KR20130094324A - 이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 - Google Patents

이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중-표지 고정화 프로브 및 그의 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 타겟 핵산서열을 검출하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 내부 뉴클레오타이드의 염기 성분의 표지로 인한 뉴클레아제에 대한 저항성에 의하여 표지가 고상 기질 상에 잔류하기 때문에, 고상 기질 상에 표지가 잔류하도록 적합한 위치를 고려할 필요가 없다. 본 발명은 프로브 상의 내부 표지의 위치를 자유로이 결정할 수 있으므로, 프로브 상 이중표지 시스템의 퀀칭 효율을 최대화하는데 적합한 위치(site)에 표지를 위치시킴으로서 백그라운드 시그널을 최소화 한다.

Description

이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequences Using Dual-Labeled Immobilized Probes on Solid Phase}
본 발명은 이중-표지 고정화 프로브 및 그의 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 타겟 핵산서열을 검출하는 신규한 방법에 관한 것이다.
DNA-기반 마이크로어레이 기술은 유전자 또는 유전자군의 존재, 수준 또는 발현패턴을 분석할 수 있는 유망한 툴로서 큰 각광을 받고 있다(Schena et al., 1995. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science, 270:467-470; DeRisi et al., 1996, Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patterns in Human Cancer, Nature Genetics 14:457-460).
종래의 DNA 마이크로어레이는 일반적으로, 표지된 타겟 서열을 고상 기질에 고정되어 있는 프로브와 혼성화시키고 표지로 부터의 시그널을 측정함으로써 타겟 서열을 검출한다. 그러나, 타겟 서열에 직접 표지를 하는 것은 비용 및 시간적인 면에서 효율적이지 않으며, 타겟 서열의 양(level)에 영향을 끼칠 가능성이 높다.
이러한 종래 마이크로어레이 기술들의 문제점을 극복하기 위하여, 표지된 타겟 서열을 이용하는 대신 분자적 비콘 프로브(molecular beacon probe)가 제안되었다(Steemers et al., Nat Biotechnol, 18:91-94(2000); Kim et al., Biosensors Bioelectronics, 22:1041-1047(2007)). FRET 현상을 이용하는 분자적 비콘 프로브 기술은, 상기 프로브가 타겟 서열에 혼성화 되는 경우에만 형광 시그널을 제공하므로 타겟 서열을 실시간 방식으로 검출할 수 있게 한다.
그러나, 타겟 서열과의 혼성화에 크게 의존적인 많은 방법들은 교차 반응(cross reactions)에 의한 위양성 데이터의 심각한 문제가 발생되어, 최종 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다.
고정화된 이중-표지 프로브를 이용하는 혼성화 과정 외에, 추가적인 엑소뉴클레아제 반응을 이용하는 몇몇 접근법들, 예컨대, 고상에서의 TaqMan 프로브 방법, 이 제안되었다(Liu et al., Nucleic Acid Res. 34:e4 (2006)). Liu 등은 고상 기질 상에 고정화된 이중-표지 프로브를 이용하였으며, 프로브의 5’-말단에 퀀처 분자, 3’-말단에 형광 리포터 분자가 연결되어 있다. 상기 프로브는 업스트림 프라이머의 연장 과정 동안 DNA 중합효소의 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 의하여 절단된다. 절단 반응 후, 퀀처 분자는 해리되고 형광 리포터 분자는 고상 기질에 잔류하게 되어, 고상 기질에서 발생하는 형광 시그널을 측정함으로써 최종적으로 타겟 서열을 검출한다. 혼성화 뿐만 아니라 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하는 TaqMan 프로브 어레이 방법은, 고상에서의 타겟 특이성을 향상시키면서 실시간 방식으로 타겟 서열을 검출 할 수 있도록 한다.
그러나, TaqMan 프로브 어레이 방법에서의 DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성은 형광 리포터 분자가 표지된 뉴클레오타이드까지 절단할 수 있으므로 고상 기질에 형광 리포터 분자가 잔류하지 못 할 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 형광 리포터 분자가 DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되지 않는 비절단 부위에 위치하도록, 이중-표지 프로브를 디자인한다. 프로브 상의 비절단 부위는, 절단 반응 동안 절단되어 짧아지는 프로브가 타겟 핵산서열로부터 변성됨으로써 주어질 수 있다. 이러한 목적으로, 형광 리포터 분자를 3’-말단에 위치시킨다.
따라서, TaqMan 프로브 어레이 방법에서는 퀀처 분자와 형광 리포터 분자 간의 거리가 멀어지게 된다. 프로브 상의 이중표지의 거리가 멀수록, 이중표지 시스템의 퀀칭 효율은 낮아진다. 낮은 퀀칭 효율은 스팟에 따라 서로 다른 백그라운드 시그널의 발생을 야기하고, 최종적으로 오류 결과를 나타낸다.
게다가, TaqMan 프로브 어레이 방법은 DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하기 때문에, 업스트림 프라이머가 필요하다. 이러한 추가적인 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머)의 사용에 관련된 제한은 멀티플렉스 타겟 검출을 위한 마이크로어레이 상의 반응 조건을 정립하기 어렵게 만들며, 이는 위양성 결과를 발생시키는 요인 중 하나가 된다.
한편, WO 2008/011004는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 절단 활성을 이용하는 LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR)에서의 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하는 TaqMan 프로브-기반 방법과 달리, WO 2008/011004에서의 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성은 프라이머의 도움을 필요로 하지 않는다. 게다가, WO 2008/011004는, 3개 이상의 메틸렌기(CH2)에 의한 표지와 프로브의 5’-말단 사이의 결합은, 프로브가 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 의해 보다 효율적으로 절단되도록 하는 반면, 메틸렌(CH2)쇄를 이용하지 않는 표지와 프로브의 5’-말단 사이의 결합은 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대하여 프로브가 저항성을 갖도록 한다는 것을 개시하고 있다.
프라이머의 도움 없이 프로브의 변형에 의해서 조절 가능한 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대한 민감도 또는 저항성을 이용하는 반응은, 추가적인 연구 및 개발에 의하여 고상에서의 타겟 검출에 적용될 수 있다.
종래의 DNA 마이크로어레이 방법들에 관련된 문제점을 극복하고, 타겟 서열, 바람직하게는 다수의 타겟 서열을 하나의 DNA 마이크로어레이 상에서 보다 간편하면서도 신뢰도 및 재현성 있게 검출할 수 있는 신규한 DNA 마이크로어레이 기술 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 게다가, 실시간 방식으로 고상에서 반응을 실시하고 시그널을 검출하는 신규한 실시간 마이크로어레이 방법 또한 타겟 핵산 서열의 정량적 분석 분야에서 필요로 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자는 상호작용적 이중표지를 갖는 프로브를 이용하여 고상에서 보다 간편한 방식으로 위양성 및 위음성 결과없이 타겟 핵산서열을 검출, 식별 및 정량 할 수 있는 신규한 타겟 검출 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자는 이중-표지 프로브 상의 표지의 결합 위치 및 패턴을 다양하게 조절하였다. 흥미롭게도, 본 발명자는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대한 염기-표지 뉴클레오타이드의 저항성을 발견하였고, 또한 타겟 핵산서열을 검출하는데 탁월하게 적용할 수 있는 이중-표지 프로브 상의 표지의 결합 위치 및 패턴을 발견하였으며, 이는 이중표지 중 제1표지는 프로브의 5’-말단에 결합되고 제2표지는 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합되는 것이다. 본 발명의 독특한 표지 방식은 프로브가 타겟 핵산서열의 존재 유무에 따라 시그널을 발생(시그널 발생, 증가 또는 감소를 포함)하도록 유도할 뿐 만 아니라 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 한다.
