 아니라 불안정한 퀀칭으로 인하여 spot에 따라 서로 다른 back ground 시그널이 발생할 수 있는 문제점이 있다.
본 발명자는 염기가 표지된 뉴클레오타이드는 프라이머에 비-의존적인 DNA 중합효소의 5’ to 3' 엑소뉴클라아제 활성에 대하여 저항성을 갖는 다는 사실을 확인하고 이와 같은 특성을 고정화된 이중 표지 프로브에 절묘하게 적용하여, 표지의 위치의 제한이 없는 이중 표지를 이용한 고상 검출방법을 완성하였다. 이와 같은 방법은 본 발명자에 의하여 처음 사용되는 것으로, 보다 효율이고 정확하게 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 고상 반응에 따르면, 타겟 핵산서열을 고정화 프로브에 혼성화 시킨다.
본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열”, “타겟 서열” 또는 “타겟 핵산”은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 증폭 조건 및 혼성화 조건에서 프라이머 및 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 바람직하게는, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에서 이용되는 고정화 프로브는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 고정화 프로브는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질에 고정화 되어 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브가 고정화 되는 고상 기질은 마이크로어레이를 포함한다. 고정화 프로브는 3’-말단을 통하여 고상 표면에 직접적 또는 간접적으로 고정화되며, 바람직하게는 간접적으로 고정화 된다. 또한, 고정화 프로브의 3’-말단은 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 표면에 고정화될 수 있다. 고정화 프로브가 간접적으로 고상 표면에 고정화 되는 경우에는, 링커가 관여를 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 링커는 마이크로어레이에서 프로브를 고정화 하는 데 이용되는 어떠한 링커도 포함한다. 예를 들어, 아민기를 가지는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 가지는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로 이용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용되어 효소의 작용 (예를 들어, 효소적 절단 반응)에 방해가 되는 space hindrance를 최소화하거나, 혼성화 효율을 증가시킬 수 있다. poly (T) 염기 또는 poly (A) 염기는 프로브의 서열에 포함되지 않는다.
본 발명에서 이용되는 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적인 이중 표지 시스템을 가지고 있다.
상호작용적 이중 표지 시스템은 공여자 분자 및 수용자 분자 사이에 에너지가 non-radioactive 하게 패싱 되는 signal generating system을 의미한다. 상호작용적 이중 표지 시스템의 대표적인 예로서, FRET (fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여자 분자) 및 퀀처 분자(수용자 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여자는 형광성이지만, 에너지 수용자는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다.
상호작용적 표지 시스템의 다른 예에서, 에너지 공여자는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고, 에너지 수용자가 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 예에서, 에너지 공여자는 발광성, 예컨대 bioluminescent, chemiluminescent 또는 electrochemiluminescent이고, 에너지 수용자가 형광성이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널은 상호작용적 이중 표지 시스템에 의해 발생되며, 보다 바람직하게는 FRET 이중 표지 시스템에 의해 발생된다.
본 발명의 고정화 프로브에 결합되는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 공지된 어떠한 것도 포함한다. 이들의 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) and Quasar 705 (610).
적합한 리포터-퀀처 페어는 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2ndEdition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6thEdition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
고정화 프로브에 있는 리포터 및 퀀처는 분자는 각각 형광물질일 수 있다. 또한, 상기 리포터 분자는 형광물질 상기 퀀처 분자는 비형광물질일 수 있다. 예를 들어, 넓은 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비형광 다크 퀀처가 본 발명에서 사용될 수 있다. 퀀처 분자가 형광물질인 경우, 형광성 퀀처 분자로부터의 시그널 변화를 통하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 고정화 프로브의 이중 표지 시스템에서, 리포터는 FRET의 도너, 퀀처는 FRET의 다른 파트너(어셉터)를 포함한다. 예컨대, fluorescein dye가 리포터로 이용될 수 있고 rhodamine dye가 퀀처로 이용될 수 있다.
상기 리포터 및 퀀처 분자는 공지의 다양한 방법으로 프로브에 연결될 수 있다. 예를 들어, 리포터 및 퀀처 분자는 최소한 3개 이상의 탄소 원자를 포함하는 스페이서 (spacer)(예를 들어, 3-carbon spacer, 6-carbon spacer, 9-carbon spacer 또는 12-carbon spacer)를 매개로 프로브에 연결된다.
본 발명의 고정화 프로브에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 고정화 프로브의 5‘-말단에 있고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있다.
고정화 프로브의 5‘-말단에 결합된 제1표지는 바람직하게는, 5‘-말단의 포스페이트기에 직접적 또는 간접적(예컨대, 링커를 통하여)으로 결합되어 있다. 또는 5’말단의 ribose에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 5-번 당탄소에 연결될 수 있다.
고정화 프로브의 제2표지는 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있다. 제2표지의 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 타이민 염기에 결합할 수 있으며, 가장 바람직하게는 타이민 염기에 결합한다.
제2표지에 의한 염기의 표지는 염기가 수소결합을 하는 위치 이외의 위치에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 타이민 염기의 경우에는 5번 또는 6번 탄소, 바람직하게는 5번 탄소에 결합된 메틸기에 제2표지를 결합시킬 수 있다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 제2표지에 의한 염기의 표지는 이 표지가 결합된 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 한다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 “저항성”은 뉴클레오타이드 분자가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 정도가 현저히 감소되는 것을 의미하며 바람직하게는 절단되지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1표지는 리포터 분자이고 제2표지는 퀀처 분자이다. 본 발명의 변형예에 따르면, 제1표지는 퀀처 분자이고 제2표지는 리포터 분자이다.
