CN103228797B - 利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用双重标记固定化探针及该双重标记固定化探针对于DNA聚合物的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，在固相检测靶核酸序列的新颖方法。本发明中，由于通过内部核苷酸碱基成分的标记引发的对于核酸酶的抵抗性，使标记残留在固相基质上，因此，无需考虑在固相基质上使标记残留的适合的位点。本发明由于能够自由决定探针上的内部标记的位点，因此，将标记位于使探针上的双重标记系统的猝灭效率最大化的适合的位点，从而使本底信号最小化。

Description

利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测
【技术领域】
本发明涉及利用双重标记固定化探针及该双重标记固定化探针对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，在固相中检测靶核酸序列的新颖方法。
【背景技术】
基于DNA的微陈列技术作为能够对基因或基因簇的存在、水平或表达模式进行分析的有前途的技术备受瞩目（Schena et al.，1995.Quantitative Monitoring of GeneExpression Patterns with a Complementary DNA Microarray，Science，270：467-470；DeRisi et al.，1996，Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene ExpressionPatterns in Human Cancer，Nature Genetics14：457-460）。
现有的DNA微陈列一般来说是将已标记的靶序列与固定于固相基质的探针进行杂交，来对标记中的信号进行检测，从而检测靶序列。但是，向靶序列直接进行标记在费用及时间方面不具有有效性，并且，对靶序列的水平（level）产生影响的可能性高。
为了克服此类现有的微陈列技术的问题，提出了代替利用标记的靶序列的分子信标探针（molecular beacon probe）（Steemers et al.，Nat Biotechnol，18：91-94(2000)；Kim et al.，Biosensors Bioelectronics，22：1041-1047（2007））。利用荧光共振能量转移（FRET，fluorescence resonance energy transfer）现象的分子信标探针技术只在上述探针与靶序列进行杂交的情况下提供荧光信号，因此，能够对靶序列以实时方式进行检测。
但是，大大依赖与靶序列的杂交的很多方法由于交叉反应（cross reactions），在假阳性数据产生严重的问题，因此，存在需要改善最终杂交信号的可靠性的问题。
在利用固定化的双重标记探针的杂交过程之外，利用追加性的外切核酸酶反应的几个接近法，提出了例如，固相中的TaqMan（拖慢）探针法（Liu et al.，Nucleic AcidRes.34：e4（2006））。Liu等在固相基质上利用固定化的双重标记探针，并在探针的5’-末端与猝灭分子相连接，在3’-末端与荧光报道分子相连接。上述探针在上游引物的延长过程中，被DNA聚合酶的5’→3’核酸酶活性切割。在进行切割反应后，猝灭分子会分离，而荧光报道分子残留于固相基质，对固相基质中生成的荧光信号进行检测，从而最终对靶序列进行检测。不仅仅是杂交，利用引物依赖性5’→3’核酸酶活性的TaqMan探针陈列方法在提高固相中的靶特异性的同时，还能以实时方式检测靶序列。
但是，TaqMan探针陈列方法中的DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’核酸酶活性连荧光报道分子标记的核苷酸也能切割，因此，在固相基质无法残留荧光报道分子。为了克服此类问题，设计双重标记探针使荧光报道分子位于不被DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’核酸酶活性切割的非切割部位。由于在切割反应期间被切割而缩短的探针由靶核酸序列得到改性，因此可决定探针上的非切割部位。为了这种目的，将荧光报道分子位于3’-末端。
因此，TaqMan探针的陈列方法中，猝灭分子和荧光报道分子之间的距离逐渐变大。探针上的双重标记的距离越远，双重标记系统的猝灭效率会降低。较低的猝灭效率根据位点产生相互不同的本底信号，最终表示错误的结果。
而且，由于TaqMan探针陈列方法利用DNA聚合酶的引物-依赖性5’→3’核酸酶活性，因此，需要上游引物。这种对追加的寡核苷酸（上游引物）的使用相关的限制很难定立用于多重靶检测的微陈列上的反应条件，并且，这会成为产生假阳性结果的因素之一。
另一方面，WO2008/011004公开一种利用DNA聚合酶的引物独立性切割活性的线性指数聚合酶链式反应（LATE-PCR，Linear-After-The-Exponential PCR）中的靶检测方法。利用DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’核酸酶活性的基于TaqMan探针的方法，与该方法不同，WO2008/011004中的DNA聚合酶的引物独立性5’→3’核酸酶活性并不需要引物的帮助。而且，WO2008/011004公开通过3个以上的亚甲基（CH2）的标记和探针的5’-末端之间的结合，使探针被DNA聚合酶的引物独立性5’→3’核酸酶活性更加有效的切割，相反，未利用亚甲基（CH2）链的标记和探针的5’-末端的结合，使探针对DNA聚合酶的引物独立性5’→3’核酸酶活性具有抵抗性。
在没有引物的帮助下，利用对于通过探针的改性得以调节的DNA聚合酶的引物独立性5’→3’核酸酶活性的敏感度或抵抗性的反应能够通过追加性的研究及开发，适用于固相中的靶检测。
在本发明所属技术领域中，出现了对于新的DNA微陈列技术研发的要求，该新的DNA微陈列技术能够克服与现有的DNA的微陈列方法相关的问题，并且在一个DNA微陈列上，能更加便捷并具有可靠性及再现性地检测靶序列，优选为多个靶序列。而且，在靶核酸序列的定量分析领域中还需要以实时方式在固相中实施反应，并对信号进行检测的新的实时微陈列方法。
在本说明书全文中参照多篇专利及文献，并用括号来表示其引用部分。这样的专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此，能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
【发明内容】
在此情况下，本发明者精心研究、努力研发一种新的靶检测技术，上述技术利用具有相互作用性双重标记的探针，以更加便捷的方式，在没有假阳性及假阴性结果的情况下，对靶核酸序列进行检测、识别及定量。本发明者对双重标记探针上的标记的结合位点及模式进行多种调节。有趣的是，本发明者发现了DNA聚合酶对引物独立性5’→3’核酸酶活性的碱基标记核苷酸抵抗性，并且，发现了一种能够有效适用于靶核酸序列检测的双重标记探针上的标记的结合位点及模式，这在双重标记中，第一标记与探针的5’-末端相结合，第二标记与位于第一标记的下游的核苷酸碱基相结合。本发明的独特的标记方式诱导探针使其根据靶核酸序列的存在与否来产生信号（包括信号的产生、增加及减少），而且对DNA聚合酶的5’→3’核酸酶活性具有抵抗性。
本发明的内部阻断双重标记探针（internally blocked dual-labeled probe）可自由决定内部标记（即，第二标记）的位点，并且，在没有假阳性及假阴性数据的情况下，能够有再现性地从固相基质上最终残留的标记中获得信号。本发明者判断，本发明利用探针在固相基质上对靶核酸序列进行检测时，提供最优化的实验方案。
因此，本发明的目的在于，提供一种在固相利用对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，检测靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供一种在固相利用对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，从DNA或核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供一种将对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性赋予给寡核苷酸的方法。
本发明的其他目的及优点通过以下实施例及权利要求书变得更加明确。
【附图说明】
图1表示本发明的过程。
图2-图4表示通过探针的核苷酸碱基成分和标记的结合来赋予的，对一部分DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性结果。图2-图4分别利用Taq、Tth及TflDNA聚合酶。
图5表示利用对于微陈列上的双重标记探针及DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性的靶核酸序列的检测结果。利用具有现有结构的双重标记探针。
图6表示利用对于微陈列上的双重标记探针及DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性的靶核酸序列的检测结果。利用具有改性双重特异性寡核苷酸（mDSO，modifieddual specificity oligonucleotide）结构的双重标记探针。
【实施方式】
本发明涉及一种靶检测方法，上述方法利用通过将探针寡核苷酸的核苷酸的碱基上结合有标记而被赋予的，对DNA聚合酶的引物独立性5’→3’外切核酸酶活性独特的抵抗性。
根据本发明的一实施方式，本发明涉及一种在固相利用对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性的双重标记探针，从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（a），将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针包括与上述靶核酸序列互补的核苷酸序列；通过3’-末端在固相基质上进行固定化的上述探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述固定化探针的5’-末端相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的核苷酸碱基相结合，这种上述第二标记的结合使上述核苷酸对上述DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性；
步骤（b），在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接触；与上述靶核酸序列互补的上述固定化探针通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，使得上述第一标记从上述固定化探针分离，来引起在上述固相基质上实现的信号变化；
步骤（c），在标有上述第二标记的上述核苷酸中结束上述DNA聚合酶的上述外切核酸切割反应；上述外切核酸切割反应的结束被具有与上述第二标记相结合的碱基的上述核苷酸的抵抗性诱导，上述第二标记残留于上述固相基质上；以及
步骤（d），对上述固相基质上的信号变化进行检测；通过上述固定化探针的上述切割而引起的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