본 발명의 내적 블록킹 이중표지-프로브(internally blocked dual-labeled probe)는 내부 표지(즉, 제2표지)의 위치를 자유로이 결정할 수 있도록 하며, 위양성 및 위음성 데이터 없이, 재현성 있게 고상 기질 상에 최종적으로 잔류된 표지로부터 시그널을 얻을 수 있도록 한다. 본 발명자는, 본 발명이 프로브를 이용하여 고상 기질 상에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서, 가장 최적화된 프로토콜을 제공한다고 판단한다.
따라서, 본 발명의 목적은 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 올리고뉴클레오타이드에 부여하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 타겟 검출 방법에 관한 것으로서, 프로브 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 염기에 표지를 결합시킴으로써 부여되는, DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 독특한 저항성을 이용한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는 이중-표지 프로브를 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 고정화 프로브에 혼성화 시키는 단계로서, 상기 고정화 프로브는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 상기 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되고; 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되고, 이러한 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물을 상기 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소와 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 고정화 프로브는 상기 DNA 중합효소의 엑소핵산 절단 반응에 의해 절단되어 상기 제1표지가 상기 고정화 프로브로부터 해리되어, 상기 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기하며;
(c) 상기 DNA 중합효소의 상기 엑소핵산 절단 반응을 상기 제2표지가 표지된 상기 뉴클레오타이드에서 종료시키는 단계로서; 상기 엑소핵산 절단 반응의 종료는 상기 제2표지가 결합된 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 유도되고, 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하며; 그리고
(d) 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화를 검출하는 단계로서; 상기 고정화 프로브의 상기 절단에 의한 상기 시그널 변화는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자는 상호작용적 이중표지를 갖는 프로브를 이용하여 고상에서 보다 간편한 방식으로 위양성 및 위음성 결과없이 타겟 핵산서열을 검출, 식별 및 정량 할 수 있는 신규한 타겟 검출 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자는 이중-표지 프로브 상의 표지의 결합 위치 및 패턴을 다양하게 조절하였다. 흥미롭게도, 본 발명자는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대한 염기-표지 뉴클레오타이드의 저항성을 발견하였고, 또한 타겟 핵산서열을 검출하는데 탁월하게 적용할 수 있는 이중-표지 프로브 상의 표지의 결합 위치 및 패턴을 발견하였으며, 이는 이중표지 중 제1표지는 프로브의 5’-말단에 결합되고 제2표지는 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합되는 것이다.
본 발명의 독특한 표지 방식은 프로브가 타겟 핵산서열의 존재 유무에 따라 시그널을 발생(시그널 발생, 증가 또는 감소를 포함하는)하도록 유도할 뿐 만 아니라 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 한다.
본 발명의 내적 블록킹 이중표지-프로브(internally blocked dual-labeled probe)는 내부 표지(즉, 제2표지)의 위치를 자유로이 결정할 수 있도록 하며, 위양성 및 위음성 데이터 없이, 재현성 있게 고상 기질 상에 최종적으로 잔류된 표지로부터 시그널을 얻을 수 있도록 한다. 본 발명자는, 본 발명이 프로브를 이용하여 고상 기질 상에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서, 가장 최적화된 프로토콜을 제공한다고 판단한다.
본 발명자는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 조절하고자 예의 연구 노력하였고, 흥미롭게도 그의 염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는다는 것을 발견하였다.
이러한 발견을 기초로 하여, 본 발명자는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 올리고뉴클레오타이드에 부여하는 신규한 접근법을 정립하였다.
또한, 본 발명자는 이러한 발견을 고정화된 이중-표지 프로브에 적용하여, 표지 위치의 제한 없이 고상에서 이중-표지 프로브를 이용한 신규한 타겟 검출 방법을 정립하였다. 본 발명자가 아는 한도에서, 이러한 접근법은 본 발명자에 의해서 최초로 제시되었으며, 이는 보다 효율적이고 정확하게 타겟 핵산 서열이 검출되도록 한다.
이중-표지 프로브의 절단 반응을 이용하는 종래 고상 방법들에 있어서, 타겟 핵산서열은, 절단 반응에서 프로브 상의 내부 뉴클레오타이드에 결합된 표지가 고상 기질 상에 잔류하는 경우에만 검출 할 수 있다. DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하는 TaqMan 프로브-기반 방법에 있어, 절단 반응에서 점차 짧아지는 프로브는 프로브 서열 및 반응 조건에 따라 타겟 핵산서열로부터 변성(denaturation)되어, 프로브 상에 비절단 부위의 형성을 초래할 수 있다. 따라서, 표지가 프로브 상의 비절단 부위에 위치하게 되는 경우, 표지는 최종적으로 고상 기질 상에 잔류할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 프로브 상의 내부 뉴클레오타이드에 결합된 표지가 비절단 부위 상에 위치하도록 반응 조건을 고려하여야 하는 심각한 문제점이 있다. 이러한 한계 때문에, 이중표지가 상당히 이격되도록 이중-표지 프로브를 디자인하여야 한다. 프로브 상의 이중표지의 거리가 멀수록, 이중표지 시스템의 퀀칭 효율은 낮아진다. 낮은 퀀칭 효율은 스팟에 따라 서로 다른 백그라운드 시그널의 발생을 야기하고, 최종적으로 오류 결과를 나타낸다.
본 발명은 상술한 종래 방법들의 문제점들을 극복하고, 이중-표지 프로브를 이용하여 고상에서 타겟 핵산서열이 검출되도록 한다. 본 발명에 따르면, 프로브의 내부 뉴클레오타이드의 염기와 표지의 결합은 내부 뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 한다. 고상 기질 상에 고정화된 프로브는 DNA 중합효소의 절단 반응을 겪게 되며, 내부 뉴클레오타이드의 염기에 결합된 표지는 저항성으로 인하여 고상 기질 상에 잔류하게 된다. DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하는 TaqMan 프로브-기반 방법과 달리, 본 발명은 반응 조건에 따라 비절단 부위를 고려할 필요 없이, 프로브 상의 내부 표지의 위치를 자유로이 결정할 수 있도록 하며, 프로브 상 이중표지 시스템의 퀀칭 효율을 최대화하는데 적합한 위치(site)에 표지를 위치시킴으로서 백그라운드 시그널을 최소화 한다.
바람직하게는, 본 발명에 이용되는 고정화 프로브는 고상 기질 상의 그의 3’-말단을 통하여 고정화된다. 상호작용적 이중표지 중의 하나는 고정화 프로브의 5’-말단에 있는 염기를 제외한 뉴클레오타이드의 구조에 카본 스페이서를 통하여 결합되며, 다른 하나는 내부 뉴클레오타이드의 염기에 연결된다. 본 발명에 따르면, 타겟 핵산서열과 혼성화되는 고정화 프로브는 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의하여 그의 5’-말단에서 5’→ 3’방향으로 점차적으로 절단되어 그의 5’-말단에 있는 제1표지가 해리된다. 상기 효소가 염기 성분에 표지된 내부 뉴클레오타이드와 만나면, 그 저항성으로 인하여 절단 반응은 종료되고 내부 뉴클레오타이드의 표지는 최종적으로 고상 기질에 잔류하게 된다.
