KR20130006477A - Ｐｔｏ 절단 및 연장 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 - Google Patents

Ｐｔｏ 절단 및 연장 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명은 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)가 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)에 혼성화되어 연장 이합체를 형성한 후 상기 연장 이합체의 존재를 검출함으로써 타겟 핵산서열을 검출한다. 연장 이합체는 연장 이합체의 존재를 나타내는 표지로부터의 시그널(시그널의 발생, 증가, 소멸 또는 감소)을 제공하고, 조절가능한 Tm 값을 가지며, 이는 타겟 핵산서열의 존재의 검출에 훌륭하게 적용할 수 있다.

Description

ＰＴＯ 절단 및 연장 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension Assay}
본 발명은 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
DNA 혼성화(hybridization)는 분자 생물학의 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 구성, 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성제의 존재에 의해 영향을 받는다. DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산 서열 결정에 매우 유용한 도구가 될 것이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다.
그러나, 혼성화에만 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브와 비-타겟 서열간의 비-특이적인 혼성화로 인한 위양성 결과가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아 있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소적 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예컨대, TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산서열에 혼성화된 표지 프로브는 업스트림 프라이머-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 발생을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합-의존적 절단(polymerization-dependent cleavage) 및 중합-독립적 절단(polymerization-independent cleavage). 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 발생되어야 한다. 연장반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하도록 하여 표지가 방출된다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은, 그의 5’-말단 부위에 타겟 서열과 혼성화 되지 않는 5’-테일구역을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일구역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일구역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일구역을 포함하는 단편이 방출되는 몇몇 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 주형에 대해 비-상보적인 5’부위 및 주형에 대해 상보적인 3’부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 주형에 혼성화 되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 주형에 혼성화 되는 절단 구조가 예시되어 있다. 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변형 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 주형에 비-상보적인 5’부위가 방출된다. 그 후 방출된 5’부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap)부위가 방출되고, 방출된 5’플랩부위는 크기 분석 또는 상호작용적 이중 표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성되는 것을 개시하고 있다. 이 방법에서, 첫 번째 절단구조로부터 방출된 플랩은, 핵산 합성 의존적인 방식으로 두 번째 절단구조를 절단하여 플랩을 방출시키며, 방출된 플랩들을 검출한다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하더라도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중 표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 5’부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 단편은 캡처 프로브에 혼성화 되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단된/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 혼성화 되지 않는 것이 필수적이다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정화되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질에서의 혼성화의 효율성을 낮게 하고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따라서, 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, 혼성화 뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction)과 같은 효소적 반응에 의하여 액상 및 고상에서 타겟 서열, 보다 바람직하게는 복수의 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 또한, 당업계에서 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않는 신규한 타겟 검출 방법이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 효소적 프로브 절단, 연장 및 연장 이합체(extended duplex)의 검출에 의하여 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에도 우수하게 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이를 이용하여, DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이를 이용하여, DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명은 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이에 의하여 타겟 핵산서열을 검출하는 신규한 방법 및 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 어세이에 의하여 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 혼성화 반응뿐만 아니라 타겟 핵산서열의 존재에 따라 발생되는 효소적 반응도 포함한다.
Ⅰ. 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE에 의한 타겟 검출 과정
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며, 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며;
(e) 일정 범위의 온도에서 상기 연장 이합체를 멜팅(melting)하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 단계로서; 상기 타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 제공되고; 그리고
(f) 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 효소적 프로브 절단, 연장 및 연장 이합체(extended duplex)의 검출에 의하여 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에도 훌륭하게 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
본 발명은 다음의 연속적인 이벤트를 이용한다; 프로브 혼성화; PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단 및 연장; 타겟-의존적인 연장 이합체의 형성; 및 연장 이합체의 검출. 따라서, 본 발명은 PTOCE (PTO Cleavage and Extension) 어세이로 명명된다.
본 발명에서, 연장 이합체는 멜팅 분석 또는 지정 온도 (predetermined temperature)에서의 검출에 의하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 표지를 갖는 특징이 있다. 또한, 연장 이합체는 조절 가능한 Tm 값을 갖는 특징을 가지며, 이는 복수의 타겟 검출 또는 비-타겟 시그널과의 구별에 있어서 중요한 역할을 한다.
타겟 핵산이 존재하는 경우에만 연장 이합체가 생성되므로, 연장 이합체의 존재는 타겟 핵산의 존재를 나타낸다.
멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이의 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO의 혼성화
본 발명에 따르면, 우선 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
용어 “어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. CTO (Capturing and Templating Oligonucleotide)의 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-상보적”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly non-complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)”는 (ⅰ) 프로브로서의 역할을 하는 3’-타겟팅 부위 및 (ⅱ) 타겟 핵산서열과의 혼성화 이후 절단되어 PTO로부터 방출되며 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 반드시 5’→3’순서로 위치한다. 도 1에서 PTO를 도식적으로 보여준다.
바람직하게는, 3’-타겟팅 부위가 타겟 핵산서열에 혼성화되고 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 단계 (a)의 혼성화가 실시된다.
PTO는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO의 길이는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위가 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 5’-태깅 부위는 CTO의 템플레이팅 부위에 특이적으로 혼성화된 후 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
PTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다. 바람직하게는, PTO의 3’-말단은 "블록킹”되어 그의 연장이 방지된다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO가 헤어핀 구조를 갖도록 디자인할 수 있다.
PTO의 5’-태깅 부위 및 타겟 핵산서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건하에서 그들 사이에 안정한 이중-가닥이 비-형성됨을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과의 혼성화에 관여하지 않는 PTO의 5’-태깅 부위는 단일-가닥을 형성한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단반응을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이 PTO를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어“이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO로부터 이격되어 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
선택적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드 길이이며, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위의 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것이다. 다운스트림 프라이머는 PTO에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시키며, 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이도를 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 단계 (a)의 결과물을 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 접촉시킨다. 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 절단되어 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO의 절단이 발생되는 데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기 및 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 그의 3’-타겟팅 부위는 혼성화에 포함되나 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일-가닥을 형성한다(참조 도 2). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
PTO의 절단반응을 위하여 다수의 종래 기술을 이용할 수 있으며, 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
종합하면, 단계 (b)의 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의하여 PTO의 절단이 시작되는 위치는 PTO 및 타겟 핵산서열 간의 이중가닥이 시작되는 지점 또는 그 시작 지점으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
따라서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 언급하면서 사용되는 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO 단편”으로 표현된다.
본 명세서에서 PTO의 5’-태깅 부위의 일부, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO 또는 CTO를 언급하면서 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드이다.
본 명세서의 바람직한 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며 보다 바람직하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에 적합한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소이다.
선택적으로, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이한 효소이다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
PTO로부터 방출된 단편은 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)와 혼성화 된다.
CTO는 3’→5’방향으로 (i) PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
CTO는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 한다. 프라이머로서의 역할을 하는 상기 단편은 CTO에 혼성화되고, 연장되어 이합체를 형성한다.
템플레이팅 부위가 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 서열을 갖는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이트 부위가 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, PTO의 5’-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다.
한편, PTO의 절단 위치를 예상함으로써 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5’-태깅 부위를 갖는 단편은 캡처링 부위와 혼성화 될 수 있으며 이후 연장된다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 될 수 있으며, 상기 단편의 3’-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3’-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인함으로써 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다(참조 도 1).
바람직하게는, 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 위치에 따라 선택될 수 있다. 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드이다.
CTO의 3’-말단은 단편과의 혼성화에 포함되지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, CTO가 상기 단편과 안정되게 혼성화 되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 구성을 포함하여 설명한다.
CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인 할 수 있다.
CTO의 길이는 다양해 질 수 있다. 예를 들어, CTO는 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다. CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화 되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 또한, CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장반응에서 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 템플레이팅 부위는 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 바람직하게는, CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
PTO로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화 되며, 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 또한, 비절단 PTO가 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되더라도, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO에 혼성화 되지 않아, 연장 이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 혼성화에 대한 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시한다. CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성한다. 반면, CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 PTO는 연장되지 않으며 이에 의해 연장 이합체도 형성되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연장 이합체”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 된 단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 CTO의 템플레이팅 부위를 주형으로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
연장 이합체는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물(hybrid)의 Tm 값과 상이한 Tm 값을 갖는다.
바람직하게는, 연장 이합체는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높은 Tm 값을 갖는다.
연장 이합체의 Tm 값은 (i) 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 단편의 서열 및/또는 길이와 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능하다.
단계 (e)에서 연장 이합체의 멜팅에 의하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널이 제공되도록 연장 이합체의 조절가능한 Tm 값을 사용하는 것은 본 발명의 큰 특징이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “Tm"은 이중가닥 핵산 분자의 집단(population)의 절반이 단일-가닥 분자로 해리되는 멜팅 온도를 의미한다. Tm 값은 혼성화 되는 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace 등, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr. 등, Biochemistry, 35:35553562(1996)); Sugimoto N. 등, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))와 같은 종래 방법에 의하여 계산할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Tm 값은 실제 사용하는 반응 조건 하에서의 실제 Tm 값을 의미한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소이다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 바람직하게는, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소와 동일하다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이이머의 연장을 위하여 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 동일하다.
연장 이합체는 (i) PTO 단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지 및 PTO 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)로부터 유래되는 표지를 갖는다.
타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 연장 이합체가 형성되기 때문에 연장 이합체의 존재는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낼 수 있다. 직접적인 방식으로 연장 이합체의 존재를 검출하기 위해서는, 검출가능한 시그널을 제공하는 표지를 갖는 연장 이합체가 단계 (d)에서 형성된다. 연장 이합체에 이용되는 표지는 연장 이합체가 이중 가닥 또는 단일 가닥인지의 여부에 따라 시그널 변화를 제공하고, 최종적으로 연장 이합체의 멜팅에 의하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다.
단계 (e): 연장 이합체의 멜팅
연장반응에 이어, 연장 이합체는 일정 범위의 온도에서 멜팅되어 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다.