제1표지가 퀀처 분자이고 제2표지가 리포터 분자인 경우, 본 발명에 따라 exonucleolytic reaction을 진행하면, 고정화 프로브의 5‘-말단은 절단되어 제1표지는 해리되고 제2표지는 고상 기질 상에 잔존하게 되어 제2표지인 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 검출하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
제1표지가 리포터 분자이고 제2표지가 퀀처 분자인 경우, 본 발명에 따라 exonucleolytic reaction을 진행하면, 고정화 프로브의 5‘-말단은 절단되어 제1표지는 해리되고 제2표지는 고상 기질 상에 잔존하게 된다. 만일, 퀀처 분자가 형광 물질이면, 고상 기질 상에 잔존하는 퀀처 분자는 제1표지가 해리되기 전과 다른 형광 시그널을 나타내며, 이를 통하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 이점 중 하나는, 내부 표지의 결합위치를 자유로이 결정할 수 있다는 것이다. 즉, 내부 표지에 의한 DNA 중합효소 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성에 의해, 내부 표지는 5‘-말단으로부터 이격된 어떠한 위치에도 올 수 있다. 바람직하게는, 내부 표지는 퀀칭 효율을 최대화할 수 있는 위치에 있다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 제1표지와 제2표지는 표지된 뉴클레오타이드 사이에 DNA 중합효소의 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성이 작용하여 절단반응이 발생할 수 있도록 떨어져 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2표지는 절단 반응에 의하여 절단되는 부위 (site) 에 의하여 제1표지로부터 분리되어 있다.
바람직하게는 제2표지는 제1표지로부터 2 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 3 뉴클레오타이드 이상, 보다 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드 이상 떨어진 뉴클레오타이드에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 제1표지로부터 2-25 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2-20 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 2-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다. 택일적으로, 제2표지는 제1표지로부터 3-25 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-20 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 3-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 제2표지는 상기 절단 과정에서 절단된 프로브가 타겟 핵산 서열에서 해리됨으로써 더 이상 절단되지 않는 부위에는 위치하지 않는다. 해리에 의하여 절단되지 않는 비절단부위는 반응조건, 프로브의 서열 등에 의존적이며, 상기 조건에 따라 제2표지의 위치가 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2표지는 프로브의 3’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 15 뉴클레오타이드 이상, 보다 더 바람직하게는 20 뉴클레오타이드 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 25 뉴클레오타이드 이상 떨어진 뉴클레오타이드에 위치한다.
본 발명의 검출 대상인 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함한다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다. 타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.
타겟 핵산서열을 프로브 또는 프라이머에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명에서, 예를 들어, 고정화 프로브의 혼성화 온도는 40-80℃, 45-75℃ 또는 50-72℃이다.
혼성화 반응에 이어, 혼성화 반응 결과물을 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소와 접촉시킨다. 고정화 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화된 경우에만 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되어 고정화 프로브로부터 제1표지가 해리되며, 이에 고상 기질 상의 고정화 프로브 상의 시그널 변화를 야기한다(참조: 도 1). 이러한 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 명세서 용어 “고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건”은 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소에 의해 고정화 프로브의 절단이 발생되는 데 유리한 반응 조건, 예컨대 온도, pH, ionic strength 및 완충액 조건 뿐만 아니라, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 사용되는 효소 등을 포함하는 의미이다. 예를 들어, 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, “고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건”은 Tris-HCl 완충액(pH 8.3), KCl, MgCl2 및 55℃ 온도를 포함한다.
본 발명에서 이용하는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소는 이중 가닥을 형성하는 프로브에 작용하여 5' to 3' 방향으로 exonuclolytic 반응을 수행하며, 단일 가닥의 핵산은 절단하지 않는 효소이다.
본 발명에서 이용 가능한 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소(e.g., E. coli DNA polymerase I, a thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase)는, 바람직하게는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소이고, 예컨대 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus, Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus, Thermus species Z05 and Thermus species sps 17 로부터 수득되는 열안정성 DNA 중합효소이다.
5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소에 의해 타겟 핵산서열에 혼성화된 고정화 프로브가 절단되고 이에 의해 고정화 프로브로부터 상기 제1표지가 해리되어 고상 기질 상의 고정화 프로브 상의 시그널 변화를 야기한다.
DNA 중합효소에 의한 exonucleolytic 반응 후, 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의한 exonucleolytic 반응이 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드에서 종결된다. 상기 exonucleolytic 반응의 종결은 상기 제2표지가 결합된 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 이루어지며, 결국 제2표지는 exonucleolytic 반응 후 상기 고상 기질 상에 잔류하게 된다.
종결 반응 후, 고상 기질 상에서 시그널 변화 (증가 또는 감소)를 검출하며, 고정화 프로브의 절단에 의한 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
시그널은 당업계의 통상적인 방법, 예컨대 형광측정기(예컨대, 형광 표지를 이용하는 경우)를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 결국, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 변화가 고상에서 검출된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브의 절단에 의한 시그널 변화는 고상 기질 상의 시그널 증가이다.
본 발명의 반응 환경을 제공하는 고상 기질, 바람직하게는 마이크로어레이는 당업계에서 이용되는 어떠한 마이크로어레이도 포함한다. 본 발명의 모든 과정, 즉 타겟 서열과의 혼성화, 절단반응 및 형광의 검출은 마이크로어레이 상에서 이루어진다. 마이크로어레이에서 표지 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상의 기질(solid substrate)은, 예를 들어 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 복수의 프로브는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 복수의 어드레서블 부위에 고정화 되며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 고상 기질에 고정화된 프로브는 물리적으로 분리 되어 있기 때문에, 한 종류의 이중표지 페어를 이용하여 다수의 타겟 핵산을 동시에 검출하는 것이 가능하므로 고상에서 수행되는 본 발명 기술을 이용하면, 검출 가능한 타겟 핵산 가지 수가 제한되지 않는다. 이 특징에 의해, 프로브가 고정된 특정 어드레서블 부위에서 시그널을 안정되게 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 단계(바람직하게는 최소 2회, 보다 바람직하게는 최소 5회, 보다 더 바람직하게는 최소 10회)를 추가적으로 포함한다.