일반적으로, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성은 업스트림 뉴클레오타이드-의존적 활성 및 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 활성으로 분류된다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 프라이머, 프라이머의 연장산물 및 절단되는 올리고뉴클레오타이드의 업스트림에 위치하는 프로브를 포함한다. 본 발명은 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 활성을 이용하기 때문에, 본 명세서에서 사용되는 용어 “DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성”은 특별한 언급이 없는 한, DNA 중합효소의 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 의미한다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다:
본 발명에 따르면, 타겟 핵산서열은 고상 기질 상에 고정화된 이중-표지 프로브에 혼성화 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 또한, 프로브는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 증폭에 있어서 최대 효율성을 갖는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드는 변형 또는 비-자연 염기를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에서 이용되는 고정화 프로브는 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 고정화 프로브는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다. 바람직한 고상 기질은 적합한 고상 또는 반-고상 지지체를 포함하며, 예컨대 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자성 또는 비자성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 극미립자 및 모세관이다. 비록 일부 구현예에서, 서로 다른 화합물들에 대하여 합성 구역, 예컨대, 웰, 레이즈드 리전(raised region), 핀, 엣지드 트렌키(etched trench) 등의 구역을 물리적으로 분리시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 다수의 구현예에서는 고상 기질의 최소 하나의 표면은 실질적으로 평면일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 고상 기질(들)은 비드, 수지, 겔, 마이크로스피어, 또는 다른 기하학적 배열의 형태를 취할 것이다.
바람직하게는, 고상 기질은 마이크로어레이를 포함한다. 프로브는 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적으로 고정화된다(바람직하게는 간접적으로). 또한, 프로브는 공유 또는 비-공유결합 방식으로 고상 기질의 표면에 고정화될 수 있다. 프로브가 간접적으로 고상 기질의 표면에 고정화 되는 경우, 적합한 링커를 이용할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 링커는 마이크로어레이에서 프로브를 고정화 하는 데 이용되는 어떠한 링커도 포함한다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 프로브 고정화를 위한 링커로 이용된다. 또한, 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일이 링커로써 이용되어 효소 작용(예를 들어, 효소적 절단 반응)을 억제할 가능성이 높은 공간적 방해(space hindrance)를 감소시키거나 또는 혼성화 효율을 증가시킬 수 있다. 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일은 프로브의 서열에 포함되지 않는다.
본 발명에 이용되는 고정화 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중-표지 시스템을 갖는다.
상기 상호작용적 표지 시스템은 공여체 분자(리포터 분자) 및 수용체 분자(퀀처 분자) 사이에 에너지가 비-방사능적 (non-radioacively)으로 전달되는 시그널 발생 시스템이다.
상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다.
상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성, 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다.
보다 바람직하게, 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지에 의해 발생되며, 가장 바람직하게는 FRET 표지 시스템이다.
프로브에 있어서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예로는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) 미국 특허 번호 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
리포터 분자 및 퀀처 분자는 각각 형광성일 수 있다. 또한, 리포터 분자는 형광성이나 퀀처 분자는 비-형광성일 수 있다. 예를 들어, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광성 다크 퀀처를 본 발명에서 이용할 수 있다. 퀀처 분자가 형광성일 경우, 형광성 퀀처 분자의 시그널 변화로부터 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
고정화 프로브 상의 이중-표지 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 색소 (fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 색소(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
리포터 분자 및 퀀처 분자는 종래 방법들에 따라 프로브에 연결될 수 있다. 예를 들어, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 개의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-탄소 스페이서, 6- 탄소 스페이서, 9- 탄소 스페이서 또는 12-탄소 스페이서)를 통해 프로브에 연결될 수 있다.
본 발명에 이용되는 고정화 프로브에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택된 제1표지는 고정화 프로브의 5’-말단에 결합되며, 리포터 분자 및 퀀처 분자로부터 선택된 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합 된다.
바람직하게는, 고정화 프로브의 5’-말단에 결합된 제1표지는 5’-말단의 포스페이트기에 직접적 또는 간접적(예컨대, 링커를 통하여)으로 결합될 수 있다. 택일적으로, 제1표지는 5’-말단의 리보스(ribose)에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 리보스의 5- 탄소이다.
고정화 프로브 상의 제2표지는 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합된다. 제2표지는 아데닌, 구아닌, 사이토신 또는 타이아민에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 타이아민이다.
제2표지에 의한 염기의 표지는 염기가 수소결합을 하는 위치 이외의 위치에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제2표지는 타이아민의 5번 또는 6번 탄소에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 타이아민의 5번 탄소의 메틸기이다.
흥미롭게도, 본 발명자는 제2표지에 의한 염기의 표지는 표지된 뉴클레오타이드에게 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 부여한다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “저항성”은 뉴클레오타이드 분자가 DNA 중합효소의 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성에 의해 거의 절단되지 않거나 전혀 절단되지 않는 것을 의미하며, 바람직하게는 전혀 절단되지 않는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1표지는 퀀처 분자이고 제2표지는 리포터 분자이다. 택일적으로, 제1표지는 리포터 분자이고 제2표지는 퀀처 분자이다.
본 발명에 이용되는 제1표지 및 제2표지는 상호작용적 이중표지 시스템을 제공한다. 이중표지는 특히, 고정화 프로브가 분석하고자 하는 시료의 핵산서열에 혼성화 되지 않는 경우에, 이중표지 간의 에너지 퀀칭이 발생할 수 있는, 고정화 프로브의 위치(site)에 위치한다.
에너지 퀀칭을 위해서, 이중표지는 특정 거리 또는 3-차원적 구조(예컨대, 랜덤 코일 또는 헤어핀 구조)로 프로브 상에 위치한다. 타겟 핵산서열과 혼성화되는 고정화 프로브는 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의하여 그의 5’-말단에서 5’→ 3’방향으로 점차적으로 절단되어 그의 5’-말단에 있는 제1표지가 해리된다. 최종적으로, 제2표지는 고상 기질에 잔류하게 되고, 제1표지 및 제2표지 간의 에너지 퀀칭이 더 이상 발생하지 않아, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 변화(시그널 발생, 소멸, 증가 또는 감소)가 야기된다.
제1표지가 퀀처 분자이고 제2표지가 리포터 분자일 경우, 고정화 프로브의 5’-말단이 엑소핵산 절단 반응에 따라 절단되어 제1표지는 해리되고, 반면 제2표지는 고상 기질 상에 잔류하게 된다. 제2표지인 리포터 분자로부터의 시그널을 측정하여 타겟 핵산서열을 검출한다.
제1표지가 리포터 분자이고 제2표지가 퀀처 분자일 경우, 고정화 프로브의 5’-말단이 엑소핵산 절단 반응에 따라 절단되어 제1표지는 해리되고, 반면 제2표지는 고상 기질 상에 잔류하게 된다. 퀀처 분자가 형광성일 경우, 고상 기질 상에 잔류된 퀀처는 제1표지가 해리되기 전의 초기 시그널과 상이한 형광 시그널을 발생시키고, 이에 의해 타겟 핵산서열이 검출된다. 제2표지인 리포터 분자로부터의 시그널을 측정하여 타겟 핵산서열을 검출한다.
본 발명의 가장 주요한 이점은, 제한 없이 내부 표지의 위치를 결정할 수 있다는 것이다. DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 내부 표지-기인 저항성(internal label-caused resistance) 때문에, 내부 표지는 고정화 프로브의 5’-말단으로부터 이격된 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 바람직하게는, 내부 표지는 이중표지의 퀀칭 효율을 최대화하기에 충분한 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성이 제1표지와 제2표지 사이의 부위에 작용할 만큼은 제1표지와 제2표지는 서로 이격되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 고정화 프로브 상의 절단 위치(cleavage site)에 의하여 제1표지로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 특정 반응 조건 하에서 저항성으로 절단 반응을 종료시킬 적합한 위치에 위치한다.