本发明者精心研究、努力研发一种新的靶检测技术，上述技术利用具有相互作用性双重标记的探针，在固相以更加便捷的方式，在没有假阳性及假阴性结果的情况下，对靶核酸序列进行检测、识别及定量。本发明者对双重标记探针上的标记的结合位点及模式进行多种调节。有趣的是，本发明者发现了DNA聚合酶对引物独立性5’→3’核酸酶活性的碱基标记核苷酸抵抗性，并且，发现了一种能够有效适用于靶核酸序列检测的双重标记探针上的标记的结合位点及模式，这在双重标记中，第一标记与探针的5’-末端相结合，第二标记与位于第一标记的下游的核苷酸碱基相结合。
本发明的独特的标记方式引起探针根据靶核酸序列的存在与否来产生信号（包括信号的生成、增加及减少），而且，对DNA聚合酶的5’→3’核酸酶活性具有抵抗性。
本发明的内部阻断双重标记探针（internally blocked dual-labeled probe）可自由决定内部标记（即，第二标记）的位点，并且，在没有假阳性及假阴性数据的情况下，能够有再现性地从固相基质上最终残留的标记中获得信号。本发明者判断，本发明利用探针在固相基质上对靶核酸序列进行检测时，提供最优化的实验方案。
本发明者精心研究、努力研发对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的调节，有趣的是，发现了碱基与标记相结合的核苷酸对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性。
基于这些发现，本发明者定立了一种新的接近法，上述接近法将对于DNA聚合酶的引物独立性5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性赋予给寡核苷酸。
并且，本发明者将这些发现适用于固定化的双重标记探针，来定立了一种新的靶检测方法，上述方法在不会受到标记位点的限制的情况下，在固相中利用双重标记探针。在本发明者知晓的限度内，此类接近法由本发明者首次提出，这有助于更有效而正确地检测靶核酸序列。
在利用双重标记探针的切割反应的现有的固相方法中，靶核酸序列只能在切割反应中与探针上的内部核苷酸相结合的标记残留于固相基质上的情况下进行检测。利用DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’核酸酶活性的基于TaqMan（拖慢）探针的方法而言，在切割反应中逐渐缩短的探针根据探针序列及反应条件由靶核酸序列得到改性（denaturation），有可能致使非切割部位形成在探针上。因此，标记位于探针上的非切割部位的情况下，标记可最终残留于固相基质上。但是，此类方法还存在一种严重的问题，即，为了使与探针上的内部核苷酸相结合的标记位于非切割部位上，需要考虑反应条件。由于受到此类限制，需要以双重标记隔开的相当远的方式设计双重标记探针。探针上的双重标记的距离越远，双重标记系统的猝灭效率越低。较低的猝灭效率根据位点，会引起相互不同的本底信号的产生，最终表示错误结果。
本发明克服上述的现有方法的问题，并利用双重标记探针在固相中检测靶核酸序列。根据本发明，探针的内部核苷酸碱基和标记的结合使内部核苷酸对DNA聚合酶的引物独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性。在固相基质上进行固定化的探针会进行DNA聚合酶的切割反应，并且，与内部核苷酸的碱基相结合的标记因抵抗性而会残留于固相基质上。与利用DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’外切核酸酶活性的基于TaqMan探针的方法不同，本发明无需根据反应条件来考虑非切割部位，能够自由决定探针上的内部标记的位点，并将标记位于适合对探针上的双重标记系统的猝灭效率进行最大化的位点（site），从而使本底信号最小化。
优选地，用于本发明的固定化探针通过固相基质上的其3’-末端进行固定化。相互作用性双重标记中的一个通过碳间隔区与除了位于固定化探针的5’-末端的碱基以外的核苷酸结构相结合，而另一个与内部核苷酸碱基相结合。根据本发明，与靶核酸序列进行杂交的固定化探针通过DNA聚合酶的引物独立性5’→3’外切核酸酶活性，从固定化探针的5’-末端向5’→3’方向逐渐被切割，来分离5’-末端的第一标记。上述酶与碱基成分上标记的内部核苷酸接触时，因其抵抗性而使切割反应结束，并将内部核苷酸标记最终残留于固相基质。
一般来说，DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性分为上游核苷酸依赖性活性及上游寡核苷酸独立性活性。上游寡核苷酸包含引物、引物的延长产物及位于切割的寡核苷酸的上游的探针。本发明由于利用上游寡核苷酸独立性活性，因此，本说明书中所使用的术语“DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性”只要没有特别的说明，就意味着DNA聚合酶的上游寡核苷酸独立性5’→3’外切核酸酶活性。
对本发明的详细说明如下。
根据本发明，靶核酸序列与在固相基质上进行固定化的双重标记探针进行杂交。
本说明书所使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，并在杂交、退火或扩增条件下，与探针或引物进行退火或杂交。
本说明书中使用的术语“探针（probe）”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或者包含这些部位的单链核酸分子。优选地，探针是单链脱氧核苷酸分子。并且，探针可包含核糖核酸。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链（模板）互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶一样的聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。优选地，引物在扩增中作为具有最大有效性的单链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。
在本发明中所利用的探针或者引物可包含自然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷（dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、脱氧鸟苷酸（dGMP）、脱氧胞苷酸（dCMP）及脱氧胸苷酸（dTMP））、改性核苷酸或者非自然核苷酸。改性核苷酸或者非自然核苷酸可包含非自然碱基。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于多个因素，例如，温度，应用领域及引物的根源（source）。在本说明书中使用的术语“退火”或者“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而形成模板核酸或者与该模板核酸的一部分互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。杂交在两个核酸链之间完全互补时（perfect match）产生，或存在部分错配的（mismatch）碱基也会产生杂交。杂交所需的互补程度可随着杂交条件而不同，尤其可以根据温度进行调节。
在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
在本发明中使用的固定化探针具有与靶核酸序列互补的核苷酸序列。术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括“实质上互补的（substantially complementary）”及“完全互补的（perfectly complementary）”的意思，优选地，意味着完全互补的意思。
在本发明中使用的固定化探针通过其3’-末端在固相基质上实现固定化。优选的固相基质包含适合的固相或者半-固相载体，例如，膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁珠或者非磁性磁珠、凝胶、管材、板、高分子、微粒及毛细管。虽然，在一部分实例中，优选地，针对互不相同的化合物，以物理方式分离合成区域，该合成区域例如为，孔板、凸起区域（raised region）、销、蚀刻沟槽（etched trench）等，但是，在多个实例中，固相基质的至少一个表面实质上可以是平面。根据本发明的其他实例，这些固相基质将会具有磁珠、树脂、凝胶、微球或者其他几何排列形态。
优选地，固相基质包含微阵列。探针在固相基质的表面直接或者间接地实现固定化（优选地，间接地实现固定化）。并且，探针能够以共价键或者非共价键方式在固相基质的表面上实现固定化。在探针间接地在固相基质的表面上实现固定化的情况下，可利用合适的连接肽。可利用于本发明的连接肽均包含用于在微阵列中使探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽利用于探针固定化。并且，可将聚尾（poly T tail）或者聚腺苷酸尾（poly A tail）作为连接肽来利用，从而能够减少有可能将酶作用（例如，酶性切割反应）抑制的可能性高的空间性妨碍（space hindrance）或者增加杂交效率。聚尾（poly T tail）或者聚腺苷酸尾（polyA tail）不包含于探针的序列。
本发明所利用的固定化探针具有相互作用性双重标记系统，上述相互作用性双重标记系统包含报道分子及猝灭分子。
上述相互作用性标记系统是能量非-放射性地（non-radioacively）传递到供体分子（报道分子）及受体分子（猝灭分子）之间的信号产生系统。
作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移（FRET，fluorescenceresonance energy transfer）标记系统包含报道分子（供体分子）及猝灭分子（受体分子）。荧光共振能量转移中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或非荧光性。
相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非荧光性，例如，为发色团（chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如，生物发光性、化学发光性或电化学发光性，受体为荧光性。
更优选地，表示靶核酸序列的信号通过相互作用性标记来产生，并且，最优选地，上述信号为荧光共振能量转移标记系统。
对探针而言，有用的报道分子及猝灭分子还可包含所属领域公知的任何分子。其例子如下：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1（509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518）、FluorXTM(519)、AlexaTM（520）、Rhodamine110（520）、Oregon GreenTM500（522）、OregonGreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、Magnesium GreenTM（531（、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1（533）、JOE（548）、BODIPY530/550(550)、Dil（565）、BODIPY TMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、Magnesium OrangeTM（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、Calcium OrangeTM（576）、Pyronin Y（580）、Rhodamine B（580）、TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX（608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、Texas Red（615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、R-phycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine（671）、Cy5.5（694）、HEX（556）、TET（536）、Biosearch Blue（447）、CAL Fluor Gold540（544）、CAL FluorOrange560（559）、CALFluor Red590（591）、CAL Fluor Red610（610）、CAL Fluor Red635（637）、FAM（520）、Fluorescein（520）、Fluorescein-C3（520）、Pulsar650（566）、Quasar570（667）、Quasar670（705）及Quasar705（610）。括号内的数字是以纳米单位表示的最大发光波长。