상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 경우, 바람직하게는 타겟 핵산서열의 이중가닥을 단일가닥으로 변성하는 과정을 포함한다. 선택적으로, 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 경우, 반복 사이클 사이에 시그널 검출 과정 및 변성 과정을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 반복 단계에서 특정 프로브가 (a)-(b) 과정 후 단계 (c)에 도달하기 전에 변성되고, 반복 단계에서 다시 타겟 핵산 서열에 혼성화되면 추가적인 절단이 발생할 수 있으며, 반복 과정에서 최종적으로 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드에 도달하게 되는 경우 단계 (c)에 의하여 절단 반응이 종결된다.
단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하면 타겟 핵산서열의 양에 의존적으로 시그널 변화 정도가 증가하게 되며, 이러한 시그널 변화 및 변화율 등을 이용하여 타겟 핵산서열의 정량도 할 수 있다. 이러한 cyclic exonucleolytic reaction을 실시하는 경우, 단계 (d)의 검출은 실시간 방식, 엔드-포인트 방식 또는 지정된 시간 간격 방식으로 실시할 수 있다. 실시간 방식의 검출은 특히 타겟 핵산서열의 정량에 적합하다.
본 발명의 이점 중 하나는 상호작용적인 이중 표지를 사용하는 경우 시그널 검출 전에 반응 결과물을 세척하지 않아도 고상 기질 상에서 실시간으로 시그널 변화를 검출할 수 있다는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시된다. 정화 프로브만을 이용한 반응보다는 고정화 프로브와 역방향 프라이머를 동시에 이용하고 역방향 프라이머에 의한 연장반응이 발생되면, 고정화 프로브가 결합할 단일가닥의 타겟 핵산서열이 보다 많이 확보되며 결국 최종적인 시그널 변화가 더욱 명확하게 나온다.
예를 들어, 2 종류 이상의 증폭 프라이머로 멀티플렉스 증폭된 타겟 핵산서열들을 2 종류 이상의 고정화 프로브가 고정화된 마이크로어레이에 적용하고 이어, 2 종류 이상의 역방향 프라이머 및 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소로 연장반응을 진행시키고 절단반응을 실시하면 역방향 프라이머를 사용하지 않는 경우보다 증가된 시그널 변화를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 고정화 프로브는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖고 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 해주는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)이다:
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단에 있고, 상기 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 TD 프로브의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고; 상기 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위 및 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5‘-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단이 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되어 TD 프로브로부터 제1표지가 해리되어 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하며, 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 단일가닥을 형성하여 상기 5‘-제2차 혼성화 부위는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되지 않으며 이에 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하지 않으며; 이에 의해 TD 프로브는 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 용어 “타겟 구별성 프로브(target discriminative probe)"는 상술한 mDSO 구조를 가지며 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열에 서로 다른 패턴으로 혼성화 되어 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 하는 프로브를 의미한다.
변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(변형 DSO: mDSO) 구조를 갖는 본 발명의 타겟 구별성 프로브는 (i) 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 타겟 및 비-타겟 핵산서열의 구별에 결정적인 역할을 하는 5’-제2차 혼성화 부위와 분할부위를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “변형 DSO 구조”는 DSO(dual specificity oligonucleotide) 구조에서 유래된다. 이 DSO 구조는 본 발명자들에 의해 처음 제시된 것으로서(WO 2006/095981), 이 DSO 구조가 프라이머 역할을 하는 경우에는 dual priming oligonucleotide (DPO)로 명명된다(Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6 e40(2007)). DSO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5'-고 Tm 특이성 부위(또는 5'-제1차 혼성화 부위) 및 3'-저 Tm 특이성 부위(또는 3'-제2차 혼성화 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 매우 놀라운 특이성을 나타낸다(see WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim, et . al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii et . al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, DSO는 서로 다른 어닐링 특성을 가지는 두 개의 프로브 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5'-제1차 혼성화 부위; 및 타겟-특이적 연장반응을 결정하는 3'-제2차 혼성화 부위. 이 DSO는 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.
변형 DSO 구조는 상기 DSO 구조의 5'-제1차 혼성화 부위 및 3'-제2차 혼성화 부위가 서로 역전된 것으로서, 변형 DSO 구조에서 초기의 안정된 혼성화는 3'-제1차 혼성화 부위가 담당하고 추가적인 타겟-특이성의 결정은 5'-제2차 혼성화 부위가 담당하게 된다. 5'-제2차 혼성화 부위가 완전하게 타겟 서열에 혼성화 되는 경우에만, 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 프로브의 5'-말단 부위가 절단되기 시작하며, 이는 5'-제2차 프라이밍 부위가 타겟-특이성을 더욱 증가시키는 역할을 담당할 수 있도록 한다.
본 발명에 따르면, TD 프로브를 사용하면 프로브를 기반으로 한 타겟 핵산서열의 검출 특히, 다수의 프로브를 동시에 이용하는 타겟 핵산 서열 검출 시에 발생할 수 있는 위양성 문제를 현저하게 개선할 수 있다.