바람직하게는, 제2표지는 제1표지로부터 최소 2 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 3 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
바람직하게는, 제2표지는 제1표지로부터 2-25 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 2-15 뉴클레오타이드, 3-25 뉴클레오타이드, 3-20 뉴클레오타이드, 3-15 뉴클레오타이드, 4-25 뉴클레오타이드, 4-20 뉴클레오타이드 또는 4-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는, 절단된 프로브가 타겟 핵산서열로부터 변성됨으로써 비절단되는 부위에 위치하지 않는다. 이러한 이유로 비절단 부위는 반응 조건 또는 프로브 서열에 의존적이며, 이는 제2표지의 위치를 결정하는 결정요인이 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 고정화 프로브의 3’-말단으로부터 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 20 뉴클레오타이드, 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 25 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명은 검출하고자 하는 타겟 핵산서열이 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않으며, 어떠한 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자도 포함한다. mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다. 본 발명에서 검출할 수 있는 타겟 핵산서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등 동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
프로브 또는 프라이머의 어닐링 또는 혼성화는 당업계에 공지된 다양한 혼성화 과정들에 의해 실시할 수 있다. 본 발명의 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온 세기와 같은 조건은 다양한 인자, 예컨대 프로브 및 타겟 핵산서열과 같은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양에 따라 다양해 질 수 있다. 혼성화의 상세한 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
예를 들어, 타겟 핵산서열과 고정화 프로브의 혼성화 온도는 40-80℃ 범위이며, 보다 바람직하게는 45-75℃, 보다 더 바람직하게는 50-72℃이다.
혼성화 반응에 이어, 단계 (a)의 결과물을 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소와 접촉시킨다. 고정화 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화된 경우에만, 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의해 절단되어 고정화 프로브로부터 제1표지가 해리되며, 이는 고상 기질 상의 시그널 변화를 야기한다(참조 도 1). 이러한 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
표현 “고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건”은 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의해 고정화 프로브의 절단이 발생하는 반응 조건을 의미하며, 예컨대 온도, pH, 이온 세기, 완충액, 프로브 길이와 서열 및 엑소뉴클레아제의 종류를 포함한다. 예를 들어, Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건은 Tris-HCl 완충액, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
본 발명에서 이용하는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 타겟 핵산서열과의 혼성화에 연관된 프로브에 작용하여 5’→ 3’방향으로 엑소핵산 절단 반응을 촉진하는 효소를 포함한다.
본 발명에서 이용되는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소(예컨대, E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파지 T7 DNA 중합효소)는 바람직하게는 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소이고, 예컨대 Thermus aquaticus ( Taq ), Thermus thermophilus , Thermus filiformis , Thermus flavus , Thermus antranikianii, Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus, Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus, Thermus species Z05 및 Thermus species sps 17을 포함한다.
타겟 핵산서열에 혼성화된 고정화 프로브는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의해 절단되고 고정화 프로브로부터 제1표지가 해리되어, 이에 의해 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기한다.
5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의한 고정화 프로브의 엑소핵산 절단 반응 후, 상기 반응은 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드에서 종료된다. 엑소핵산 절단 반응의 종료는 제2표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 유도되며, 최종적으로 제2표지는 고상 기질 상에 잔류하게 된다.
엑소핵산 절단 반응의 종료에 이어, 고상 기질 상에서 시그널 변화(시그널 증가 또는 감소)를 검출하며, 고정화 프로브의 절단에 의한 시그널 변화는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
시그널은 각 표지에 대한 종래 방법들에 의해 검출 또는 측정될 수 있다. 예를 들어, 형광 시그널은 종래 방법, 예컨대, 형광측정기에 의하여 검출 또는 측정될 수 있다.
최종적으로, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 변화가 고상에서 검출된다. 바람직하게는, 고정화 프로브의 절단에 의한 시그널 변화는 고상 기질 상의 시그널 증가이다.
본 발명의 반응 환경을 제공하는 고상 기질, 바람직하게는 마이크로어레이는 당업계에서 이용되는 어떠한 마이크로어레이도 포함한다. 본 발명의 모든 과정, 즉 타겟 서열과의 어닐링, 연장/절단 및 형광의 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상의 고정화 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질(solid substrate)은, 예를 들어 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 복수의 고정화 프로브는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 구역(region) 또는 복수의 어드레서블 구역(region)에 고정화 되며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 구역을 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화 프로브가 제작(fabricate)될 수 있다.
본 발명은, 고상 기질 상의 고정화 프로브들은 서로 물리적으로 이격되어 있기 때문에, 한 종류의 이중표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 고상 기질 상에서 동시적으로 검출할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 의하여 고상에서 검출되는 타겟 핵산서열의 수는 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 단계(바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 최소 5회, 보다 더 바람직하게는 최소 10회)를 추가적으로 포함한다.
단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 경우, 본 발명은 타겟 핵산서열의 이중 가닥을 단일 가닥으로 변성하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하여 반복적 엑소핵산 절단 반응을 유도하는 경우, 시그널 변화 정도는 타겟 핵산서열의 양에 따라 증가하여, 타겟 핵산서열의 정량을 가능하게 한다. 본 발명을 반복적 엑소핵산 절단 반응에 따라 실시하는 경우, 단계 (d)의 검출은 반복의 종료시점에서(즉, 엔드-포인트 방식), 반복의 각 사이클에서(즉, 실시간 방식) 또는 반복 동안 소정의 시간 간격 각각에서 실시할 수 있다. 실시간 검출은 타겟 핵산서열을 정량화하는데 적합하다.
세척 단계는 단계 (d) 이전에 실시될 수 있다. 그러나, 본 발명은 고상 기질 상의 이중-표지 프로브로부터 해리된 표지 분자의 간섭이 없고 고상 기질을 세척하지 않는 콘포컬 레이저 스캐너와 같은 적합한 기기를 이용하여 고상 기질 상에 존재하는 시그널만을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)는 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함한다. 타겟 핵산서열의 추가적인 생성은 시그널 변화가 강하게 발생되도록 한다.
예를 들어, 최소 2 종의 증폭 프라이머를 이용하여 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 멀티플렉스-증폭하고 최소 2 종의 고정화 프로브에 혼성화시키고 최소 2 종의 역방향 프라이머 및 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 이용하여 연장 및 절단 반응을 실시하면, 최종적으로 역방향 프라이머를 사용하지 않는 반응보다 증가된 시그널 변화를 얻는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브는 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. mDSO 구조는 종래 프로브보다 상당히 높은 타겟 특이성을 갖는다(참조: WO 2011/028041).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브는 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별하도록 하는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)인 것을 특징으로 하는 방법:
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
상기 일반식에서, X’p는 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고; Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되며; 상기 제1표지는 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단에 결합되고, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합되며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내고; 그리고 X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 상기 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 X’p, Y’q, Z’r의 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 타겟 핵산서열에 대한 혼성화 측면에서 상기 5’-제2차 혼성화 부위가 상기 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 TD 프로브의 혼성화 특이성은 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브의 전체 혼성화 특이성을 향상시키며; 상기 TD 프로브가 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단은 상기 DNA 중합효소의 엑소핵산 절단 반응에 의하여 절단되며 상기 제1표지가 상기 TD 프로브로부터 해리되어, 상기 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기하며; 상기 제2표지가 결합된 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 TD 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 분할 부위가 모두 단일가닥을 형성하여 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 DNA 중합효소에 의해 절단되지 않아, 상기 고상 기질 상에서의 시그널의 변화를 야기하지 않으며, 이에 의해 상기 TD 프로브는 상기 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 상기 시그널 변화는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 구별성 프로브(target discriminative probe)"는 상술한 mDSO 구조를 가지며 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열에 서로 다른 패턴으로 혼성화 되어 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 하는 프로브를 의미한다.
상기 mDSO 구조를 갖는 본 발명에서 이용되는 TD 프로브는 (i) 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열의 구별에 결정적인 역할을 하는 5’-제2차 혼성화 부위와 분할부위를 포함한다.
상기 mDSO 구조는 DSO(dual specificity oligonucleotide) 구조의 새로운 변형 형태이며, 상기 DSO는 본 발명자에 의해 처음 제시되었다(참조: WO 2006/095981).