适合的报道-猝灭对公开在如下的许多文献中：Pesce等，editors，（MarcelDekker，New York，1971）；White等，Fluorescence Analysis：A Practical Approach（Marcel Dekker,New York，1970）；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules，2nd Edition（Academic Press，New York，1971）；Griffiths，ColorANDConstitution of Organic Molecules（Academic Press，New York，1976）；Bishop，editor，Indicators（Pergamon Press,Oxford,1972）；Haugland,Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes，Eugene，1992）；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers，New York，1949）；Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6thEdition（Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996）美国专利第3996345号及美国专利第4351760号。
报道分子及猝灭分子可以分别呈现荧光性。并且，报道分子可以呈现荧光性，或者猝灭分子可以呈现非荧光性。例如，在本发明中可利用能够对广范围波长或特定波长的荧光进行猝灭的非荧光性黑猝灭分子。猝灭分子呈现荧光性的情况下，可通过荧光性猝灭分子的信号变化来检测靶核酸序列。
固定化探针上的双重标记系统中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye）用作报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）用作猝灭分子。
报道分子及猝灭分子能够通过现有的方法，与探针相连接。例如，报道分子及猝灭分子可通过包含至少3个碳原子的间隔区（例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区、9-碳间隔区或者12-碳间隔区）与探针相连接。
本发明所利用的固定化探针中，选自报道分子及猝灭分子的第一标记与固定化探针的5’-末端相结合，选自报道分子及猝灭分子的第二标记与位于上述第一标记的下游的核苷酸的碱基相结合。
优选地，与固定化探针的5’-末端相结合的第一标记能够与5’-末端的磷酸盐基进行直接或间接（例如，通过连接肽）的结合。选择性的，第一标记能够与5’-末端的核糖（ribose）相结合，优选地，与核糖的5-碳相结合。
固定化探针上的第二标记与位于第一标记的下游的核苷酸的碱基相结合。第二标记能够与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或硫胺相结合，优选地，与硫胺相结合。
基于第二标记的碱基的标记优选地结合在除了碱基成为氢键的位点之外的位点。例如，第二标记能够与硫胺的第5碳或第6碳相结合，优选地，与硫胺的第5号碳的甲基相结合。
有趣的是，本发明者发现了基于第二标记的碱基的标记将对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性赋予给已标记的核苷酸。
本说明书中所使用的术语“抵抗性”意味着核苷酸分子通过DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性几乎未被切割或完全未被切割，优选地，是完全未被切割。
根据本发明的优选实例，第一标记为猝灭分子，第二标记为报道分子。选择性的，第一标记为报道分子，第二标记为猝灭分子。
本发明所利用的第一标记及第二标记提供相互作用性双重标记系统。双重标记尤其在固定化探针未与所要分析的试样的核酸序列进行杂交的情况下，位于可发生双重标记之间的能量猝灭的固定化探针的位点（site）。
为了实现能量猝灭，双重标记以特定距离或三维结构（例如，随机线圈或发夹结构）位于探针上。与靶核酸序列进行杂交的固定化探针通过DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性，从固定化探针5’-末端向5’→3’方向逐渐被切割，来分离位于固定化探针5’-末端的第一标记。最终，第二标记残留于固相基质，第一标记及第二标记之间不再发生能量猝灭，从而引起表示靶核酸序列的存在的信号变化（信号的产生、衰落、增加或减少）。
在第一标记为猝灭分子、第二标记为报道分子的情况下，固定化探针的5’-末端通过外切核酸切割反应被切割，来分离第一标记，相反，第二标记残留于固相基质上。作为第二标记的报道分子中检测信号，来检测靶核酸序列。
在第一标记为报道分子、第二标记为猝灭分子的情况下，固定化探针的5’-末端通过外切核酸切割反应被切割，来分离第一标记，相反，第二标记残留于固相基质上。猝灭分子呈现荧光性的情况下，残留于固相基质上的猝灭分子产生与第一标记被分离前的初期信号不同的荧光信号，由此，检测靶核酸序列。作为第二标记的报道分子中检测信号，来检测靶核酸序列。
本发明的最主要的优点在于，能够不受限制地决定内部标记的位点。由于对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的内部标记引起的抵抗性（internal label-causedresistance），内部标记还可位于从固定化探针的5’-末端隔开的任何位点。优选地，内部标记位于能够充分使双重标记的猝灭效率最大化的位点。
根据本发明的优选实例，第一标记和第二标记相互隔开，使DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性作用于第一标记和第二标记之间的部位。
根据本发明的优选实例，第二标记通过被5’→3’外切核酸酶活性切割的固定化探针上的切割位点（cleavage site），从第一标记中分离。
根据本发明的优选实例，第二标记位于能够在特定反应条件下以抵抗性结束切割反应的适合的位点。
优选地，第二标记位于从第一标记隔开至少2核苷酸的位点，更优选地，位于隔开至少3核苷酸的位点，进而优选地，位于隔开至少3核苷酸的位点。
优选地，第二标记位于从第一标记隔开2-25核苷酸、2-20核苷酸、2-15核苷酸、3-25核苷酸、3-20核苷酸、3-15核苷酸、4-25核苷酸、4-20核苷酸或4-15核苷酸的位点。
根据本发明的优选实例，第二标记由于被切割的探针由靶核酸序列得到改性，从而并不位于非切割部位。由于上述的理由，非切割部位对反应条件或探针序列具有依赖性，这也成为决定第二标记的位点的决定因素。
根据本发明的优选实例，杜尔标记位于从固定化探针的3’-末端隔开至少10核苷酸的位点，更优选地，隔开至少15核苷酸的位点，进而优选地，隔开至少20核苷酸的位点，尤其优选地，隔开至少25核苷酸的位点。
本发明所要检测的靶核酸序列并不要求任何特定的序列或长度，并包含DNA（gDNA或者cDNA）以及RNA分子。在将mRNA作为初期物质来利用的情况下，在实施退火步骤之前必需要进行反转录步骤，以上详细的内容公开在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；及Noonan，K.F.等，Nucleic Acids Res.16：10366（1988）。为了反转录反应，可利用随机六聚体或者与mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。在本发明能够进行检测的靶核酸序列还均包含任何自然（naturally occurring）原核细胞核酸、真核细胞（例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物）核酸、病毒（例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV，HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS）、流感病毒、EB病毒（Epstein-Barr virus）、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等）核酸或者类病毒核酸。
探针或者引物的退火或者杂交可根据本发明所属技术领域公知的多种杂交方法来实施。在本发明中，适合的杂交条件借助最优化程序决定为一连串的过程。温度、成分的浓度、杂交及清洗时间、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件根据多种因子而变得多样，例如，探针及靶核酸序列的寡核苷酸的长度及糖皮质激素（GC）含量。对于杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（2001）；及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.（1999）确认。
例如，靶核酸序列和固定化探针的杂交温度为40℃-80℃，更优选为45℃-75℃，进而优选为50℃-72℃。
紧接着杂交反应，在切割固定化探针的条件下，使步骤（a）的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接触。仅在固定化探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，由具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶所切割，使第一标记从固定化探针分离，这会引起固相基质上的信号变化（参照图1）。这种信号变化表示靶核酸序列的存在。
本说明书中的“切割固定化探针的发生条件”意味着有助于由具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶致使固定化探针被切割的反应条件，包括温度、pH、离子强度、缓冲液、探针长度、序列及外切核酸酶的种类。例如，利用Taq DNA聚合酶的情况下，发生固定化探针的切割的条件包括三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl，Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液、KCl、MgCl2及温度。
本发明所利用的具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶包含一种酶，该酶作用于与靶核酸序列的杂交相关联的探针，来向5’→3’方向促进外切核酸切割反应。