타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 시그널”은 연장 이합체의 존재를 나타낼 수 있는 모든 시그널을 의미한다. 예를 들어, 타겟 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸), 표지로부터의 시그널의 변화(시그널 증가 또는 감소), 멜팅 커브, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 멜팅 단계에서 연장 이합체의 표지로부터의 시그널의 변화이다. 시그널의 변화는 적어도 두 개의 상이한 온도에서 시그널을 측정함으로써 얻을 수 있다. 택일적으로, 타겟 시그널은 일정 온도의 범위에서 연장 이합체의 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)이다. 바람직하게는, 온도의 범위는 멜팅 커브 분석을 위한 온도의 범위 또는 연장 이합체의 Tm 값의 주위 온도이다.
연장 이합체는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물보다 높은 Tm 값을 갖는다. 따라서, 연장 이합체 및 혼성화물은 서로 상이한 멜팅 패턴을 나타낸다. 이러한 상이한 멜팅 패턴은 비-타겟 시그널과 타겟 시그널을 구별되도록 한다. 상이한 멜팅 패턴 또는 멜팅 온도는 적합한 표지 시스템과 함께 타겟 시그널을 발생시킨다.
멜팅은 종래 기술들에 의하여 실시될 수 있으며, 예컨대, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 멜팅은 80-105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 제공되어 있다.
본 발명에 사용되는 적합한 표지 시스템은 이들의 종류, 위치 및 시그널 발생 방식의 측면에 있어서 다양하다.
본 발명에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 상세하게 설명될 수 있다:
(ⅰ) 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널은 단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공된다. 연장 이합체는 PTO 단편 및 CTO 간에 형성되므로, PTO 단편 또는 CTO의 표지는 연장 이합체에 존재하여 멜팅 단계에서 타겟 시그널을 제공한다.
표지는 상호작용적 이중 표지 및 단일 표지를 포함한다.
(ⅰ-1) 상호작용적 이중 표지
상호작용적 표지 시스템은 공여체 분자 및 수용체 분자 사이에 에너지가 비-방사능적(non-radioacively)으로 전달되는 시그널 발생 시스템이다. 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀칭 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 설명될 수 있다.
바람직하게는, 연장 이합체의 존재(즉, 타겟 핵산서열의 존재)를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 발생되며, 보다 바람직하게는 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중 표지 시스템)이다.
구현예 1(가닥 내 상호작용적-이중 표지)
상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예 1에서, 단편 또는 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (e)에서의 연장 이합체의 멜팅은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서 타겟 시그널을 제공한다. 상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예 1은 도 2, 6 및 9에서 도식적으로 보여준다. 구현예 1은 가닥 내 상호작용적-이중 표지로 명명된다.
도 2에서의 구현예 1(가닥 내 상호작용적-이중 표지)
예시된 구현예는 도 2를 참고하여 설명된다. CTO의 템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되어 단편을 방출하며, 상기 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 연장 이합체를 형성한다.
단계 (d)에서 연장 이합체가 형성되는 경우, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformationally)으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고; 단계 (e)에서 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 근접한”은 단편 또는 CTO의 형태적 구조, 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3 차원적으로 서로 인접하게 되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어”는 이중 가닥의 형성에 의한 단편 또는 CTO의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3 차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, 단계 (d)에서 발생되는 형광 시그널의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체 멜팅에 의존적으로 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 CTO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 연결된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 CTO의 5’-말단 및 3’-말단에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 3’-말단 또는 그의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 CTO의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 80 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에 위치하며, 보다 바람직하게는 최대 60 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최대 30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최대 25 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에 위치하며, 보다 바람직하게는 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 10 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드이다.
본 발명에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 형성될 수 있다.
도 2에서 보여주는 바와 같이, CTO의 템플레이팅 부위가 상호작용적 이중 표지로 표지되는 경우, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 표지로부터의 시그널의 변화는 유도되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
CTO의 캡처링 부위가 상호작용적 이중 표지로 표지되는 경우, 멜팅 단계에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있다.
도 6에서의 구현예 1(가닥 내 상호작용적-이중 표지)
예시된 구현예는 도 6을 참고하여 설명된다. PTO의 5’-태깅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되어, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 있는 5’-태깅 부위를 포함하는 단편을 방출한다. 상기 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된다.
단계 (d)에서 연장 이합체가 형성되는 경우, 단편의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고; 단계 (e)에서 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체의 멜팅에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단편의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 단편의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 50 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에 위치하며, 보다 바람직하게는 최대 40 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최대 30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최대 20 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에 위치하며, 보다 바람직하게는 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 10 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드이다.
도 6에서 보여주는 바와 같이, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 멜팅 단계에서 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있다.
구현예 2(가닥 간 상호작용적-이중 표지)
상호작용적 표지 시스템의 구현예 2에서, 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 가지며, CTO는 상호작용적 이중 표지의 나머지 하나를 갖고; 상기 단계 (e)에서의 연장 이합체의 멜팅은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서 타겟 시그널을 제공한다.
예시된 구현예는 도 8을 참고하여 설명된다.
단계 (d)에서 연장 이합체가 형성되는 경우, PTO에 연결된 퀀처 분자에 의하여 CTO에 연결된 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭된다. 단계 (e)에서 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, 상호작용적 이중 표지로부터의 형광 시그널의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
연장 이합체의 퀀처 분자에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTO 단편 및 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 5’-태깅 부위의 5’-말단에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3’-말단에 위치한다.
도 8에서 보여주는 바와 같이, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 멜팅 단계에서 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
CTO에 적용되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 색소(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 색소 (rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
(ⅰ-2) 단일 표지
또한 본 발명은 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단편 또는 CTO는 단일 표지를 가지며, 단계 (e)에서의 연장 이합체의 멜팅은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서 타겟 시그널을 제공한다.
도 3에서의 구현예 1(단일 표지 시스템)
예시된 구현예는 도 3을 참고하여 설명된다. CTO의 템플레이팅 부위는 단일 형광 표지를 갖는다. 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되어 단편을 방출한다. 상기 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고 연장되어 연장 이합체를 형성한다. 연장 이합체의 형성에 의하여, 단일 형광 표지로부터 나오는 형광의 강도는 증가하게 된다. 연장 이합체가 단계 (e)에서 멜팅되는 경우, 단일 형광 표지로부터 나오는 형광의 강도는 감소하게 되고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체의 멜팅에 따라 단일 표지로부터의 시그널의 수준에 변화가 있는 한, 단일 표지는 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단일 표지는 CTO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 연결된다.
도 3에서 보여주는 바와 같이, CTO의 템플레이팅 부위가 단일 표지로 표지되는 경우, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
CTO의 캡처링 부위가 단일 표지로 표지되는 경우, 멜팅 단계에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있다.
도 7에서의 구현예 2(단일 표지 시스템)
예시된 구현예는 도 7을 참고하여 설명된다. PTO의 5’-태깅 부위는 단일 형광 표지를 갖는다. 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되어 단일 형광 표지가 있는 5’-태깅 부위를 포함하는 단편을 방출한다. 혼성화에 의하여, 5’-태깅 부위의 단일 형광 표지로부터 나오는 형광의 강도는 증가된다. 연장 이합체가 단계 (e)에서 멜팅되는 경우, 단일 형광 표지로부터 나오는 시그널 강도는 감소하게 되고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체의 멜팅에 따라 단일 표지로부터의 시그널의 수준에 변화가 있는 한, 단일 표지는 PTO 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
도 7에서 보여주는 바와 같이, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 멜팅 단계에서 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별한다.
본 명세서에서 사용되는 단일 표지는 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 바람직하게는, 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합 위치는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 바람직하게는, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지되는 뉴클레오타이드의 잔기는 5’-말단 또는 3’-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
특히, 고상에서 본 발명이 단일 표지를 이용하여 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 강도를 갖는 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정한 형광 표지를 필요로 하지 않는다. 고상 기질에서 제공되는 타겟 시그널이 측정된다. 고정화된 CTO를 사용하는 단일 표지 시스템의 구현예는 도 12에서 도식적으로 보여준다.
고상 기질 상에 고정화된 CTO를 이용하는 경우, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소적 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 이용할 수 있다.
“단편 및/또는 CTO에 연결된 표지”를 이용하는 표지 시스템에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우에 표지는 상기 혼성화물이 단계 (e)에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치한다. 택일적으로, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우에 표지는 상기 혼성화물이 단계 (e)에서 비-타겟 시그널을 제공하는 범위 내에 위치할 수 있고; 상기 연장 이합체의 Tm 값은 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높다.
특히, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치하는 경우, 상기 혼성화물의 Tm 값을 포함하고 있는 구간은 타겟 핵산서열 검출을 위한 연장 이합체의 Tm 값을 선택하는 데 이용될 수 있다.
(ⅱ) 연장 이합체 내에 삽입된 표지
본 발명은 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하기 위하여, 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
비록 PTO 단편 또는 CTO가 표지를 갖지 않아도, 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하여 성공적으로 연장 이합체를 표지시킨다. 도 10 및 11은 단일-표지 뉴클레오타이드가 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 구현예를 도식적으로 나타낸다(참조 도 10 및 11의 C 및 D). 또한, 본 구현예는 멜팅 분석을 이용하는 다른 구현예들에도 적용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되며; 상기 삽입된 단일 표지는 연장반응 동안 삽입되는 뉴클레오타이드에 연결되어 있고; 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서 타겟 시그널을 제공한다.
예시된 구현예는 도 10을 참고하여 설명된다. 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되어 단편을 방출한다. 상기 단편은 고상 기질 상에 고정화된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고, 단일 형광 표지로 표지된 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장되어 연장 이합체를 형성한다. 연장 이합체로부터의 형광 시그널은 CTO가 고정화된 고상 기질의 스팟 상에서 검출할 수 있다. 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다(도 10에서는 나타나지 않음). 따라서, 시그널의 변화가 연장 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, CTO-고정화 스팟 상에서 형광 강도의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 도 11에서 도식적으로 보여주는 바와 같이, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는다. 바람직하게는, 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 CTO의 템플레이팅 부위의 어떠한 위치에도 위치한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기”는 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연적 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기”는 모화합물(mother compound)로서 자연적 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 특정한 방식으로도 형성된다.