또한 상기 DSO 구조가 프라이머 역할을 하는 경우에는 DPO(dual priming oligonucleotide)로 명명된다(Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)). DSO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5’-고 Tm 특이성 부위(또는 5’-제1차 혼성화 부위, 5’-제1차 프라이밍 부위) 및 3’-저 Tm 특이성 부위(또는 3’-제2차 혼성화 부위, 3’-제2차 프라이밍 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 현저히 향상된 혼성화 특이성을 나타낸다(참조: WO 2006/095981; Kim 등, Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim 등, Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii 등, Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, 상기 DSO는 서로 다른 혼성화 특성을 가지는 두 개의 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5’-제1차 혼성화 부위, 및 타겟 특이성을 결정하는 3’-제2차 혼성화 부위. 이 DSO는 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.
상기 mDSO 구조는 상기 DSO 구조가 역전된 것이다: 타겟 특이성을 결정하는 5’-제2차 혼성화 부위 및 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 3’-제1차 혼성화 부위. TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위가 타겟 핵산서열에 완벽하게 혼성화 되는 경우에만, 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소에 의해 프로브의 5’-말단이 절단되며, 이는 TD 프로브의 놀라운 타겟 특이성에 기여한다.
본 발명에서, TD 프로브는 타겟 핵산서열의 검출, 특히 타겟 핵산서열의 멀티플렉스 검출에서, 위양성 데이터의 제거에 부분적으로 기여하며, 이는 TD 프로브가 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열에 대하여 명확하게 다른 혼성화 행동(behavior)을 나타내기 때문이다.
TD 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위 및 3’-제1차 혼성화 부위 모두가 타겟 핵산과 이중가닥을 형성한다. TD 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화(즉, 비-타겟 혼성화 또는 결합) 되는 경우, 그의 3’-제1차 혼성화 부위가 우세적으로 비-타겟 핵산서열에 결합하지만, 5’-제2차 혼성화 부위 및 분할 부위 모두는 비-타겟 핵산에 혼성화 되지 못하고 단일가닥을 형성하게 된다.
TD 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 그의 5’-제2차 혼성화 부위는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합 효소에 의해서 절단되고, 제1표지(예컨대, 퀀처 분자)는 해리되어 시그널 변화가 발생된다. 제2표지가 표지된 뉴클레오타이드의 저항성 때문에, 제2표지는 고상 기질 상에 잔류하게 된다. 따라서, 고상 기질 상에서 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 변화가 얻어지고, 이에 의해 타겟 핵산서열의 존재가 결정된다.
이와 대조적으로, TD 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 5’-제2차 혼성화 부위 및 분할 부위 모두가 단일가닥을 형성하여 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합 효소에 의해서 절단되지 않는다. TD 프로브의 절단반응이 발생하지 않으면 결국 시그널 변화도 발생하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위에 위치한다. 제2표지가 표지된 뉴클레오타이드의 저항성 때문에, TD 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 된 후 절단되는 경우에도 5’-제2차 혼성화 부위의 제2표지는 절단되지 않고 고상 기질 상에 잔류한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2’-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2’-OMe 이노신, 2’-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2’-OMe 3-니트로피롤, 2’-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2’-OMe 5-니트로인돌, 2’-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2’-F 네불라린, 2’-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2’-0-메톡시에틸이노신, 2’-0-메톡시에틸 네불라린, 2’-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2’-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2’-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
바람직하게는, 분할 분위는 최소 3 개, 보다 바람직하게는 최소 4 개, 가장 바람직하게는 최소 5 개의 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 분할부위는 최소 3 개, 보다 바람직하게는 최소 4 개, 가장 바람직하게는 최소 5 개의 유니버설 염기를 갖는 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다. 택일적으로, 분할부위는 3-10, 3-8, 4-7 또는 4-5 연속된 유니버설 염기를 포함한다.
바람직하게는, 3’-제1차 혼성화 부위의 길이는 5’-제2차 혼성화 부위보다 길다. 3’-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는 15-60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-40 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 5’-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최소 3 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 5 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 6 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 5’-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최대 15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최대 13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 12 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 5’-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 3-15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4-12 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-11 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 분할 부위는 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-8 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4-7 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 4-5 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 5’-제2차 혼성화 부위 및 분할 부위의 길이는 바람직하게는 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 9 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 12 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 3’-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-70℃의 Tm이다. 5’-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 6-40℃의 Tm을 가지며, 보다 바람직하게는 10-40℃의 Tm이다. 분할 부위는 바람직하게는 2-15℃의 Tm을 가지며, 보다 바람직하게는 3-15℃의 Tm이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 TD 프로브의 5’-제2차 혼성화 부위에 위치한다. 보다 바람직하게는, 5’-제2차 혼성화 부위 상의 제2표지는 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단에 결합된 제1표지로부터 2-15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2-10 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 타겟 핵산서열은 증폭용 프라이머에 의해 전-증폭된 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출의 민감도와 특이성을 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 역방향 프라이머 또는 증폭용 프라이머는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조는 본 명세서 전체에 참조로 삽입된 WO 2006/095981에서 개시한 것처럼 종래 프라이머보다 상당히 높은 타겟 특이성을 갖는다.
프라이머 또는 프로브를 언급하면서 사용되는 용어 “종래”는 mDSO 구조 또는 DPO 구조를 갖지 않는 모든 프라이머 또는 프로브를 의미한다. 그것들은 본 명세서에서 종래 프라이머 또는 프로브로 설명된다.
본 발명은 최소 2 종의 타겟 핵산서열의 동시적(멀티플렉스) 검출에도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2 종의 핵산서열을 포함하고(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종), 프로브(및/또는 역방향 프라이머)는 최소 2 종의 프로브를 포함한다(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종).
게다가, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에도 매우 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 연속적 DNA 단편들 또는 서열이 유사한 DNA 단편들에서 특정 위치에 존재하는 DNA 서열의 뉴클레오타이드의 다양성을 의미한다. 그러한 연속적 DNA 단편은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입, 치환 및 트랜스로케이션을 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예 따르면, 고정화 프로브는 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 또는 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는 이중-표지 프로브를 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 키트를 제공한다:
(a) 고상 기질;
(b) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고정화 프로브; 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 상기 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되고; 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되고, 이러한 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고; 및
(c) 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 상기 DNA 중합효소.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위하여 제작된 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1표지는 퀀처 분자이고 제2표지는 리포터 분자이다. 택일적으로, 제1표지는 리포터 분자이고 제2표지는 퀀처 분자이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 고정화 프로브 상의 절단 위치(cleavage site)에 의하여 제1표지로부터 분리된다. 바람직하게는, 제2표지는 제1표지로부터 2-20 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다. 보다 바람직하게는, 제2표지는 제1표지로부터 4-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1표지는 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2표지는 상기 고정화 프로브에서 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 결합된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 키트는 고정화 프로브에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고정화 프로브는 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별하도록 하는 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)이다.
바람직하게, 본 키트는 타겟 핵산서열 증폭용 프라이머 세트를 추가적으로 포함하며, 상기 타겟 핵산서열은 전-증폭된 핵산서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2 종의 핵산서열을 포함하고 고정화 프로브는 최소 2 종의 프로브를 포함한다. 바람직하게는, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼와 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 올리고뉴클레오타이드에 부여하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 및
(b) 상기 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드의 염기에 표지를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계로서, 이에 의해 상기 뉴클레오타이드는 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는다.