优选地，本发明中所利用的具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶（例如，E.coliDNA聚合酶I、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7DNA聚合酶）为具有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶，例如包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermusspecies Z05及Thermus species sps17。
与靶核酸序列进行杂交的固定化探针由具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶所切割，使上述第一标记从固定化探针分离，从而引起固相基质上实现的信号变化。
具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶引起固定化探针的外切核酸切割反应后，上述反应在与第二标记相结合的核苷酸中结束。外切核酸切割反应的结束由与第二标记相结合的核苷酸抵抗性来引导，最终，第二标记残留于固相基质上。
外切核酸切割反应结束之后，紧接着对固相基质上实现的信号变化（信号的增加或减少）进行检测，并且，固定化探针的切割引起信号变化表示靶核酸序列的存在。
信号能够通过对于各个标记的现有的方法来检测或测定。例如，荧光信号能够通过现有的方法，如通过荧光检测仪来进行检测或测定。
最终，在固相检测到表示靶核酸序列存在的信号变化。优选地，通过固定化探针的切割的信号变化为固相基质上的信号的增加。
在本发明中提供反应环境的固相基质优选包括在本发明所属领域中公知的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的退火、延长/切割反应及荧光的检测在微阵列上完成。在微阵列中固定化探针利用为杂交阵列因素（hybridizable array element）。用于制备微阵列的固相基质（solid substrate）包含，例如金属（例如，金、金与铜的合金及铝）、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶片、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物（例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚丙烯酰胺）、琼脂糖凝胶、琼脂糖及胶体，但是不局限于此。本发明的多个固定化探针固定化在固相基质上的一个可设定地址的（addressable）区域（region）或者多个可设定地址的区域（region），固相基质可包括2-1000000个可设定地址的区域（region）。为了通过如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法等现有制备技术，生产阵列或者用于特定应用的阵列而可以制备（fabricate）固定化探针。
在本发明中，由于在固相基质上实现固定化的探针以物理方式相互隔开，因此，即使利用一种的双重标记，也可以在固相基质上检测多个靶核酸序列。由此，通过本发明在固相中检测到的靶核酸序列的数量并不受限。
根据本发明的优选实例，本发明的方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤（优选为2次，更优选为至少5次，进而优选为至少10次）。
反复进行上述步骤（a）-（b）或（a）-（c）的情况下，优选地，本发明还包括将靶序列的双链以单链进行改性的过程。
反复进行上述步骤（a）-（b）或（a）-（c），来引导反复的外切核酸切割反应的情况下，信号的变化程度根据靶核酸序列的量来增加，从而使靶核酸序列的定量成为可能。将本发明根据反复的外切核酸切割反应来实施的情况下，步骤（d）的检测能够分别在反复的结束点（即，终点方式），反复的各个周期（即，实时方式），或反复期间的预定的时间间隔实施。实时的检测适合对靶核酸序列进行定量化。
清洗步骤可在步骤（d）之前实施。但是，本发明不受从固相基质上的双重标记探针分离的标记分子的干涉，并利用未清洗固相基质的如共聚焦激光扫描仪等适合的设备，能够仅检测存在于固相基质上的信号。
根据本发明的优选实例，步骤（a）中还包含反向引物，上述反向引物用于生成与固定化探针进行杂交的靶核酸序列。靶核酸序列的追加性的生成使信号变化较强地发生。
例如，利用至少两种扩增引物，对最少两种的靶核酸序列进行多重-增幅，与至少两种固定化探针进行杂交，并利用至少两种反向引物及具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶实施延长及切割反应，最终，获得比未使用反向引物的反应还要增加的信号变化。
根据本发明的优选实例，固定化探针具有改性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。改性双重特异性寡核苷酸结构与现有的探针相比，具有相当高的靶特异性（参照：WO2011/028041）。
根据本发明的优选实例，固定化探针是具有一种用于区分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的靶区分性探针（targetdiscriminative probe：TD probe）：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位（5’-second hybridization portion）；Y’q是包含至少3个通用碱基的分离部位（separation portion）；Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位（3’-first hybridization portion）；上述靶区分性探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；上述第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述5’-第二次杂交部位的5’-末端相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的核苷酸的碱基相结合；p、q及r表示核苷酸的数量，并且，X’、Y’及Z’是DNA或核糖核酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm比上述3’-第一次杂交部位的Tm低，上述分离部位在上述X’p、Y’q、Z’r3个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从3’-第一次杂交部位分离，由此，上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位都与上述靶核酸序列进行杂交，上述5’-第二次杂交部位的5’-末端通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，上述第一标记从上述靶区分性探针分离，来引起上述固相基质上实现的信号变化；通过具有与上述第二标记相结合的碱基的上述核苷酸的抵抗性，上述第二标记残留于上述固相基质上；上述靶区分性探针与非靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位都形成单链，从而使上述5’-第二次杂交部位不被DNA聚合酶切割，因此，不会引起上述固相基质上的信号变化，由此，上述靶区分性探针对上述靶核酸序列及非靶核酸序列进行区分，上述固相基质上实现的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
本说明书所使用的术语“靶区分性探针（target discriminative probe）”具有上述的改性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构，并意味着与靶核酸序列和非靶核酸序列以不同模式进行杂交，来对靶核酸序列和非靶核酸序列进行区分。
上述具有改性双重特异性寡核苷酸结构的，用于本发明的靶区分性探针包括以下序列：（i）与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；及（ii）对靶核酸序列和非靶核酸序列的区分起到关键作用的5’-第二次杂交部位和分离部位。
上述改性双重特异性寡核苷酸结构是双重特异性寡核苷酸（DSO，dualspecificity oligonucleotide）改性的新结构，上述双重特异性寡核苷酸（DSO）由本发明者第一次提出（参照WO2006/095981）。并且，上述双重特异性寡核苷酸结构起到引物作用时，命名为双重引发寡核苷酸（DPO，dual priming oligonucleotide）（Chun等，Dualpriming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratoryviruses and SNP genotyping of CYP2C19gene，Nucleic Acid Research，35：6e40（2007））。双重特异性寡核苷酸体现一种由杂交或退火通过分离区域相互分离的5’-高Tm特异性部位（或5’-第一次杂交部位、5’-第一次引发部位）及3’-低Tm特异性部位（或3’-第二次杂交部位，3’-第二次引发部位）双重性地决定的新的概念，并表示显著提高的杂交特异性（参照：WO2006/095981；Kim等，Direct detection of lamivudine-resistanthepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotideprimers，Journal of Virological Methods，149：76-84（2008）；Kim等，Rapid detectionand identification of12respiratory viruses using a dual primingoligonucleotide system-based multiplex PCR assay,Journal of VirologicalMethods，doi：10.1016/j.jviromet.2008.11.007（2008）;Horii 等，Use of dual primingoligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens inclinical specimens，Letters in Applied Microbiology，doi：10.111/j.1472-765X2009.02618x（2009））。如上所述，上述双重特异性寡核苷酸最终获得具有相互不同的杂交特性的两个片段，即，造成初期的稳定的杂交的5’-第一次杂交部位及决定靶特异性的3’-第二次杂交部位。上述双重特异性寡核苷酸由于双重性地决定杂交，因此，能够显示大大提高的杂交特异性。
上述改性双重特异性寡核苷酸结构是由上述双重特异性寡核苷酸结构逆转而成的，即，决定靶特异性的5’-第二次杂交部位及造成初期的稳定的杂交的3’-第一次杂交部位。仅在靶区分性探针的5’-第二次杂交部位与靶核酸序列完整地进行杂交的情况下，通过具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割探针的5’-末端，而这贡献于靶区分性探针的惊人的靶特异性。
本发明中，靶区分性探针在靶核酸序列的检测，尤其在靶核酸序列的多重检测中，向假阳性数据的去除以部分性地进行贡献，这是由于靶区分性探针对靶核酸序列和非靶核酸序列明确地表示不同的杂交行为（behavior）。
靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，靶区分性探针的5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位都与靶核酸形成双链。靶区分性探针与非靶核酸序列进行杂交（即，非靶杂交或非靶结合）的情况下，其3’-第一次杂交部位优势性地与非靶核酸序列相结合，但5’-第二次杂交部位及分离部位都不能与非靶核酸进行杂交，并形成单链。
靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，其5’-第二次杂交部位被具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割，第一标记（例如，猝灭分子）被分离，来发生信号变化。由于标有第二标记的核苷酸的抵抗性，第二标记会残留于固相基质上。因此，获得一种信号变化，上述信号变化表示固相基质上的靶核酸序列的存在，并由此决定靶核酸序列的存在。
相反，靶区分性探针与非靶核酸序列进行杂交的情况下，5’-第二次杂交部位及分离部位都形成单链，从而不会被具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割。在不会发生靶区分性探针的切割反应时，最终也不会发生信号变化。
根据本发明的优选实例，第二标记位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位。由于标有第二标记的核苷酸的抵抗性，在靶区分性探针与靶核酸序列杂交后进行切割的情况下，5’-第二次杂交部位的第二标记也不会切割，并残留于固相基质上。
根据本法的优选实例，位于分离部位的通用碱基选自脱氧肌苷（Deoxy inosine）、肌苷（inosine）、7-去氮-2’-脱氧肌苷（7-diaza-2'-deoxy inosine）、2-氮杂-2’-脱氧肌苷（2-aza-2'-deoxy inosine）、2’-甲氧基肌苷（2’-OMe inosine）、2’-F肌苷（2’-Finosine）、脱氧3-硝基吡咯（deoxy3-nitro pyrrole）、3-硝基吡咯（3-nitro pyrrole）、2’-甲氧基3-硝基吡咯（2’-OMe3-nitro pyrrole）、2’-F3-硝基吡咯（2’-F3-nitro pyrrole）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxy-bata-D-Ribofuranose）-3-nitropyrrole）、脱氧5-硝基吡咯（deoxy5-nitro pyrrole）、5-硝基吲哚（5-Nitro indole）、2’-甲氧基5-硝基吲哚（2’-OMe5-Nitro indole）、2’-F5-硝基吲哚（2’-F5-Nitro indole）、脱氧4-硝基苯并咪唑（deoxy4-Nitrobenzimidazole）、4-硝基苯并咪唑（4-Nitrobenzimidazole）、脱氧4-氨基苯并咪唑（deoxy4-Aminobenzimidazole）、4-氨基苯并咪唑（4-Aminobenzimidazole）、脱氧水粉蕈素（Deoxy nebularin）、2’-F水粉蕈素（2’-Fnebularin）、2’-F4-硝基苯并咪唑（2’-F4-Nitrobenzimidazole）、肽核酸-5-硝基吲哚（PNA-5-introindole）、肽核酸-水粉蕈素（PNA-nebularin）、肽核酸-肌苷（PNA-inosine）、肽核酸-4-硝基苯并咪唑（PNA-4-Nitrobenzimidazole）、肽核酸-3-硝基吡咯（PNA-4-nitropyrrole）、吗啉基-5-硝基吲哚（Morpholino-4-Nitro indole）、吗啉基-水粉蕈素（Morpholino-nebularin）、吗啉基-肌苷（Morpholino-inosine）、吗啉基-4-硝基苯并咪唑（Morpholino-4-Nitrobenzimidazole）、吗啉基-3-硝基吡咯（Morpholino-3-nitropyrrole）、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚（phosphoramidate-5-Nitro indole）、氨基磷酸酯-水粉蕈素（phosphoramidate-nebularin）、氨基磷酸酯-肌苷（phosphoramidate-inosine）、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑（phosphoramidat-4-Nitrobenzimidazole）、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯（phosphoramidat-3-nitro pyrrole）、2’-0-甲氧基乙基肌苷（2’-0-methoxyethylinosine）、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素（2’-0-methoxyethyl nebularin）、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚（2’-0-methoxyethyl5-Nitro indole）、2’-0-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑（2’-0-methoxyethyl4-Nitrobenzimidazole）、2’-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯（2’-0-methoxyethyl3-nitro pyrrole）及由上述碱基的组合组成的组中。更优选地，位于分离区域的通用碱基是脱氧肌苷、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚，最优选为脱氧肌苷。
分离部位包含核苷酸，该核苷酸优选地具有至少3个通用碱基，更优选地具有至少4个通用碱基，最优选地具有至少5个通用碱基。分离部位包含连续的核苷酸，该核苷酸更优选地具有至少3个通用碱基，进而优选地具有至少4个通用碱基，最优选地具有至少5个通用碱基。选择性的，分离部位包含3-10、3-8、4-7或4-5连续的通用碱基。
优选地，3’-第一次杂交部位的长度比5’-第二次杂交部位的长度长。3’-第一次杂交部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-30核苷酸的长度。5’-第二次杂交部位优选地具有至少3核苷酸的长度，更优选地具有5核苷酸的长度，进而优选地具有6核苷酸的长度。5’-第二次杂交部位优选地具有最大15核苷酸的长度，更优选地具有最大13核苷酸的长度，进而优选地具有12核苷酸的长度。5’-第二次杂交部位优选地具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有3-13核苷酸的长度，进而优选地具有4-12核苷酸的长度，最优选地具有5-11核苷酸的长度。分离部位优选地具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有3-8核苷酸的长度，进而优选地具有4-7核苷酸的长度，最优选地具有4-5核苷酸的长度。5’-第二次杂交部位及分离部位的长度优选地具有至少6核苷酸的长度，更优选地具有至少9核苷酸的长度，进而优选地具有至少12核苷酸的长度，最优选地具有至少15核苷酸的长度。
根据本发明的优选实例，3’-第一次杂交部位具有40℃-80℃的Tm，优选为45℃-70℃的Tm。5’-第二次杂交部位优选地具有6℃-40℃的Tm，更优选为10℃-40℃的Tm。分离部位优选地具有2℃-15℃的Tm，更优选为3℃-15℃的Tm。
根据本发明的优选实例，第二标记位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位。更优选地，5’-第二次杂交部位上的第二标记位于从与5’-第二次杂交部位的5’-末端相结合的第一标记隔开2-15核苷酸的位点，更优选地，位于隔开2-10核苷酸的位点。
根据本发明的优选实例，本发明所利用的靶核酸序列是一种通过扩增用引物进行预-扩增的核酸序列。利用预-扩增的核酸序列会增加本发明的靶检测的敏感度和特异性。
根据本发明的优选实例，反向引物或扩增用引物具有双重引发寡核苷酸（DPO）结构。双重引发寡核苷酸结构，如作为参照插入到如本说明书全文中的WO2006/095981所述，与现有的引物相比，具有相当高的靶特异性。
提及引物或探针时所使用的术语“现有”意味着不具有改性双重特异性寡核苷酸结构或双重引发寡核苷酸结构的所有引物或探针。它们在本说明书中被说明为现有引物或现有探针。
本发明很好地适用于至少两种靶核酸序列的同步（多重）检测。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选地，包含至少3种，进而优选地，包含至少5种），而探针（和/或反向引物）包含至少两种探针（更优选地，包含至少3种，进而优选地，包含至少5种）。
而且，本发明对核苷酸变异的检测也非常有用。本说明书中所使用的术语“核苷酸变异（nucleotide variation）”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的核苷酸的多样性。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的某些其他部位。例如，可以通过本发明的方法而检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）、缺失、插入、置换及易位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的多种变异（例如，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase）基因的变异）、与病原体的药物耐性相关的变异及癌产生-相关变异。根据本发明的优选实例，固定化探针包含与核苷酸变异互补的核苷酸或者相当于核苷酸变异的核苷酸。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种在固相利用对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性的双重标记探针，从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，该试剂盒包含：
（a），固相基质；
（b），固定化探针，其包含与上述靶核酸序列互补的核苷酸序列；通过上述固定化探针的3’-末端在固相基质上进行固定化的上述固定化探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述固定化探针的5’-末端相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的核苷酸的碱基相结合，这种上述第二标记的结合使上述核苷酸对上述DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性；以及
（c），上述DNA聚合酶，其具有5’→3’外切核酸酶活性。
本发明的试剂盒是为了实施上述的本发明的检测方法制备的，为了避免本说明书的过度的复杂性，将省略其之间共同的内容。
根据本发明的优选实例，第一标记为猝灭分子，第二标记为报道分子。选择性的，第一标记为报道分子，第二标记为猝灭分子。
根据本发明的优选实例，第二标记通过被5’→3’外切核酸酶活性切割的固定化探针上的切割位点（cleavage site）从第一标记分离。优选地，第二标记位于从第一标记隔开2-20核苷酸的位点。进而优选地，第二标记位于从第一标记隔开4-15核苷酸的位点。
根据本发明的优选实例，第一标记与固定化探针的5’-末端的磷酸盐基相结合。
根据本发明的优选实例，第二标记在上述固定化探针中与胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合。