본 발명에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서 false signals 없이 실시할 수 있는 이유 중 하나는 타겟 구별성 프로브가 가지고 있는 mDSO 구조에 의한 혼성화 특이성이다.
mDSO 구조를 가지는 타겟 구별성 프로브는 타겟 핵산과 비-타겟 핵산에 혼성화 되는 경우 서로 다른 패턴으로 혼성화 된다. 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산에 혼성화 되는 경우에는 프로브 전체 서열에 걸쳐 타겟 핵산과 이중가닥을 형성하지만, 타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화(비-특이적 결합) 되는 경우에는 3’-제1차 혼성화 부위를 통하여 우세적으로 혼성화 되며 5’-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 그의 낮은 Tm 값 때문에 비-타겟 핵산에 혼성화 되지 못하고 단일가닥을 형성하게 된다.
결국, 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우에는 타겟 구별성 프로브의 5’-말단으로부터 절단반응이 발생되어 고정화 프로브의 5’-말단에 결합된 제1표지 예컨대 퀀처분자가 해리되어 시그널 변화가 발생하며, 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하여, 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우에는 타겟 구별성 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위와 분할 부위가 단일가닥을 형성하게 되며 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성은 5’-말단 부위가 단일가닥으로 되어 있어 타겟 구별성 프로브를 절단하지 못한다. 프로브의 절단반응이 발생하지 않으며 결국 시그널 변화가 발생하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 타겟 구별성 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위에 존재하며, 상기 제2표지는 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우에도 절단되지 않고 상기 고상 기질 상에 잔류한다.
상술한 바와 같이, mDSO 구조를 가지는 타겟 구별성 프로브의 intriguing design에 의해 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 본 발명에서 완벽하게 구별하여 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
상기 분할부위는 최소한 3개 이상, 보다 바람직하게는 최소한 4개 이상, 가장 바람직하게는 최소한 5개 이상의 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 분할부위는 3-10, 3-8, 4-7 또는 4-5 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 분할부위는 연속된 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 3'-제1차 혼성화 부위의 길이는 5'-제2차 혼성화 부위보다 길다.
상기 3'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는 15-60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-40 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최소한 3 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 5 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 6 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 한편, 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최대한 15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 12 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 3-15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4-12 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-11 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
5'-제2차 혼성화 부위 및 분할 부위는 최소한 6, 보다 바람직하게는 최소한 9, 보다 더 바람직하게는 최소한 12, 가장 바람직하게는 최소한 15 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-70℃의 Tm을 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 6-40℃의 Tm, 보다 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는 2-15℃의 Tm, 보다 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위에 위치한다. 보다 바람직하게는, 5’-제2차 혼성화 부위에 결합된 제2표지는 5’-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단에 있는 제1표지로부터 2-15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2-10 뉴클레오타이드 이격되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적용되는 타겟 핵산 서열은 증폭용 프라이머에 의해 전-증폭된 핵산서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 역방향 프라이머 또는 증폭용 프라이머는 하기 일반식 II의 구조를 가지는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO)이다:
5’-Xp-Yq-Zr-3’ (II)
상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열에 대한 혼성화 서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열에 대한 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
DPO의 상세한 설명은 상술한 mDSO 구조를 인용하여 설명될 수 있다.
바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 발명은 멀티플렉스 검출에도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2종의 핵산서열을 포함하고, 상기 고정화 프로브는 최소 2종의 프로브를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2종의 핵산서열을 포함하고, 상기 고정화 프로브는 최소 2종의 프로브를 포함하며, 상기 역방향 프라이머는 최소 2종의 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 유전자 분석(genetic analysis)에서도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 서열이다.
본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 의미한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서 뉴클레오타이드 변이의 검출은, 지노타이핑 또는 대립유전자형의 검출로 표현될 수 있다.
뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입 및 트랜스로케이션 등 모든 변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예 따르면, 고정화 프로브는 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 또는 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이가 포함된 타겟 핵산서열을 검출하는 경우, 바람직하게는 단계 (a)에서 사용되는 타겟 핵산서열은 전-증폭된 타겟 핵산서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출을 위한 키트를 제공한다:
(a) 고상 기질;
(b) 3’-말단을 통하여 고상 기질에 고정화 되어 있고 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 표지 고정화 프로브로서, 상기 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5‘-말단에 있고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고; 그리고,
(c) 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소.
본 발명의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1표지는 리포터 분자이고 상기 제2표지는 퀀처 분자이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1표지는 퀀처 분자이고 상기 제2표지는 리포터 분자이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2표지는 제1표지로부터 3-25 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다. 보다 바람직하게는, 상기 제2표지는 제1표지로부터 3-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2표지는 타이미딘 뉴클레오타이드의 타이민 염기에 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 상기 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브는 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖고 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 해주는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 타겟 핵산 서열 증폭용 프라이머 세트를 포함하며 상기 키트에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열은 전-증폭된 핵산서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 고정화 프로브는 최소 두 종의 프로브이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 염기에 표지된 뉴클레오타이드는 DNA 중합효소의 5’to 3' exonuclease 활성에 대하여 저항성을 갖는 특성을 고상에 고정된 이중 표지 프로브에 적용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이다. 고상에 고정화되고 5' 말단 및 내부 뉴클레오타이드의 염기에 각각 표지를 갖는 프로브가 타겟 핵산 서열에 혼성화되는 경우, DNA 중합효소의 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 의하여 프로브가 절단되면서 5’말단의 표지는 해리되지만, 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합된 표지는 표지된 뉴클레오타이드의 저항성으로 인하여 고상에 잔류하게 되어 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
(b) 본 발명은 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 저항성에 의하여 고상에 표지가 잔류하게 되므로, 절단과정에서 표지가 고상에 잔류하도록 반응조건 등을 고려하여 표지가 결합되는 뉴클레오타이드의 위치를 조절할 필요가 없다. 반면에, 프라이머에 의존적인 DNA 중합효소의 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 TaqMan probe 방법을 고상에서 실시하는 경우에는, 고상에 하나의 표지를 잔류시키기 위하여 반응조건을 면밀히 고려하여 표지의 결합 위치를 조절하여야 한다.