비-자연 염기의 특정한 예는 다음 염기들의 염기 쌍 조합을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (참조 미국특허 제7,422,850호).
예시된 구현예는 도 11을 참고하여 설명된다. 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 CTO에 단편이 혼성화된다. 단일 형광 표지로 표지된 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 연장 이합체를 형성한다. 연장반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 위치에 삽입된다.
연장 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 고정화된 CTO가 있는 고상 기질의 스팟 상에서 검출될 수 있다. 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다(도 11에서는 나타나지 않음). 따라서, 시그널의 변화가 연장 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 혼성화물은 연장되지 않기 때문에 표지는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물 내에 포함되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
사용되는 단일 표지의 종류 및 특징은 본 명세서에서 상술한 “단편 및/또는 CTO에 연결된 표지”를 이용하는 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(ⅲ) 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 또는 CTO에 연결된 표지
도 4 및 5에서 도식적으로 보여주는 바와 같이, 본 발명은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지의 조합을 이용한 표지 시스템을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지에 의하여 제공되고, 삽입된 표지는 상기 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 상기 단계 (e)에서의 연장 이합체의 멜팅은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서의 타겟 시그널을 제공한다.
보다 바람직하게는, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, CTO는 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는다.
예시된 구현예는 도 4를 참고하여 설명된다. 리포터 또는 퀀처 분자 및 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 CTO에 단편이 혼성화된다. 퀀처 또는 리포터 분자로 표지된 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 연장 이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭된다. 연장반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 위치에 삽입된다.
단계 (e)에서 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
CTO 상에서의 표지 위치 및 삽입되는 표지의 삽입 위치는, 멜팅 단계에서 상기 두 개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중 표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
보다 바람직하게는, CTO의 템플레이팅 부위는 리포터 또는 퀀처 분자 및 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 단계 (d)에서의 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 CTO 내의 제2 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시된다. 단계 (d)의 연장 이합체의 두 개의 비-자연 염기는 염기-쌍을 형성하면서 퀀처 분자에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하고 시그널의 변화를 유도하여, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다. 선택적으로, 단편은 리포터 또는 퀀처 분자를 가지며, CTO의 템플레이팅 부위는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 단계 (d)에서의 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 CTO 내의 제2 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시된다. 단계 (d)의 연장 이합체의 두 개의 비-자연 염기는 염기-쌍을 형성하면서 퀀칭에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널의 변화를 유도하여, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다.
또 다른 예시된 구현예는 도 5를 참고하여 설명된다. 본 구현예에서는, 리포터 또는 퀀처 분자를 포함하는 단편이 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 CTO에 혼성화된다. 퀀처 또는 리포터 분자로 표지된 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 연장 이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭된다. 연장반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 위치에 삽입된다.
단계 (d)에서 연장 이합체가 형성되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며; 상기 단계 (e)에서 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
PTO의 표지 위치 및 삽입되는 표지의 삽입 위치는 멜팅 단계에서 두 개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중 표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 혼성화물은 연장되지 않기 때문에 표지는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물 내에 포함되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 멜팅 단계에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
(ⅳ) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명은 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다. 시료 내 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 발생시킬 수 있기 때문에, 고정화된 CTO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는, SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 thiazole orange를 포함한다. 인터컬레이팅 염료가 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 발생시킨다.
연장 이합체의 염기-쌍 사이에 인터컬레이팅 염료가 끼어들어가는 구현예를 도 13에서 도식적으로 보여준다(도 13의 C 및 D). 또한, 본 구현예는 멜팅 분석을 이용하는 다른 구현예들에도 적용할 수 있다.
예시된 구현예는 도 13을 참고하여 설명된다. 고상 기질 상에 고정화된 CTO의 캡처링 부위에 단편이 혼성화 된다. 인터컬레이팅 염료(예컨대, SYBRTM Green)의 존재 하에 연장을 실시하여 인터컬레이팅 염료를 포함하는 연장 이합체를 생성한다. 고정화된 CTO가 있는 고상 기질의 스팟 상의 연장 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 인터컬레이팅 형광 염료를 이용하여 검출될 수 있다. 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 인터컬레이팅 형광 염료가 방출되어 스팟 상에서 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다(도 13에서는 나타나지 않음). 따라서, 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 멜팅 단계에서 비-타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체 및 혼성화물의 Tm 값의 차이로 연장 이합체의 타겟 시그널과 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있다(도 13에서는 나타나지 않음).
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은, 단계 (e)에서 발생되는 형광 시그널의 변화를 측정하여 얻는 멜팅 커브, 멜팅 패턴 또는 Tm 값을 포함한다.
단계 (f): 타겟 시그널의 검출
최종적으로, 연장 이합체는 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널을 측정함으로써 검출되며, 이에 의해 연장 이합체의 존재는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
타겟 시그널의 종류에 따라 다양한 방법으로 검출을 실시할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널의 검출은 멜팅 분석에 의하여 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “멜팅 분석”은 연장 이합체의 멜팅에 의하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 두 가지 상이한 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석, 및 멜팅 피크 분석을 포함한다. 바람직하게는, 멜팅 분석은 멜팅 커브 분석이다.
본 명세서에서 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (e)의 멜팅 이후에 혼성화를 실시하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 연장 이합체의 존재는 혼성화 커브 분석에 의하여 검출된다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 종래의 기술들 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같이 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 형광이, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅(plotting) 된 아웃풋 시그널을 갖는다.
PTO 및 CTO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, PTO 및 CTO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. PTO 및 CTO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기”는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 혼성화 되는 CTO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3’-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 다양한 위치에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5’-태깅 부위를 갖는 PTO를 복수의 타겟 핵산서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 서로 다른 PTO 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 CTO에 유용하게 사용된다. CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 CTO 또는 최소한의 타입의 CTO를 사용하도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(f)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며, 바람직하게는 다운스트림 프라이머를 함께 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기들에서 실시한다. 예를 들면, 단계 (a)-(b), (c)-(d) 또는 (e)-(f)를 개별 반응 용기들에서 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b) 및 (c)-(f)는 반응 조건(특히, 온도)에 따라 하나의 반응 용기에서도 동시적 또는 개별적으로 진행될 수 있다.
본 발명에서는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
본 발명에서 검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 바람직하게는 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 단편은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP (single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다.
타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 발명에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 매칭 주형(matching template)으로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 미스매칭 주형(mismatching template)으로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟핵산서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3’-말단은 매칭 주형에 어닐링되고 연장되어 PTO 절단을 유도한다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3’-말단이 미스매칭 주형에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치 되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 주형에 혼성화 되더라도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3’-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 타겟 시그널이 발생되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 주형에 혼성화된 후 절단된다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO에 혼성화 되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, PTO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 주형에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 이러한 경우, 바람직하게는 PTO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
택일적으로, 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치하고, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것이 바람직하다.
단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 구현예에서, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단은 타겟 핵산서열의 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매칭 주형에 혼성화된 PTO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 3’-방향으로 바로 근접(immediately adjacent)한 한 위치에서 유도될 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. PTO 단편은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 CTO에 혼성화된 후 연장되어 연장 이합체를 형성하여, 타겟 시그널을 제공한다. 만일, 동일한 PTO가, 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고는 매칭 주형에 대하여 동일한 서열을 갖는 미스매칭 주형에 혼성화된다면, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드 만큼 이격된 위치에서 PTO의 절단이 발생될 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화되는 CTO의 위치가, 상기 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드에 대하여 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인 된 경우, PTO 단편의 3’-말단은 CTO에 혼성화 되지 않으며, 조절된 조건에서 PTO 단편이 연장되지 않는다. 만일 PTO 단편이 연장되어 연장 이합체를 형성하여도, 상기 이합체는, PTO 및 미스매칭 주형 간의 혼성화에 의한 이합체와는 상이한 Tm 값을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 가지는 PTO의 절단 위치는, 매칭 주형 또는 미스매칭 주형과의 혼성화에 의존적으로 상이해지고, 이에 의해 상기 두 혼성화 이벤트로부터 방출되는 PTO 단편들은 상이한 서열을 가지며, 바람직하게는 그의 3’-말단 일부, 보다 바람직하게는 그의 3’-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO 단편의 3’-말단 일부의 차이를 고려한 CTO의 뉴클레오타이드 서열의 선택으로 매칭 주형과 미스매칭 주형을 구별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 타겟 핵산서열은 전-증폭된 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 상당히 높게 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
최소 2 종의 타겟 핵산서열이 동시에 검출(멀티플렉스)된다는 점에서 본 발명의 이점이 더욱 두드러진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시된다(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시되고(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종), PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하고(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종), CTO는 최소 1 종의 CTO를 포함하며(보다 바람직하게는 최소 2 종, 보다 더 바람직하게는 최소 3 종, 가장 바람직하게는 최소 5 종); 상기 최소 2 종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 최소 2 종의 타겟 시그널을 제공한다.
최소 2 개의 PTO의 5’-태깅 부위는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명이 타겟 핵산서열의 스크리닝에 실시되는 경우, PTO의 5’-태깅 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다.
더욱이, 한 종류의 CTO를 다수의 타겟 핵산서열의 검출에 이용할 수 있다. 예를 들면, 5’-태깅 부위에 동일한 서열을 갖는 PTO들을 타겟 핵산서열의 스크리닝에 이용하는 경우, 한 종류의 CTO를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 최소 2 종의 타겟 시그널은 서로 상이한 종류의 표지로부터 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당 최소 2 종의 타겟 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당 최소 2 종의 타겟 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공되며; 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “상이한 종류의 표지”는 검출가능한 시그널이 상이한 특징을 갖는 표지를 의미한다. 예를 들면, 형광 리포터 표지로서의 FAM 및 TAMRA를 상이한 종류의 표지로써 고려되는데 이는 이들의 여기(excitation) 및 방출 파장이 서로 상이하기 때문이다.