본 발명은 상술한 검출 방법에 이용되는 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 염기-표지 뉴클레오타이드의 저항성에 관련된 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 타겟 핵산서열에 상보적인 서열을 갖도록 결정될 수 있다. 뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화될 수 있는 범위내에서, 뉴클레오타이드 서열은 타겟 핵산서열에 대한 하나 또는 그 이상의 미스매치 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 올리고뉴클레오타이드는 프로브이다.
올리고뉴클레오타이드의 합성은, 개시된 종래 방법들에 의하여 실시될 수 있다(예컨대 Needham-VanDevanter 등이 Nucleic Acids Res., 12:6159-6168(1984)에서 개시한 자동 합성기를 이용하는 고상 포스포라미디트 트리에스테르 방법(solid phase phosphoramidite triester method, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862(1981)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지가 결합된 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 내부 뉴클레오타이드이다.
뉴클레오타이드의 염기 성분과 표지의 결합은 개시된 종래 방법들에 의하여 실시될 수 있다(Nelson, 등, Nucleic Acids Research 20(23):6253-6259(1992); 미국 특허 번호 제4,757,141호, 제5,559,767호 및 제5,231,191호; 및 Haralambidis 등, Nucleic Acids Research, 15:4856-4876 (1987)).
표지가 결합되는 염기 성분은 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 타이아민을 포함하며, 바람직하게는 타이아민이다.
표지에 의한 염기 성분의 표지는 타겟 핵산서열이 수소결합을 하는 위치 이외의 위치에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 표지는 타이아민의 5번 또는 6번 탄소에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 타이아민의 5번 탄소의 메틸기이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 염기 성분과 표지의 결합이 올리고뉴클레오타이드가 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 한다는 독특한 특징을 이용한다. 본 발명은 고상에 고정화된 프로브 상의 이중-표지 시스템과 함께, 이러한 독특한 특징을 타겟 검출 시스템에 적용한다. 그의 5’-말단 및 내부 부위에 표지를 갖는 고정화 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 고정화 프로브는 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의하여 그의 5’-말단에서 5’→ 3’방향으로 점차적으로 절단되어 그의 5’-말단에 있는 표지가 해리된다. 저항성으로 인하여 염기 성분에 표지된 내부 뉴클레오타이드에서 절단 반응이 종료되고, 결국, 내부 뉴클레오타이드의 표지는 고상 기질에 잔류하게 되어, 최종적으로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 변화가 제공된다.
(b) 본 발명은, 내부 뉴클레오타이드의 염기 성분의 표지로 인한 DNA 중합효소의 프라이머-독립적 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성에 의하여 제2표지가 고상 기질 상에 잔류하기 때문에, 고상 기질 상에 제2표지가 잔류하도록 적합한 위치를 고려할 필요가 없다. 이와는 달리, DNA 중합효소의 프라이머-의존적 5’→ 3’뉴클레아제 활성을 이용하는 고상 기질에서의 TaqMan 프로브-기반 방법은 고상 기질에 제2표지를 잔류시키기 위하여 반응조건을 고려하여 제2표지의 위치를 엄격하게 결정하여야 한다.
(c) 본 발명은 프로브 상의 내부 표지의 위치를 자유로이 결정할 수 있으므로, 이중표지 시스템의 퀀칭 효율을 최대화하는데 적합한 프로브 상 위치에 표지를 위치시킴으로서 백그라운드 시그널을 최소화한다.
(d) 본 발명에서 사용되는 바람직한 프로브인 mDSO 구조를 갖는 TD 프로브는, 종래 프로브가 비-타겟 핵산서열에 비-특이 혼성화함으로써 일반적으로 발생되는 위양성 시그널의 제거에 부분적으로 기여한다.
(e) 상호작용적 이중표지를 이용하는 본 발명은 엔드-포인트 또는 실시간 방식으로 고상에서의 시그널 변화(시그널 감소 또는 증가)를 측정할 수 있으며, 타겟 핵산서열의 정성적인 분석 뿐 만 아니라 정량적인 분석도 할 수 있다.
(f) 본 발명은 프로브 및 타겟 핵산 서열 간의 혼성화 뿐만 아니라 효소적 반응(DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의한)에 의한 시그널 변화를 제공한다. 즉, 본 발명의 타겟 특이성은 이중적으로 결정되어, 프로브의 비-특이적 혼성화에 의한 위양성 결과 문제가 성공적으로 해결된다. 게다가, 본 발명의 순환적 반복(cyclic repetition)은 고정화 프로브가 시그널 변화를 제공하도록 하며, 따라서 시그널 변화 정도를 최대화 할 수 있다.
(g) 본 발명은, TaqMan 프로브-기반 방법과 달리, 프라이머의 사용 없이, 고정화된 프로브만을 이용하여 실시 할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 다수의 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정 및 반응 조건의 최적화에서의 곤란성 및 비용 대비 비효율성과 같은, 다수의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법에서 나타나는 문제점들로부터 완벽하게 자유롭다. 이와 같은 이점은 멀티플렉스 타겟 검출에서 보다 명확하게 인식된다.
(h) 본 발명은, 고상 기질 상의 고정화 프로브들이 서로 물리적으로 이격되어 있으므로, 한 종류의 이중표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 고상 기질 상에서 동시적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 과정을 도식적으로 보여준다.
도 2-4는 프로브의 뉴클레오타이드의 염기 성분과 표지의 결합에 의하여 부여된, 일부 DNA 중합 효소들의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성 결과들을 보여준다. 도 2-4는 각각 Taq , Tth 및 Tfl DNA 중합효소를 이용하였다.
도 5는 마이크로어레이 상에서 이중-표지 프로브 및 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용한 타겟 핵산서열의 검출 결과를 보여준다. 종래 구조를 갖는 이중-표지 프로브를 이용하였다.
도 6은 마이크로어레이 상에서 이중-표지 프로브 및 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용한 타겟 핵산서열의 검출 결과를 보여준다. mDSO(modified dual specificity oligonucleotide) 구조를 갖는 이중-표지 프로브를 이용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: DNA 중합 효소의 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성의 평가
본 발명자는, 그의 염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드가 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 가지는 지 여부를 평가하였다.
이러한 평가를 위하여, Staphylococcus aureus(SA) 유전자의 합성 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 사용하였다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq , Tth 및 Tfl DNA 중합효소를 5’→ 3’엑소핵산 절단 반응(5’→ 3’exonucleolytic reaction)에 이용하였다. 이중-표지 프로브를 이 평가에 이용하였다. 상기 프로브는 그의 5’-말단에 있는 포스페이트 기(phosphate group)(SEQ ID NO: 2) 또는 티미딘 뉴클레오타이드의 티민(thymine of a thymidine nucleotide)(SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6 및 7)에 결합된 형광 리포터 분자(fluorescent reporter molecule, FAM)를 갖고, 그의 3’-말단에는 퀀처 분자(BHQ-1)를 갖는다. 본 실시예에서 이용된 프로브들은 Biosearch Technologies Inc.(USA)로부터 제공받았다. 카본 스페이서(C6 spacer)를 포함하고 있는 FAM을 프로브(Biosearch Technologies Inc., USA) 제작에 이용하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
SA-T 5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTT
GAATTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)
SA-Con-M1 [FAM]TCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 2)
SA-Con-D0(dT) [T( FAM )]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 3)
SA-Con-D1(dT) G[T( FAM )]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 4)
SA-Con-D3(dT) TGG[T( FAM )]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 5)
SA-Con-D5(dT) CGTGG[T( FAM )]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 6)
SA-Con-D8(dT) TTCCGTGG[T( FAM )]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO: 7)
(밑줄 친 문자는 형광 리포터 분자가 결합된 티민을 가리킨다)
SA에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 0.5 pmole, 프로브(SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 5 pmole, 10 X 반응 버퍼(5 mM MgCl2) 2 ㎕, dNTPs 각각 50 μM, Taq(Solgent, Korea), Tth(Epicentre Biotechnologies, US) 또는 Tfl DNA 중합효소(Epicentre Biotechnologies, US) 2 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반복적 엑소핵산 절단 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 2 분간 변성시키고 95℃에서 20 초, 55℃에서 20 초 과정을 50 회 반복하였다. 각 사이클의 55℃에서 시그널을 검출하였다.