根据本发明的优选实例，具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶为具有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
根据本发明的优选实例，本试剂盒还包含反向引物，上述反向引物用于生成在固定化探针进行杂交的靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，固定化探针为靶区分性探针（target discriminativeprobe：TD probe），上述靶区分性探针是对靶核酸序列和非靶核酸序列进行区分的，具有通式I的改性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。
优选地，本试剂盒还包含靶核酸序列扩增用引物套组，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种的核酸序列，固定化探针包含至少两种探针。优选地，靶核酸序列包括核苷酸变异。
本发明的试剂盒可选择性地包含在实施靶扩增聚合酶链式反应（PCR）（例如，聚合酶链式反应）时所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。
并且，本发明的试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本领域的技术人员能够容易地决定在特定反应中所使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装或者组分（compartment）而制备。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种将对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性赋予给寡核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：
步骤（a），决定上述寡核苷酸的核苷酸序列；以及
步骤（b），对上述寡核苷酸中的一个核苷酸的碱基上结合有标记的寡核苷酸进行合成，由此，上述核苷酸对上述DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性。
本发明是上述的检测方法所利用的对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的碱基标记核苷酸的抵抗性相关的，为了避免本说明书的过度的复杂性，将省略这两者之间共同的内容。
寡核苷酸的核苷酸序列能够具有与靶核酸序列互补的序列。在核苷酸能够与靶核酸序列进行特异性杂交的范围内，核苷酸序列可具有相对于靶核酸序列的一个或一个以上的错配核苷酸。
根据本发明的优选实例，寡核苷酸为探针。
寡核苷酸的合成能够通过公开的现有的方法来实施（例如，Needham-VanDevanter等在Nucleic Acids Res.，12：6159-6168（1984））中公开的利用自动合成器的固相亚磷酰胺酯的方法（solid phase phosphoramidite triester method，Beaucage andCaruthers，Tetrahedron Letts.，22（20)：1859-1862（1981））。
根据本发明的优选实例，具有与标记相结合的碱基的核苷酸为寡核苷酸的内部核苷酸。
核苷酸碱基成分和标记的结合能够通过公开的现有方法来实施（Nelson，等，Nucleic Acids Research20（23）：6253-6259（1992）；美国专利第4757141号，美国专利第5559767号及美国专利第5231191号；及Haralambidis等，Nucleic Acids Research，15：4856-4876（1987））。
与标记相结合的碱基成分包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及硫胺，优选为硫胺。
基于标记的碱基成分的标记优选地结合在除了靶核酸序列成为氢键的位点之外的位点。例如，标记能够与硫胺的第5碳或第6碳相结合，优选地，与硫胺的第5碳的甲基相结合。
对本发明的特征及优点如下进行概括：
（a）本发明利用寡核苷酸的核苷酸碱基成分与标记的结合使寡核苷酸对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性的独特的特征。本发明与在固相进行固定化的探针上的双重标记系统一同将此类独特的特征适用于靶检测系统。在5’-末端及内部部位具有标记的固定化探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，固定化探针通过DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性，从5’-末端向5’→3’方向逐渐被切割，来分离5’-末端的标记。由于抵抗性，在碱基成分进行标记的内部核苷酸中结束切割反应，结果，内部核苷酸的标记残留于固相基质，最终提供显示靶核酸序列的存在的信号变化。
（b）本发明通过由内部核苷酸的碱基成分的标记引起的DNA聚合酶的引物独立性5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，使第二标记残留于固相基质上，因此，无需考虑固相基质上残留第二标记的适合的点位。与此相反，利用DNA聚合酶的引物依赖性5’→3’核酸酶活性的固相基质中的基于TaqMan探针的方法为了在固相基质上残留第二标记，考虑反应条件，应严格决定第二标记的位点。
（c）本发明能够自由决定探针上的内部标记的位点，因此，使标记位于适合对双重标记系统的猝灭效率进行最大化的适合的探针上的位点，从而使本底信号最小化。
（d）本发明中所使用的，作为优选探针的具有改性双重特异性寡核苷酸结构的靶区分性探针是由现有探针与非靶核酸序列进行非特异杂交，因此，对一般产生的假阳性信号的去除进行部分性的贡献。
（e）利用相互作用性双重标记的本发明能够以终点方式或实时方式对固相中的信号变化（信号的减少或增加）进行检测，并且，不仅能够进行靶核酸序列的正常分析，还能进行定量分析。
（f）本发明不仅通过探针及靶核酸序列之间的杂交，还通过酶反应（基于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性进行）提供信号变化。即，本发明的靶特异性进行双重性的决定，从而成功解决由探针的非特异性杂交引起的假阳性结果问题。而且，本发明的循环反复（cyclic repetition）使固定化探针提供信号变化，因此能够使信号的变化程度最大化。
（g）本发明与基于TaqMan探针方法不同，在不使用引物的情况下，仅用固定化的探针来实施。因此，本发明解决了多个寡核苷酸序列的决定及反应条件的最优化中的困难性及费用对比的非有效性之类的利用多个寡核苷酸的方法所表现的问题。此类的优点在多重靶检测中显得更为明确。
（h）本发明中，由于固相基质上的固定化探针以物理方式分离，因此，即使利用一种双重标记，也能在固相基质上同时检测多个靶核酸序列。
下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的宗旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性的评价】
本发明者评价碱基上结合有标记的核苷酸对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性是否具有抵抗性。
为了这种评价，将金黄色葡萄球菌（SA，Staphylococcus aureus）基因的合成寡核苷酸用作模板。将具有5’核酸酶活性的Taq、Tth及TflDNA聚合酶利用于5’→3’外切核酸切割反应（5’→3’exonucleolytic reaction）。并且，将双重标记探针利用于该评价。上述探针具有荧光报道分子（fluorescent reporter molecule，FAM），该荧光报道分子与探针的5’-末端的磷酸基（phosphate group）（SEQ ID NO：2）或胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶（thymineof a thymidine nucleotide）（SEQ ID NOs：3、4、5、6及7）相结合，而上述探针的3’-末端具有猝灭分子（BHQ-1）。本实施例中所利用的探针是由百思勤科技有限公司（美国）（Biosearch Technologies Inc.，USA）提供。将包含碳间隔区（C6spacer）的荧光报道分子利用于探针（百思勤科技有限公司（美国））的制备。
在本实施例中所利用的合成模板及探针的序列如下：
SA-T
5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’（SEQ ID NO：1）
SA-Con-M1
[FAM]TCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]（SEQ ID NO：2）
SA-Con-D0（dT）[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]（SEQ ID NO：3）
SA-Con-D1（dT）G[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]（SEQ ID NO：4）
SA-Con-D3（dT）TGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]
（SEQ ID NO：5）
SA-Con-D5（dT）CGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]
（SEQ ID NO：6）
SA-Con-D8（dT）TTCCGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1]（SEQ IDNO：7）
（下划线部分的文字是指结合有荧光报道分子的胸腺嘧啶。）
以含有对于金黄色葡萄球菌（SA）的合成模板（SEQ ID NO：1）0.5pmole、探针（SEQID NOs:2、3、4、5、6或7）5pmole、10×反应缓冲液（5mM MgCl2）2μl、各50μM三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）、Taq（索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea）、Tth（生物谷公司，英国：Epicentre Biotechnologies,US）或TflDNA聚合酶（生物谷公司，英国：EpicentreBiotechnologies,US）2单元（unit）的20μl的最终体积实施了反复性外切核酸切割反应。将含有上述反应混合物的管位于实时热循环器（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）。将上述反应混合物在95℃内进行2分钟的改性，并在95℃中进行20秒钟，在55℃中进行20秒钟，并将此过程反复进行50次。在各个周期的55℃中检测信号。
如图2、图3及图4所示，在靶核酸存在的情况下，位于5’-末端的磷酸基与荧光报道分子相结合的探针（SEQ ID NO：2）产生荧光信号。但是，即使靶核酸存在，在胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶结合荧光报道分子的探针（SEQ ID NOs：3、4、5、6及7）也不会产生荧光信号。在没有靶核酸的情况下，未产生荧光信号。
此类结果表示，在碱基具有标记的核苷酸对DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性。