(c) 본 발명은 내부 표지의 결합위치를 자유로이 결정할 수 있으므로, 이중 표지간의 퀀칭 효율을 최대화할 수 있도록 표지의 위치를 조절하여 background signal을 최소화할 수 있다.
(d) 본 발명에서 사용되는 프로브는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 mDSO 형태를 가질 수 있으며, 이와 같은 형태의 프로브 (TD 프로브)는 통상적인 형태의 프로브가 비타겟 핵산 서열과 혼성화되어 발생될 수 있는 위양성 (false positive) 시그널 발생을 획기적으로 제거할 수 있다.
(e) 본 발명은 상호작용적인 이중 표지 프로브를 사용하므로 solid substrate에서의 시그널의 변화 (감소 또는 증가)를 end point에서 뿐만 아니라, 실시간으로 측정할 수 있으며, 이를 통하여 타겟 핵산 서열의 정성 분석 뿐만 아니라 정량 분석을 수행할 수 있다.
(f) 본 발명은 프로브 및 타겟 핵산 서열의 혼성화 여부에만 의존하지 않고 추가적인 enzymatic reaction (DNA 중합효소의 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성)에 의하여 시그널 변화를 발생시키므로 이중적으로 특이도가 적용되어 비특이적 혼성화에 의한 위양성 시그널 문제를 개선한다. 또한, 변성 및 혼성화 반응의 반복 과정을 통하여 고정된 프로브 모두가 시그널 변화를 발생시키도록 함으로써 시그널 변화를 최대화 할 수 있다.
(e) 본 발명은 TaqMan probe 방법과 같이 추가적인 프라이머의 사용 없이, 고정화된 프로브만을 사용하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 따라서, 다수 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정이나 최적 반응 조건 결정 등에서의 곤란성 및 비용 등 다수 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 검출 방법에서 나타나는 문제점은 본 발명에 의하여 해소 될 수 있다. 한편, 이와 같은 이점은 멀티플렉스 타겟 핵산 검출에서 보다 명확하게 인식될 수 있다.
(h) 고상에서는 프로브의 위치가 물리적으로 분리되어 있으므로 한 종류의 표지 분자를 사용하여도 다수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명을 개념적으로 보여주는 모식도이다. 퀀처 분자가 고정화 프로브의 5‘-말단에 결합되어 있고 리포터 분자가 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합되어 있다. 이중표지 고정화 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우 그의 5‘-말단은 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소에 의해 절단되어 제1표지(퀀처 분자)가 해리된다. 제2표지(리포터 분자)가 결합되어 있는 뉴클레오타이드는 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 가지고 있어 최종적으로 고상 기질 상에 잔존하며, 이로부터 시그널이 발생하게 된다.
도 2는 주형으로서 Staphylococcus aureus 유전자를 이용하여 본 발명에 따라 고상에서 연쇄 절단반응을 실시한 결과로서, 뉴클레오타이드의 염기에 결합된 표지가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 가지는 지 여부를 규명한 결과이다. 사용된 고정화 프로브의 5‘-말단 부위에 형광성 리포터 분자가 있고 3’-말단에 퀀처 분자가 있다. 표의 프로브 명칭에서 숫자는 프로브의 형광성 리포터 분자가 결합되는 뉴클레오타이드의 위치를 나타낸다. “(dT)"는 형광성 리포터 분자가 뉴클레오타이드의 타이민에 표지된 것을 나타낸다. 예를 들어, SA_Con_M4(dT)는 5’-말단에서 4 번째 뉴클레오타이드의 타이민에 표지가 된 것을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 주형 (template) 및 이중 표지 프로브의 준비
염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드가 DNA 중합 효소의 5' to 3' exonuclease 활성에 대하여 저항성을 가지는 것을 확인하고 이와 같은 특성을 고상에 고정된 이중 표지 프로브에 적용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 구현하기 위하여 표 1과 같이 주형 및 이중 표지 프로브를 제조한다.
Staphylococcus aureus gene의 합성 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 1)를 주형으로 사용하였다. 액상 실험에서 사용되는 이중-표지 프로브 (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7)는 5’-말단 부위에 형광 리포터 분자 (FAM)를 표지하였으며, 퀀처 분자 (BHQ-1)를 3’-말단에 표지하였다. 5’-말단의 표지는 phosphate group에 결합 (SEQ ID NO: 2)되거나 염기에 결합되었으며(SEQ ID NO: 3), 5’-말단에서 2 번째 염기 (SEQ ID NO: 4), 4 번째 염기 (SEQ ID NO: 5), 6 번째 염기 (SEQ ID NO: 6) 또는 9 번째 염기 (SEQ ID NO: 7)에 표지가 결합되었다.
고상에 고정화되는 이중-표지 프로브는 5’-말단의 phosphate group에 퀀처 분자 (BHQ-2)를 표지하였으며, 5’-말단에서 9 번째 염기 (SEQ ID NO: 8) 또는 23 번째 염기 (SEQ ID NO: 9)에 형광 리포터 분자 (Q570)를 표지하였다. 양성 컨트롤인 마커 프로브의 5’-말단은 Q570로 표지되었다. 고상 지지체에 고상용 프로브를 부착하기 위하여 프로브의 3’-말단은 (CH2)7-NH2으로 변형되었다.