도 2, 3 및 4에서 보여주는 바와 같이, 타겟 핵산이 존재하는 경우, 5’-말단에 있는 포스페이트 기에 형광 리포터 분자가 결합된 프로브(SEQ ID NO: 2)는 형광 시그널이 발생하였다. 그러나, 타겟 핵산이 존재하더라도, 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 형광 리포터 분자가 결합된 프로브(SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6 및 7)는 형광 시그널이 발생되지 않았다. 타겟 핵산이 없는 경우, 형광 시그널은 발생되지 않았다.
이러한 결과는, 염기에 표지를 갖는 뉴클레오타이드가 DNA 중합 효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 2: 이중-표지 프로브 및 DNA 중합 효소의 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용한 마이크로어레이 상에서의 타겟 핵산서열의 검출
본 발명자는 이중-표지 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에, 염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드의 저항성을 적용하였다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 5’→ 3’엑소핵산 절단 반응에 이용하였다.
이중-표지 프로브는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 갖고 또한 내부 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 결합된 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는다. 카본 스페이서(C6 spacer)를 포함하고 있는 Quasar570을 이용하여 상기 프로브(Biosearch Technologies Inc., USA)를 제작하였다. 추가적으로 삽입된 카본 스페이서(C6 spacer)를 통하여 BHQ-2를 결합하였다. 프로브의 3’-말단에 있는 아미노 기(AminnoC7)를 이용하여 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정화시켰다. 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브를 그의 3’-말단에 있는 아미노 기를 이용하여 유리 슬라이드 상에 고정화시켰다. Staphylococcus aureus(SA) 에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 이용하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 이중-표지 프로브 및 마커의 서열은 다음과 같다:
SA-T 5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTT
GAATTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)
SA-Con-M [BHQ-2][C6 spacer]TCATTCCG[T( Quasar570 )]GGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC
TTTTT[AminoC7] (SEQ ID NO: 8)
Marker [Quasar570]ATATATATAT[AminoC7] (SEQ ID NO: 9)
(밑줄 친 문자는 형광 리포터 분자가 결합된 티민을 가리킨다)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 상기 이중-표지 프로브(SEQ ID NO: 8) 및 마커(SEQ ID NO: 9)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)로 최종 농도 50 μM이 되도록 용해시킨 상기 이중-표지 프로브 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅 하였다. 상기 이중-표지 프로브 및 마커를 2x1 포맷(duplicate spots)으로 나란히 스팟팅(spotting) 하였고, 이렇게 하여 제작된 슬라이드를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 비-특이적으로 결합된 이중-표지 프로브 및 마커를 제거하기 위하여, 상기 슬라이드들을 2x SSPE(0.3 M 소디윰 클로라이드, 0.02 M 소디윰 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에 37℃에서 30 분 동안 세척하고 증류수로 세척하였다. 그 후 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드들을 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실에서 보관하였다.
SA에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 10 pmole, 10X 반응 버퍼(6 mM MgCl2) 3 ㎕, dNTPs 각각 200 μM 및 Diastar-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.2 unit을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 엑소핵산 절단반응을 실시하였다; 상기 이중-표지 프로브(SEQ ID NO: 8)가 교호결합(cross-linked)된 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물을 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 상기 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 2 분간 변성 및 55℃에서 60 분. 최종적으로, 상기 슬라이드를 100℃에서 1 분간 증류수로 세척하였다. 각각 세척한 이후, 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(Molecular Device, USA)를 이용하여 10-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어인 GenePix pro6.0 소프트웨어(Molecular Device, USA)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2 개씩 스팟팅하였다. 형광 강도는 2 개의 스팟의 평균 값으로 나타냈다.
도 5에서 보여주는 바와 같이, 타겟 핵산이 존재하는 경우 형광 시그널이 발생하였다(RFU: 65,486 ± 0.7). 타겟 핵산이 없는 경우에는 형광 시그널이 발생하지 않았다.
실시예 3: 이중-표지 TD 프로브 및 DNA 중합 효소의 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 이용한 마이크로어레이 상에서의 타겟 핵산서열의 검출
본 발명자는 이중-표지 TD 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출에, 염기에 표지가 결합된 뉴클레오타이드의 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 적용하였다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 5’→ 3’엑소핵산 절단 반응에 이용하였다.
이중-표지 TD 프로브는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 갖고 또한 5’-제2차 혼성화 부위에 위치한 내부 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 결합된 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는다. 카본 스페이서(C6 spacer)를 포함하고 있는 Quasar570을 이용하여 상기 프로브(Biosearch Technologies Inc., USA)를 제작하였다. 추가적으로 삽입된 카본 스페이서(C6 spacer)를 통하여 BHQ-2를 결합하였다. TD 프로브의 3’-말단에 있는 아미노 기(AminnoC7)를 이용하여 TD 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정화시켰다. 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브를 그의 3’-말단에 있는 아미노 기를 이용하여 유리 슬라이드 상에 고정화시켰다. Staphylococcus aureus(SA) 에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 이용하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 이중-표지 TD 프로브 및 마커의 서열은 다음과 같다:
SA-T 5’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTT
GAATTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)
SA-TD-M [BHQ2][C6 spacer]TCATTCCG[T( Quasar570 )]GGIIIII CATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC
TTTTT[AminoC7] (SEQ ID NO: 10)
Marker [Quasar570]ATATATATAT[AminoC7] (SEQ ID NO: 9)
(밑줄 친 문자는 형광 리포터 분자가 결합된 티민을 가리킨다)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 상기 이중-표지 TD 프로브(SEQ ID NO: 10) 및 마커(SEQ ID NO: 9)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)로 최종 농도 50 μM이 되도록 용해시킨 상기 이중-표지 TD 프로브 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅 하였다. 상기 이중-표지 TD 프로브 및 마커를 2x1 포맷(duplicate spots)으로 나란히 스팟팅(spotting) 하였고, 이렇게 하여 제작된 슬라이드를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 비-특이적으로 결합된 이중-표지 TD 프로브 및 마커를 제거하기 위하여, 상기 슬라이드들을 2x SSPE(0.3 M 소디윰 클로라이드, 0.02 M 소디윰 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에 37℃에서 30 분 동안 세척하고 증류수로 세척하였다. 그 후 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드들을 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실에서 보관하였다.
SA에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 10 pmole, 10X 반응 버퍼(6 mM MgCl2) 3 ㎕, dNTPs 각각 200 μM 및 Diastar-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.2 unit을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 엑소핵산 절단반응을 실시하였다; 상기 이중-표지 TD 프로브(SEQ ID NO: 10)가 교호결합(cross-linked)된 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물을 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 상기 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 2 분간 변성 및 55℃에서 60 분. 최종적으로, 상기 슬라이드를 100℃에서 1 분간 증류수로 세척하였다. 각각 세척한 이후, 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(Molecular Device, USA)를 이용하여 10-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어인 GenePix pro6.0 소프트웨어(Molecular Device, USA)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2 개씩 스팟팅하였다. 형광 강도는 2 개의 스팟의 평균 값으로 나타냈다.
도 6에서 보여주는 바와 같이, 타겟 핵산이 존재하는 경우 형광 시그널이 발생하였다(RFU: 65,486 ± 0.0). 타겟 핵산이 없는 경우에는 형광 시그널이 발생하지 않았다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.