【实施例2：利用双重标记探针及对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性的微陈列上的靶核酸序列的检测】
本发明者在利用双重标记探针的固相中的靶核酸序列检测中，适用碱基与标记结合的的核苷酸的抵抗性。具有5’核酸酶活性的TaqDNA聚合酶利用于5’→3’外切核酸切割反应。
双重标记探针在其5’-末端具有猝灭分子（BHQ-2），并在内部具有与胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合的荧光报道分子（Quasar570）。利用包含碳间隔区（C6spacer）的Quasar570制备上述探针（百思勤科技有限公司，美国：Biosearch Technologies Inc.，USA）。通过追加性插入的碳间隔区（C6spacer），来结合BHQ-2。利用位于探针的3’-末端的氨基（AminnoC7），将探针固定于载玻片上。利用位于3’-末端的氨基将在5’-末端具有荧光报道分子（Quasar570）的标记探针固定于载玻片上。将对于黄金色葡萄球菌的合成寡核苷酸用作模板。
本实施例中所利用的合成模板、双重标记探针及标记的序列如下：
SA-T
5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’（SEQ ID NO：1）
SA-Con-M[BHQ-2][C6spacer]TCATTCCG[T（Quasar570）]GGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCT TTTT[AminoC7]（SEQ ID NO：8）
Marker[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]（SEQ ID NO：9）
（下划线部分的文字是指结合有荧光报道分子的胸腺嘧啶。）
将NSB9NHS载玻片（NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea）用于上述双重标记探针（SEQ ID NO：8）及标记（SEQ ID NO：9）的制备。将利用NSB测定位点缓冲液（NSBspotting buffer）溶解成最终浓度为50μM的上述双重标记探针及标记，利用PersonalArrayerTM16微陈列点样仪（Microarray Spotter）（博奥生物：CapitalBio，China：中国）印刷在NSB9NHS载玻片上。将上述双重标记探针及标记以2×1格式（双重点：duplicate spots）并行了测定点位（spotting），将由此制备的载玻片在约85%的湿度的培养皿中培养一宿。为了去除非特异性结合的双重标记探针及标记，在37℃下，用含有2×SSPE（0.3M氯化钠（sodium chloride），0.02M磷酸氢钠（sodium hydrogen phosphate）及2.0mM乙二胺四乙酸（EDTA，ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID））及7.0mM十二烷基硫酸钠（SDS：Sodium dodecyl sulfate）的pH7.4缓冲液溶液中，对上述载玻片进行30分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用玻片离心分离器，对上述DNA-功能化（DNA-functionalized）的载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌（SA）的合成模板（SEQ ID NO：1）10pmole、10×反应缓冲液（6mM MgCl2）3μl、各200μM三磷酸脱氧核苷酸及Diastar-TaqDNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea）1.2单元的30μl的最终体积，实施了反复性外切核酸切割反应。将上述整体混合物适用于由上述双重标记探针（SEQ ID NO：8）进行交联（cross-linked）的载玻片的表面上组装的培养皿。利用原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（基因扩增仪B4I，中国：Genepro B4I，China）。如下实施上述反应：在95℃下进行2分钟的改性及在55℃下进行60分钟的改性，最终，将上述载玻片在100℃下利用蒸馏水清洗1分钟。分别进行清洗后，利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepix4100A（分子器件，美国：Molecular Device，USA），并通过10-μm像素分辨率的扫描获取了各个载玻片的图像。利用定量的微阵列分析软件GenePix pro6.0软件（分子器件，美国：Molecular Device，USA）分析了荧光强度。去除周边本底后用点-中央值表示荧光强度。为了勘察再现性，按每两个点进行测定点位。用2个点的平均值表示了荧光强度。
如图5所示，在存在靶核酸的情况下，产生荧光信号（RFU：6486±0.7）。在没有靶核酸的情况下，未产生荧光信号。
【实施例3：利用双重标记靶区分性（TD）探针及对于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性的微陈列上的靶核酸序列的检测】
本发明者在利用双重标记靶区分性探针的固相中的靶核酸序列检测中，适用对于碱基与标记相结合的核苷酸DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性。具有5’核酸酶活性的TaqDNA聚合酶利用于5’→3’外切核酸切割反应。
双重标记探针在其5’-末端具有猝灭分子（BHQ-2），并具有与位于5’-第二次杂交部位的内部胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合的荧光报道分子（Quasar570）。利用包含碳间隔区（C6spacer）的Quasar570制备上述探针（百思勤科技有限公司，美国：BiosearchTechnologies Inc.，USA）。通过追加性插入的碳间隔区（C6spacer），来结合BHQ-2。利用位于靶区分性探针的3’-末端的氨基（AminnoC7），将靶区分性探针固定于载玻片上。利用位于3’-末端的氨基，将在5’-末端具有荧光报道分子（Quasar570）的标记探针固定于载玻片上。将黄金色葡萄球菌的合成寡核苷酸用作模板。
本实施例中所利用的合成模板、双重标记TD探针及标记的序列如下：
SA-T
5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’（SEQ ID NO：1）
SA-TD-M[BHQ2][C6spacer]TCATTCCG[T（Quasar570）]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]（SEQ ID NO：10）
Marker[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]（SEQ ID NO:9）
（下划线部分的文字是指结合有荧光报道分子的胸腺嘧啶。）
将NSB9NHS载玻片（NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea）用于上述双重标记靶区分性探针（SEQ ID NO：10）及标记（SEQ ID NO:9）的制备。将利用NSB测定位点缓冲液（NSB spotting buffer）溶解成最终浓度为50μM的上述双重标记靶区分性探针及标记，利用PersonalArrayerTM16微陈列点样仪（Microarray Spotter）（博奥生物：CapitalBio，China：中国）印刷在NSB9NHS载玻片上。将上述双重标记靶区分性探针及标记以2×1格式（双重点：duplicate spots）并行了测定点位（spotting），将由此制备的载玻片在85%的湿度的培养皿中培养一宿。为了去除非特异性结合的双重标记靶区分性探针及标记，在37℃下，用含有2×SSPE（0.3M氯化钠，0.02M磷酸氢钠及2.0mM乙二胺四乙酸）及7.0mM十二烷基硫酸钠的pH7.4缓冲液溶液中，对上述载玻片进行30分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用玻片离心分离器，对上述DNA-功能化（DNA-functionalized）的载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌（SA）的合成模板（SEQ ID NO：1）10pmole、10×反应缓冲液（6mM MgCl2）3μl、各200μM三磷酸脱氧核苷酸及Diastar-TaqDNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea）1.2单元的30μl的最终体积，实施了反复性外切核酸切割反应。将上述整体混合物适用于由上述双重标记靶区分性探针（SEQ ID NO：10）进行交联（cross-linked）的载玻片的表面上组装的培养皿。利用原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（基因扩增仪B4I，中国：Genepro B4I，China）。如下实施上述反应：在95℃下进行2分钟的改性及在55℃下进行60分钟的改性，最终，将上述载玻片在100℃下利用蒸馏水清洗1分钟。分别进行清洗后，利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepix4100A（分子器件，美国：MolecularDevice，USA），并通过10-μm像素分辨率的扫描获取了各个载玻片的图像。利用定量的微阵列分析软件GenePix pro6.0软件（分子器件，美国：Molecular Device，USA）分析了荧光强度。去除周边本底后用点-中央值表示荧光强度。为了勘察再现性，按每两个点进行测定点位。用2个点的平均值表示了荧光强度。
如图6所示，在存在靶核酸的情况下，产生荧光信号（RFU：65486±0.0）。在没有靶核酸的情况下，未产生荧光信号。
对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修改，本发明的范围根据所附的权利要求书及其等同替代而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (29)

1.一种在固相利用对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性的双重标记探针，从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针具有与上述靶核酸序列互补的核苷酸序列；通过3’-末端在固相基质上进行固定化的上述探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述固定化探针的5’-末端的磷酸基相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合，这种上述第二标记的结合使上述胸腺嘧啶核苷对上述DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性；
步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接触；与上述靶核酸序列互补的上述固定化探针通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，使得上述第一标记从上述固定化探针分离，来引起在上述固相基质上的信号变化；