명칭 타입 서열 (5' → 3') 서열번호
SA_T70 주형 GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA SEQ ID NO:1
SA_Con_M1 프로브 [FAM]TCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:2
SA_Con_M1(dT) 프로브 [T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:3
SA_Con_M2(dT) 프로브 G[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:4
SA_Con_M4(dT) 프로브 TGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:5
SA_Con_M6(dT) 프로브 CGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:6
SA_Con_M9(dT) 프로브 TTCCGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] SEQ ID NO:7
SA_Chip_Con_L 프로브 [BHQ-2][Sp9]CATTCCG[T(Q570)]GGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[Amino C7] SEQ ID NO:8
SA_Chip_Con_S 프로브 [BHQ-2][Sp9]TCAATCATTCGGTTTACGGCG[T(Q570)]TGTTACCTTTTT[Amino C7] SEQ ID NO:9
Marker 프로브 [Q570]ATATATATAT[AminoC7] SEQ ID NO:10
I: Deoxyinosine
BHQ: Black Hole Quencher
FAM: Carboxyfluorescein
Q570:Quasar 570
실시예 2: 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 DNA 중합 효소의 5' to 3' exonuclease 활성에 대한 저항성 평가
실시예 1에서 준비한 주형(SEQ ID NO: 1) 및 이중-표지된 프로브(SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7)를 이용하여, 염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드가 DNA 중합 효소의 5' to 3' exonuclease 활성에 대하여 저항성을 갖는 지 실험하였다. 5' to 3' exonuclease 활성을 갖는 DNA 중합효소로서 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
Cyclic Exonucleolytic Reaction (CER)
DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 5 pmole 프로브(SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7), 50 μM dNTP, 10 mM MgCl2, 0.5 mM MnSO4, 2 U의 5' to 3' exonuclease 활성을 가지는 Diastar Taq 중합효소 및 0.5 pmole의 주형 (SEQ ID NO: 1)을 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘CFX96 Real-time Cycler, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 실시간 연쇄절단반응을 수행한다. 실시간 연쇄절단반응은 시료를 95°C에서 2분간 반응시킨 후, 95°C에서 20초, 55°C에서 20초 반응과정을 50회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클의 혼성화와 절단반응 단계(55°C)에서 측정한다.
도 2에 따르면, 주형이 존재하는 경우, 5’-말단의 phosphate group에 6-FAM이 결합되어있는 프로브(SEQ ID NO: 2)는 사이클이 진행함에 따라 상당한 형광 변화를 보여주었으나, 5’-말단의 염기에 FAM이 결합되어 있는 프로브 (SEQ NO ID: 3)에서는 형광 변화가 현저히 줄어들었다. 한편, 5’-말단으로부터 2 번째 base, 4 번째 base, 6 번째 base 또는 9 번째 base에 FAM이 결합되어 있는 프로브 (SEQ ID NO: 4, 5, 6 or 7)는 거의 형광 변화를 보이지 않았다. 주형이 존재하지 않은 경우에 모든 프로브는 형광 변화를 보이지 않았다.
상기 결과는 염기에 표지된 뉴클레오타이드는 DNA polymerase의 5' to 3' exonuclease 활성에 대하여 저항성을 갖는 것을 보여준다.
실시예 3: 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 절단 저항성을 이용한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출
고정화된 이중 표지 프로브를 사용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 DNA polymerase의 5' to 3' exonuclease 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에 형광 표지를 잔류시킴으로써 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 실험하였다.
실시예 1에서 준비한 주형(SEQ ID NO: 1), 고정화 이중-표지 프로브(SEQ ID NO: 8 및 9) 그리고 마커 (SEQ ID NO: 10)를 이용하였다.
슬라이드에 이중-표지 프로브 고정
실시예 1에서 제조한 3’-말단이 아민기로 변형된 이중-표지 프로브(SEQ ID NOs: 8, 9 및 10)를 NHS로 활성화된 마이크로어레이 슬라이드(NSBPOSTECH)에 고정시켰다. 이중-표지 프로브를 스팟팅 완충용액 (NSB Spotting solution, NSBPOSTECH)을 이용하여 20 μM로 희석한 후 마이크로에레이 슬라이드에 스팟팅 하였다. 슬라이드는 2X SSPE (0.3 M sodium chloride, 0.02 M sodium hydrogen phosphate, 2.0 mM EDTA), pH 7.4, 7.0 mM SDS가 포함된 완충 용액(37℃) 에서 30분간 세척하여 사용 전까지 4°C에 보관하였다.
고상에서의 연쇄절단반응 ( Cyclic Exonucleolytic Reaction )
DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 50 μM dNTPs, 5 mM MgCl2, 2 U의 5’to 3’엑소뉴클레아제 활성을 가지는 Taq DNA 중합효소 및 10 pmole의 주형 (SEQ ID NO: 1)을 포함한 시료 30 ㎕를 프로브(SEQ ID NO: 8, 9, 10)가 부착되어있는 마이크로어레이 슬라이드에 가한 후 증발을 막기 위하여 커버슬립으로 덮었다. 반응은 슬라이드용 연쇄중합반응증폭기 (in situ Thermocycler, 제품명 ‘Genepro B4I, BIOER사 제품, 중국)를 이용하여 수행하였다. 연쇄절단반응(cyclic exonucleolytic reaction)은 시료를 95°C에서 2분간 반응시킨 후, 95°C에서 20초, 55°C에서 20초 반응과정을 50 cycle 진행한다. 형광의 탐지와 이미지 획득은 공초점 레이져 스캐너 Axon Genepix4100A (Molecular Device, US)를 이용하여 5μm 해상도로 스캔한다. 형광의 정량은 마이크로어레이어 소프트웨어 Genepix pro5.1 (Molecular Device, US)을 이용 하였다. 형광 강도는 spot median값에서 local background 시그널을 뺀 값으로 하였다.