멜팅 커브 분석에 의하여 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하기 위해 본 발명을 실시하여 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 연장 이합체가 서로 상이한 Tm 값을 갖는 경우, 한 종류의 표지(예컨대, FAM)를 이용하더라도 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
고상에 고정화된 CTO를 이용한 타겟 검출
본 발명의 두드러진 이점은 마이크로어레이와 같은 고상에서도 타겟 핵산서열의 검출이 효과적이라는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되며 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다. 고상에서는, 고상 기질 상에서 제공되는 타겟 시그널을 측정한다.
고정화된 CTO를 이용하는 경우, 상기 서술한 표지 시스템을 이용한 멜팅 분석은 본 발명의 고상 반응에 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 단편에 연결된 단일 표지 또는 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공된다. 특히, 고상에서 본 발명이 단일 표지를 이용하여 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 강도를 갖는 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정한 형광 표지를 필요로 하지 않는다.
고상 기질 상에 고정화된 CTO를 이용하는 경우, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소적 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 이용할 수 있다.
고상 반응을 위하여, CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단(바람직하게는, 3’-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적으로(바람직하게는 간접적) 고정화된다. 또한, CTO는 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 고정화된 CTO가 고상 기질 표면에 간접적으로 고정화 되는 경우, 적합한 링커를 이용한다. 본 발명에서 유용한 링커는 고상 기질 표면 상의 프로브 고정화에 이용되는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로써 CTO 고정화에 이용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명의 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업계에 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 CTO는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다수의 고정화된 CTO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 복수의 어드레서블 부위에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 CTO가 조립(fabricate)될 수 있다.
고상에서 실시하는 본 발명은, 고정화된 CTO 상의 표지는 물리적으로 이격되어 있기 때문에 한 종류의 표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 따라서, 고상에서 본 발명에 의하여 검출가능한 타겟 핵산서열의 수는 제한되지 않는다.
Ⅱ. 타겟 핵산서열의 증폭을 이용한 바람직한 구현예
바람직하게는, 본 발명은 타겟 핵산서열을 합성할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림을 포함하는 프라이머 한 쌍을 이용하여 타겟 핵산서열의 증폭을 이용하여 동시적으로 실시된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 한 쌍 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 각각은 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지되며;
(b) 상기 프라이머의 연장 및 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되는 경우, 상기 업스트림 프라이머는 연장되고 상기 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 상기 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 상기 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며;
(e) 일정 범위의 온도에서 상기 연장 이합체를 멜팅(melting)하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 단계로서; 상기 타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 제공되고; 그리고
(f) 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예는 상기 상술된 본 발명의 단계들을 실시하기 때문에, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(f)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 반응 반복은 타겟 핵산서열의 증폭을 동반한다. 바람직하게는, 상기 증폭은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 최소 2 종의 타겟 시그널은 동일한 종류의 표지로부터 제공되며; 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
Ⅲ. 지정 온도에서의 검출 과정을 포함하는 PTOCE에 의한 타겟 검출 방법
본 발명은 연장 이합체의 형성과 연관되어 발생하는 타겟 시그널을 이용하기 위해 변형시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 상기 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 상기 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 타겟 시그널을 제공하고; 그리고
(e) 상기 연장 이합체가 그의 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서, 이에 의해 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예는, 멜팅 단계를 제외하고 상기 상술된 본 발명의 단계들을 실시하기 때문에, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
타겟 시그널은 연장 이합체의 멜팅에서 제공되는 시그널 변화를 측정하여 제공되기 때문에, 상술한 멜팅 분석을 이용하는 본 발명은 최소 2 개의 상이한 온도에서 표지로부터 나오는 시그널들의 검출을 필요로 한다.
이와는 달리, 본 발명의 일 양태에서, 연장 이합체 자체가 연장 이합체가 형성된 경우와 형성되지 않은 경우를 구별하게 하는 시그널을 제공하며, 상기 시그널은 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도(predetermined temperature)에서 검출되고, 이에 의해 타겟 핵산서열의 존재가 결정된다.
본 발명은 타겟 핵산서열의 존재를 검출하기 위하여 연장 이합체의 형성과 연관된 타겟 시그널을 측정하는 것이다.
본 발명에서, 연장 이합체는 표지를 가지며, 이에 의해 연장 이합체는 타겟 시그널을 제공한다.
바람직하게는, 타겟 시그널은 지정 온도에서 연장 이합체의 표지로부터 나오는 시그널(시그널 발생 또는 시그널 소멸)을 포함한다.
본 발명의 표지는 상기 서술한 멜팅 분석을 이용한 방법과 동일한 방식으로 실시할 수 있다. 도 2-13는 지정 온도에서의 검출을 위해 약간 변형된 본 발명의 일 양태를 설명할 수 있다.
연장 이합체로부터 나오는 타겟 시그널을 기본으로 한 작동 원리는 다음과 같다: (ⅰ) 단편의 연장은 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하며; 또는
(ⅱ) 단편 및 CTO의 혼성화는 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다.
작동 원리 (ⅰ)의 구현예는 도 9를 참조하여 설명될 수 있다. 고정화된 CTO를 이용하는 경우, 본 발명은 보다 더욱 효과적인 방식으로 다수의 타겟 핵산서열을 검출한다. 고정화된 CTO의 템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되는 경우, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 상기 연장 이합체의 형성에 의하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 타겟 시그널은 연장 단계에서 제공된다(도 9의 C 및 D).
도 9에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물(hybrid)은 연장 이합체를 형성하지 않는다. 따라서, 퀀처 분자는 여전히 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하게 된다. 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
작동 원리 (ⅱ)의 구현예는 도 6을 참조하여 설명될 수 있다. 도면은 멜팅 분석을 이용한 방법뿐만 아니라 본 발명의 양태도 보여준다. PTO의 5’-태깅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO는 절단되어, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는 5’-태깅 부위를 포함하는 단편을 방출하고, 상기 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된다. 상기 혼성화에 의하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 타겟 시그널은 단편 혼성화 단계에서 제공되고, 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다(도 6의 C 및 D).
도 6에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며(도 6의 C 및 D), 비-타겟 시그널을 제거하기 위하여 혼성화물을 해리시키는 것을 필요로 한다. 따라서, 타겟 시그널을 측정하는 온도는, 혼성화물이 해리 되도록 결정된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 추가적으로 결정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화물이 부분적으로 해리되는 온도에서 연장 이합체는 검출될 수 있다.
지정 온도는 혼성화물의 Tm 값에서 10℃ 뺀 온도보다 높고, 바람직하게는 혼성화물의 Tm 값에서 5℃ 뺀 온도보다 높으며, 보다 바람직하게는 혼성화물의 Tm 값보다 높은 온도이고, 보다 더 바람직하게는 혼성화물의 Tm 값에서 5℃ 더한 온도보다 높다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체에 의하여 제공되는 타겟 시그널은 단계 (d)의 연장 동안 제공되며; 도 2-4 및 9-11에 나타난 바와 같이, 상기 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체에 의하여 제공되는 타겟 시그널은 단계 (C)에서의 단편 및 CTO의 혼성화에 의하여 제공되고, 단계 (d)에서 상기 연장 이합체의 형성은 타겟 시그널을 유지하며; 비절단 PTO 및 CTO 간의 상기 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하고; 도 5-8 및 12-13에 나타난 바와 같이, 상기 지정 온도는 혼성화물의 Tm 값보다 높다.
비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공하는 경우(도 6의 패널 D), 비-타겟 시그널을 제거하기 위하여 혼성화물을 해리시키는 것을 필요로 한다. 따라서, 타겟 시그널을 측정하는 온도는, 혼성화물이 해리 되도록 결정된다.
본 발명에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(ⅰ) 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지
(ⅰ-1) 상호작용적 이중 표지
상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예에서, CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (d)에서의 상기 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다. 상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예 1은 도 2에서 도식적으로 보여준다. 타겟 시그널은 연장-동기화(extension-synchronized) 시그널 발생으로 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 CTO의 템플레이팅 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예에서, CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (c)에서의 단편 및 CTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 CTO의 캡처링 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 3’-말단 또는 그의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 구현예에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며; 상기 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예에서, 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (c)에서의 상기 단편 및 CTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다. 상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예 1은 도 6에서 도식적으로 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단편의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있고, 나머지 하나는 단편의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 구현예에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며; 상기 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예에서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 가지며 CTO는 상기 상호 작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 가지고; 단계 (c)에서의 상기 단편 및 CTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다. 상호작용적 이중 표지 시스템의 구현예는 도 8에서 도식적으로 보여준다.
리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTO 단편 및 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는, PTO의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 PTO의 5’-말단에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는, CTO의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 CTO의 5’-말단에 위치한다.
본 구현예에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며; 상기 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
(ⅰ-2) 단일 표지
단일 표지 시스템의 구현예에서, CTO는 단일 표지를 가지며, 단계 (d)에서의 단편의 연장은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다. 단일 표지 시스템의 구현예는 도 3에서 도식적으로 보여준다. 타겟 시그널은 연장-동기화(extension-synchronized) 시그널 발생으로 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이팅 부위는 단일 표지로 표지된다.
단일 표지 시스템의 구현예에서, CTO는 단일 표지를 가지며, 단계 (c)에서의 단편 및 CTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 캡처링 부위는 단일 표지로 표지된다.
본 구현예에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며; 상기 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
단일 표지 시스템의 구현예에서, 단편은 단일 표지를 가지며, 단계 (c)에서의 단편 및 CTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 타겟 시그널을 유지한다. 단일 표지 시스템의 구현예는 도 12에서 도식적으로 보여준다.
본 구현예에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며; 상기 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 단일 표지는 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 바람직하게는, 단일 표지는 형광 표지를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 선호되는 결합 위치는 미국 특허 번호 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서 전체에서 참조로 포함된다. 바람직하게는, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지되는 뉴클레오타이드의 잔기는 5’-말단 또는 3’-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 바와 같이 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
특히, 고상에서 본 발명이 단일 표지를 이용하여 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 강도를 갖는 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정한 형광 표지를 필요로 하지 않는다.