<110> SEEGENE, INC. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING DUAL-LABELED IMMOBILIZED PROBES ON SOLID PHASE <130> PP110097 <150> KR 1020100103599 <151> 2010-10-22 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-T <400> 1 ggtgtaggtg gtggcggtaa caacgccgta aaccgaatga ttgaccacgg aatgaataat 60 gttgaattta 70 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-M1 <400> 2 tcaatcattc ggtttacggc gttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-D0(dT) <400> 3 tcaatcattc ggtttacggc gttg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-D1(dT) <400> 4 gtcaatcatt cggtttacgg cgttg 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-D3(dT) <400> 5 tggtcaatca ttcggtttac ggcgttg 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-D5(dT) <400> 6 cgtggtcaat cattcggttt acggcgttg 29 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-D8(dT) <400> 7 ttccgtggtc aatcattcgg tttacggcgt tg 32 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-Con-M <400> 8 tcattccgtg gtcaatcatt cggtttacgg cgttgttacc ttttt 45 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Marker <400> 9 atatatatat 10 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-TD-M <220> <221> misc_feature <222> (12)..(16) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 tcattccgtg gnnnnncatt cggtttacgg cgttgttacc ttttt 45

Claims (34)

  1. 다음 단계를 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는 이중-표지 프로브를 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 고정화 프로브에 혼성화 시키는 단계로서, 상기 고정화 프로브는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 상기 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되고; 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되고, 이러한 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고;
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 상기 고정화 프로브의 절단이 발생하는 조건 하에서 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소와 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 고정화 프로브는 상기 DNA 중합효소의 엑소핵산 절단 반응에 의해 절단되어 상기 제1표지가 상기 고정화 프로브로부터 해리되어, 상기 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기하며;
    (c) 상기 DNA 중합효소의 상기 엑소핵산 절단 반응을 상기 제2표지가 표지된 상기 뉴클레오타이드에서 종료시키는 단계로서; 상기 엑소핵산 절단 반응의 종료는 상기 제2표지가 결합된 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 유도되고, 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하며; 그리고
    (d) 상기 고상 기질 상에서의 시그널 변화를 검출하는 단계로서; 상기 고정화 프로브의 상기 절단에 의한 상기 시그널 변화는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 퀀처 분자이고 상기 제2표지는 리포터 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 리포터 분자이고 상기 제2표지는 퀀처 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 고정화 프로브 상의 절단 위치(cleavage site)에 의하여 상기 제1표지로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 제1표지로부터 2-20 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 제1표지로부터 4-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 고정화 프로브에서 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 상기 검출은 실시간 방식, 엔드-포인트 방식 또는 지정된 시간 간격 방식으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 상기 DNA 중합효소는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 고정화 프로브에 혼성화 되는 상기 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화 프로브는 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별하도록 하는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)인 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
    상기 일반식에서, X’p는 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고; Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되며; 상기 제1표지는 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단에 결합되고, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합되며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내고; 그리고 X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 상기 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 X’p, Y’q, Z’r의 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 타겟 핵산서열에 대한 혼성화 측면에서 상기 5’-제2차 혼성화 부위가 상기 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 TD 프로브의 혼성화 특이성은 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브의 전체 혼성화 특이성을 향상시키며; 상기 TD 프로브가 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단은 상기 DNA 중합효소의 엑소핵산 절단 반응에 의하여 절단되며 상기 제1표지가 상기 TD 프로브로부터 해리되어, 상기 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기하며; 상기 제2표지가 결합된 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 TD 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 분할 부위가 모두 단일가닥을 형성하여 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 DNA 중합효소에 의해 절단되지 않아, 상기 고상 기질 상에서의 시그널의 변화를 야기하지 않으며, 이에 의해 상기 TD 프로브는 상기 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 상기 시그널 변화는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 5’-제2차 혼성화 부위에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 전-증폭된 핵산서열인 것을 특징으로 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 2 종의 핵산서열을 포함하고 상기 고정화 프로브는 최소 2 종의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 방법.
  18. 다음을 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는 이중-표지 프로브를 이용하여 고상에서 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 키트:
    (a) 고상 기질;
    (b) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 고정화 프로브; 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 상기 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되고; 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합 되고, 이러한 상기 제2표지의 결합은 상기 뉴클레오타이드가 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖도록 하고; 및
    (c) 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 상기 DNA 중합효소.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 제1표지는 퀀처 분자이고 상기 제2표지는 리포터 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 제1표지는 리포터 분자이고 상기 제2표지는 퀀처 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 제2표지는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 고정화 프로브 상의 절단 위치(cleavage site)에 의하여 상기 제1표지로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 제1표지로부터 2-20 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 제1표지로부터 4-15 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 제1표지는 상기 고정화 프로브의 5’-말단의 포스페이트기에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 제 18 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 고정화 프로브에서 티미딘 뉴클레오타이드의 티민에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 18 항에 있어서, 상기 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 상기 DNA 중합효소는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 제 18 항에 있어서, 상기 키트는 상기 고정화 프로브에 혼성화 되는 상기 타겟 핵산서열을 생성하기 위한 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 18 항에 있어서, 상기 고정화 프로브는 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별하도록 하는 하기 일반식 I의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는 타겟 구별성 프로브(target discriminative probe: TD probe)인 것을 특징으로 하는 키트:
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
    상기 일반식에서, X’p는 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고; Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 상기 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고; 상기 TD 프로브는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 상호작용적 이중표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 간의 에너지 퀀칭을 유도할 수 있도록 상기 고정화 프로브에 위치하며; 제1표지 및 제2표지는 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자로부터 선택되며; 상기 제1표지는 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단에 결합되고, 상기 제2표지는 상기 제1표지의 다운스트림에 위치한 뉴클레오타이드의 염기에 결합되며; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내고; 그리고 X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 상기 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 X’p, Y’q, Z’r의 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 타겟 핵산서열에 대한 혼성화 측면에서 상기 5’-제2차 혼성화 부위가 상기 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 TD 프로브의 혼성화 특이성은 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 TD 프로브의 전체 혼성화 특이성을 향상시키며; 상기 TD 프로브가 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5’-제2차 혼성화 부위의 5’-말단은 상기 DNA 중합효소의 엑소핵산 절단 반응에 의하여 절단되며 상기 제1표지가 상기 TD 프로브로부터 해리되어, 상기 고상 기질 상의 시그널의 변화를 야기하며; 상기 제2표지가 결합된 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드의 저항성에 의해 상기 제2표지는 상기 고상 기질 상에 잔류하고; 상기 TD 프로브가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는, 상기 5’-제2차 혼성화 부위 및 상기 분할 부위가 모두 단일가닥을 형성하여 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 DNA 중합효소에 의해 절단되지 않아, 상기 고상 기질 상에서의 시그널의 변화를 야기하지 않으며, 이에 의해 상기 TD 프로브는 상기 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별하고 상기 고상 기질 상에서의 상기 시그널 변화는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 제2표지는 상기 5’-제2차 혼성화 부위에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 18 항에 있어서, 상기 키트는 상기 타겟 핵산서열 증폭용 프라이머 세트를 추가적으로 포함하며 상기 타겟 핵산서열은 전-증폭된 핵산서열인 것을 특징으로 키트.
  31. 제 18 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 2 종의 핵산서열을 포함하고 상기 고정화 프로브는 최소 2 종의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 키트.
  32. 제 18 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 키트.
  33. 다음 단계를 포함하며, DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 올리고뉴클레오타이드에 부여하는 방법:
    (a) 상기 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 및
    (b) 상기 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드의 염기에 표지를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계로서, 이에 의해 상기 뉴클레오타이드는 상기 DNA 중합효소의 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 저항성을 갖는다.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 표지가 결합된 상기 염기를 갖는 상기 뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드의 내부 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
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