마이크로어레이 이미지 결과에서, 주형이 존재하는 경우에 두 종류의 이중-표지 프로브에서 모두 (SEQ ID NO: 8, 9) spot의 형광이 증가하였다. 반면, 음성 컨트롤로써 주형이 없는 경우에서는 RFU 값의 변화가 없었다.
따라서, 고정화된 프로브 상에서 이중 표지간의 거리를 충분히 가깝게 표지하는 경우 (SEQ ID NO: 8)라도 염기에 표지된 뉴클레오타이드의 절단 활성에 대한 저항성으로 인하여 형광 리포터 표지가 해리되지 않고 고상에 잔류하며, 이를 통하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (32)

  1. 다음 단계를 포함하는 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 고정화 프로브에 혼성화 시키는 단계로서; 상기 고정화 프로브는 3’-말단을 통하여 고상 기질에 고정화 되어 있고 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5‘-말단에 있고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고;
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 상기 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소와 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 고정화 프로브는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소의 exonucleolytic 반응에 의해 절단되어 상기 고정화 프로브로부터 상기 제1표지가 해리되어 상기 고상 기질 상의 고정화 프로브 상의 시그널 변화를 야기하며;
    (c) 상기 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의한 exonucleolytic 반응이 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드에서 종결되는 단계로서; 상기 exonucleolytic 반응의 종결은 상기 제2표지가 결합된 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 이루어지며, 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 그리고
    (d) 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화를 검출하는 단계로서; 상기 고정화 프로브의 절단에 의한 상기 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 리포터 분자이고 상기 제2표지는 퀀처 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 퀀처 분자이고 상기 제2표지는 리포터 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 절단 반응에 의하여 절단되는 부위(site)에 의하여 제1표지로부터 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 제1표지로부터 2-20 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제2표지는 제1표지로부터 2-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 타이미딘 뉴클레오타이드의 타이민 염기에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복 사이클 사이에 변성 과정이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복 사이클 사이에 시그널 검출 과정 및 변성 과정이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 검출은 실시간 방식, 엔드-포인트 방식 또는 지정된 시간 간격 방식으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화 프로브는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖고 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 해주는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)인 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단에 있고, 상기 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 TD 프로브의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고; 상기 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위 및 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5‘-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단이 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되어 TD 프로브로부터 제1표지가 해리되어 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하며, 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 단일가닥을 형성하여 상기 5‘-제2차 혼성화 부위는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되지 않으며 이에 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하지 않으며; 이에 의해 TD 프로브는 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 제2표지는 5’-제2차 혼성화 부위에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 증폭용 프라이머에 의해 전-증폭된 핵산서열인 것을 특징으로 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 고정화 프로브는 최소 두 종의 프로브인 것을 특징으로 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 방법.
  19. 다음을 포함하는 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 선택적 검출을 위한 키트:
    (a) 고상 기질;
    (b) 3’-말단을 통하여 고상 기질에 고정화 되어 있고 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 표지 고정화 프로브로서, 상기 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5‘-말단에 있고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고; 그리고,
    (c) 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제1표지는 리포터 분자이고 상기 제2표지는 퀀처 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 제1표지는 퀀처 분자이고 상기 제2표지는 리포터 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 제2표지는 절단 반응에 의하여 절단되는 부위(site)에 의하여 제1표지로부터 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 제2표지는 제1표지로부터 2-20 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 제2표지는 제1표지로부터 2-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 19 항에 있어서, 상기 제2표지는 타이미딘 뉴클레오타이드의 타이민 염기에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 제 19 항에 있어서, 상기 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 중합효소는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 19 항에 있어서, 상기 키트는 상기 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  29. 제 19 항에 있어서, 상기 고정화 프로브는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖고 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 해주는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)인 것을 특징으로 하는 키트:
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 이중 표지로 표지되어 있고; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제1표지는 상기 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단에 있고, 상기 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택되는 제2표지는 상기 제1표지에 대하여 다운스트림에 위치하는 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되어 있으며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 TD 프로브의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고; 상기 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위 및 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5‘-제2차 혼성화 부위의 5‘-말단이 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되어 TD 프로브로부터 제1표지가 해리되어 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하며, 상기 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 타겟 구별성 프로브의 5‘-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 단일가닥을 형성하여 상기 5‘-제2차 혼성화 부위는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되지 않으며 이에 상기 고상 기질 상에 고정화된 TD 프로브에서 시그널 변화를 야기하지 않으며; 이에 의해 TD 프로브는 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
  30. 제 19 항에 있어서, 상기 키트는 타겟 핵산 서열 증폭용 프라이머 세트를 포함하며 상기 키트에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열은 전-증폭된 핵산서열인 것을 특징으로 키트.
  31. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 고정화 프로브는 최소 두 종의 프로브인 것을 특징으로 키트.
  32. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 키트.