고상 기질 상에 고정화된 CTO를 이용하는 경우, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소적 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우, 도 2-3 및 9에서 보여주는 바와 같이, 상기 혼성화물이 단계 (d)에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지가 위치한다.
선택적으로, 도 6-8 및 12에서 보여주는 바와 같이 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우, 상기 혼성화물이 단계 (d)에서 비-타겟 시그널을 제공하는 범위 내에 표지가 위치할 수 있으며; 상기 연장 이합체의 Tm 값은 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물보다 높다.
(ⅱ) 연장 이합체 내에 삽입된 표지
특히, 본 발명이 고정화된 CTO를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 도 10 및 11에서 도식적으로 보여주는 바와 같이, 본 표지 시스템이 타겟 시그널을 제공하는 데 보다 유용하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되며; 삽입된 단일 표지는 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있고; 단계 (d)에서의 단편의 연장은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (d)에서의 타겟 시그널을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 도 11에서 도식적으로 보여주는 바와 같이, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, CTO는 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 바람직하게는, 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 CTO의 템플레이팅 부위의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 혼성화물은 연장되지 않기 때문에, 표지는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물 내에 포함되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
(ⅲ) 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 또는 CTO에 연결된 표지
도 4 및 5에서 도식적으로 보여주는 바와 같이, 본 발명은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지의 조합을 이용한 표지 시스템을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지에 의하여 제공되고; 상기 삽입된 표지는 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 상기 단계 (d)에서의 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다.
보다 바람직하게는, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, CTO는 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은 단계 (d)의 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널이다.
연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 혼성화물은 연장되지 않기 때문에, 표지는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물 내에 포함되지 않는다. 따라서, 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는다.
(ⅳ) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명은 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다. 시료 내 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 발생시킬 수 있기 때문에, 고정화된 CTO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
예시된 구현예는 도 13을 참고하여 설명된다. 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO는 절단되어 단편을 방출한다. 상기 단편은 CTO에 혼성화된다. 인터컬레이팅 염료(예컨대, SYBRTM Green)의 존재 하에 연장을 실시하여 인터컬레이팅 염료를 포함하는 연장 이합체를 생성한다.
도 13에서, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하며(도 13의 C 및 D), 비-타겟 시그널을 제거하기 위하여 혼성화물을 해리시키는 것이 필요하다. 따라서, 타겟 시그널을 측정하는 온도는 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
바람직하게는, 단계 (e)에서 제공되는 타겟 시그널은 인터컬레이팅 염료로부터 나오는 시그널이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO 및/또는 CTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도할 정도로 PTO에 근접하게 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장 가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b) 또는 (c)-(e)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기들에서 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시되고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하고, CTO는 최소 1 종의 CTO를 포함하며; 상기 최소 2 종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열에 해당하는 최소 2 종의 타겟 시그널을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 단계 (b)에서는 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되고, 상기 고상 기질에서 제공되는 타겟 시그널을 측정한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 단편에 연결된 단일 표지 또는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
단계 (e)의 검출은 실시간 방식, 엔드-포인트 방식 또는 지정 시간 간격 방식으로 실시될 수 있다. 본 발명이 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 경우, 지정 온도에서의 상기 반복의 각 사이클에서(즉, 실시간 방식), 지정 온도에서의 상기 반복의 종료시점에서(즉, 엔드-포인트 방식) 또는 지정 온도에서의 상기 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 시그널 검출이 실시되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 검출은 실시간 방식으로 상기 반복의 각 사이클에서 실시하여 검출의 정확성과 정량화를 개선할 수 있다.
Ⅳ. 타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; 그리고
(c) CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고; 그리고 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의하여 연장되어 연장 이합체를 형성한다.
본 발명의 키트는 상기 설명된 본 발명의 검출 방법을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PTO 및/또는 CTO는 최소 하나의 표지를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 PTO 및/또는 CTO는 최소 하나의 표지를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 인터컬레이팅 표지를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 표지는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 최소 2 종의 핵산서열을 검출하는 데 이용하며, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하며 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은, 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)가 절단되어 단편을 방출하고 상기 단편은 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)에 혼성화되어 연장 이합체를 형성하는 타겟-의존적 연장 이합체를 제공한다. 연장 이합체는 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널(시그널 발생 또는 소멸) 또는 시그널 변화(시그널 증가 또는 감소)를 제공한다.
(b) 연장 이합체의 존재는 멜팅 커브 및 지정 온도에서의 검출(예컨대, 실시간 방식 및 엔드-포인트 방식)과 같은 다양한 방법 또는 과정에 의하여 결정된다.
(c) 본 발명은 한 종류의 표지(예컨대, FAM)만을 이용하더라도, 멜팅 커브 분석에 의하여 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출한다. 반면, 액상에서 실시되는 종래 멀티플렉스 실시간 방식은 검출가능한 형광 표지의 수에 연관된 한계로 심각한 문제를 겪는다. 본 발명은 이러한 단점을 성공적으로 극복하고, 멀티플렉스 실시간 검출의 응용을 넓혔다.
(d) 본 발명은 다수의 표지 시스템을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, PTO 및/또는 CTO의 어떠한 위치에 연결되는 표지는 연장 이합체를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 데 이용될 수 있다. 또한, 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 본 발명에 이용할 수 있다. 이 뿐만 아니라, 이러한 표지들의 조합을 이용할 수 있다. 본 발명에 적용가능한 다목적의 표지 시스템은 실험적 조건 또는 목적에 따라 적합한 표지 시스템을 선택하게 된다.
(e) 본 발명은 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 상기 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 상기 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 지정 Tm 값을 갖는 타겟-의존적 연장 이합체를 제공한다.
(f) 증폭 산물을 이용하는 종래 멜팅 커브 분석은 증폭산물의 서열에 의존하며, 이에 의해 증폭산물의 원하는 Tm 값을 얻기가 매우 어려웠다. 반면, 본 발명은 증폭산물의 서열이 아닌 연장 이합체의 서열에 의존하여, 연장 이합체의 원하는 Tm 값을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명은 복수의 타겟 서열을 검출하는 데 용이하게 적용할 수 있다.
(g) 표지 프로브 및 타겟 핵산서열 간의 직접적인 혼성화를 이용하는 종래 멜팅 커브 분석은 프로브의 비-특이적 혼성화 때문에 위양성 시그널이 발생할 가능성이 높다. 반면, 본 발명은 PTO 혼성화뿐만 아니라 효소적 절단 및 연장을 이용하여, 위양성 시그널의 문제를 완벽하게 극복하였다.
(h) 종래 멜팅 커브 분석의 Tm 값은 타겟 핵산서열의 서열 변이에 의한 영향을 받는다. 그러나, 본 발명의 연장 이합체는 타겟 핵산서열의 서열 변이에 상관없이 변함없는 일정한 Tm 값을 제공하여, 멜팅 커브 분석에서 탁월한 정확성을 보장한다.
(i) PTO의 5’-태깅 부위의 서열 및 CTO의 서열은 타겟 핵산서열을 고려할 것 없이 선택할 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이것은 PTO의 5’-태깅 부위 및 CTO에 대한 서열의 풀을 사전-디자인이 가능하도록 한다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열을 고려하여 제작하여야 하지만, CTO는 타겟 핵산서열의 정보 또는 타겟 핵산서열에 대한 고려 없이 기성 방식(ready-made fashion)으로 제작할 수 있다. 이러한 특징은 멀티플렉스 타겟 검출, 특히, 고상 기질 상에 고정화된 CTO를 이용하는 마이크로 어레이 상에서 두드러지는 이점을 제공한다.
도 1은 PTO 절단 및 연장 어세이(PTOCE assay)에 이용되는 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)및 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 도식적인 구조를 보여준다. 바람직하게는, PTO 및 CTO의 3’-말단은 블록킹되어 연장이 방지된다.
도 2는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 3은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자를 갖는다. 상기 리포터 분자는, 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 형태 상에 존재하는 가에 따라 상이한 시그널 강도를 나타내는 것이 요구된다.
도 4는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 iso-dC 잔기 및 리포터 분자를 갖는다. 퀀처-iso-dGTP는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입(incorporated)된다.
도 5는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖고, CTO는 그의 템플레이팅 부위에 iso-dC 잔기를 갖는다. 퀀처-iso-dGTP는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된다.
도 6은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 7은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖는다. 상기 리포터 분자는, 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 형태 상에 존재하는 가에 따라 상이한 시그널 강도를 나타내는 것이 요구된다.
도 8은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 퀀처 분자를 갖고, CTO는 그의 캡처링 부위에 리포터 분자를 갖는다.
도 9는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. CTO는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
도 10은 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. 리포터-표지 dATP는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된다. CTO는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
도 11은 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 iso-dC 잔기를 갖고, 리포터-iso dGTP는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된다. CTO는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
도 12는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖는다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
도 13은 인터컬레이팅 표지를 이용하는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 도식적으로 보여준다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
도 14는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 15는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. PTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자를 갖고 CTO는 그의 3’-말단에 리포터 분자를 갖는다.
도 16은 연장 이합체의 Tm 값이 CTO 서열에 의하여 조절된다는 결과를 보여준다.
도 17은 PCR 증폭을 이용한 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 도 17a는 실시간 PCR 검출을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여주고, 도 17b는 포스트-PCR 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여준다.
도 18은 PCR 증폭을 이용한 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 5’-말단에 iso-dC 잔기 및 리포터 분자를 갖는다. 퀀처-iso-dGTP는 연장반응 동안 연장 이합체 내에 삽입된다. 도 18a는 실시간 PCR 검출을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여주고, 도 18b는 포스트-PCR 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여준다.
도 19는 PCR 증폭을 이용한 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. PTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자를 갖고 CTO는 그의 3’-말단에 리포터 분자를 갖는다. 도 19a는 실시간 PCR 검출을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여주고, 도 19b는 포스트-PCR 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이의 결과를 보여준다.
도 20은 포스트-PCR 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae (NG) 유전자 및 Staphylococcus aureus (SA) 유전자의 동시적 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 21은 마이크로어레이에서의 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고정화된다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖는다.
도 22는 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고정화된다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖는다.
도 23은 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 Neisseria gonorrhoeae 유전자의 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 3’-말단을 통하여 고정화되고 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 24는 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 엔드 포인트 검출을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 단일 또는 복수의 타겟 검출 결과를 보여준다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고정화된다. PTO는 그의 5’-태깅 부위에 리포터 분자를 갖는다. Neisseria gonorrhoeae (NG) 유전자 및 Staphylococcus aureus (SA) 유전자는 타겟 핵산서열로써 이용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: PTOCE(Probing and Tagging Oligonucleotide Cleavage & Extension) 어세이의 평가
연장 이합체가 타겟 핵산서열의 검출을 위한 타겟 시그널을 제공할 수 있는 지의 여부를 실험하여, 본 발명의 신규한 어세이인 PTOCE(PTO Cleavage and Extension)를 평가하였다.
이 평가를 위하여, 멜팅 분석에 의하여 연장 이합체의 존재를 검출하는 PTOCE 어세이(멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이)를 실시하였다. 본 발명자들은 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 이용하였다.
어세이를 실시하는 동안 형성된 연장 이합체는 상호작용적 이중 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 상호작용적 이중 표지는 (ⅰ) 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 CTO(이중-표지 CTO) 또는 (ⅱ) 퀀처 분자를 갖는 PTO 및 리포터 분자를 갖는 CTO(퀀처-표지 PTO 및 리포터-표지 CTO)에 의하여 제공하였다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG) 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 주형으로 이용하였다.
1-1. 이중-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO는 표지를 갖지 않는다. CTO는 그의 템플레이팅(templating) 부위에 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)를 갖는다. 본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-1 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO-1 5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer]-3’(SEQ ID NO: 4)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 과정을 30 회 반복하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 14에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 76.5℃에서 피크가 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 피크도 검출되지 않았다. 본 표지 방법에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물(hybrid)은 어떠한 시그널도 제공하지 않기 때문에, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물에 해당하는 피크는 검출되지 않았다. PTO가 존재하지 않거나 또는 CTO가 존재하지 않는 경우, 어떠한 피크도 관찰되지 않았다.
1-2. 퀀처-표지 PTO 및 리포터-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO는 그의 5’-말단을 퀀처 분자(BHQ-1)로 표지하였다. CTO는 그의 3’-말단을 형광 리포터 분자(FAM)로 표지하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCG
GCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-2 5’- [BHQ-1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’
(SEQ ID NO: 5)
NG-CTO-2 5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[FAM]-3’(SEQ ID NO: 6)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 5) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 6) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 30 회 반복하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 15에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 77℃에서 피크가 검출되었다. 본 표지 방법에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하기 때문에, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 예상 Tm값에 해당하는 64.0℃-64.5℃에서 피크가 나타났다. PTO가 존재하지 않거나 또는 CTO가 존재하지 않는 경우, 어떠한 피크도 관찰되지 않았다.
이러한 결과들은 타겟-의존적인 연장 이합체가 생성되고, 상기 연장 이합체는 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다는 것을 보여준다.
실시예 2: 연장 이합체 Tm 값의 조절
본 발명자들은 PTOCE 어세이에서 연장 이합체의 Tm 값이 CTO의 서열에 의하여 조절 가능한 지 여부를 추가적으로 실험하였다.
본 실험을 위하여, 본 발명자들은 템플레이팅(templating) 부위에 서로 다른 서열을 갖는 3 종의 CTO를 이용하였다. PTO는 표지를 갖지 않는다. 3 종의 CTO는 그의 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)를 갖는다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다.
3 종의 CTO 각각을 이용하여 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 실시하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-3 5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 7)
NG-CTO-1 5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer] -3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-CTO-3 5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTCCTCCTCCAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer] -3’ (SEQ ID NO: 8)
NG-CTO-4 5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer] -3’(SEQ ID NO: 9)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 7) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4, 8 또는 9) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 과정을 30 회 반복하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 16에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 76.0℃, 69.0℃, 또는 64.5℃에서 피크가 검출되었다. 각각의 피크는 실험대상의 CTO에 의한 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 것이다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 피크도 검출되지 않았다.
이러한 결과들은 연장 이합체의 Tm 값이 CTO의 서열에 의하여 조절 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 실시간 검출 또는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
본 발명자들은, PTOCE 어세이가 실시간 PCR 방식(ⅰ) 또는 포스트-PCR 멜팅 분석 방식(ⅱ)으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 지의 여부를 실험하였다: (ⅰ) PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장은 PCR 과정에 의하여 타겟 핵산의 증폭을 수반하였고, 연장 이합체의 존재는 각 사이클의 지정 온도에서 검출하였다(지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이); 또는 (ⅱ) PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장은 PCR 과정에 의하여 타겟 핵산의 증폭을 수반하였고, 연장 이합체의 존재는 포스트-PCR 멜팅 분석에 의하여 검출하였다(멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이).
업스트림 프라이머는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO 절단에 관여하며, 또한 다운스트림 프라이머와 함께 PCR 과정에 의한 타겟 핵산서열 증폭에도 관여한다. 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장에 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 이용하였다.
연장 이합체는 상호작용적 이중 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 상호작용적 이중 표지는 (ⅰ) 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 CTO, (ⅱ) 연장반응 동안 삽입된 퀀처-iso-dGTP 및 리포터 분자와 iso-dC 잔기를 갖는 CTO 또는 (ⅲ) 퀀처 분자를 갖는 PTO 및 리포터 분자를 갖는 CTO에 의하여 제공되었다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다.
Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA를 타겟 핵산으로 이용하였다.
3-1. 이중-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO는 표지를 갖지 않으며, CTO는 그의 템플레이팅(templating) 부위에 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)를 갖는다.
본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-3 5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 7)
NG-CTO-1 5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer] -3’ (SEQ ID NO: 4)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
3-1-1. 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이
NG의 지놈 DNA 100 pg, 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 10) 10 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 7) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 30 초 과정을 60 회 반복하였다. 각 사이클의 60℃에서 시그널을 검출하였다. 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였다.
도 17a에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 타겟 시그널(Ct 31.36)이 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다.
3-1-2. 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이
실시예 3-1-1의 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 17b에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 76.0℃에서 피크가 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 피크도 검출되지 않았다. 본 표지 방법에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 어떠한 시그널도 제공하지 않기 때문에, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물에 해당하는 피크는 검출되지 않았다.
3-2. 퀀처-iso-dGTP 및 iso-dC 잔기를 갖는 리포터-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO는 표지를 갖지 않는다. CTO는 그의 5’-말단에 리포터 분자(FAM) 및 iso-dC 잔기를 갖는다. PTO 단편의 연장반응 동안, 퀀처 분자(dabcyl)로 표지된 iso-dGTP는 iso-dC 잔기에 대하여 상보적인 위치에 삽입된다.
본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-1 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO-5 5’-[FAM][Iso-dC]CTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 11)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
3-2-1. 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이
NG의 지놈 DNA 100 pg, 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 10) 10 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 11) 2 pmole 및 2X 플렉서 마스터 믹스(Cat. No. A4100, Promega, USA) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 30 초 과정을 60 회 및 72℃에서 30초, 55℃에서 30초 과정을 5회 반복하였다. 각 사이클의 60℃에서 시그널을 검출하였다. 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였다.
플렉서 마스터 믹스 내 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는, 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장에 이용하였다.
도 18a에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 타겟 시그널(Ct 33.03)이 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다.
3-2-2. 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이
실시예 3-2-1의 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 18b에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 70.0℃에서 피크가 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 피크도 검출되지 않았다. 본 표지 방법에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 어떠한 시그널도 제공하지 않기 때문에, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물에 해당하는 피크는 검출되지 않았다.
3-3. 퀀처-표지 PTO 및 리포터-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO의 5’-말단은 퀀처 분자(BHQ-1)로 표지하였다. CTO의 3’-말단은 형광 리포터 분자(FAM)로 표지하였다.
본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-4 5’-[BHQ-1]ACGACGGCTTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 12)
NG-CTO-2 5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[FAM]-3’ (SEQ ID NO: 6)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
3-3-1. 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이
NG 지놈 DNA 100 pg, 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 10) 10 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 12) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 6) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 30 초 과정을 60 회 반복하였다. 각 사이클의 60℃에서 시그널을 검출하였다. 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였고, 상기 온도는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높다.
도 19a에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 타겟 시그널(Ct 29.79)이 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다.
3-3-2. 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이
실시예 3-3-1의 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 19b에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 연장 이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 76.5℃에서 피크가 검출되었다. 본 표지 방법에서 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하기 때문에, 주형이 없는 경우, 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값에 해당하는 피크가 48.0℃에서 검출되었다.
이러한 결과들은 실시간 검출 또는 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE에 의하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이에 의한 복수의 타겟 핵산서열의 검출
또한, 본 발명자들은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이가 동일한 종류의 리포터 분자를 이용하여 복수의 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 지의 여부를 실험하였다.
PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장은 PCR 과정에 의한 타겟 핵산의 증폭과 함께 수반되었고, 연장 이합체의 존재는 포스트-PCR 멜팅 분석(멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이)에 의하여 검출하였다.
어세이 동안 형성된 연장 이합체는 상호작용적 이중 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 상호작용적 이중 표지는 그의 템플레이팅 부위의 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 CTO에 의하여 제공되었다. CTO은 동일한 종류의 형광 리포터 분자(FAM)을 갖지만, 상이한 Tm 값의 연장 이합체가 생성된다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블록킹하였다.
Neisseria gonorrhoeae (NG) 및 Staphylococcus aureus (SA)의 지놈 DNA를 타겟 핵산으로 이용하였다.
본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-3 5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 7)
NG-CTO-1 5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer] -3’(SEQ ID NO: 4)
SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’ (SEQ ID NO: 13)
SA-R 5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG-3’ (SEQ ID NO: 14)
SA-PTO-1 5’-AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3 spacer] -3’ (SEQ ID NO: 15)
SA-CTO-1 5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T(FAM)]AGCGTGGTCGGATT[C3 spacer] -3’(SEQ ID NO: 16)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
NG의 지놈 DNA 100 pg, SA의 지놈 DNA 100 pg, 각 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 10 및 13) 10 pmole, 각 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2 및 14) 10 pmole, 각 PTO(SEQ ID NO: 7 및 15) 5 pmole, 각 CTO(SEQ ID NO: 4 및 16) 2 pmole, 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 10 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 1.6 unit을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 30 초 과정을 60 회 반복하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 35℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 35℃에서 90℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 20에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우 복수의 타겟 시그널(NG의 Tm: 75.5℃ 및 SA의 Tm: 63.5℃)이 검출되었다. 주형이 없는 경우에는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다.
이러한 결과들은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이는, 타겟 핵산에 해당하는 연장 이합체가 상이한 Tm 값을 갖는 조건에서 동일한 종류의 리포터 분자(e.g. FAM)를 이용함으로써 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 마이크로어레이에서의 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이의 평가
본 발명자들은 마이크로어레이에서의 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 어세이를 추가적으로 실험하였다. PTO 절단은 개별 용기에서 실시하였고, CTO가 고정화된 마이크로어레이에 상기 반응결과물의 일부분을 옮겼다. 연장반응 이후, 연장 이합체의 존재를 멜팅 분석에 의하여 검출하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장에 이용하였다. 어세이 동안 형성된 연장 이합체는 단일 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 단일 표지는 그의 5’-말단이 형광 리포터 분자인 Quasar570으로 표지된 PTO에 의하여 제공되었다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블록킹하였다. CTO는 링커로서 폴리(T)5을 가지며, 그의 5’-말단에 있는 아미노기(AminnoC7)를 이용하여 유리 슬라이드 표면에 고정하였다. 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브는 그의 3’-말단에 있는 아미노기를 이용하여 유리 슬라이드 표면에 고정하였다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO, CTO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-5 5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 17)
NG-CTO-S1 5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer]-3’ (SEQ ID NO: 18)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 CTO 및 마커(SEQ ID NO: 18 및 19)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)로 최종 농도 10 μM이 되도록 용해시킨 CTO 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅 하였다. CTO 및 마커를 2x1 포맷(duplicate spots)으로 나란히 스팟팅(spotting) 하였고, 이렇게 하여 제작된 마이크로어레이를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 비-특이적으로 결합된 CTO 및 마커를 제거하기 위하여, 상기 슬라이드들을 2x SSPE(0.3 M 소디윰 클로라이드, 0.02 M 소디윰 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에 37℃에서 30 분 동안 세척하고 증류수로 세척하였다. 그 후 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드들을 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실에서 보관하였다.
NG유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 17) 1 pmole 및 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 25 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 4 unit을 함유한 50 ㎕의 최종 부피로 절단반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 63℃에서 60 초 과정을 30 회 반복하였다.
CTO(SEQ ID NO: 18)가 교호결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 결과물인 혼합물 30 ㎕를 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 멜팅 분석을 위하여, 6 개의 동일한 슬라이드를 제작하였다. 연장반응을 55℃에서 20 분 동안 실시하였다. 그 후, 이렇게 하여 제작된 슬라이드를 1 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 각 슬라이드를 44℃, 52℃, 60℃, 68℃, 76℃ 또는 84℃에서 증류수로 1 분 동안 세척시켰다. 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(molecular Device, US)을 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro6.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값(spot-medians)으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 21a 및 21b에서 보여주는 바와 같이, 상이한 세척 온도들에 의해 제작된 스팟으로부터의 형광 강도를 측정함으로써 멜팅 커브를 얻었다. 상기 멜팅 커브 데이터로부터 연장 이합체의 존재를 결정하였다.
실시예 6: 마이크로어레이에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이의 평가
본 발명자들은 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 실시간 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 실험하였다.
CTO가 고정화된 마이크로어레이 상에서 PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 반복하였다. 소정의 사이클 마다 지정 온도에서 연장 이합체의 존재를 검출하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장에 이용하였다.
어세이 동안 형성된 연장 이합체는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 단일 표지는 리포터 분자로 표지된 PTO(리포터-표지 PTO)에 의하여 제공되었다. 연장 이합체의 상호작용적 이중 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 CTO(이중-표지 CTO)에 의하여 제공되었다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블록킹하였다.
CTO는 링커로서 폴리(T)를 갖는다. CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단에 있는 아미노기(AminnoC7)를 이용하여 유리 슬라이드 표면에 고정하였다. 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브는 그의 3’-말단에 있는 아미노기를 이용하여 유리 슬라이드 표면에 고정하였다. 유리 슬라이드 상의 형광 강도는 지정 온도에서 측정하였다. 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였다. Neisseria gonorrhoeae (NG)에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 이용하였다.
6-1. 리포터-표지 PTO를 이용한 PTOCE 어세이
PTO는 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자로서 Quasar570을 갖는다. CTO는 그의 5’-말단을 통하여 고정화시켰다. 본 표지 방법에서는, 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였고, 상기 온도는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO, CTO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-5 5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 17)
NG-CTO-S1 5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer]-3’(SEQ ID NO: 18)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
실시예 5에서 이용된 것과 동일한 프로토콜로 슬라이드 제작을 실시하였다. NG유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 17) 1 pmole 및 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 15 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 2.4 unit을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 PTOCE 반응을 실시하였다; CTO(SEQ ID NO: 18)가 교호결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물 을 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 사이클링 분석을 위하여, 5 개의 동일한 슬라이드를 제작하였다. PTOCE 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 15 분 동안 변성시키고, 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 55℃에서 60 초 과정을 0, 5, 10, 20 또는 30 사이클 실시하였다. 각 사이클 수에 따른 반응 이후, 상기 슬라이드를 64℃에서 증류수로 1 분 동안 세척시켰다. 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(molecular Device, US)을 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro6.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 22a 및 22b에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우, 타겟 핵산서열에 대한 형광 강도는 사이클 수에 따라 증가하였다(0 사이클_RFU: 1,304± 0.7; 5 사이클_RFU: 18,939± 1,342.1; 10 사이클_RFU: 30,619± 285.0; 20 사이클_RFU: 56,248± 2,208.3; 및 30 사이클_RFU: 64,645± 1,110.2). 주형이 없는 경우에는, 사이클 수에 따른 형광 강도의 변화가 없었다.
6-2. 이중-표지 CTO를 이용한 PTOCE 어세이
CTO는 그의 3’-말단을 통하여 고정화되고, 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는다.
본 실시예에서 이용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO, CTO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-6 5’- ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 20)
NG-CTO-S2
5’- [BHQ-2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(Quasar570)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGTTTTTTT
TTTT[AminoC7]-3’ (SEQ ID NO: 21)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
실시예 5에서 이용된 것과 동일한 프로토콜로 슬라이드 제작을 실시하였다. NG유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 20) 1 pmole 및 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 15 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 2.4 unit을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 PTOCE 반응을 실시하였다; CTO(SEQ ID NO: 21)가 교호결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물 을 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 사이클링 분석을 위하여, 5 개의 동일한 슬라이드를 제작하였다. PTOCE 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 15 분 동안 변성시키고, 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 50℃에서 60 초 과정을 0, 5, 10, 20 또는 30 사이클 실시하였다. 각 사이클 수에 따른 반응 이후, 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(molecular Device, US)을 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro6.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 23a 및 23b에서 보여주는 바와 같이, 주형이 있는 경우, 타겟 핵산서열에 대한 형광 강도는 사이클 수에 따라 증가하였다(0 사이클_RFU: 28,078± 460.3; 5 사이클_RFU: 35,967± 555.1; 10 사이클_RFU: 44,674± 186.0; 20 사이클_RFU: 65,423± 2.1; 및 30 사이클_RFU: 65,426± 2.8). 주형이 없는 경우에는, 사이클 수에 따른 형광 강도의 변화가 없었다.
실시예 7: 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 엔드-포인트 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 이용한 복수의 타겟 핵산서열의 검출
본 발명자들은 마이크로어레이에서 지정 온도에서의 엔드-포인트 검출을 포함하는 PTOCE 어세이를 이용하여 복수의 타겟 검출을 추가적으로 실험하였다.
PTO 절단은 개별 용기에서 PCR 과정을 이용하여 실시하고, CTO가 고정화된 마이크로어레이에 상기 결과물의 적정량을 옮긴다. 연장반응 이후, 연장 이합체의 존재를 지정 온도에서의 엔드-포인트 검출에 의하여 검출하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장에 이용하였다.
어세이 동안 형성된 연장 이합체는 단일 표지를 갖도록 디자인하였다. 연장 이합체의 단일 표지는 5’-말단이 형광 리포터 분자인 Quasar570으로 표지된 PTO에 의하여 제공되었다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블록킹하였다.
CTO는 링커로서 폴리(T)5을 가지며, 그의 5’-말단에 있는 아미노기(AminnoC7)를 이용하여 유리 슬라이드에 고정하였다. 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브는 그의 3’-말단에 있는 아미노기를 이용하여 유리 슬라이드에 고정하였다.
유리 슬라이드 상의 형광 강도는 지정 온도에서 측정하였다. 연장 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 범위에서 검출 온도를 결정하였고, 상기 온도는 비절단 PTO 및 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높다. Staphylococcus aureus(SA) 및 Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA를 이용하였다.
본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’- TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID 5 NO: 10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO-5 5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 17)
NG-CTO-S1 5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer]-3’ (SEQ ID NO: 18)
SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’ (SEQ ID NO: 13)
SA-R2 5’-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3’ (SEQ ID NO: 22)
SA-PTO-2 5’-[Quasar570] AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 23)
SA_CTO-S1 5’-[AminoC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCAGCATAGCGTGGTCGGATT [C3 Spacer]-3’ (SEQ ID NO: 24)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅(tagging) 부위를 가리킨다)
실시예 5에서 이용된 것과 동일한 프로토콜로 슬라이드 제작을 실시하였다.
각 SA 및/또는 NG의 지놈 DNA 100 pg, 각 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 10 및/또는 13) 10 pmole, 각 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2 및/또는 22) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 17 및/또는 23) 1 pmole 및 2.5 mM MgCl2 함유한 2X 마스터 믹스 25 ㎕, dNTPs 200 M 및 H-Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea) 4 unit을 함유한 50 ㎕의 최종 부피로 절단반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 63℃에서 60 초 과정을 60 회 반복하였다. CTO(SEQ ID NO: 18 및 24)가 교호결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 결과물인 혼합물 30 ㎕를 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 연장반응을 55℃에서 20 분 동안 실시하였다. 그 후, 이렇게 하여 제작된 슬라이드를 64℃에서 증류수로 1 분 동안 세척시켰다. 각 세척 이후, 이미지 획득은 콘포컬 레이저 스캐너 Axon GenePix4100A(molecular Device, US)을 이용하여 10 ㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro6.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 24에서 보여주는 바와 같이, SA 주형이 있는 경우, SA에 대한 타겟 시그널(RFU: 65,192± 198.7)이 검출되었다. NG 주형이 있는 경우, NG에 대한 타겟 시그널(RFU: 65,332± 1.4)이 검출되었다. SA 및 NG 의 주형이 모두 있는 경우, SA에 대한 타겟 시그널(RFU: 65,302± 0.7) 및 NG(RFU 65,302± 0.7)에 대한 타겟 시그널도 모두 검출되었다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.
<110> Seegene, Inc. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY PTO CLEAVAGE AND EXTENSION ASSAY <130> PP110046 <150> 10-2011-0002840 <151> 2011-01-11 <150> 10-2011-0023465 <151> 2011-03-16 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-T <400> 1 aaatatgcga aacacgccaa tgaggggcat gatgctttct ttttgttctt gctcggcaga 60 gcgagtgata ccgatccatt gaaaaa 86 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-R <400> 2 caatggatcg gtatcactcg c 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-1 <400> 3 acgacggctt ggctgcccct cattggcgtg tttcg 35 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-1 <400> 4 cctcctcctc ctcctcctcc tccagtaaag ccaagccgtc gt 42 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-2 <400> 5 acgacggctt ggctttactg cccctcattg gcgtgtttcg 40 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-2 <400> 6 cctcctcctc ctcctcctcc tccagtaaag ccaagccgtc gt 42 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-3 <400> 7 acgacggctt ggcccctcat tggcgtgttt cg 32 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-3 <400> 8 tttttttttt cctcctccag taaagccaag ccgtcgt 37 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-4 <400> 9 tttttttttt ttttttttag taaagccaag ccgtcgt 37 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-F <400> 10 tacgcctgct actttcacgc t 21 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-5 <400> 11 cctcctccag taaagccaag ccgtcgt 27 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-4 <400> 12 acgacggctt gcccctcatt ggcgtgtttc g 31 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-F <400> 13 tgttagaatt tgaacaagga tttaatc 27 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-R <400> 14 gataagttta aagcttgacc gtctg 25 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-PTO-1 <400> 15 aatccgacca cgcattccgt ggtcaatcat tcggtttacg 40 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-CTO-1 <400> 16 tttttttttt tttttttgca tagcgtggtc ggatt 35 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-5 <400> 17 acgacggctt ggctttactg cccctcattg gcgtgtttcg 40 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-S1 <400> 18 tttttcctcc tcctcctcct cctcctccag taaagccaag ccgtcgt 47 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Marker <400> 19 atatatatat 10 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO-6 <400> 20 acgacggctt ggctttactg cccctcattg gcgtgtttcg 40 <210> 21 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO-S2 <400> 21 cctcctcctc ctcctcctcc tccagtaaag ccaagccgtc gttttttttt tt 52 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-R2 <400> 22 ttagctcctg ctcctaaacc a 21 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-PTO-2 <400> 23 aatccgacca cgctatgctc attccgtggt caatcattcg gtttacg 47 <210> 24 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA_CTO-S1 <400> 24 tttttcttct tcttcttctt cttcttcttc ccccagcata gcgtggtcgg att 53

Claims (77)

  1. 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며, 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며;
    (e) 일정 범위의 온도에서 상기 연장 이합체를 멜팅(melting)하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 단계로서; 상기 타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 제공되고; 그리고
    (f) 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 연장 이합체의 존재는 멜팅 분석에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)의 멜팅 이후에 혼성화를 실시하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 연장 이합체의 존재는 혼성화 분석에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단편 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 단계 (e)에서 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고, 상기 CTO는 상기 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 가지며; 상기 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 단계 (e)에서 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 단편 또는 상기 CTO는 단일 표지를 갖고, 상기 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 표지는 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 혼성화물(hybrid)이 형성되는 경우, 상기 혼성화물이 단계 (e)에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 표지는 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우, 상기 혼성화물이 단계 (e)에서 비-타겟 시그널을 제공하는 범위 내에 위치하고; 상기 연장 이합체의 Tm 값은 상기 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 상기 혼성화물의 Tm 값보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되며; 상기 삽입된 단일 표지는 상기 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있고; 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서의 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 연장반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 상기 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지에 의하여 제공되고, 상기 삽입된 표지는 상기 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 단계 (e)에서의 상기 연장 이합체의 멜팅은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (e)에서의 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 연장반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 상기 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO 및/또는 CTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 캡처링 부위는 그의 5’-말단 일부에, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 1-5 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(f)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기들에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 실시되며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 1 종의 CTO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 PTO의 5’-태깅 부위는 서로 동일한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 최소 2 종의 상기 타겟 시그널은 서로 상이한 종류의 표지로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 최소 2 종의 상기 타겟 시그널은 동일한 종류의 표지로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 최소 2 종의 상기 타겟 시그널은 동일한 종류의 표지로부터 제공되고; 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 단계 (b)는 상기 업스트림 프라이머의 상기 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이(variation)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서, 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편에 연결된 단일 표지 또는 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 한 쌍 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 각각은 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지되며;
    (b) 상기 프라이머의 연장 및 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되는 경우, 상기 업스트림 프라이머는 연장되고 상기 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 상기 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 상기 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며;
    (e) 일정 범위의 온도에서 상기 연장 이합체를 멜팅(melting)하여 상기 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 단계로서; 상기 타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 제공되고; 그리고
    (f) 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(f)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 최소 2 종의 상기 타겟 시그널은 동일한 종류의 표지로부터 제공되고; 상기 최소 2 종의 상기 타겟 핵산서열에 해당하는 상기 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 다음의 단계를 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 상기 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 상기 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 타겟 시그널을 제공하고; 그리고
    (e) 상기 연장 이합체가 그의 이중-가닥 형태를 유지하는 지정의 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서, 이에 의해 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 연장 이합체에 의하여 제공되는 상기 타겟 시그널은 단계 (d)의 연장 동안 제공되며; 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, 상기 연장 이합체에 의하여 제공되는 상기 타겟 시그널은 단계 (c)에서 상기 단편 및 상기 CTO의 상기 혼성화에 의하여 제공되고, 단계 (d)에서 상기 연장 이합체의 상기 형성은 타겟 시그널을 유지하며; 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 상기 혼성화물은 비-타겟 시그널을 제공하고; 상기 지정 온도는 상기 혼성화물의 Tm 값에서 10℃ 뺀 온도보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (c)에서의 상기 단편 및 상기 CTO의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서, 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (c)에서의 상기 단편 및 상기 CTO의 상기 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 43 항에 있어서, 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 단계 (d)에서의 상기 단편의 상기 연장은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 43 항에 있어서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고, 상기 CTO는 상기 상호작용적 이중 표지의 나머지 하나를 가지며; 단계 (c)에서의 상기 단편 및 상기 CTO의 상기 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 43 항에 있어서, 상기 단편 또는 상기 CTO는 단일 표지를 가지며, 단계 (c)에서의 상기 단편 및 상기 CTO의 상기 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장 이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 43 항에 있어서, 상기 CTO는 단일 표지를 가지며, 단계 (d)에서의 상기 단편의 상기 연장은 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 43 항에 있어서, 상기 표지는 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우, 상기 혼성화물이 단계 (d)에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 43 항에 있어서, 상기 표지는 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우, 상기 혼성화물이 단계 (d)에서 비-타겟 시그널을 제공하는 범위 내에 위치하고; 상기 연장 이합체의 Tm 값은 상기 비절단 PTO 및 상기 CTO 간의 상기 혼성화물의 Tm 값보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 40 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되며; 상기 삽입된 단일 표지는 상기 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있고; 단계 (d)에서의 상기 단편의 상기 연장은 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 단계 (d)에서의 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 연장반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 상기 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 40 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지에 의하여 제공되고; 상기 삽입된 표지는 상기 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 단계 (d)에서의 상기 단편의 상기 연장은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 연장반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 상기 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 40 항에 있어서, 상기 PTO 및/또는 CTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지된 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 40 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 40 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 상기 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 57 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 상기 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 40 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 40 항에 있어서, 단계 (a)-(e)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기들에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 40 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 실시되며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 1 종의 CTO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 40 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 단계 (b)는 상기 업스트림 프라이머의 상기 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 40 항에 있어서, 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편에 연결된 단일 표지 또는 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 40 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 다음을 포함하며, PTOCE(PTO 절단 및 연장) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트:
    (a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    (b) PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; 그리고
    (c) CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 및 상기 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고; 그리고 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의하여 연장되어 연장 이합체를 형성한다.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  69. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  70. 제 67 항에 있어서, 상기 PTO 및/또는 상기 CTO는 최소 하나의 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  71. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입된 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  72. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 상기 연장반응 동안 상기 연장 이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 PTO 및/또는 상기 CTO는 최소 하나의 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  73. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 인터컬레이팅 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  74. 제 70 항에 있어서, 상기 표지는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  75. 제 67 항에 있어서, 상기 키트는 최소 2 종의 핵산서열의 검출에 이용되며, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2 종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  76. 제 67 항에 있어서, 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화 되는 것을 특징으로 하는 키트.
  77. 제 67 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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