步骤(c)，在标有上述第二标记的上述胸腺嘧啶核苷中结束上述DNA聚合酶的上述外切核酸切割反应；
其中上述外切核酸切割反应的结束被具有与上述第二标记相结合的胸腺嘧啶的上述胸腺嘧啶核苷的抵抗性诱导，
其中所述第二标记与胸腺嘧啶的结合给所述胸腺嘧啶与所述第二标记相结合的胸腺嘧啶核苷赋予对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，
其中上述第二标记残留于上述固相基质上；以及
步骤(d)，对上述固相基质上的信号变化进行检测；通过上述固定化探针的上述切割而引起的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述第一标记为猝灭分子；
上述第二标记为报道分子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述第一标记为报道分子；
上述第二标记为猝灭分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标记通过被引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性切割的固定化探针上的切割位点，从上述第一标记分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开2～20核苷酸的位点。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开4～15核苷酸的位点。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括反复进行上述步骤(a)～步骤(b)或者步骤(a)～步骤(c)的步骤，并在反复循环之间具有变性过程。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(d)的上述检测以实时方式、终点方式或预定时间间隔方式实施。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有上述引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的上述DNA聚合酶是具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)中还包含反向引物，上述反向引物用于生成与上述固定化探针进行杂交的上述靶核酸序列的拷贝。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化探针是具有用于区分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，
X’p是3～15个核苷酸长、且具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位；
Y’q是包含至少3个通用碱基的分离部位；
Z’r是15～60个核苷酸长、且具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位；
上述靶区分性探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；
上述第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；
上述第一标记与上述5’-第二次杂交部位的5’-末端的磷酸基相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合；
p、q及r表示核苷酸的数量，并且，X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；
上述5’-第二次杂交部位的Tm比上述3’-第一次杂交部位的Tm低，上述分离部位在上述X’p、Y’q、Z’r3个部位中具有最低的Tm；
上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从3’-第一次杂交部位分离，由此，上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位都与上述靶核酸序列进行杂交，上述5’-第二次杂交部位的5’-末端通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，上述第一标记从上述靶区分性探针分离，来引起上述固相基质上的信号变化；
通过具有与上述第二标记相结合的胸腺嘧啶的上述胸腺嘧啶核苷的抵抗性，上述第二标记残留于上述固相基质上；
上述靶区分性探针与非靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位都形成单链，上述5’-第二次杂交部位不被DNA聚合酶切割，因此，不会引起上述固相基质上的信号变化，由此，上述靶区分性探针对上述靶核酸序列及非靶核酸序列进行区分，上述固相基质上的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二标记存在于上述5’-第二次杂交部位。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列；
上述固定化探针包含至少两种探针。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸序列包含核苷酸变异。
16.试剂盒用于实施权利要求1～15之任一项的方法的用途，其中所述试剂盒包含：
(a)，固相基质；
(b)，固定化探针，其包含与上述靶核酸序列互补的核苷酸序列；通过上述固定化探针的3’-末端在固相基质上进行固定化的上述固定化探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述固定化探针的5’-末端的磷酸基相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合，这种上述第二标记的结合使上述胸腺嘧啶核苷对上述DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性；以及
(c)，上述DNA聚合酶，其具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，
上述第一标记为猝灭分子；
上述第二标记为报道分子。
18.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，
上述第一标记为报道分子；
上述第二标记为猝灭分子。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述第二标记通过被引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性切割的固定化探针上的切割位点，从第一标记分离。
20.根据权利要求16所述的用途，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开2～20核苷酸的位点。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开4～15核苷酸的位点。
22.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，具有上述引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的上述DNA聚合酶是具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
23.根据权利要求16所述的用途，其中所述试剂盒还包含反向引物，上述反向引物用于生成与上述固定化探针进行杂交的上述靶核酸序列。
24.根据权利要求16所述的用途，其中所述固定化探针是具有用于区分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，
X’p是3～15个核苷酸长、且具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位；
Y’q是包含至少3个通用碱基的分离部位；
Z’r是15～60个核苷酸长、且具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位；
上述靶区分性探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；
上述第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；
上述第一标记与上述5’-第二次杂交部位的5’-末端的磷酸基相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合；
p、q及r表示核苷酸的数量，并且，X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；
上述5’-第二次杂交部位的Tm比上述3’-第一次杂交部位的Tm低，上述分离部位在上述X’p、Y’q、Z’r3个部位中具有最低的Tm；
上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此，上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位都与上述靶核酸序列进行杂交，上述5’-第二次杂交部位的5’-末端通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，上述第一标记从上述靶区分性探针分离，来引起上述固相基质上的信号的变化；
通过具有与上述第二标记相结合的胸腺嘧啶的上述胸腺嘧啶核苷的抵抗性，上述第二标记残留于上述固相基质上；
上述靶区分性探针与非靶核酸序列进行杂交的情况下，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位都形成单链，上述5’-第二次杂交部位不被DNA聚合酶所切割，因此，不会引起上述固相基质上的信号的变化，由此，上述靶区分性探针对上述靶核酸序列及非靶核酸序列进行区分，上述固相基质上的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述第二标记存在于上述5’-第二次杂交部位。
26.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，
上述试剂盒还包含上述靶核酸序列扩增用引物组；
上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
27.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，
上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列；
上述固定化探针包含至少两种探针。
28.根据权利要求16所述的用途，其中所述靶核酸序列包含核苷酸变异。
29.一种将对于DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性赋予给寡核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(a)，测定上述寡核苷酸的核苷酸序列；以及
步骤(b)，对上述寡核苷酸中的一个内部胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶上结合有标记的寡核苷酸进行合成，由此，上述胸腺嘧啶核苷对上述DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性。
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