KR1020100103599A 2010-10-22 2010-10-22 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 KR20120042100A (ko)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100103599A KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2010-10-22 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
EP11834650.1A EP2630262B1 (en) 2010-10-22 2011-10-20 Detection of target nucleic acid sequences using dual-labeled immobilized probes on solid phase
PCT/KR2011/007855 WO2012053850A2 (en) 2010-10-22 2011-10-20 Detection of target nucleic acid sequences using dual-labeled immobilized probes on solid phase
US13/880,199 US9885081B2 (en) 2010-10-22 2011-10-20 Detection of target nucleic acid sequences using dual-labeled immobilized probes on solid phase
KR1020137010497A KR101607662B1 (ko) 2010-10-22 2011-10-20 이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
CN201180050984.9A CN103228797B (zh) 2010-10-22 2011-10-20 利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测
JP2013534825A JP2013544079A (ja) 2010-10-22 2011-10-20 二重標識固定化プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列の検出
JP2016014466A JP6228242B2 (ja) 2010-10-22 2016-01-28 二重標識固定化プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列の検出

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100103599A KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2010-10-22 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120042100A true KR20120042100A (ko) 2012-05-03

Family

ID=45975754

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100103599A KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2010-10-22 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
KR1020137010497A KR101607662B1 (ko) 2010-10-22 2011-10-20 이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137010497A KR101607662B1 (ko) 2010-10-22 2011-10-20 이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9885081B2 (ko)
EP (1) EP2630262B1 (ko)
JP (2) JP2013544079A (ko)
KR (2) KR20120042100A (ko)
CN (1) CN103228797B (ko)
WO (1) WO2012053850A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
US8637436B2 (en) 2006-08-24 2014-01-28 California Institute Of Technology Integrated semiconductor bioarray
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
EP3118333B1 (en) 2006-12-13 2019-04-03 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of pcr in real time
EP2761032B1 (en) 2011-09-29 2017-07-19 Luminex Corporation Hydrolysis probes
US20170260576A1 (en) * 2012-02-24 2017-09-14 Seegene, Inc. Td probe and its uses
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
US9499861B1 (en) * 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
JP2022525322A (ja) 2019-03-14 2022-05-12 インシリクサ， インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
CA3151131A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Dots Technology Corp. Optimized nucleic acid probes for analyte detection
JP2023542408A (ja) * 2020-09-23 2023-10-06 マキュラ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド 核酸を検出する組み合わせ、方法及びキット

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9014A (en) * 1852-06-15 William compton
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US5231191A (en) 1987-12-24 1993-07-27 Applied Biosystems, Inc. Rhodamine phosphoramidite compounds
US5573907A (en) 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
EP0544824B1 (en) * 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
JP3019181B2 (ja) 1993-12-27 2000-03-13 日本電気株式会社 光ヘッドのサーボ信号検出装置
US6255083B1 (en) * 1998-12-14 2001-07-03 Li Cor Inc System and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis
US20040081959A9 (en) * 1999-12-08 2004-04-29 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US6727356B1 (en) * 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US20040076994A1 (en) * 2001-10-26 2004-04-22 Hidenobu Yaku Method of detecting target nucleic acid and nucleic acid probe
EP1485056B1 (en) * 2002-02-27 2011-04-06 Life Technologies Corporation Methods of using fet labeled oligonucleotides that include a'5' exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
US6818420B2 (en) * 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
JP4457001B2 (ja) * 2002-05-31 2010-04-28 セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法
AU2004235747B2 (en) * 2003-05-01 2009-05-28 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch
GB0324456D0 (en) * 2003-10-20 2003-11-19 Isis Innovation Parallel DNA sequencing methods
JP4190562B2 (ja) * 2004-12-08 2008-12-03 健 山本 遺伝子配列検査法
KR100977186B1 (ko) 2005-03-05 2010-08-23 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중특이성 올리고뉴클레오타이드
AU2005333512A1 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Nucleic acid detection method involving the direct generation of a measurable signal
JP2007105041A (ja) * 2005-10-13 2007-04-26 F Hoffmann La Roche Ag 多重固相核酸増幅アッセイ
US7915014B2 (en) * 2006-07-17 2011-03-29 Brandeis University Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection
US7902345B2 (en) * 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
CN101605909A (zh) * 2006-12-05 2009-12-16 塞昆纳姆股份有限公司 使用质谱法的生物分子检测和定量
WO2009023676A1 (en) 2007-08-12 2009-02-19 Integrated Dna Technologies, Inc. Microarray system with improved sequence specificity
WO2011027966A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
US8815509B2 (en) * 2011-06-14 2014-08-26 University Of Southern California Fluorescence-based assay for the rapid detection and quantification of deoxyribonucleoside triphosphates

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016119902A (ja) 2016-07-07
WO2012053850A2 (en) 2012-04-26
JP2013544079A (ja) 2013-12-12
EP2630262B1 (en) 2017-05-10
WO2012053850A3 (en) 2012-08-09
CN103228797A (zh) 2013-07-31
EP2630262A4 (en) 2014-05-14
US20130252827A1 (en) 2013-09-26
JP6228242B2 (ja) 2017-11-08
US9885081B2 (en) 2018-02-06
EP2630262A2 (en) 2013-08-28
CN103228797B (zh) 2018-03-20
KR20130094324A (ko) 2013-08-23
KR101607662B1 (ko) 2016-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20120042100A (ko) 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
KR101462192B1 (ko) Ｐｔｏ 절단 및 연장 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR101832867B1 (ko) Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
KR101569476B1 (ko) Ｔｓｇ프라이머 타겟 검출
JP6099684B2 (ja) 反復的エキソ核酸切断反応によるターゲット核酸配列の検出
JP6529934B2 (ja) Ｐｏ切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出
KR20120046780A (ko) Ｔｄ프로브 및 그의 용도
KR20110050327A (ko) Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
EP2619317B1 (en) Detection of target nucleic acid sequences by exonucleolytic activity using single-labeled immobilized probes on solid phase
KR20120081482A (ko) 태그 프로브 절단 및 연장에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR20110048734A (ko) 5―미스매치 프로브 타겟 검출
RU2588457C2 (ru) Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации