BR112012026221B1 - método e kit para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo de um dna ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de ptoce - Google Patents

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Abstract

MÉTODO E KIT PARA DETECTAR SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO-ALVO DE UM DNA OU UMA MISTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ATRAVÉS DE UM ENSAIO DE PTOCE. A presente invenção refere-se à detecção de uma sequência de ácido nucléico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão com PTO). A presente invenção detecta uma sequência de ácido nucléico alvo em que o PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) hibridizado com a sequência de ácido nucléico alvo é clivado para liberar um fragmento e o fragmento é hibridizado com o CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde) para formar um duplex estendido, seguido pela detecção da presença do duplex estendido. O duplex estendido fornece sinais (geração, aumento, extinção ou decréscimo de sinais) partindo das marcações que indicam a presença do duplex estendido e possui valor de T m ajustável, que são bem adotáveis para a detecção da presença da sequência de ácido nucléico alvo.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se à detecção de uma sequên cia de ácido nucleico-alvo através de um ensaio PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).
DESCRIÇÃO DA ARTE RELACIONADA
[0002] A hibridização do DNA é um processo fundamental na bio logia molecular e é afetada pela força iônica, a composição de bases, o comprimento de fragmento ao qual o ácido nucleico foi reduzido, o grau de pareamento errado e a presença de agentes desnaturantes. As tecnologias baseadas na hibridização do DNA seriam uma ferramenta muito útil na determinação de sequências de ácidos nucleicos específicas e claramente seriam valiosas no diagnóstico clínico, na pesquisa genética e na análise de laboratório forense.
[0003] Entretanto, os métodos e os processos convencionais que dependem principalmente da hibridização muito provavelmente produzem resultados falsos positivos devido à hibridização não específica entre as sondas e sequências que não são alvo. Portanto, permanecem problemas que devem ser resolvidos para aprimorar sua confiabilidade.
[0004] Além dos processos de hibridização de sondas, várias abordagens utilizando reações enzimáticas adicionais, por exemplo, o método de sonda TaqManTM, foram sugeridas.
[0005] No método de sonda de TaqManTM, a sonda marcada hi- bridizada com uma sequência de ácido nucleico-alvo é clivada por uma atividade de 5' nuclease de uma DNA polimerase dependente de iniciador a montante, gerando um sinal que indica a presença de uma sequência-alvo (Pat. U.S. Nos. 5.210.015. 5.538.848 e 6.326.145). O método de sonda de TaqManTM sugere duas abordagens para a produção de sinal: clivagem dependente de polimerização e clivagem independente de polimerização. Na clivagem de-pendente de polimeri- zação, a extensão do iniciador a montante tem que ocorrer antes de um ácido nucleico polimerase encontrar a extremidade a 5' da sonda marcada. À medida que a reação de extensão continua, a polimerase progressivamente cliva a extremidade a 5' da sonda marcada. Na clivagem independente de polimerização, o iniciador a montante e a sonda marcada são hibridizados com uma sequência de ácido nuclei- co-alvo em proximidade íntima de forma que a ligação da ácido nuclei- co polimerase à extremidade a 3' do iniciador a montante a coloca em contato com a com a extremidade a 5' da sonda marcada para liberar a marcação. Em adição, o método de sonda de TaqManTM divulga que a sonda marcada em sua extremidade a 5' que possui uma região de cauda a 5' que não pode ser hibridizada com uma sequência-alvo é também clivada para formar um fragmento que compreende a região de cauda a 5'.
[0006] Foram relatados alguns métodos em que uma sonda que possui uma região de cauda a 5' não complementar a uma sequência- alvo é clivada por 5' nuclease para liberar um fragmento que compreende a região de cauda a 5'.
[0007] Por exemplo, a Pat. U.S. No. 5.691.142 divulga uma estrutu ra de clivagem que será digerida pela atividade de nuclease a 5' da DNA polimerase. É exemplificada uma estrutura de clivagem em que um oligonucleotídeo que compreende uma porção não complementar a 5' a e uma porção não complementar a 3' a um molde é hibridizada com o molde e um oligonucleotídeo a montante é hibridizado com o molde em proximidade íntima. A estrutura de clivagem é clivada por DNA poli- merase que possui atividade de nuclease a 5' ou DNA polimerase modi- ficada com atividade de síntese reduzida para liberar a porção a 5' não complementar ao molde. A porção a 5' liberada é então hibridizada com um oligonucleotídeo que possui uma estrutura em grampo de cabelo para formar uma estrutura de clivagem, induzindo assim reações de clivagem progressiva para detectar uma sequência-alvo.
[0008] A Pat. U.S. No. 7.381.532 divulga um processo em que a estrutura de clivagem que possui o oligonucleotídeo a montante com extremidade a 3' bloqueada é clivada por DNA polimerase que possui atividade de nuclease a 5' ou FEN nuclease para liberar a região flap a 5' não complementar e a região flap a 5' liberada é detectada através da análise de tamanho ou de marcação dual interativa. A Pat. U.S. No. 6.893.819 divulga que flaps liberados detectáveis são produzidos por um método de amplificação sequencial mediado por flap dependente da síntese de ácido nucleico. Neste método, um flap liberado partindo de uma primeira estrutura de clivagem cliva, de uma maneira dependente da síntese de ácido nucleico, uma segunda estrutura de clivagem para liberar um flap da segunda estrutura de clivagem e os flaps liberados são detectados.
[0009] Através da hibridização de sondas marcadas com fluores cência em uma fase líquida, um grande número de sequências de ácidos nucleicos-alvo pode ser simultaneamente detectado utilizando até mesmo um único tipo de uma marcação fluorescente através da análise de curva de fusão. Entretanto, as tecnologias convencionais para a detecção de sequências-alvo através da clivagem mediada por nuclease a 5' de sondas duais interativas marcadas requerem tipos diferentes de marcações fluorescentes para sequências-alvo diferentes na detecção de-alvo multiplex, o que limita o número de sequências-alvo que será detectado devido à limitação do número de tipos de marcações fluorescentes.
[00010] A Pub. de Pedido de Patente U.S. 2008-0241838 divulga um método de detecção de-alvo utilizando a clivagem de uma sonda que possui uma porção não complementar a 5' a uma sequência de ácido nucleico-alvo e a hibridização de uma sonda de captura. Uma marcação fica posicionada na porção a 5' não complementar. A sonda marcada hibridizada com a sequência-alvo é clivada para liberar um fragmento, após o que o fragmento é então hibridizado com a sonda de captura para detectar a presença da sequência-alvo. Neste método, é necessário que uma sonda não clivada/intacta não seja hibridizada com a sonda de captura. Para isto, a sonda de captura que possui um comprimento menor tem que ser imobilizada sobre um substrato sólido. Entretanto, tal limitação resulta em uma menor eficiência de hibri- dização sobre um substrato sólido e também em dificuldades na otimização de condições de reação.
[00011] Portanto, permanecem necessidades sentidas há muito tempo na arte de desenvolver novas abordagens para a detecção de uma sequência-alvo, preferencialmente várias sequências-alvo, em uma fase líquida e em uma fase sólida não somente através da hibridi- zação, mas também reações enzimáticas tal como uma reação nucleo- lítica a 5' de uma maneira mais conveniente, confiável e reproduzível. Além disso, um novo método de detecção de-alvo não limitado pelo número de tipos de marcações (particularmente, marcações fluorescentes) também é necessário na arte.
[00012] Ao longo de todo este pedido de patente, várias patentes e publicações são referidas e citações são fornecidas entre parênteses. A divulgação destas patentes e publicações em sua totalidade é incorporada aqui como referências dentro deste pedido de patente com a finalidade de descrever de forma mais completa esta invenção e o estado da arte ao qual esta invenção está relacionada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00013] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para o desenvolvimento de novas abordagens para detectar sequências-alvo com acurácia e conveniência melhoradas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como um resultado, os presentes inventores estabeleceram novos protocolos para a detecção de sequências-alvo, em que a detecção do-alvo é realizada através da hibridização de sondas, da clivagem enzimática da sonda, da extensão e da detecção de uma dupla-fita estendida. Os presentes protocolos são bem adotados às reações em fase líquida bem como às reações em fase sólida e garantem a detecção de várias sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas.
[00014] Portanto, é um objetivo desta invenção fornecer um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).
[00015] É outro objetivo desta invenção fornecer um kit para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).
[00016] Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes partindo da descrição detalhada a seguir tomadas juntas com as reivindicações e os desenhos em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00017] A Figura 1 mostra as estruturas esquemáticas de PTO (Probing and Tagging Oligonucleotide (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação)) e CTO (Capturing and Templating Oligonucleotide (Oli- gonucleotídeo de Captura e Molde)) utilizados no ensaio de Clivagem e Extensão de PTO (ensaio de PTOCE). Preferencialmente, as extremidades a 3' do PTO e do CTO são bloqueadas para proibir sua extensão.
[00018] A Figura 2 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde.
[00019] A Figura 3 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui uma molécula repórter em sua porção de molde. A molécula repórter é requerida para exibir intensidade de sinal diferente dependendo de sua presença em uma forma de fita simples ou uma forma de fita dupla.
[00020] A Figura 4 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui um resíduo de iso-dC e uma molécula repórter em sua porção de molde. O extintor-iso-dGTP é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão.
[00021] A Figura 5 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5' e o CTO possui um resíduo de iso-dC em sua porção de molde. O extintor-iso-dGTP é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão.
[00022] A Figura 6 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de marcação a 5'.
[00023] A Figura 7 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5'. A molécula repórter é requerida para exibir intensidade de sinal diferente dependendo de sua presença em uma forma de fita simples ou uma forma de fita dupla.
[00024] A Figura 8 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula de extinção em sua porção de marcação a 5' e o CTO possui uma molécula repórter em sua porção de captura.
[00025] A Figura 9 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a detecção a uma temperatura predeterminada. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade a 3'.
[00026] A Figura 10 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a detecção a uma temperatura predeterminada. Um dATP marcado com o repórter é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade a 3'.
[00027] A Figura 11 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a detecção a uma temperatura predeterminada. O CTO possui um resíduo de iso-dC em sua porção de molde e um repórter-iso-dGTP é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade a 3'.
[00028] A Figura 12 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a detecção a uma temperatura predeterminada. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5'. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade a 5'.
[00029] A Figura 13 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a detecção a uma temperatura predeterminada com um corante intercalante. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade a 5'.
[00030] A Figura 14 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde.
[00031] A Figura 15 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula de extinção em sua extremidade a 5' e CTO possui uma molécula repórter em sua extremidade a 3'.
[00032] A Figura 16 mostra os resultados em que os valores de Tm de dúplices estendidos são ajustados por sequências de CTO.
[00033] A Figura 17 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde. A Figura 17A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Figura 17B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.
[00034] A Figura 18 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O CTO possui um resíduo de iso-dC e uma molécula repórter em sua extremidade a 5'. O extintor-iso-dGTP é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão. A Figura 18A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Figura 18B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.
[00035] A Figura 19 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O PTO possui uma molécula de extinção em sua extremidade a 5' e CTO possui uma molécula repórter em sua extremidade a 3'. A Figura 19A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Figura 19B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.
[00036] A Figura 20 mostra os resultados da detecção simultânea do gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) e do gene de Staphylococcus aureus (SA) através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde.
[00037] A Figura 21 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão sobre microarranjo. O CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5'. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5'.
[00038] A Figura 22 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada sobre microarranjo. O CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5'. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5'.
[00039] A Figura 23 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada sobre microarranjo. O CTO é imobilizado através de sua extremidade a 3' e possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde.
[00040] A Figura 24 mostra os resultados da detecção com único ou-alvos múltiplos através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção no ponto final a uma temperatura predeterminada sobre mi- croarranjo. O CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5'. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação a 5'. O gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) e o gene de Staphylococcus aureus (SA) foram utilizados como as sequências de ácidos nucleicos- alvo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DESTA INVENÇÃO
[00041] A presente invenção é direcionada para um novo método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) e um kit para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo através de um ensaio de PTOCE.
[00042] A presente invenção envolve não somente reações de hi- bridização, mas também reações enzimáticas que ocorrem dependendo da presença de uma sequência de ácido nucleico-alvo. 1. Processo de Detecção de-alvo por PTOCE que Compreende a Análise de Fusão
[00043] Em um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), que compreende: (a) a hibridização da sequência de ácido nucleico-alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o oligonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento a 3' que compreende uma sequência de nucleotí- deos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico- alvo e (ii) uma porção de direcionamento a 5' que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; em que a porção de direcionamento a 3' é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de direcionamento a 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o oligo- nucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO; (b) o contato do resultado da etapa (a) com uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' sob condições para a clivagem do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5' de forma que a clivagem libere um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO; (c) a hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde); em que o CTO compreende em uma direção 3' até 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) a realização de uma reação de extensão utilizando o resultado da etapa (c) e um ácido nucleico polimerase dependente do molde; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e uma dupla-fita estendida é formada; em que a dupla-fita estendida possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; (e) a fusão da dupla-fita estendida ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida; em que o sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão, (iii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) uma marcação intercalante; e (f) a detecção da dupla-fita estendida através da medida do sinal-alvo; em que a presença da dupla-fita estendida indica a presen- ça da sequência de ácido nucleico-alvo.
[00044] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para o desenvolvimento de novas abordagens para detectar as sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como um resultado, os presentes inventores estabeleceram novos protocolos para a detecção de sequências-alvo, em que a detecção do-alvo é realizada através da hibridização de sondas, da clivagem enzimática da sonda, da extensão e da detecção de uma dupla-fita estendida. Os presentes protocolos são bem adotados às reações em fase líquida assim como às reações em fase sólida e garantem a detecção de várias sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas.
[00045] A presente invenção emprega eventos sucessivos seguidos pela da hibridização de sondas; clivagem de PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) e extensão; formação de uma dupla-fita estendida dependente do-alvo; e detecção da dupla-fita estendida. Portanto, isto é chamado de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).
[00046] Na presente invenção, a dupla-fita estendida é caracterizada como possuindo uma (ou mais) marcação(ões) fornecendo um sinal que indica a presença da dupla-fita estendida através da análise de fusão ou através da detecção a uma temperatura predeterminada. Além disso, a dupla-fita estendida é caracterizada como possuindo um valor de Tm que pode ser ajustado, que desempenha uma função crítica na detecção múltipla do-alvo ou na discriminação do sinal que não é alvo.
[00047] Uma vez que a dupla-fita estendida é produzida apenas se existir o ácido nucleico-alvo, a presença da dupla-fita estendida indica a presença do ácido nucleico-alvo.
[00048] O ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão será descrito em maiores detalhes a seguir: Etapa (a): Hibridização de um oligonucleotídeo a montante e um PTO com uma sequência de ácido nucleico-alvo
[00049] De acordo com a presente invenção, uma sequência de ácido nucleico-alvo é primeiramente hibridizada com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação).
[00050] O termo utilizado aqui "ácido nucleico-alvo", "sequência de ácido nucleico-alvo" ou "sequência-alvo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de interesse para a detecção, que é anelado a ou hibri- dizado com uma sonda ou um iniciador sob condições de hibridização, anelamento ou amplificação.
[00051] O termo utilizado aqui "sonda" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de fita simples que compreende uma porção ou porções que são substancialmente complementares a uma sequência de ácido nucleico-alvo.
[00052] O termo "iniciador" como utilizado aqui se refere a um oli- gonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de início de síntese quando colocado sob condições em que a síntese do produto da extensão do iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico (molde) is induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização, tal como a DNA polimerase e a uma temperatura e um pH adequados.
[00053] Preferencialmente, a sonda e o iniciador são moléculas de desoxirribonucleotídeos de fita simples. As sondas ou os iniciadores utilizados nesta invenção podem ser compreendidos de dNMP que ocorre naturalmente (isto é, dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado ou nucleotídeo não natural. As sondas ou os iniciadores também podem incluir ribonucleotídeos.
[00054] O iniciador tem que ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos da extensão na presença do agente para polimeri- zação. O comprimento exato dos iniciadores dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação e fonte do iniciador. O termo "anelamento" ou "priming" como utilizado aqui se refere à justaposição de um oligodesoxinucleotídeo ou ácido nucleico a um ácido nucleico de molde, em que a justaposição possibilita que a polimerase polimeri- ze nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico que é complementar ao molde ácido nucleico ou uma porção do mesmo.
[00055] O termo "hibridização" utilizado aqui se refere à formação de um ácido nucleico de fita dupla partindo de ácidos nucleicos de fita simples complementares. A hibridização pode ocorrer entre duas fitas de ácidos nucleicos perfeitamente combinados ou substancialmente combinados com alguns pareamentos errados. A complementaridade para a hibridização pode depender das condições de hibridização, particularmente da temperatura.
[00056] A hibridização de uma sequência de ácido nucleico-alvo com o oligonucleotídeo a montante e o PTO pode ser realizada sob condições de hibridização adequadas determinadas de forma rotineira através de procedimentos de otimização. Condições tais como temperatura, concentração de componentes, tempos de hibridização e lavagem, componentes tamponantes e seu pH e força iônica podem ser variadas dependendo de vários fatores, incluindo o comprimento e o conteúdo de GC do oligonucleotídeo (oligonucleotídeo a montante e PTO) e da sequência de nucleotídeos-alvo. Por exemplo, quando um oligonucleotídeo relativamente curto for utilizado, é preferível que condições de baixa estringência sejam adotadas. As condições detalhadas para hibridização podem ser encontradas em Joseph Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag Nova York Inc. N.Y.(1999).
[00057] Não há distinção pretendida entre os termos "anelamento" e "hibridização" e estes termos serão utilizados de forma intercambiável.
[00058] O oligonucleotídeo a montante e o PTO possuem sequências de nucleotídeos hibridização complementares à sequência de ácido nucleico-alvo. O termo "complementar" é utilizado aqui para significar que iniciadores ou sondas são suficientemente complementares para se hibridizarem de forma seletiva com uma sequência de ácido nucleico-alvo sob as condições de anelamento ou as condições estrin- gentes determinadas, abrangendo os termos "substancialmente complementar" e "perfeitamente complementar", preferencialmente “perfeitamente complementar”.
[00059] A porção de direcionamento a 5' do PTO possui uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nu- cleico-alvo. A porção de molde do CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde) possui uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' do PTO. O termo "não complementar" é utilizado aqui para significar que os iniciadores ou as sondas são suficientemente não complementares para não se hibridizar de forma seletiva a uma sequência de ácido nu- cleico-alvo sob as condições de anelamento ou as condições estrin- gentes determinadas, abrangendo os termos "substancialmente não complementar" e "perfeitamente não complementar", preferencialmente perfeitamente não complementar.
[00060] O termo utilizado aqui "PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação)" significa um oligonucleotídeo que compreende (i) uma porção de direcionamento a 3' que serve como uma sonda e (ii) uma porção de direcionamento a 5' com uma sequência de nucleotí- deos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo, que é nu- cleoliticamente liberado do PTO após a hibridização com a sequência de ácido nucleico-alvo. A porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' no PTO têm que estar posicionadas em uma or- dem 5' para 3'. O PTO é esquematicamente ilustrado na Figura 1.
[00061] Preferencialmente, a hibridização na etapa (a) é realizada sob condições estringentes em que a porção de direcionamento a 3' é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de direcionamento a 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nuclei- co-alvo.
[00062] O PTO não requer quaisquer comprimentos específicos. Por exemplo, o comprimento do PTO pode ser de 15-150 nucleotí- deos, 15-100 nucleotídeos, 15-80 nucleotídeos, 15-60 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos, 20-150 nucleotídeos, 20-100 nucleotídeos, 20-80 nucleotídeos, 20-60 nucleotídeos, 20-50 nucleotídeos, 30-150 nucleo- tídeos, 30-100 nucleotídeos, 30-80 nucleotídeos, 30-60 nucleotídeos, 30-50 nucleotídeos, 35-100 nucleotídeos, 35-80 nucleotídeos, 35-60 nucleotídeos ou 35-50 nucleotídeos. A porção de direcionamento a 3' do PTO pode ter quaisquer comprimentos contanto que esta seja especificamente hibridizada com as sequências de ácidos nucleicos-alvo. Por exemplo, a porção de direcionamento a 3' do PTO pode ser de 10100 nucleotídeos, 10-80 nucleotídeos, 10-50 nucleotídeos, 10-40 nu- cleotídeos, 10-30 nucleotídeos, 15-100 nucleotídeos, 15-80 nucleotí- deos, 15-50 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos, 15-30 nucleotídeos, 20100 nucleotídeos, 20-80 nucleotídeos, 20-50 nucleotídeos, 20-40 nu- cleotídeos ou 20-30 nucleotídeos in comprimento. A porção de direcionamento a 5' pode ter quaisquer comprimentos contanto que esta seja especificamente hibridizada com a porção de molde do CTO e então estendida. Por exemplo, a porção de direcionamento a 5' do PTO pode ter de 5-50 nucleotídeos, 5-40 nucleotídeos, 5-30 nucleotídeos, 5-20 nucleotídeos, 10-50 nucleotídeos, 10-40 nucleotídeos, 10-30 nucleotí- deos, 10-20 nucleotídeos, 15-50 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos, 1530 nucleotídeos ou 15-20 nucleotídeos de comprimento.
[00063] A extremidade a 3' do PTO pode ter um 3'-OH terminal. Preferencialmente, a extremidade a 3' do PTO é "bloqueada" para proibir sua extensão.
[00064] O bloqueio pode ser atingido de acordo com métodos convencionais. Por exemplo, o bloqueio pode ser realizado através da adição ao grupo 3'-hidroxila do último nucleotídeo de um grupamento químico tal como biotina, marcações, um grupo fosfato, um grupo alquila, ligante sem ser nucleotídeo, fosforotioato ou alcano-diol. Alternativamente, o bloqueio pode ser realizado através da remoção do grupo 3'-hidroxila do último nucleotídeo ou utilizando um nucleotídeo com nenhum grupo 3'-hidroxila tal como didesoxinucleotídeo.
[00065] Alternativamente, o PTO pode ser planejado para ter uma estrutura em grampo de cabelo.
[00066] A não hibridização entre a porção de direcionamento a 5' do PTO e a sequência de ácido nucleico-alvo refere-se a não formação da fita dupla estável entre as mesmas sob certas condições de hibridiza- ção. De acordo com uma modalidade preferida, a porção de direcionamento a 5' do PTO não envolvida na hibridização com a sequência de ácido nucleico-alvo forma um fita simples.
[00067] O oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO.
[00068] Em adição, o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo induz a clivagem do PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[00069] A indução da clivagem de PTO pelo oligonucleotídeo a montante pode ser realizada de duas maneiras: (i) indução de clivagem independente da extensão do oligonucleotídeo a montante; e (ii) indução de clivagem dependente da extensão do oligonucleotídeo a montante.
[00070] Quando o oligonucleotídeo a montante é posicionado de forma adjacente ao PTO de maneira suficiente para induzir a clivagem de PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5', a enzima ligada ao oligonucleotídeo a montante digere o PTO sem reação de extensão. Em contraste, quando o oligonucleotídeo a montante é posicionado de forma distante do PTO, uma enzima que possui uma atividade de polimerase (por exemplo, polimerase dependente do molde) catalisa a extensão do oligonucleotídeo a montante (por exemplo, iniciador a montante) e uma enzima que possui uma atividade de nuclease a 5' ligada ao produto estendido digere o PTO.
[00071] Portanto, o oligonucleotídeo a montante pode estar localizado relativamente ao PTO de duas maneiras. O oligonucleotídeo a montante pode estar localizado de forma adjacente ao PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira independente da extensão. Alternativamente, o oligonucleotídeo a montante pode estar localizado distantemente ao PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira dependente da extensão.
[00072] O termo utilizado aqui "adjacente" com referência às posições ou localizações significa que o oligonucleotídeo a montante é localizado de forma adjacente à porção de direcionamento a 3' do PTO para formar um pequeno corte. Ainda, o termo significa que o oligonu- cleotídeo a montante fica localizado 1-30 nucleotídeos, 1-20 nucleotí- deos ou 1-15 nucleotídeos além da porção de direcionamento a 3' do PTO.
[00073] O termo utilizado aqui "distante" com referência às posições ou localizações inclui quaisquer posições ou localizações suficientes para garantir as reações de extensão.
[00074] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante fica localizado distantemente ao PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira dependente da extensão.
[00075] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante. O iniciador a montante é adequado em uma indução de clivagem independente da extensão ou uma clivagem dependente da extensão e a sonda a montante é adequada em uma indução de clivagem independente da extensão.
[00076] Alternativamente, o oligonucleotídeo a montante pode ter uma sequência sobreposta parcial com a parte a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO. Preferencialmente, a sequência sobreposta possui 1-10 nucleotídeos, mais preferencialmente 1-5 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1-3 nucleotídeos de comprimento. Quando o oligonucleotídeo a montante possuir uma sequência sobreposta parcial com a parte a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO, a porção de direcionamento a 3' é parcialmente digerida junto com a porção de marcação a 5' na reação de clivagem da etapa (b). Em adição, a sequência sobreposta permite clivar um sítio desejado da porção de direcionamento a 3'.
[00077] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante induz através de sua fita estendida a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[00078] As tecnologias convencionais para as reações de clivagem pelos oligonucleotídeos a montante podem ser aplicadas na presente invenção, contanto que o oligonucleotídeo a montante induz a clivagem do PTO hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo para liberar um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO. Por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 e 7.381.532 e a Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2008-0241838 pode ser aplicada à presente invenção.
[00079] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante. O iniciador a jusante ge ra adicionalmente uma sequência de ácido nucleico-alvo que será hi- bridizada com o PTO, aumentando a sensibilidade na detecção do- alvo.
[00080] De acordo com uma modalidade preferida, quando o iniciador a montante e o iniciador a jusante são utilizados, um ácido nuclei- co polimerase dependente do molde é adicionalmente empregada para a extensão dos iniciadores.
[00081] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante (iniciador a montante ou sonda a montante), o iniciador a jusante e/ou a porção de direcionamento a 5' do PTO possui uma estrutura de oligonucleotídeo de iniciação dual (DPO) desenvolvida pelo presente inventor. Os oligonucleotídeos que possuem a estrutura de DPO exibem especificidade ao-alvo significativamente aprimorada comparada com os com iniciadores e sondas convencionais (ver a WO 2006/095981; Chun e outros, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
[00082] De acordo com uma modalidade preferida, a porção de direcionamento a 3' do PTO possui uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) desenvolvida pelo presente inventor. A estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) mostra especificidade ao-alvo significativamente aprimorada comparada com as sondas convencionais (ver a WO 2011/028041). Etapa (b): Liberação do fragmento do PTO
[00083] Posteriormente, o resultado da etapa (a) é colocado em contato com uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' sob condições para a clivagem do PTO. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5' para liberar um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO.
[00084] O termo utilizado aqui "condições para a clivagem do PTO" significa condições suficientes para digerir o PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5', tais como temperatura, pH, força iônica, tampão, comprimento e sequência de oligonucleotídeos e enzimas. Por exemplo, quando a Taq DNA polimerase é utilizada como a enzima que possui a atividade de nuclease a 5', as condições para a clivagem do PTO incluem tampão Tris-HCl, KCl, MgCl2 e temperatura.
[00085] Quando o PTO é hibridizado com a sequência de ácido nu- cleico-alvo, sua porção de direcionamento a 3' é envolvida na hibridi- zação e a porção de direcionamento a 5' forma um fita simples sem hibridização com a sequência de ácido nucleico-alvo (ver a Figura 2). Como tal, um oligonucleotídeo que compreende tanto estruturas de fita simples quanto de fita dupla pode ser digerido utilizando uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' através de uma variedade de tecnologias conhecidas por um perito na arte.
[00086] Os sítios de clivagem do PTO são variados dependendo do tipo de oligonucleotídeos a montante (sonda a montante ou iniciador a montante), sítios de hibridização de oligonucleotídeos a montante e condições de clivagem (ver as Pat. U.S. Nos. 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 e 7.381.532 e a Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2008-0241838).
[00087] Um grande número de tecnologias convencionais pode ser empregado para a reação de clivagem do PTO, liberando um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5'.
[00088] Sucintamente, pode haver três sítios de clivagem na etapa (b). Primeiramente, o sítio de clivagem é um sítio de junção entre uma porção de hibridização do PTO (porção de direcionamento a 3') e uma porção sem ser de hibridização (porção de direcionamento a 5'). O segundo sítio de clivagem é um sítio localizado vários nucleotídeos em uma direção a 3' além da extremidade a 3' da porção de direcionamento a 5' do PTO. O segundo sítio de clivagem fica localizado na parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO. O terceiro sítio de clivagem é um sítio localizado vários nucleotídeos em uma direção a 5' além da extremidade a 3' da porção de direcionamento a 5' do PTO.
[00089] De acordo com uma modalidade preferida, o sítio inicial para a clivagem do PTO pela polimerase dependente do molde que possui a atividade de nuclease a 5' após a extensão do iniciador a montante é um ponto de partida do fita dupla entre o PTO e a sequência de ácido nucleico-alvo ou um sítio 1-3 nucleotídeos além do ponto de partida.
[00090] Sob este aspecto, o termo utilizado aqui "um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO" em associação com a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5' é utilizado para abranger (i) a porção de direcionamento a 5', (ii) a porção de direcionamento a 5' e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' e (iii) uma parte da porção de direcionamento a 5'. Neste pedido de patente, o termo "um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO" também pode ser descrito como "fragmento de PTO".
[00091] O termo "parte" utilizado em associação com o PTO ou CTO tal como a parte da porção de direcionamento a 5' do PTO, a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO e a parte da extremidade a 5' da porção de captura do CTO refere-se a uma sequência de nucleotídeos composta de 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1- 10 ou 1-5 nucleotídeos, preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos.
[00092] De acordo com uma modalidade preferida, a enzima que possui a atividade de nuclease a 5' é a DNA polimerase que possui a atividade de nuclease a 5' ou FEN nuclease, mais preferencialmente uma DNA polimerase termostável que possui a atividade de nuclease a 5' ou FEN nuclease.
[00093] Uma DNA polimerase adequada que possui a atividade de nuclease a 5' nesta invenção é uma DNA polimerase termostável obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Ther- mus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igni- terrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Espécie de Thermus Z05, Espécie de Thermus sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafrica- nus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus e Aquifex aeolieus. Mais preferencialmente, a DNA polimerase termostável é Taq polimerase.
[00094] Alternativamente, a presente invenção pode empregar DNA polimerases que possuem a atividade de nuclease a 5' modificada para ter menos atividades de polimerase.
[00095] A FEN (flap endonuclease) nuclease utilizada é uma nuclease específica a flap a 5'.
[00096] A FEN nuclease adequada na presente invenção compreende FEN nucleases obtidas de uma variedade de espécies bacteria- nas, incluindo Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profun dus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Me- thanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix e Ar- chaeaglobus veneficus.
[00097] Quando o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), é preferível que as condições para a clivagem do PTO compreendam a reação de extensão do iniciador a montante.
[00098] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), uma polimerase dependente do molde é utilizada para a extensão do iniciador a montante e a polime- rase dependente do molde é idêntica à enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[00099] Opcionalmente, o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), uma polimerase dependente do molde é utilizada para a extensão do iniciador a montante e a polimerase dependente do molde é diferente da enzima que possui a atividade de nuclease a 5'. Etapa (c): Hibridização do fragmento liberado do PTO com CTO
[000100] O fragmento liberado do PTO é hibridizado com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde).
[000101] O CTO compreende em uma direção 3' até 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' do PTO.
[000102] O CTO atua como um molde for extensão do fragmento liberado partindo do PTO. O fragmento que serve como um iniciador é hi- bridizado com o CTO e estendido para formar uma dupla-fita estendida.
[000103] A porção de molde pode compreender qualquer sequência contanto que não seja complementar à porção de direcionamento a 5' e à porção de direcionamento a 3' do PTO. Além disso, a porção de molde pode compreender qualquer sequência contanto que esta possa atuar como um molde para a extensão do fragmento liberado partindo do PTO.
[000104] Como descrito anteriormente, quando o fragmento que possui a porção de direcionamento a 5' do PTO é liberado, é preferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5'. Quando o fragmento que possui a porção de direcionamento a 5' e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' for liberado, é preferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3'. Quando o fragmento que possui uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO é liberado, é pre-ferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à parte da porção de direcionamento a 5'.
[000105] Além disso, é possível planejar a porção de captura do CTO com a premeditação dos sítios de clivagem do PTO. Por exemplo, quando a porção de captura do CTO é planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5', o fragmento que possui uma parte da porção de direcionamento a 5' ou o fragmento que possui a porção de direcionamento a 5' pode ser hibridizado com a porção de captura e então estendido. Quando o fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' for liberada, esta pode ser hibridizada com a porção de captura do CTO planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos comple- mentar à porção de direcionamento a 5' e então estendida de forma bem sucedida embora nucleotídeos com pareamento errado estejam presentes na porção da extremidade a 3' do fragmento. Isto é devido ao fato de que os iniciadores podem ser estendidos dependendo das condições de reação embora sua extremidade a 3' contenha alguns nucleotídeos com pareamento errado (por exemplo 1-3 nucleotídeos com pareamento errado).
[000106] Quando o fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' é liberado, a parte da extremidade a 5' da porção de captura do CTO pode ser planejada para ter uma sequência de nucleotídeos complementar à parte clivada da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3', resolvendo os problemas associados com os nucleotí- deos com pareamento errado (ver a Figura 1).
[000107] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos da parte da extremidade a 5' da porção de captura do CTO complementar à parte clivada da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' pode ser selecionada dependendo dos sítios de clivagem previstos na porção de direcionamento a 3' do PTO. É preferível que a sequência de nucleotídeos da parte da extremidade a 5' da porção de captura do CTO complementar à parte clivada da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' tenha 1-10 nucleotídeos, mais preferencialmente 1-5 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1-3 nucleotídeos.
[000108] A extremidade a 3' do CTO pode compreender nucleotídeos adicionais não envolvidos na hibridização com o fragmento. Além disso, a porção de captura do CTO pode compreender uma sequência de nu- cleotídeos complementar apenas a uma parte do fragmento (por exemplo, uma parte do fragmento que contém sua porção da extremidade a 3') contanto que esteja estavelmente hibridizada com o fragmento.
[000109] O termo utilizado "captura da porção que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5'" é descrito aqui para abranger vários planejamentos e composições da porção de captura do CTO como discutido anteriormente.
[000110] O CTO pode ser planejado para possuir uma estrutura em grampo de cabelo.
[000111] O comprimento do CTO pode ser amplamente variado. Por exemplo, o CTO tem 7-1000 nucleotídeos, 7-500 nucleotídeos, 7-300 nucleotídeos, 7-100 nucleotídeos, 7-80 nucleotídeos, 7-60 nucleotí- deos, 7-40 nucleotídeos, 15-1000 nucleotídeos, 15-500 nucleotídeos, 15-300 nucleotídeos, 15-100 nucleotídeos, 15-80 nucleotídeos, 15-60 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos, 20-1000 nucleotídeos, 20-500 nu- cleotídeos, 20-300 nucleotídeos, 20-100 nucleotídeos, 20-80 nucleotí- deos, 20-60 nucleotídeos, 20-40 nucleotídeos, 30-1000 nucleotídeos, 30-500 nucleotídeos, 30-300 nucleotídeos, 30-100 nucleotídeos, 30-80 nucleotídeos, 30-60 nucleotídeos ou 30-40 nucleotídeos de comprimento. A porção de captura do CTO pode ter qualquer comprimento contanto que seja especificamente hibridizada com o fragmento liberado partindo do PTO. Por exemplo, a porção de captura do CTO tem 5100 nucleotídeos, 5-60 nucleotídeos, 5-40 nucleotídeos, 5-30 nucleotí- deos, 5-20 nucleotídeos, 10-100 nucleotídeos, 10-60 nucleotídeos, 1040 nucleotídeos, 10-30 nucleotídeos, 10-20 nucleotídeos, 15-100 nu- cleotídeos, 15-60 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos, 15-30 nucleotí- deos ou 15-20 nucleotídeos de comprimento. A porção de molde do CTO pode ter qualquer comprimento contanto que possa atuar como um molde na extensão do fragmento liberado partindo do PTO. Por exemplo, a porção de molde do CTO tem 2-900 nucleotídeos, 2-400 nucleotídeos, 2-300 nucleotídeos, 2-100 nucleotídeos, 2-80 nucleotí- deos, 2-60 nucleotídeos, 2-40 nucleotídeos, 2-20 nucleotídeos, 5-900 nucleotídeos, 5-400 nucleotídeos, 5-300 nucleotídeos, 5-100 nucleotí- deos, 5-80 nucleotídeos, 5-60 nucleotídeos, 5-40 nucleotídeos, 5-30 nucleotídeos, 10-900 nucleotídeos, 10-400 nucleotídeos, 10-300 nu- cleotídeos, 15-900 nucleotídeos, 15-100 nucleotídeos, 15-80 nucleotí- deos, 15-60 nucleotídeos, 15-40 nucleotídeos ou 15-20 nucleotídeos de comprimento.
[000112] A extremidade a 3' do CTO pode ter um 3'-OH terminal. Preferencialmente, a extremidade a 3' do CTO é bloqueada para proibir sua extensão. O bloqueio do CTO que não pode ser estendido pode ser conseguido de acordo com métodos convencionais. Por exemplo, o bloqueio pode ser realizado através da adição ao grupo 3'- hidroxila do último nucleotídeo do CTO de um grupamento químico tal como biotina, marcações, um grupo fosfato, grupo alquila, ligante sem ser nucleotídeo, fosforotioato ou alcano-diol. Alternativamente, o bloqueio pode ser realizada através da remoção do grupo 3'-hidroxila do último nucleotídeo ou utilizando um nucleotídeo sem grupo 3'-hidroxila tal como didesoxinucleotídeo.
[000113] O fragmento liberado do PTO é hibridizado com o CTO, fornecendo uma forma adequada na extensão do fragmento. Embora um PTO não digerido também seja hibridizado com a porção de captura do CTO através de sua porção de direcionamento a 5', sua porção de direcionamento a 3' não é hibridizada ao CTO que proíbe a formação de uma dupla-fita estendida.
[000114] A hibridização na etapa (c) pode ser descrita em detalhes com referência às descrições na etapa (a). Etapa (d): Extensão do fragmento
[000115] A reação de extensão é realizada utilizando o resultado da etapa (c) e um ácido nucleico polimerase dependente do molde. O fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido para formar uma dupla-fita estendida. Em contraste, o PTO hibridizado não clivado com a porção de captura do CTO não é estendido de forma que nenhuma dupla-fita estendida seja formada.
[000116] O termo utilizado aqui "dupla-fita estendida" significa uma dupla-fita formada através da reação de extensão em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido utilizando a porção de molde do CTO como um molde e a ácido nucleico polimera- se dependente de molde.
[000117] A dupla-fita estendida possui valor de Tm diferente daquele do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados.
[000118] Preferencialmente, a dupla-fita estendida possui valor de Tm maior que o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados.
[000119] O valor de Tm da dupla-fita estendida é ajustável por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO.
[000120] É uma característica notável da presente invenção que o valor de Tm ajustável da dupla-fita estendida é empregado para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida através da fusão da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000121] O termo utilizado aqui "Tm" refere-se a uma temperatura de fusão em que metade da população de molécula de ácido nucleicos de fita dupla é dissociada em moléculas de fita simples. O valor de Tm é determinado pelo comprimento e o conteúdo de G/C de nucleotídeos hibridizados. O valor de Tm pode ser calculado através de métodos convencionais tais como a regra de Wallace (R.B. Wallace e outros, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) e o método do vizinho mais próximo (SantaLucia J. Jr. e outros, Biochemistry, 35:3555- 3562(1996)); Sugimoto N. e outros, Nucleic Acids Res., 24:4501- 4505(1996)).
[000122] De acordo com uma modalidade preferida, o valor de Tm refere-se a valores reais de Tm sob condições de reação praticadas atualmente.
[000123] A ácido nucleico polimerase dependente de molde utilizada na etapa (d) pode incluir quaisquer ácido nucleico polimerases, por exemplo, fragmento de Klenow da DNA polimerase I de E. coli, uma DNA polimerase termostável e DNA polimerase de bacteriófago T7. Preferencialmente, a polimerase é uma DNA polimerase termostável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikia- nii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ru-ber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Espécie de Thermus Z05, Espécie de Thermus sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermo- siphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus e Aquifex aeolieus. Mais preferencialmente, a ácido nuclei- co polimerase dependente de molde é Taq polimerase.
[000124] De acordo com uma modalidade preferida, a enzima que possui a atividade de nuclease a 5' utilizada na etapa (b) é idêntica à ácido nucleico polimerase dependente de molde utilizada na etapa (d). Mais preferencialmente, a enzima que possui a atividade de nuclease a 5' utilizada na etapa (b), a ácido nucleico polimerase dependente de molde utilizada para a extensão do iniciador a montante e a ácido nu- cleico polimerase dependente de molde utilizada na etapa (d) são idênticas uma a outra.
[000125] A dupla-fita estendida possui uma marcação originada de (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento de PTO e/ou CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão, (iii) uma marcação incorporada dentro da dupla- fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento de PTO e/ou CTO ou (iv) uma marcação intercalante.
[000126] A presença da dupla-fita estendida pode indicar a presença da sequência de ácido nucleico-alvo porque a dupla-fita estendida é formada quando a sequência de ácido nucleico-alvo está presente. Para a detecção da presença da dupla-fita estendida de uma maneira direta, uma dupla-fita estendida que possui uma marcação fornecendo um sinal detectado é formada na etapa (d). Uma marcação utilizada na dupla-fita estendida fornece uma alteração de sinal dependendo do fato da dupla-fita estendida estar em um fita dupla ou um fita simples, finalmente fornecendo o sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida através da fusão da dupla-fita estendida. Etapa (e): Fusão da dupla-fita estendida
[000127] Após a reação de extensão, a dupla-fita estendida é fundida ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida.
[000128] O sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão, (iii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) uma marcação intercalante.
[000129] O termo utilizado aqui "sinal-alvo" significa qualquer sinal capaz de indicar a presença da dupla-fita estendida. Por exemplo, o sinal-alvo inclui um sinal das marcações (geração ou extinção de sinal), uma alteração de sinal de marcações (aumento ou diminuição de sinal), uma curva de fusão, um padrão de fusão e uma temperatura de fusão (ou valor de Tm).
[000130] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é uma alteração de sinal partindo de uma marcação na dupla-fita estendida na etapa de fusão. A alteração de sinal pode ser obtida através da medida dos sinais a não menos que duas temperaturas diferentes. Alternativamente, o sinal-alvo é uma curva de fusão, um padrão de fusão e uma temperatura de fusão (ou valor de Tm) obtida através da medida dos sinais partindo de uma marcação na dupla-fita estendida ao longo de uma faixa de temperaturas. Preferencialmente, a faixa de temperaturas é uma faixa de temperaturas for uma análise da curva de fusão ou temperaturas em torno do valor de Tm da dupla-fita estendida.
[000131] A dupla-fita estendida possui maior valor de Tm que o híbrido entre os PTO e CTO não clivados. Portanto, a dupla-fita estendida e o híbrido exibem padrões de fusão diferentes um de cada outro. Tais padrões de fusão diferentes permitem discriminar um sinal-alvo de sinais que não são alvo. O padrão de fusão diferente ou a temperatura de fusão gera o sinal-alvo junto com um sistema de marcação adequado.
[000132] A fusão pode ser realizada através de tecnologias convencionais, incluindo, mas não limitadas a, aquecimento, álcali, formami- da, uréia e tratamento com glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase) e proteínas de ligação. Por exemplo, a fusão pode ser conseguida através do aquecimento à temperatura variando de 80 C até 105 C. Os métodos gerais para a realização deste tratamento são fornecidos por Joseph Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).
[000133] Os sistemas de marcação adequados utilizados nesta invenção são vários em termos de seus tipos, localizações e maneira de produção de sinal.
[000134] Os sistemas de marcação úteis nesta invenção serão descritos em detalhes a seguir: (i) Marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO
[000135] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO. À medida que a dupla-fita estendida é formada entre o fragmento de PTO e CTO, uma marcação no fragmento de PTO ou no CTO fica presente na dupla-fita estendida, fornecendo o sinal-alvo na etapa de fusão.
[000136] A marcação inclui uma marcação dual interativa e uma marcação isolada. (i-1) Marcação dual interativa
[000137] O sistema de marcação interativa é um sistema de geração de sinal em que a energia é passada de forma não radioativa entre uma molécula doadora e uma molécula receptora. Como uma representação do sistema de marcação interativa, o sistema de marcação FRET (transferência de energia de ressonância fluorescente) inclui uma molécula repórter fluorescente (molécula doadora) e uma molécula de extinção (molécula receptora). No FRET, o doador de energia é fluorescente, mas o receptor de energia pode ser fluorescente ou não fluorescente. Em outra forma de sistemas de marcação interativa, o doador de energia não é fluorescente, por exemplo, um cromóforo e o receptor de energia é fluorescente. Ainda em outra forma de sistemas de marcação interativa, o doador de energia é luminescente, por exemplo, bioluminescente, quimioluminescente, eletroquimiolumines- cente e o receptor é fluorescente. A molécula doadora e a molécula receptora podem ser descritas como uma molécula repórter e uma molécula de extinção na presente invenção, respectivamente.
[000138] Preferencialmente, o sinal indicativo da presença da dupla- fita estendida (isto é, a presença da sequência de ácido nucleico-alvo) é gerado por sistemas de marcação interativa, mais preferencialmente o sistema de marcação de FRET (isto é, sistema de marcação dual interativa). Primeira Modalidade (Marcação dual interativa intrafita)
[000139] Em uma primeira modalidade de um sistema de marcação dual interativa, o fragmento ou o CTO possui uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a fusão da dupla-fita estendida na etapa (e) induz alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo na etapa (e). A primeira modalidade do sistema de marcação dual interativa é ilustrada nas Figuras 2, 6 e 9. A primeira modalidade é chamada de uma marcação dual interativa intrafita. Primeira Modalidade na Figura 2 (Marcação dual interativa intrafita)
[000140] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 2. A porção de molde do CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento e o fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO e estendido para formar a dupla-fita estendida.
[000141] Quando a dupla-fita estendida é formada na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção no CTO são conformacio- nalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes a cada outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000142] A expressão utilizada aqui "a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes" significa que a molécula repórter e a molécula de extinção estão de forma tridimensional adjacentes a cada outra através de uma estrutura conformacional do fragmento ou CTO tal como mola aleatória e estrutura em grampo de cabelo.
[000143] A expressão utilizada aqui "a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas" significa que a molécula repórter e a molécula de extinção são tridimensionalmente separadas através da alteração da estrutura conformacional do fragmento ou CTO após a formação de um fita dupla.
[000144] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente gerado na etapa (d).
[000145] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem ser localizadas em qualquer sítio no CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto e não extinto dependendo da fusão da dupla-fita estendida.
[000146] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção estão ambas ligadas à porção de molde ou à porção de captura do CTO.
[000147] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção estão posicionadas na extremidade a 5' e na extremidade a 3' de CTO.
[000148] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade a 5' ou 1-5 nucleotídeos além de sua extremidade a 5' e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.
[000149] De acordo com a modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade a 3' ou 1-5 nucleotídeos além de sua extremidade a 3' e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.
[000150] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula re- pórter e a molécula de extinção estão posicionadas a não mais que 80 nucleotídeos, mais preferencialmente não mais que 60 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente não mais que 30 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente não mais que 25 nucleotídeos além de cada outra. De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas por pelo menos 4 nu- cleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 6 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.
[000151] Na presente invenção, um híbrido entre o PTO e o CTO não clivados pode ser formado.
[000152] Quando a porção de molde do CTO for marcada com uma marcação dual interativa que é mostrada na Figura 2, uma alteração de sinal partindo de uma marcação no híbrido entre o PTO e o CTO não clivados não é induzida. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.
[000153] Quando a porção de captura do CTO for marcada com uma marcação dual interativa, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm da dupla-fita estendida e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido. Primeira Modalidade na Figura 6 (Marcação dual interativa intrafita)
[000154] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 6. A porção de direcionamento a 5' do PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' com a molécula repórter e a molécula de extinção. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO.
[000155] Quando a dupla-fita estendida é formada na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção no fragmento são confor- macionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes a cada outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000156] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem ser localizadas em qualquer sítio no fragmento, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto e não extinto dependendo da fusão da dupla-fita estendida.
[000157] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no fragmento é localizada em sua extremidade a 5' ou 1-5 nucleotídeos além de sua extremidade a 5' e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação do fragmento.
[000158] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção são posicionadas a mais que 50 nu- cleotídeos, mais preferencialmente não mais que 40 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente não mais que 30 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente não mais que 20 nucleotídeos além de cada outra. De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas por pelo menos 4 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 6 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.
[000159] Como representado na Figura 6, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença em valores de Tm da dupla-fita estendida e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido. Segunda Modalidade (Marcação dual interativa interfita)
[000160] Na segunda modalidade do sistema de marcação interativa, o fragmento possui uma de uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção e o CTO possui a outra da marcação dual interativa; em que a fusão da dupla- fita estendida na etapa (e) induz alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
[000161] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 8.
[000162] Quando a dupla-fita estendida é formada na etapa (d), o sinal da molécula repórter ligado ao CTO é extinto pela molécula de extinção ligado ao PTO. Quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000163] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente proveniente da marcação dual interativa.
[000164] A molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas em qualquer sítio do fragmento de PTO e do CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto pela molécula de extinção na dupla-fita estendida.
[000165] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter ou a molécula de extinção no fragmento de PTO fica localizada na extremidade a 5' da porção de direcionamento a 5'.
[000166] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter ou a molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade a 3'.
[000167] Como representado na Figura 8, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm da dupla-fita estendida e do híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido.
[000168] A molécula repórter e a molécula de extinção úteis na presente invenção podem incluir quaisquer moléculas conhecidas na arte. Os exemplos destas são: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BO- DIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO- PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C- Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein- C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) e Quasar 705 (610). O número entre parênteses é um comprimento de ondas de emissão máxima em nanômetros. Preferencialmente, a molécula repórter e a molécula de extinção incluem JOE, FAM, TAMRA, ROX e marcação à base de fluoresceína.
[000169] Os pares adequados de repórter-extintor são divulgados em uma variedade de publicações como a seguir: Pesce e outros, editores, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, Nova York, 1971); White e outros, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, Nova York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a Edição (Academic Press, Nova York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, Nova York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Fosforescence (Interscience Publishers, Nova York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6a Edição (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) Pat. U.S. Nos. 3.996.345 e 4.351.760.
[000170] É digno de nota que uma molécula de extinção negra não fluorescente capaz de extinguir uma fluorescência de uma faixa ampla de comprimentos de onda ou um comprimento de onda específico pode ser utilizada na presente invenção. Os exemplos destas são BHQ e DABCYL.
[000171] Na marcação de FRET adotada para o CTO, o repórter abrange um doador de FRET e o extintor abrange o outro parceiro (receptor) de FRET. Por exemplo, um corante de fluoresceína é utilizado como o repórter e um corante de rodamina como o extintor. (i-2) Marcação isolada
[000172] A presente invenção é também excelentemente executada utilizando sistemas de marcação isolada para fornecer sinais que indicam a presença de sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000173] De acordo com uma modalidade preferida, o fragmento ou o CTO possui uma marcação isolada e a fusão da dupla-fita estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal da marcação isolada para fornecer o sinal-alvo na etapa (e). Primeira Modalidade na Figura 3 (Sistema de marcação isolada)
[000174] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 3. A porção de molde do CTO possui uma marcação fluorescente isolada. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO e estendido para formar a dupla-fita estendida. Através da formação da dupla-fita estendida, a intensidade fluorescente proveniente da marcação fluorescente isolada se torna maior. Quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a intensidade fluorescente proveniente da marcação fluorescente isolada se torna menor, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000175] De acordo com uma modalidade preferida, a marcação isolada pode estar localizada em qualquer sítio no CTO, contanto que o nível de sinal proveniente da marcação isolada seja alterado dependendo da fusão da dupla-fita estendida.
[000176] De acordo com uma modalidade preferida, a marcação isolada é ligada à porção de molde ou à porção de captura do CTO.
[000177] Quando a porção de molde do CTO é marcada com uma marcação isolada como mostrado na Figura 3, uma alteração de sinal de uma marcação no híbrido entre o PTO e o CTO não clivados não é induzida. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.
[000178] Quando a porção de captura do CTO é marcada com uma marcação isolada, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm da dupla-fita estendida e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido. Segunda Modalidade na Figura 7 (Sistema de marcação isolada)
[000179] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 7. A porção de direcionamento a 5' do PTO possui a marcação fluorescente isolada. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nu- cleico-alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' com a marcação fluorescente isolada. Através da hibridização, a intensidade de sinal proveniente da marcação fluorescente isolada na porção de direcionamento a 5' é aumentada. Quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a intensidade de sinal proveniente da marcação fluorescente isolada se torna re-duzida, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000180] De acordo com uma modalidade preferida, a marcação isol’ada pode ser localizada em qualquer sítio no fragmento de PTO, contanto que o nível de sinal proveniente da marcação isolada seja alterado dependendo da fusão da dupla-fita estendida.
[000181] Como representado na Figura 7, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença em valores de Tm da dupla-fita estendida e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido.
[000182] A marcação isolada utilizada aqui tem que ser capaz de fornecer um sinal diferente dependendo de sua presença em um fita dupla ou uma fita isolada. A marcação isolada inclui uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescen- te, uma marcação eletroquímica e uma marcação com metal. Preferencialmente, a marcação isolada inclui uma marcação fluorescente.
[000183] Os tipos e os sítios de ligação preferíveis de marcações flu-orescentes isoladas utilizados nesta invenção são divulgados nas Pat. U.S. Nos. 7.537.886 e 7.348.141, cujos ensinamentos são incorporados aqui como referência em sua totalidade. Preferencialmente, a marcação fluorescente isolada inclui JOE, FAM, TAMRA, ROX e a marcação à base de fluoresceína. O resíduo de nucleotídeo marcado fica preferencialmente posicionado no resíduo de nucleotídeo interno dentro do oligonucleotídeo ao invés de na extremidade a 5' ou na extremidade a 3'.
[000184] A marcação fluorescente isolada útil na presente invenção pode ser descrita com referência às descrições para moléculas repórteres e de extinção como indicado anteriormente.
[000185] Em particular, quando a presente invenção em uma fase sólida é realizada utilizando uma marcação isolada, esta pode utilizar uma marcação fluorescente geral e não requer uma marcação fluorescente específica capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença no fita dupla ou na fita isolada. O sinal-alvo fornecido no substrato sólido é medido. A modalidade do sistema de marcação isolada com CTO imobilizado é ilustrada na Figura 12.
[000186] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcações químicas (por exemplo, biotina) ou marcações en- zimáticas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-gluocosidase) podem ser utilizadas.
[000187] Em um sistema de marcação utilizando "marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO", as marcações podem ser posicionadas até a extensão de que quando um híbrido entre um PTO e CTO não clivados é formado, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa (e). Alternativamente, as marcações podem ser posicionadas até a extensão de que quando um híbrido entre um PTO e CTO não clivados é formado, o híbrido fornece um sinal que não é alvo na etapa (e); em que o valor de Tm da dupla-fita estendida é maior que aquele do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados.
[000188] Particularmente, quando as marcações são posicionadas até a extensão de que um híbrido entre um PTO e CTO não clivados não fornece um sinal que não é alvo, a faixa incluindo o valor de Tm do híbrido pode ser utilizada para selecionar o valor de Tm da dupla- fita estendida para a detecção de uma sequência de ácido nucleico- alvo. (ii) Marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida
[000189] A presente invenção pode empregar uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão para o fornecimento do sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida.
[000190] Embora o fragmento de PTO ou CTO não possua marcação, uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão é utilizada de forma bem sucedida para permitir que a dupla-fita estendida seja marcada. As Figuras 10 e 11 ilustram uma modalidade em que um nucleotídeo com marcação isolada é incorporado dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão (ver C e D das Figuras 10 e 11). Esta modalidade também é aplicável a outras modalidades utilizando a análise de fusão.
[000191] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação isolada incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão; em que a marcação isolada incorporada é ligada a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que a fusão da dupla-fita estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação isolada para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
[000192] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 10. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO imobilizado sobre um substrato sólido e estendido na presença de nucleotídeos marcados com a marcação fluorescente isolada para formar a dupla-fita estendida. O sinal fluorescente partindo da dupla-fita estendida pode ser detectado no ponto do substrato sólido com CTO imobilizado. Quando a dupla-fita estendida é fundida, uma fita que possui uma marcação fluorescente é liberado e o sinal fluorescente é não é mais detectado sobre o ponto (não mostrado na Figura 10). Portanto, uma alteração de sinal pode ser fornecida sobre o ponto através da fusão da dupla-fita estendida. Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000193] O sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração da intensidade fluorescente no ponto com CTO imobilizado.
[000194] De acordo com uma modalidade preferida, um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira base não natural, como ilustrado na Figura 11. O nucleotídeo que possui a segunda base não natural é preferencialmente localizado em qualquer sítio na porção de molde do CTO.
[000195] O termo utilizado aqui "base não natural" refere-se a derivados de bases naturais tais como adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) e uracil (U), que são capazes de formar pares de bases com ligação de hidrogênio. O termo utilizado aqui "base não natural" inclui bases que possuem diferentes padrões de pareamento de bases de bases naturais como compostos de origem, como descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.432.272, 5.965.364, 6.001.983 e 6.037.120. O pareamento de bases entre bases não naturais envolve duas ou três ligações de hidrogênio como as bases naturais. O pare- amento de bases entre bases não naturais também é formado de uma maneira específica.
[000196] Os exemplos específicos de bases não naturais incluem as bases a seguir em combinações de pares de bases: iso-C/iso-G, iso- dC/iso-dG, K/X, H/J e M/N (ver a Pat. U.S. No. 7.422.850).
[000197] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 11. O fragmento é hibridizado com o CTO com um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, iso-dC) com uma afinidade de ligação específica a uma primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença do nucleo- tídeo que possui a primeira base não natural marcada com a marcação fluorescente isolada, formando a dupla-fita estendida. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.
[000198] O sinal fluorescente proveniente da dupla-fita estendida pode ser detectado sobre o ponto de um substrato sólido com CTO imobilizado. Quando a dupla-fita estendida é fundida, uma fita que possui uma marcação fluorescente é liberada e o sinal fluorescente não é mais detectado sobre o ponto (não mostrado na Figura 11). Portanto, uma alteração de sinal pode ser fornecida sobre o ponto através da fusão da dupla-fita estendida. Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000199] Quando uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão é empregada, uma marcação não é incorporada dentro do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.
[000200] Os tipos e as características das marcações isoladas utili- zadas podem ser descritos com referência às descrições para um sistema de marcação utilizando "marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO" como indicado anteriormente aqui. (iii) Marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida e marcação ligada ao fragmento ou ao CTO
[000201] A presente invenção pode empregar um sistema de marcação utilizando a cooperação da marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, como ilustrada nas Figuras 4 e 5.
[000202] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO e a marcação incorporada é ligada a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que as duas marcações são uma marcação dual interativa de uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a fusão da dupla-fita estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
[000203] Mais preferencialmente, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica à primeira não natural.
[000204] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 4. O fragmento é hibridizado com o CTO que compreende uma molécula repórter ou de extinção e um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, iso-dC) que é uma afinidade de ligação específica a uma primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a primeira base não natural marcada com uma molécula de extinção ou repórter, formando a dupla-fita estendida em que o sinal da molécula repórter é extinto pela molécula de extinção. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.
[000205] Quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000206] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal proveniente da marcação dual interativa.
[000207] O sítio da marcação no CTO e o sítio de incorporação da marcação incorporada são determinados até a extensão de que as duas marcações atuam como uma marcação dual interativa para a indução de alteração de sinal na etapa de fusão.
[000208] Ainda mais preferencialmente, a porção de molde do CTO possui uma molécula repórter ou de extinção e um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural. A reação de extensão na etapa (d) é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a molécula de extinção ou repórter e a primeira base não natural com uma afinidade de ligação específica à segunda base não natural no CTO. As duas bases não naturais na dupla-fita estendida na etapa (d) formam um pareamento de bases para extinguir um sinal proveniente da molécula repórter pela molécula de extinção e para induzir a alteração de um sinal, através do que o sinal-alvo é fornecido. Alternativamente, o fragmento possui uma molécula repórter ou de extinção e a porção de molde do CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural. A reação de extensão na etapa (d) é realizada na presen- ça de um nucleotídeo que possui a molécula de extinção ou repórter e a primeira base não natural com uma afinidade de ligação específica à segunda base não natural no CTO. As duas bases não naturais na dupla-fita estendida na etapa (d) formam um pareamento de bases para induzir a alteração de um sinal proveniente da molécula repórter através de extinção, através do que o sinal-alvo é fornecido.
[000209] Outra modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 5. Nesta modalidade, o fragmento que possui uma molécula repórter ou de extinção é hibridizado com o CTO que compreende um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, iso-dC) que é uma afinidade de ligação específica à primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a primeira base não natural marcada com a molécula de extinção ou repórter, formando a dupla-fita estendida em que o sinal da molécula repórter é extinto pela molécula de extinção. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.
[000210] Quando a dupla-fita estendida é formada na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando a dupla-fita estendida é fundida na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção estão con- formacionalmente adjacentes a cada outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo seja fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000211] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal proveniente da marcação dual interativa.
[000212] O sítio da marcação no PTO e o sítio de incorporação da marcação incorporada são determinados até a extensão de que as duas marcações atuam como uma marcação dual interativa para a indução de alteração de sinal na etapa de fusão.
[000213] Quando uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão é empregada, uma marcação não é incorporada dentro do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. (iv) Marcação intercalante
[000214] A presente invenção pode empregar uma marcação interca- lante para o fornecimento o sinal-alvo indicativo da presença da dupla- fita estendida. A marcação intercalante é mais útil em uma reação em fase sólida utilizando CTOs imobilizados porque as moléculas de ácidos nucleicos de fita dupla presentes nas amostras podem gerar sinais.
[000215] Os corantes intercalantes exemplificados úteis nesta invenção incluem SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BO- BO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO- PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM e laranja de tiazol. Os corantes intercalantes se intercalam especificamente dentro das moléculas de ácidos nucleicos de fita dupla para gerar sinais.
[000216] A Figura 13 ilustra uma modalidade em que os corantes in- tercalantes se intercalam entre pares de bases da dupla-fita estendida (C e D na Figura 13). A modalidade também é aplicável a outra modalidade utilizando a análise de fusão.
[000217] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fi- gura 13. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO imobilizado sobre um substrato sólido. A extensão é realizada na presença de um corante intercalante (por exemplo, SYBRTM Green) e produz a dupla-fita estendida com corantes intercalantes. O sinal fluorescente proveniente da dupla-fita estendida sobre o ponto do substrato sólido com CTO imobilizado pode ser detectado utilizando corantes fluorescentes intercalantes. Quando a dupla-fita estendida é fundida, corantes fluorescentes intercalantes são liberados e o sinal fluorescente não é mais detectado sobre o ponto (não mostrado na Figura 13). Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença da dupla-fita estendida na etapa (e).
[000218] O híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm da dupla-fita estendida e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo da dupla-fita estendida do sinal que não é alvo do híbrido (não mostrado na Figura 13).
[000219] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente gerado na etapa (d). Etapa (f): Detecção do sinal-alvo
[000220] Finalmente, a dupla-fita estendida é detectada através da medida do sinal-alvo fornecido na etapa (e), em que a presença da dupla-fita estendida indica a presença da sequência de ácido nucleico- alvo.
[000221] A detecção pode ser realizada de várias maneiras dependendo dos tipos do sinal-alvo.
[000222] De acordo com uma modalidade preferida, a detecção do sinal-alvo é realizada através da análise de fusão.
[000223] O termo utilizado aqui "análise de fusão" significa um méto- do em que um sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida é obtido através da fusão da dupla-fita estendida, incluindo um método para medir os sinais a duas temperaturas diferentes, análise da curva de fusão, análise do padrão de fusão e análise do pico de fusão. Preferencialmente, a análise de fusão é uma análise da curva de fusão.
[000224] De acordo com uma modalidade preferida, a fusão da etapa (e) é seguida pela a hibridização para fornecer o sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida. Em tal caso, a presença da dupla-fita estendida é detectada através da análise da curva de hibridização.
[000225] A curva de fusão ou a curva de hibridização pode ser obtida através de tecnologias convencionais, por exemplo, como descrito nas U.S. Pat Nos. 6.174.670 e 5.789.167, Drobyshev e outros, Gene 188: 45(1997); Kochinsky e Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Li- vehits e outros J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); e Howell e outros Nature Biotechnology 17:87(1999). Por exemplo, uma curva de fusão ou uma curva de hibridização pode consistir de uma representação gráfica ou exibição da variação do sinal de saída com o parâmetro de estringência de hibridização. O sinal de saída pode ser representado graficamente diretamente contra o parâmetro de hibridização. Tipicamente, uma curva de fusão ou uma curva de hibridização terá o sinal de saída, por exemplo, fluorescência, que indica o grau de estrutu-ra da dupla-fita (isto é, a extensão de hibridização), representado graficamente no eixo Y e o parâmetro de hibridização no eixo X.
[000226] O PTO e o CTO podem ser compreendidos de dNMPs que ocorrem naturalmente. Alternativamente, o PTO e CTO podem ser compreendidos de nucleotídeo modificado ou nucleotídeo não natural tal como PNA (ácido nucleico peptídico, ver a Publicação PCT No. WO 92/20702) e LNA (ácido nucleico trancado, ver as Publicações PCT Nos. WO 98/22489, WO 98/39352 e WO 99/14226). O PTO e o CTO podem compreender bases universais tais como desoxiinosina, inosi na, 1-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol e 5-nitroindol. O termo "base universal" refere-se a uma capaz de formar pares de bases com cada uma das bases de DNA/RNA naturais com pouca discriminação entre as mesmas.
[000227] Como descrito anteriormente, o PTO pode ser clivado em um sítio localizado em uma direção a 3' além da extremidade a 3' da porção de direcionamento a 5' do PTO. O sítio de clivagem pode ser localizado na parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO. Quando o fragmento de PTO compreende a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO, um sítio do CTO hibridizado com a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' pode compreender uma base universal, sequência degenerada ou combinação das mesmas. Por exemplo, se o PTO for clivada em um sítio localizado em um nucleotídeo em uma direção a 3' além da extremidade a 3' da porção de direcionamento a 5' do PTO, é vantajoso que a parte da extremidade a 5' da porção de captura do CTO compreenda uma base universal para a hibridização com o nu- cleotídeo. Se o PTO for clivado em um sítio localizado dois nucleotí- deos em uma direção a 3' além da extremidade a 3' da porção de direcionamento a 5' do PTO, é vantajoso que a extremidade a 5' da porção de captura do CTO compreenda uma sequência degenerada e seu nucleotídeo adjacente à direção a 3' compreenda uma base universal. Como tal, quando a clivagem do PTO ocorre em vários sítios da parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3', a utilização de bases universais e sequências degeneradas no CTO é útil. Em adição, quando os PTOs que possuem a mesma porção de direcionamento a 5' são utilizados para a verificação de várias sequências de ácidos nu- cleicos-alvo sob clivagem do iniciador a montante dependente da indução da extensão, os fragmentos de PTO que possuem partes da extremidade a 5' diferentes da porção de direcionamento a 3' podem ser gerados. Em tais casos, as bases universais e as sequências de-generadas são empregadas de forma útil no CTO. As estratégias que utilizam bases universais e sequências degeneradas no CTO garantem o uso de um tipo ou tipos mínimos do CTO para a verificação de várias sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000228] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a)-(b), (a)-(d) ou (a)-(f) com desnaturação entre ciclos de repetição preferencialmente, com um iniciador a jusante. Esta repetição permite amplificar a sequência de ácido nucleico-alvo e/ou o sinal-alvo.
[000229] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a)-(f) são realizadas em um recipiente de reação ou em recipientes de reação separados. Por exemplo, as etapas (a)-(b), (c)-(d) ou (e)-(f) podem ser realizadas em recipientes de reação separados.
[000230] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a)-(b) e (c)-(f) podem ser simultaneamente ou separadamente igualadas em um recipiente de reação dependendo das condições de reação (particularmente, temperatura).
[000231] A presente invenção não requer que sequências de ácidos nucleicos-alvo que serão detectadas e/ou amplificadas tenham qualquer sequência ou comprimento particular, incluindo quaisquer moléculas de DNA (gDNA e cDNA) e RNA.
[000232] Quando um mRNA é empregado como material de partida, uma etapa de transcrição inversa é necessária antes de realizar a etapa de anelamento, cujos detalhes são encontrados em Joseph Sam- brook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. e outros, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988). Para a transcrição inversa, um hexâmero aleatório ou um iniciador de oligonucleotídeo dT que pode ser hibridizado ao mRNA pode ser utilizado.
[000233] As sequências de ácidos nucleicos-alvo que podem ser detectados e/ou amplificados incluem qualquer ácido nucleico de proca- rioto, eucarioto (por exemplo, protozoários e parasitos, fungos, levedura, plantas superiores, animais inferiores e superiores, incluindo mamíferos e humanos) ou viral (por exemplo, Herpes vírus, HIV, vírus influenza, vírus Epstein-Barr, vírus da hepatite, vírus da pólio etc.) ou virói- de que ocorre naturalmente.
[000234] A presente invenção é também útil na detecção de uma variação de nucleotídeo. Preferencialmente, a sequência de ácido nu- cleico-alvo compreende uma variação de nucleotídeo. O termo "variação de nucleotídeo" utilizado aqui se refere a quaisquer substituições, deleções ou inserções de nucleotídeos isoladas ou múltiplas em uma sequência de DNA em uma localização particular entre os segmentos de DNA contíguos que são de outra maneira similares em sequência. Tais segmentos de DNA contíguos incluem um gene ou qualquer outra porção de um cromossomo. Esta variação de nucleotídeos pode ser variações alélicas mutantes ou polimórficas. Por exemplo, a variação de nucleotídeo detectada na presente invenção inclui SNP (polimorfismo de nucleotídeos isolados), mutação, deleção, inserção, substituição e translocação. A variação de nucleotídeo exemplificada inclui inúmeras variações no genoma humano (por exemplo, variações no gene da MTHFR (metilenotetrahidrofolato redutase)), variações envolvidas na resistência a fármacos de agentes patogênicos e variações que causa tumorigênese.
[000235] Na presente invenção para a detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo, quando iniciadores ou sondas utilizadas possuem sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo, a sequência de ácido nucleico-alvo que contém a variação de nucleotídeo é descrita aqui como um molde de combinação. Quando iniciadores ou sondas utilizadas possuem uma sequência não complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo, a sequência de ácido nucleico-alvo que contém a variação de nucleotídeo é descrita aqui como um molde com pareamento errado.
[000236] Para a detecção de variação de nucleotídeos, a extremidade a 3' do iniciador a montante pode ser planejada para ser oposta a um sítio de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. De acordo com uma modalidade preferida, a extremidade a 3' do iniciador a montante possui uma sequência complementar à variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. A extremidade a 3' do iniciador a montante que possui uma sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nu- cleico-alvo é anelada ao molde que se combina e estendida para induzir a clivagem do PTO. O fragmento resultante de PTO é hibridizado com o CTO fornecer o sinal-alvo. Em contraste, quando a extremidade a 3' do iniciador a montante é pareada errado com um variação de nu- cleotídeo em um molde que se pareia errado, esta não é estendida sob condições de que o anelamento da extremidade a 3' de iniciadores é essencial para a extensão mesmo quando o iniciador a montante é hibridizado com o molde que se pareia errado, resultando assim na não geração do sinal-alvo.
[000237] Alternativamente, é possível utilizar a clivagem de PTO dependendo da hibridização de PTO que possui a sequência complementar a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. Por exemplo, sob condições controladas, um PTO que possui a sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo é hibridizado com o molde que se combina e então clivado. O fragmento resultante de PTO é hibridizado com o CTO para fornecer o sinal-alvo. Enquanto que, sob as condições controladas, o PTO não é hibridizado com um molde que se pa- reia errado que possui sequência não complementar na posição da variação de nucleotídeo e não é clivado. Preferencialmente, neste caso, a sequência complementar à variação de nucleotídeo no PTO é posicionada no meio de sua porção de direcionamento a 3' do PTO.
[000238] Alternativamente, é preferível que a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO fique posicionada a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo para a detecção da variação de nucleotídeo e a parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO possui a sequência complementar à variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nu- cleico-alvo.
[000239] Em uma modalidade para a detecção da variação isolada de nucleotídeo, a extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO possui uma sequência complementar à variação isolada de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. Como descrito anteriormente, a clivagem do PTO hibridizado com um molde que se combina pode ser induzido em um sítio imediatamente adjacente em uma direção a 3' à extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO, por exemplo, sob indução dependente da extensão da clivagem do iniciador a montante. A extremidade a 3' do fragmento de PTO possui o nucleotídeo complementar à variação isolada de nucleotídeo. O fragmento de PTO é hibridizado com um CTO que possui uma porção de captura que compreende uma sequência que corresponde à variação de nucleotídeo e então estendido para formar a dupla-fita estendida, fornecendo o sinal-alvo. Se o mesmo PTO for hibridizado com um molde que se pareia errado que possui a sequência idêntica ao molde que se combina exceto para a variação isolada de nucleotídeo, a clivagem do PTO pode ocorrer em um sítio dois nucleotídeos além em uma direção a 3' partindo da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' do PTO. A extremidade a 3' do fragmento de PTO pos- sui o nucleotídeo adicionalmente clivado que o nucleotídeo complementar à variação isolada de nucleotídeo. Quando o sítio do CTO hi- bridizado com o nucleotídeo adicionalmente clivado é planejado para ter uma complementar não sequência ao nucleotídeo adicionalmente clivado, a extremidade a 3' do fragmento de PTO não é hibridizada com o CTO, resultando na não extensão do fragmento de PTO em uma condição controlada. Mesmo se o fragmento de PTO for estendido para formar a dupla-fita estendida, a dupla-fita possui um valor de Tm diferente da dupla-fita derivada da hibridização entre o PTO e o molde que se pareia errado.
[000240] De acordo com uma modalidade preferida, um sítio de clivagem do PTO que possui uma sequência complementar à variação de nucleotídeo em sua parte da extremidade a 5' da porção de direcionamento a 3' é diferente dependendo da hibridização com um molde que se combina ou com um molde que se pareia errado, de forma que o fragmento de PTO liberado de qualquer evento de hibridização possui sequência preferencialmente diferente, em sua parte da extremidade a 3', mais preferencialmente, em sua extremidade a 3'.
[000241] De acordo com uma modalidade preferida, a seleção da sequência de nucleotídeos de CTO em consideração de uma diferença nas partes da extremidade a 3' dos fragmentos de PTO permite discriminar o molde que se combina do molde que se pareia errado.
[000242] De acordo com uma modalidade preferida, a sequência de ácido nucleico-alvo utilizado na presente invenção é uma sequência de ácido nucleico pré-amplificada. A utilização da sequência de ácido nu- cleico pré-amplificada permite aumentar significativamente a sensibilidade e a especificidade de detecção do-alvo da presente invenção.
[000243] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante.
[000244] As vantagens da presente invenção podem ser destacadas na detecção simultânea (multiplex) de pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000245] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000246] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos-alvo; em que o oligonucleotí- deo a montante compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) dos PTOs e o CTO compreende pelo menos um tipo (preferencialmente pelo menos dois tipos, mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferenci-almente pelo menos cinco tipos) do CTO; em que quando pelo menos dois tipos de the sequências de ácidos nucleicos-alvo estão presentes, o método fornece pelo menos dois tipos do sinal-alvos que corresponde aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos- alvo.
[000247] As porções de direcionamento a 5' dos pelo menos dois PTOs podem ter uma sequência idêntica a cada outra. Por exemplo, quando a presente invenção é realizada para a verificação de sequências de ácidos nucleicos-alvo, as porções de direcionamento a 5' de PTOs podem ter a sequência idêntica.
[000248] Além disso, um único tipo do CTO pode ser utilizado para a detecção do grande número de sequências de ácidos nucleicos-alvo. Por exemplo, quando os PTOs que possuem uma sequência idêntica em suas porções de direcionamento a 5' são empregados para a verificação de sequências de ácidos nucleicos-alvo, um único tipo do CTO pode ser utilizado.
[000249] De acordo com uma modalidade preferida, os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo possuem valores de Tm diferentes de cada outro.
[000250] De acordo com uma modalidade preferida, os pelo menos dois tipos do sinal-alvos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo são fornecidos partindo dos tipos diferentes de marcações de cada outro.
[000251] De acordo com uma modalidade preferida, os pelo menos dois tipos do sinal-alvos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcações.
[000252] De acordo com uma modalidade preferida, os pelos menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcações; em que os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nuclei- cos-alvo possuem valores de Tm diferentes de cada outro.
[000253] O termo utilizado aqui "tipos diferentes de marcações" refere-se a marcações com diferentes características de sinais detectados. Por exemplo, FAM e TAMRA como marcações repórteres fluorescentes são considerados como tipos diferentes de marcações porque seus comprimentos de onda excitação e emissão são diferentes de cada outro.
[000254] Quando a presente invenção é realizada para detectar si-multaneamente pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nu- cleicos-alvo através da análise da curva de fusão e os dúplices esten- didos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo possuem valores de Tm diferentes de cada outro, é possível detectar pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo ainda utilizando um único tipo da marcação (por exemplo, FAM). Detecção do-alvo Utilizando CTO Imobilizado em uma Fase Sólida
[000255] A vantagem proeminente da presente invenção é ser eficiente na detecção de sequências de ácidos nucleicos-alvo mesmo em uma fase sólida tal como um microarranjo.
[000256] De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção é realizado sobre a fase sólida e o CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5' ou extremidade a 3' sobre um substrato sólido. Na fase sólida, o sinal-alvo fornecido sobre o substrato sólido é medido.
[000257] Quando o CTO imobilizado é utilizado, a análise de fusão utilizando sistemas de marcação como descrito anteriormente é aplicável à reação em fase sólida da presente invenção.
[000258] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação isolada ligada ao fragmento ou por uma marcação isolada incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão. Em particular, quando a presente invenção sobre uma fase sólida é realizado utilizando uma marcação isolada, pode utilizar uma marcação fluorescente geral e não requer uma marcação fluorescente específica capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença no fita dupla ou na fita isolada.
[000259] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcações químicas (por exemplo, biotina) ou marcações en- zimáticas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-gluocosidase) podem ser utilizadas.
[000260] Para a reação em fase sólida, o CTO é imobilizado diretamente ou indiretamente (preferencialmente indiretamente) através de sua extremidade a 5' ou extremidade a 3' (preferencialmente a extremidade a 3') sobre a superfície do substrato sólido. Além disso, o CTO pode ser imobilizado sobre a superfície do substrato sólido de uma maneira covalente ou não covalente. Quando os CTOs imobilizados forem imobilizados indiretamente sobre a superfície do substrato sólido, ligantes adequados são utilizados. Os ligantes úteis nesta invenção podem incluir quaisquer ligantes utilizados para imobilização da sonda sobre a superfície do substrato sólido. Por exemplo, compostos alquila ou arila com funcionalidade de amina ou compostos alquila ou arila com funcionalidade de tiol servem como ligantes para a imobilização de CTO. Em adição, cauda poli (T) ou cauda poli (A) pode servir como ligantes.
[000261] De acordo com uma modalidade preferida, o substrato sólido utilizado na presente invenção é um microarranjo. O microarranjo que fornece um ambiente de reação nesta invenção pode incluir qualquer um dos conhecidos por um perito na arte. Todos os processos da presente invenção, isto é, hibridização com sequências de ácidos nu- cleicos-alvo, clivagem, extensão, fusão e detecção por fluorescência, são realizados sobre o microarranjo. Os CTOs imobilizados sobre o microarranjo servem como elementos de arranjo hibridizável. O substrato sólido para fabricar o microarranjo inclui, mas não limitado a, metais (por exemplo, ouro, liga de ouro e cobre, alumínio), óxido metálico, vidro, cerâmica, quartzo, silício, semicondutor, wafer de Si/SiO2, ger- mânio, arsenieto de gálio, carbono, nanotubo de carbono, polímeros (por exemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno e poliacrilamida), sepharose, agarose e colóides. Um grande número de CTOs imobilizados nesta invenção pode ser imobilizado sobre uma região que pode ser direcionada ou duas ou mais regiões que podem ser direciona- das sobre um substrato sólido que pode compreender 2-1.000.000 regiões que pode ser direcionada. Os CTOs imobilizados podem ser fabricados para produzir arranjo ou arranjos para uma aplicação fornecida através de tecnologias de fabricação convencionais tais como fotoli- tografia, jateamento de tinta, micromanchas mecânicas e derivados dos mesmos.
[000262] A presente invenção realizada sobre a fase sólida pode detectar simultaneamente um grande número de sequências de ácidos nucleicos-alvo mesmo quando se utiliza um único tipo da marcação porque as marcações nos CTOs imobilizados são fisicamente separadas. Sob este aspecto, o número de sequências de ácidos nucleicos- alvo que será detectado pela presente invenção sobre a fase sólida não é limitado. II. Modalidade Preferível com Amplificação de uma Sequência de Ácido Nucleico-alvo
[000263] Preferencialmente, a presente invenção é realizada simultaneamente com amplificação de uma sequência de ácido nucleico- alvo utilizando um par de iniciadores compostos de um iniciador a montante e um iniciador a jusante capaz de sintetizar a sequência de ácido nucleico-alvo.
[000264] Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para a detecção das sequências de ácidos nucleicos-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), que compreende: (a) a hibridização das sequências de ácidos nucleicos-alvo com um par de iniciadores que compreende um iniciador a montante e um iniciador a jusante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que cada um do iniciador a montante e do iniciador a jusante compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento a 3' que compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo e (ii) uma porção de direcionamento a 5' que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; em que a porção de direcionamento a 3' é hi- bridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de direcionamento a 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico- alvo; o PTO é localizado entre o iniciador a montante e o iniciador a jusante; em que o PTO é bloqueado em sua extremidade a 3' para proibir sua extensão; (b) o contato do resultado da etapa (a) com um ácido nu- cleico polimerase dependente do molde que possui a atividade de nuclease a 5' sob condições para a extensão dos iniciadores e para a clivagem do PTO; em que quando o PTO é hibridizado com as sequências de ácidos nucleicos-alvo, o iniciador a montante é estendido e a fita estendida induz a clivagem do PTO pela ácido nucleico polime- rase dependente de molde que possui a atividade de nuclease a 5' de forma que a clivagem libere um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO; (c) a hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde); em que o CTO compreende em uma direção 3' até 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3'; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com as porções de captura do CTO; (d) a realização de uma reação de extensão utilizando o re- sultado da etapa (c) e a ácido nucleico polimerase dependente de molde; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e uma dupla-fita estendida é formada; em que a dupla-fita estendida possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; (e) a fusão da dupla-fita estendida ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença da dupla-fita estendida; em que o sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão, (iii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) marcação intercalante; e (f) a detecção da dupla-fita estendida através da medida do sinal-alvo; em que a presença da dupla-fita estendida indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.
[000265] Uma vez que a modalidade preferível da presente invenção segue as etapas do presente método descrito anteriormente, as descrições comuns entre estas são omitidas para evitar redundância desnecessária que leva à complexidade deste pedido de patente.
[000266] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a)-(b), (a)-(d) ou (a)-(f) com desnaturação entre ciclos de repetição. A repetição de reação é acompanhada pela amplificação da sequência de ácido nucleico-alvo. Preferencialmente, a amplificação é realizada de acordo com a PCR (reação em cadeia da polimerase) que é divulgada nas Pat. U.S. Nos. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159.
[000267] De acordo com uma modalidade preferida, o método é rea- lizado para detectar pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000268] De acordo com uma modalidade preferida, os pelos menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcações; em que os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nuclei- cos-alvo possuem valores de Tm diferentes de cada outro. III. Processo de Detecção de-alvo por PTOCE que Compreende a Detecção a uma Temperatura Predeterminada
[000269] A presente invenção pode ser modificada para utilizar um sinal-alvo gerado em associação à formação da dupla-fita estendida.
[000270] Ainda em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), que compreende: (a) a hibridização da sequência de ácido nucleico-alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o oligonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento a 3' que compreende uma sequência de nucleotí- deos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico- alvo e (ii) uma porção de direcionamento a 5' que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; em que a porção de direcionamento a 3' é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de direcionamento a 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o oligo- nucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO; (b) o contato do resultado da etapa (a) com uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' sob condições para a clivagem do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5' de forma que a clivagem libere um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO; (c) a hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde); em que o CTO compreende em uma direção 3' até 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) a realização de uma reação de extensão utilizando o resultado da etapa (c) e um ácido nucleico polimerase dependente do molde; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido para formar uma dupla-fita estendida; em que a dupla-fita estendida possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; em que a dupla-fita estendida fornece um sinal-alvo por (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão, (iii) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou CTO e uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão ou (iv) marcação intercalante; e (e) a detecção da dupla-fita estendida através da medida do sinal-alvo a uma temperatura predeterminada que a dupla-fita estendida mantém sua forma de fita dupla, em que a presença da dupla-fita estendida indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.
[000271] Uma vez que a modalidade preferível da presente invenção segue as etapas do presente método descrito anteriormente exceto pela etapa de fusão, as descrições comuns entre as mesmas são omitidos com a finalidade de evitar redundância desnecessária levando à complexidade deste relatório descritivo.
[000272] A presente invenção que utiliza a análise de fusão descrita anteriormente aqui requer a detecção de sinais das marcações a não menos que duas temperaturas diferentes porque o sinal-alvo é fornecido através da medida da alteração de sinal fornecido na fusão da dupla-fita estendida.
[000273] Improvavelmente, neste aspecto desta invenção, a dupla- fita estendida per se fornece sinal capaz de discriminar a formação partindo da não formação da dupla-fita estendida e o sinal é detectado a uma temperatura predeterminada que a dupla-fita estendida mantém sua forma de fita dupla, em que a presença de uma sequência de ácido nucleico-alvo é determinada.
[000274] A presente invenção é para medir um sinal-alvo em associação com a formação da dupla-fita estendida, para a detecção da presença da sequência de ácido nucleico-alvo.
[000275] Na presente invenção, a dupla-fita estendida possui uma marcação de forma que a dupla-fita estendida fornece um sinal-alvo.
[000276] Preferencialmente, o sinal-alvo inclui um sinal (geração de sinal ou extinção de sinal) partindo de uma marcação sobre a dupla- fita estendida a uma temperatura predeterminada.
[000277] A marcação na presente invenção pode ser executada da mesma maneira que para o método que utiliza a análise de fusão descrita anteriormente. As Figuras 2-13 podem ilustrar este aspecto da presente invenção com uma pequena modificação para a detecção a uma temperatura predeterminada.
[000278] O princípio de trabalho sustenta um sinal-alvo proveniente da dupla-fita estendida é como a seguir: (i) a extensão do fragmento induz a alteração de um sinal proveniente de uma marcação para fornecer o sinal-alvo; ou (ii) a hibridização do fragmento e o CTO induz a alteração de um sinal proveniente de uma marcação para fornecer o sinal-alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo.
[000279] A modalidade exemplificada do princípio de trabalho (i) pode ser descrita com referência à Fig 9. Quando os CTOs imobilizados são utilizados, a presente invenção detecta um grande número de sequências de ácidos nucleicos-alvo de uma maneira muito mais eficiente. A porção de molde do CTO imobilizado possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. A molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes a cada outra para permitir que a molécula de extinção elimine um sinal proveniente da molécula repórter. Quando o fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, a molécula de extinção extingue o sinal da molécula repórter. Através da formação da dupla-fita estendida, a molécula re-pórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter. O sinal-alvo é fornecido na etapa de extensão (C e D na Figura 9).
[000280] Na Figura 9, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados não forma uma dupla-fita estendida. Portanto, é permitido que a molécula de extinção ainda elimine um sinal proveniente da molécula repórter. O híbrido não fornece sinal que não é alvo.
[000281] A modalidade exemplificada para o princípio de trabalho (ii) pode ser descrita com referência à Figura 6. A figura ilustra o presente aspecto bem como o método que utiliza a análise de fusão. A porção de direcionamento a 5' do PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. A molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes a cada outra para permitir que a molécula de extinção elimine um sinal proveniente da molécula repórter. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' com a molécula repórter e a molécula de extinção e o fragmento é hibridizada com a porção de captura do CTO. Através da hi- bridização, a molécula repórter e a molécula de extinção são confor- macionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter. O sinal-alvo é fornecido na etapa de hibridização do fragmento e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo (C e D na Figura 6).
[000282] Na Figura 6, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo (C e D na Figura 6) e é necessário para dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada para dissociar o híbrido. De acordo com uma modalidade preferida, a temperatura é adicionalmente determinada em consideração ao valor de Tm do híbrido.
[000283] De acordo com uma modalidade preferida, a dupla-fita estendida pode ser detectada a temperaturas que o híbrido é parcialmente dissociado.
[000284] A temperatura predeterminada é maior que o valor de Tm do híbrido menos 10oC, preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido menos 5oC, mais preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido e ainda mais preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido mais 5oC.
[000285] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo fornecido pela dupla-fita estendida é fornecido durante a extensão da etapa (d); em que um híbrido entre um PTO e um CTO não clivados não fornece um sinal que não é alvo, como representado nas Figuras 2-4 e 9-11.
[000286] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo fornecido pela dupla-fita estendida é fornecido pela hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) e a formação da dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo na etapa (d); em que um híbrido entre um PTO e um CTO não clivados fornece um sinal que não é alvo; em que a temperatura predeterminada é maior que o valor de Tm do híbrido, como representado nas Figuras 5-8 e 12-13.
[000287] Quando o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo (Painel D na Fig 6), é necessário dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada para dissociar o híbrido.
[000288] Os sistemas de marcação úteis nesta invenção serão descritos como a seguir: (i) Marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO (i-1) Marcação dual interativa
[000289] Em uma modalidade de um sistema de marcação dual interativa, o CTO possui uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo. A primeira modalidade do sistema de marcação dual interativa é ilustrada na Figura 2. O sinal-alvo é fornecido com a geração de sinal sincronizada com a extensão.
[000290] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem ser localizadas na porção de molde do CTO.
[000291] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécu- la repórter e da molécula de extinção no CTO ficam localizadas em sua extremidade a 5' ou 1-5 nucleotídeos além de sua extremidade a 5' e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação de CTO.
[000292] Em uma modalidade de um sistema de marcação dual interativa, o CTO possui uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a hibridi- zação do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo.
[000293] De acordo com a modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas na porção de captura do CTO.
[000294] De acordo com a modalidade preferida, uma molécula repórter e uma molécula de extinção no CTO ficam localizadas em sua extremidade a 3' ou 1-5 nucleotídeos além de sua extremidade a 3' e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.
[000295] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.
[000296] Em uma modalidade de um sistema de marcação dual interativa, o fragmento possui uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal- alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo. A primeira modalidade do sistema de marcação dual interativa é ilustrada na Figura 6.
[000297] De acordo com a modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no fragmento fica localizada em sua extremidade a 5' ou a 1-5 nucleotídeos além da extremidade a 5' do fragmento e a outra fica localizada para extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação do fragmento.
[000298] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.
[000299] Em uma modalidade do sistema de marcação interativa, em que o fragmento possui uma de uma marcação dual interativa que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção e o CTO possui a outra da marcação dual interativa; em que a hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcação dual interativa é ilustrada nas Figuras 8.
[000300] A molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas em qualquer sítio do fragmento de PTO e o CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto pela molécula de extinção.
[000301] De acordo com a modalidade, a molécula repórter ou a molécula de extinção no fragmento de PTO fica localizada, preferencialmente, em sua extremidade a 5'.
[000302] De acordo com a modalidade, a molécula repórter ou a molécula de extinção no CTO fica localizada, preferencialmente, em sua extremidade a 5'.
[000303] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido. (i-2) Marcação isolada
[000304] Em uma modalidade de um sistema de marcação isolada, o CTO possui uma marcação isolada e a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação isolada para fornecer o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcação isolada é ilustrada na Figura 3. O sinal-alvo é fornecido com geração de sinal sincronizada com a extensão.
[000305] De acordo com a modalidade, a porção de molde do CTO é marcada com a marcação isolada.
[000306] Em uma modalidade de um sistema de marcação isolada, o CTO possui uma marcação isolada e a hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo.
[000307] De acordo com a modalidade, a porção de captura do CTO é marcada com a marcação isolada.
[000308] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.
[000309] Em uma modalidade de um sistema de marcação isolada, o fragmento possui uma marcação isolada e a hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo e a dupla-fita estendida mantém o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcação isolada é ilustrada na Figura 12.
[000310] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.
[000311] A marcação isolada utilizada aqui tem que ser capaz de fornecer um sinal diferente dependendo de sua presença no fita dupla ou na fita isolada. A marcação isolada inclui uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente, uma marcação eletroquímica e uma marcação metálica. Preferencialmente, a marcação isolada inclui uma marcação fluorescente. Os tipos e os sítios de ligação preferíveis de marcações isoladas fluorescentes utilizados nesta invenção são divulgados nas Pat. U.S. Nos. 7.537.886 e 7.348.141, cujos ensinamentos são incorporados aqui como referência em sua totalidade. Preferencialmente, a marcação fluorescente isolada inclui JOE, FAM, TAMRA, ROX e marcação à base de fluoresceí- na. Um resíduo de nucleotídeo marcado fica preferencialmente posicionado no resíduo de nucleotídeo interno dentro do oligonucleotídeo ao invés de na extremidade a 5' ou na extremidade a 3'.
[000312] A marcação fluorescente isolada útil na presente invenção pode ser descrita com referência às descrições para as moléculas repórteres e de extinção como indicado anteriormente.
[000313] Em particular, quando a presente invenção sobre a fase sólida é realizada utilizando uma marcação isolada, esta pode utilizar uma marcação fluorescente geral e não requer a marcação fluorescente específica capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença no fita dupla ou na fita isolada.
[000314] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcações químicas (por exemplo, biotina) ou marcações en- zimáticas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-gluocosidase) podem ser utilizadas.
[000315] Em uma modalidade preferida, as marcações ligadas ao fragmento e/ou ao CTO ficam posicionadas até a extensão de que quando um híbrido entre um PTO e um CTO não clivados é formado, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa (d), como repre- sentado nas Figuras 2-3 e 9.
[000316] Alternativamente, as marcações podem ser posicionadas até a extensão de que quando um híbrido entre um PTO e um CTO não clivados é formado, o híbrido fornece um sinal que não é alvo na etapa (d); em que o valor de Tm da dupla-fita estendida é maior que aquele do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados como representado nas Figuras 6-8 e 12. (ii) Marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida
[000317] Em particular, quando a presente invenção é realizada em uma fase sólida utilizando um CTO imobilizado, este sistema de marcação se torna mais útil para fornecer o sinal-alvo como ilustrado nas Figuras 10 e 11.
[000318] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação isolada incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão; em que a marcação isolada incorporada é ligada a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação isolada para fornecer o sinal-alvo na etapa (d).
[000319] De acordo com uma modalidade preferida, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira base não natural, como ilustrado na Figura 11. O nucleotídeo que possui a segunda base não natural fica preferencialmente localizado em qualquer sítio na porção de molde do CTO.
[000320] Quando uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão é empregada, uma marcação não é incorporada dentro do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo. (iii) Marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida e marcação ligada ao fragmento ou ao CTO
[000321] A presente invenção pode empregar um sistema de marcação utilizando a cooperação da marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, como ilustrado nas Figuras 4 e 5.
[000322] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO; em que uma marcação incorporada é ligada a um nucle- otídeo incorporado durante a reação de extensão; em que as duas marcações são uma marcação dual interativa de uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo.
[000323] Mais preferencialmente, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica à primeira não natural.
[000324] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) é um sinal proveniente da marcação dual interativa na etapa (d).
[000325] Quando uma marcação incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão é empregada, uma marcação não é incorporada dentro do híbrido entre o PTO e o CTO não clivados porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo. (iv) Marcação intercalante
[000326] A presente invenção pode empregar uma marcação interca- lante para o fornecimento do sinal-alvo indicativo da presença da du- pla-fita estendida. A marcação intercalante é mais útil em uma reação em fase sólida utilizando CTOs imobilizados porque as moléculas de ácidos nucleicos de fita dupla presentes nas amostras podem gerar sinais.
[000327] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Figura 13. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com o CTO. A extensão é realizada na presença de um corante intercalante (por exemplo, SYBRTM Green) e forma a dupla-fita estendida com corantes intercalantes.
[000328] Na Figura 13, o híbrido entre o PTO e o CTO não clivados fornece sinal que não é alvo (C e D na Figura 13) e é necessário dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.
[000329] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) é um sinal proveniente do corante intercalante.
[000330] De acordo com uma modalidade preferida, o PTO e/ou o CTO é bloqueado em sua extremidade a 3' para proibir sua extensão.
[000331] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante.
[000332] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante fica localizado de forma adjacente ao PTO até a extensão de que o oligonucleotídeo a montante induz a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[000333] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante induz através de sua fita estendida a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[000334] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a)-(b), (a)-(d) ou (a)-(e) com desnaturação entre ciclos de repetição.
[000335] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a)-(b) e (c)-(e) são realizadas em um recipiente de reação ou em recipientes de reação separados.
[000336] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos-alvo; em que o oligonucleotídeo a montante compreende pelo menos dois tipos de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos do PTOs e o CTO compreende pelo menos um tipo dos CTOs; em que quando pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo estão presentes, o método fornece pelo menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleicos-alvo.
[000337] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante e a etapa (b) utiliza um ácido nucleico polimerase dependente do molde para a extensão do iniciador a montante.
[000338] De acordo com uma modalidade preferida, o CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5' ou extremidade a 3' sobre um substrato sólido e o sinal-alvo fornecidos sobre o substrato sólido é medido.
[000339] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por uma marcação isolada ligada ao fragmento ou por uma marcação isolada incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão.
[000340] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante.
[000341] A detecção da etapa (e) pode ser realizada de uma maneira em tempo real, de uma maneira em ponto final ou de uma maneira com intervalos de tempo pré-determinados. Quando a presente inven- ção compreende ainda a repetição das etapas (a)-(b), (a)-(d) ou (a)- (e), é preferido que a detecção de sinal seja realizada para cada ciclo da repetição a uma temperatura predeterminada (isto é, maneira em tempo real), no final da repetição a uma temperatura predeterminada (isto é, maneira em ponto final) ou em cada um dos intervalos de tempo pré-determinados durante a repetição a uma temperatura predeterminada. Preferencialmente, a detecção pode ser realizada para cada ciclo da repetição de uma maneira em tempo real para aprimorar a acurácia e a quantificação da detecção. IV. Kits para a Detecção do-alvo
[000342] Em um aspecto adicional desta invenção, é fornecido um kit para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), que compreende: (a) um oligonucleotídeo a montante que compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; (b) um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) que compreende (i) uma porção de direcionamento a 3' que compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo e (ii) uma porção de direcionamento a 5' que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo, em que a porção de direcionamento a 3' é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de direcionamento a 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz a clivagem do PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' de forma que a clivagem libere um fragmento que compreende a porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO; e (c) um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde) que compreende em uma direção 3' até 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de direcionamento a 5' ou uma parte da porção de direcionamento a 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de direcionamento a 5' e a porção de direcionamento a 3' do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com a porção de captura do CTO; e o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido por um ácido nucleico polimerase dependente do molde para formar uma dupla-fita estendida.
[000343] Uma vez que o kit desta invenção é construído para realizar a detecção do método da presente invenção descrito anteriormente, as descrições comuns entre este são omitidas com a finalidade de evitar redundância desnecessária que leva à complexidade deste relatório descritivo.
[000344] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5'.
[000345] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda um ácido nucleico polimerase dependente do molde.
[000346] De acordo com uma modalidade preferida, o PTO e/ou o CTO possui pelo menos uma marcação.
[000347] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda uma marcação que será incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão.
[000348] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda uma marcação que será incorporada dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão e o PTO e/ou o CTO possui pelo menos uma marcação.
[000349] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda uma marcação intercalante.
[000350] De acordo com uma modalidade preferida, uma marcação é uma marcação isolada ou marcação dual interativa.
[000351] De acordo com uma modalidade preferida, o kit é utilizado para a detecção de pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos, o oligonucleotídeo a montante compreende pelo menos dois tipos de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos do PTO e o CTO compreende pelo menos dois tipos do CTO.
[000352] De acordo com uma modalidade preferida, o CTO é imobilizado através de sua extremidade a 5' ou extremidade a 3' sobre um substrato sólido.
[000353] De acordo com uma modalidade preferida, o kit compreende ainda um iniciador a jusante.
[000354] Todos os presentes kits descritos anteriormente aqui podem opcionalmente incluir os reagentes necessários para a realização das reações de amplificação por PCR do-alvo (por exemplo, reações de PCR) tais como tampões, cofatores de DNA polimerase e desoxirri- bonucleotídeo-5-trifosfatos. Opcionalmente, os kits podem incluir ainda várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes e anticorpos que inibem a atividade da DNA polime- rase. Os kits também podem incluir reagentes necessários para a realização de reações de controle positivo e negativo. As quantidades ótimas de reagentes que serão utilizadas em uma certa reação podem ser facilmente determinadas pelo perito na arte que possuem o benefício da presente divulgação. Os kits, tipicamente, são adotados para conter os constituintes descritos anteriormente em embalagens ou compartimentos separados.
[000355] As características e as vantagens desta invenção serão resumidas como a seguir: (a) A presente invenção fornece uma dupla-fita estendida dependente do-alvo em que o PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) que se hibridizada com uma sequência de ácido nucleico- alvo é clivado para liberar um fragmento e o fragmento é hibridizado com CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde) para formar uma dupla-fita estendida. A dupla-fita estendida fornece um sinal (geração ou extinção de sinal) ou uma alteração de sinal (aumento ou diminuição de sinal) indicando a presença de uma sequência de ácido nucleico- alvo. (b) A presença da dupla-fita estendida é determinada através de uma variedade de métodos ou processos tais como a análise da curva de fusão e a detecção a uma temperatura predeterminada (por exemplo, a maneira em tempo real e a maneira em ponto final). (c) A presente invenção permite detectar simultaneamente pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos-alvo através da análise da curva de fusão mesmo utilizando um único tipo da marcação (por exemplo, FAM). Em contraste, o método em tempo real com multiplex convencional realizado em uma fase líquida está sofrendo gravemente da limitação associada com o número de marcações fluorescentes detectáveis. A presente invenção permite superar de forma bem sucedida tais inconvenientes e ampliar a aplicação da detecção em tempo real com multiplex. (d) A presente invenção pode ser realizada utilizando um grande número de sistemas de marcação. Por exemplo, as marcações ligadas a qualquer sítio do PTO e/ou do CTO podem ser utilizadas para o fornecimento do sinal-alvo indicando a dupla-fita estendida. Ainda, as marcações incorporadas dentro da dupla-fita estendida durante a reação de extensão podem ser utilizadas na presente invenção. Em adição a isto, a combinação de tais marcações pode ser utilizada. Os sistemas de marcação versáteis aplicáveis à presente invenção permi te escolher um sistema de marcação apropriado dependendo de condições ou objetivos experimentais. (e) A presente invenção fornece uma dupla-fita estendida dependente do-alvo que possui um valor de Tm pré-determinado que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO. (f) A análise da curva de fusão convencional utilizando um produto amplificado depende da sequência do produto amplificado de forma que é difícil obter um valor de Tm desejado do produto amplificado. Em contraste, a presente invenção depende da sequência de uma dupla-fita estendida não da sequência de um produto amplificado, permitindo selecionar um valor de Tm desejado da dupla-fita estendida. Portanto, a presente invenção pode ser facilmente adotada para a detecção de várias sequências-alvo. (g) A análise da curva de fusão convencional utilizando uma hibridização direta entre sondas marcadas e sequências de ácidos nu- cleicos-alvo muito provavelmente gera sinais falsos positivos devido à hibridização não específica de sondas. Em contraste, a presente invenção emprega não somente a hibridização de PTO, mas também clivagem enzimática e extensão, que supera completamente os problemas de sinais de falsos positivos. (h) o valor de Tm de análise da curva de fusão convencional é afetado por uma variação de sequência sobre as sequências de ácidos nucleicos-alvo. Entretanto, uma dupla-fita estendida na presente invenção fornece um valor de Tm constante independente de uma variação de sequência sobre as sequências de ácidos nucleicos-alvo, permitindo garantir excelente acurácia na análise da curva de fusão. (i) É digno de nota que a sequência da porção de direciona- mento a 5' de PTO e a sequência de CTO podem ser selecionadas sem consideração das sequências de ácidos nucleicos-alvo. Isto torna possível pré-planejar um conjunto de sequências para a porção de direcionamento a 5' de PTO e CTO. Embora a porção de direcionamento a 3' do PTO tenha que ser preparada em consideração às sequências de ácidos nucleicos-alvo, o CTO pode ser preparado de uma maneira pronta para uso sem consideração ou conhecimento das sequências de ácidos nucleicos-alvo. Tais características fornecem vantagens proeminentes na detecção múltipla do-alvo, inter alia, sobre um ensaio em micro- arranjo utilizando CTOs imobilizados sobre um substrato sólido.
[000356] A presente invenção será agora descrita em detalhes adicionais pelos exemplos. Seria óbvio para os peritos na arte que estes exemplos são pretendidos para serem mais concretamente ilustrativos e o âmbito da presente invenção que é apresentado nas reivindicações em anexo não é limitado a ou pelos exemplos. EXEMPLOS EXEMPLO 1: Avaliação do Ensaio de Clivagem & Extensão do Oli- gonucleotídeo de Sondagem e Marcação (PTOCE)
[000357] Um novo ensaio, ensaio de Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação Clivagem & Extensão (PTOCE), foi avaliado se uma dupla-fita estendida pode fornecer um sinal-alvo para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo.
[000358] Para esta avaliação, o ensaio de PTOCE que detecta a presença de uma dupla-fita estendida através da análise de fusão foi realizado (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão). Os presentes inventores utilizaram Taq DNA polimerase que possui a atividade de nuclease a 5' para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO.
[000359] A dupla-fita estendida formada durante o ensaio foi planejado para ter uma marcação dual interativa. A marcação dual interativa na dupla-fita estendida foi fornecida por (i) CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção (CTO com marcação dual) ou (ii) PTO que possui uma molécula de extinção e CTO que possui uma molécula repórter (um PTO com marcação de extinção e um CTO com marcação repórter). PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'. O oligonucleotí- deo sintético para o gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como um molde-alvo. 1-1. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcação dual
[000360] O PTO não possui marcação. O CTO possui uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua porção de molde. As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTO e CTO utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-1 5'- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 3) NG-CTO-1 5'-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 4) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000361] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 4) e 10 μL de 2X Mas- ter Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, BioRad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000362] Como mostrado na Figura 14, um pico a 76,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado da dupla-fita estendida foi detectado na presença do molde. Nenhum pico foi detectado na ausência do molde. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO e CTO não clivado. No caso de nenhum PTO ou nenhum CTO, não foi observado qualquer pico. 1-2. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO com marcação de extinção e um CTO com marcação repórter
[000363] O PTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) em sua extremidade a 5'. O CTO é marcado com uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua extremidade a 3'.
[000364] As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTO e CTO utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-2 5'- [BHQ- 1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaç ador C3]-3' (SEQ ID NO: 5) NG-CTO-2 5'- CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCG- TCGT[FAM]-3' (SEQ ID NO: 6) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000365] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 5), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 6) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, BioRad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000366] Como mostrado na Figura 15, um pico a 77,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado da dupla-fita estendida foi detectado na presença do molde. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado fornece um sinal que não é alvo neste método de marcação, havia um pico a 64,0°C~64,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado do híbrido de PTO e CTO não clivado. No caso de nenhum PTO ou nenhum CTO, não foi observado qualquer pico.
[000367] Estes resultados indicam que uma dupla-fita estendida dependente do-alvo é produzido e a dupla-fita estendida fornece o sinal- alvo indicando a presença da sequência de ácido nucleico-alvo. EXEMPLO 2: Capacidade de ajuste do valor de Tm de uma dupla- fita estendida
[000368] Foi adicionalmente verificado se o valor de Tm de uma dupla-fita estendida pode ser ajustado pela sequência de CTO no ensaio de PTOCE.
[000369] Para a verificação, os presentes inventores utilizaram três tipos de CTOs que possuem sequências diferentes em sua porção de moldes. O PTO não possui marcação. Os três tipos de CTOs possuem uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em suas porções de molde. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'.
[000370] O ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão foi realizado com cada um dos três tipos de CTOs.
[000371] As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTOs e CTOs utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5'- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5'-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3 (SEQ ID NO: 4) NG-CTO-3 5'-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTCCTCCTCCAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[espa çador C3] -3' (SEQ ID NO: 8) NG-CTO-4 5'-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[espaç ador C3] -3' (SEQ ID NO: 9) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000372] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NOs: 4, 8 ou 9) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000373] Como mostrado na Figura 16, um pico foi detectado a 76,0°C, 69,0°C ou 64,5°C na presença do molde. Cada pico corresponde ao Tm esperado da dupla-fita estendida gerada partindo do CTO verificado. Nenhum pico foi detectado na ausência do molde.
[000374] Estes resultados indicam que o valor de Tm da dupla-fita estendida pode ser ajustado pela sequência de CTO. EXEMPLO 3: Detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo utilizando o ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real ou a análise de fusão
[000375] Foi adicionalmente verificado se o ensaio de PTOCE pode detectar uma sequência de ácido nucleico-alvo da maneira de PCR em tempo real (i) ou da maneira da análise de fusão pós-PCR (ii): (i) A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram acompanhadas com a amplificação de um ácido nucleico-alvo através do processo de PCR e a presença da dupla-fita estendida foi detectada a uma temperatura predeterminada em cada ciclo (ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada) ou; (ii) A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram acompanhadas com a amplificação de um ácido nucleico-alvo através do processo de PCR e a presença da dupla-fita estendida foi detectada através da análise de fusão pós-PCR (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão).
[000376] O iniciador a montante está envolvido na clivagem de PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease a 5' e também envolvida na amplificação da sequência de ácido-alvo com iniciador a jusante através do processo de PCR. A Taq DNA polimerase que possui a atividade de nuclease a 5' foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e do iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.
[000377] A dupla-fita estendida foi planejada para ter uma marcação dual interativa. A marcação dual interativa na dupla-fita estendida foi fornecida por (i) CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção, (ii) um extintor-iso-dGTP incorporado durante a reação de extensão e CTO que possui uma molécula repórter e um resíduo de iso-dC ou (iii) PTO que possui uma molécula de extinção e CTO que possui uma molécula repórter. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'.
[000378] O DNA genômico de Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como um ácido nucleico-alvo. 3-1. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcação dual
[000379] O PTO não possui marcação e o CTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua porção de molde.
[000380] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizadas neste Exemplo são: NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3' (SEQ ID NO: 10) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5'- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5'-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 4) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO) 3-1-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada
[000381] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 4) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. A detecção de the sinal foi realizada a 60°C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla.
[000382] Como mostrado na Figura 17A, o sinal-alvo (Ct 31.36) foi detectado na presença do molde. Nenhum sinal foi detectado na ausência do molde. 3-1-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão
[000383] Após a reação no Exemplo 3-1-1, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000384] Como mostrado na Figura 17B, um pico a 76,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado da dupla-fita estendida foi detectado na presença do molde. Nenhum pico foi detectado na ausência do molde. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO e CTO não clivado. 3-2. Ensaio de PTOCE utilizando um extintor-iso-dGTPe um CTO com marcação repórter que possui um resíduo de iso-dC
[000385] O PTO não possui marcação. O CTO possui uma molécula repórter (FAM) e um resíduo de iso-dC em sua extremidade a 5'. Durante a reação de extensão de fragmento de PTO, um iso-dGTP marcado com uma molécula de extinção (dabcyl) é incorporado na posição complementar ao resíduo de iso-dC.
[000386] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizadas neste Exemplo são: NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3' (SEQ ID NO: 10) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-1 5'- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 3) NG-CTO-5 5'-[FAM][Iso- dC]CTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 11) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO) 3-2-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada
[000387] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 11) e 10 μL de 2X Plexor® Master Mix (Cat. No. A4100, Promega, USA); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95 °C 60 s a 60 °C, 30 s a 72 °C e 5 ciclos de 30 s a 72 °C, 30 s a 55 °C. A detecção do sinal foi realizada a 60 °C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla.
[000388] A DNA polimerase que possui nuclease a 5' no Plexor® Master Mix foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e do iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.
[000389] Como mostrado na Figura 18A, o sinal-alvo (Ct 33.03) foi detectado na presença do molde. Nenhum sinal foi detectado na ausência do molde. 3-2-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão
[000390] Após a reação no Exemplo 3-2-1, a curva de fusão foi obti- da através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000391] Como mostrado na Figura 18B, um pico a 70,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado da dupla-fita estendida foi detectado na presença do molde. Nenhum pico foi detectado na ausência do molde. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO e CTO não clivado. 3-3. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO com marcação de extinção e um CTO com marcação repórter
[000392] O PTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) em sua extremidade a 5'. O CTO é marcado com uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua extremidade a 3'.
[000393] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizadas neste Exemplo são: NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3' (SEQ ID NO: 10) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-4 5'-[BHQ- 1]ACGACGGCTTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 12) NG-CTO-2 5'- CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAA- GCCGTCGT[FAM]-3' (SEQ ID NO: 6) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO) 3-3-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada
[000394] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de NG DNA genômico, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmo- les de PTO (SEQ ID NO: 12), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 6) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. A detecção do sinal foi realizada a 60°C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO e CTO não clivado.
[000395] Como mostrado na Figura 19A, o sinal-alvo (Ct 29.79) foi detectado na presença do molde. Nenhum sinal foi detectado na ausência do molde. 3-3-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão
[000396] Após a reação no Exemplo 3-3-1, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000397] Como mostrado na Figura 19B, um pico a 76,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado da dupla-fita estendida foi detectado na presença do molde. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado fornece um sinal que não é alvo neste método de marcação, o pico que corresponde ao valor de Tm do híbrido de PTO e CTO não clivado foi detectado a 48,0°C na ausência do molde.
[000398] Estes resultados indicam que uma sequência de ácido nu- cleico-alvo pode ser detectada através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real ou a análise de fusão. EXEMPLO 4: Detecção de várias sequências de ácidos nucleicos- alvo através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão
[000399] Também foi verificado se o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pode detectar várias sequências de ácidos nucleicos-alvo utilizando o mesmo tipo de uma molécula repórter.
[000400] A clivagem de PTOs e a extensão de fragmentos de PTO foram acompanhadas com a amplificação de sequências de ácidos nucleicos-alvo através do processo de PCR e a presença de os dúplices estendidos foi detectada através da análise de fusão pós-PCR (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão).
[000401] Os dúplices estendidos formados durante o ensaio foram planejados para ter uma marcação dual interativa. A marcação dual interativa na dupla-fita estendida foi fornecida por CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de molde. Os CTOs possuem o mesmo tipo de uma molécula repórter fluorescente (FAM), mas possuem sequências diferentes para gerar os valores de Tm diferentes dos dúplices estendidos. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'.
[000402] Os DNA genômicos de Neisseria gonorrhoeae (NG) e Sta-phylococcus aureus (SA) foram utilizados como ácidos nucleicos- alvos.
[000403] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTOs e CTOs utilizadas neste Exemplo são: NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3' (SEQ ID NO: 10) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5'- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5'-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 4) SA-F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3' (SEQ ID NO: 13) SA-R 5'-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG-3' (SEQ ID NO: 14) SA-PTO-1 5'- AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT- TACG[espaçador C3] -3' (SEQ ID NO: 15) SA-CTO-1 5'-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T(FAM)]AGCGTGGTCGGATT[espaçad or C3] -3' (SEQ ID NO: 16) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000404] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 100 pg de DNA genômico de SA, 10 pmoles de cada iniciador a jusante (SEQ ID NOs: 10 e 13), 10 pmoles de cada iniciador a montante (SEQ ID NOs: 2 e 14), 5 pmoles de cada PTO (SEQ ID NOs: 7 e 15), 2 pmoles de cada CTO (SEQ ID NOs: 4 e 16) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C duran-te 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.
[000405] Como mostrado na Figura 20, vários sinais-alvo (Tm de NG: 75,5°C e Tm de SA: 63,5°C) foram detectados na presença dos moldes. Nenhum sinal foi detectado na ausência dos moldes.
[000406] Estes resultados indicam que o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão permite detectar vários ácidos nuclei- cos-alvos através da utilização do mesmo tipo de uma molécula repórter (por exemplo, FAM) na condição que os dúplices estendidos que correspondem aos ácidos nucleicos-alvos possuem valores de Tm diferentes. EXEMPLO 5: Avaliação do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão sobre microarranjo
[000407] Foi adicionalmente verificado o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão sobre microarranjo. A clivagem de PTO foi realizada em um recipiente separado e uma alíquota do resultado foi colocada dentro de um microarranjo em que o CTO foi imobilizado. Após a reação de extensão, a presença da dupla-fita estendida foi detectada através da análise de fusão.
[000408] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease a 5' foi utilizada para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO. A dupla-fita estendida formada durante o ensaio foi planejado para possuir uma marcação isolada. A marcação isolada na dupla-fita estendida foi fornecida por PTO marcado com Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente em sua extremidade a 5'. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'. O CTO possui poli(T)5 como um braço ligante e foi imobilizado sobre a superfície de uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade a 5'. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repór-ter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade a 5' foi imobilizada sobre a superfície da lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade a 3'.
[000409] As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5'- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 17) NG-CTO-S1 5'- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 18) Marcador 5'-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000410] Lâminas de NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coréia) foram utilizadas para a fabricação do CTO e o marcador (SEQ ID NOs: 18 e 19). O CTO e o marcador dissolvidos em tampão de formação de pontos de NSB na concentração final de 10 μM foram impressos sobre as lâminas de NSB9 NHS com PersonalArrayer™16 Microarray Spotter (CapitalBio, China). O CTO e o marcador foram aplicados em pontos lado a lado em um formato 2x1 (pontos em duplicata) e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida a ~85% de umidade durante a noite. As lâminas foram então lavadas em uma solução tam- pão contendo 2xSSPE (0,3 M de cloreto de sódio, 0,02 M de bifosfato de sódio e 2,0 mM de EDTA), pH 7,4 e 7,0 mM de SDS a 37°C durante 30 min para remover o CTO e o marcador não ligados especificamente e lavadas com água destilada. Então, as lâminas funcionalizadas com DNA foram secas utilizando uma centrífuga de lâmina e armazenadas na escuridão a 4°C até o uso.
[000411] A reação de clivagem foi realizada no volume final de 50 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 17) e 25 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 63°C.
[000412] Os 30 μL da mistura resultante foram aplicados a uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro de NSB sobre a qual o CTO (SEQ ID NO: 18) foi ligado de forma cruzada. A lâmina foi colocada sobre o bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). Seis lâminas iguais foram preparadas para a análise de fusão. A reação de extensão foi permitida por 20 min a 55°C. Então, as lâminas resultantes foram incubadas durante 1 min à temperatura ambiente. Finalmente cada lâmina foi lavada em água destilada durante 1 min a 44°C, 52°C, 60°C, 68°C, 76°C ou 84°C. A aquisição de imagem foi realizada através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microarranjos, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de fundo locais. Cada ponto foi dupli- cado para o teste de reprodutividade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[000413] Como mostrado na Figura 21A e 21B, a curva de fusão foi obtida através da medida da intensidade fluorescente partindo dos pontos preparados através de temperaturas de lavagem diferentes. A presença da dupla-fita estendida foi determinada partindo dos dados da curva de fusão. EXEMPLO 6: Avaliação do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real sobre microarranjo
[000414] Foi adicionalmente verificado o ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada sobre microarranjo.
[000415] A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram repetidas sobre um microarranjo em que o CTO foi imobilizado. A presença da dupla-fita estendida foi detectada a uma temperatura predeterminada em vários ciclos determinados.
[000416] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease a 5' foi utilizada para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.
[000417] A dupla-fita estendida formada durante o ensaio foi planejado para possuir uma marcação isolada ou uma marcação dual interativa. A marcação isolada na dupla-fita estendida foi fornecida por PTO marcado com uma molécula repórter (PTO marcado com repórter). A marcação dual interativa na dupla-fita estendida foi fornecida por CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção (CTO com marcação dual). PTO e CTO são bloqueados com um es- paçador de carbono em suas extremidades a 3'.
[000418] O CTO possui poli(T) como um braço ligante. O CTO foi imobilizado sobre uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade a 5' ou sua extremidade a 3'. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade a 5' foi imobilizada sobre a lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade a 3'. Uma intensidade fluorescente sobre a lâmina de vidro foi medida a uma temperatura predeterminada. A temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla. O oligonucleotídeo sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como molde. 6-1. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO marcado com repórter
[000419] O PTO possui Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente em sua extremidade a 5'. O CTO foi imobilizado através de sua extremidade a 5'. Neste método de marcação, a temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO e CTO não clivado.
[000420] As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5'- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 17) NG-CTO-S1 5'- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 18) Marcador 5'-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000421] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.
[000422] A reação de PTOCE foi realizada no volume final de 30 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 17) e 15 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 2,4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); a mistura toda foi aplicada em uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro de NSB sobre a qual o CTO (SEQ ID NO: 18) foi ligado de forma cruzada. A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). cinco lâminas do mesmo tipo foram preparadas para a análise de ciclos. A reação de PTOCE foi realizada como a seguir: 15 min desnaturação a 95°C e 0, 5, 10, 20 ou 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 60 s a 55°C. Após a reação do número de ciclos correspondentes, as lâminas foram lavadas em água destilada a 64°C durante 1 min. A aquisição de imagem foi realizada após cada lavagem através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura em resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de mi- croarranjos, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de fundo locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutividade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[000423] Como mostrado nas Figuras 22A e 22B, a intensidade fluo- rescente para a sequência de ácido nucleico-alvo foi aumentada dependendo dos números de ciclos (0 ciclo_UFR: 1.304±0,7; 5 ci- clos_UFR: 18.939±1.342,1; 10 ciclos_UFR: 30.619±285,0; 20 ci- clos_UFR: 56.248±2.208,3; e 30 ciclos_UFR: 64.645±1.110,2) na presença do molde. Não havia alteração da intensidade fluorescente dependendo dos números de ciclos na ausência do molde. 6-2. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcação dual
[000424] O CTO foi imobilizado através de sua extremidade a 3' e possui uma molécula de extinção (BHQ-2) e uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua porção de molde.
[000425] As sequências de molde sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizadas neste Exemplo são: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO: 1) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-6 5'- ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTG- TTTCG[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 20) NG-CTO-S2 5'- [BHQ- 2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(Quasar570)]CCAGTAAAGCCAAG CCGTCGTTTTTTT TTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 21) Marcador 5'-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000426] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.
[000427] A reação de PTOCE foi realizada no volume final de 30 μL contendo 2 pmoles de molde sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 20) e 15 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 2,4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); a mistura toda foi aplicada em uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro de NSB sobre a qual o CTO foi ligado de forma cruzada (SEQ ID NO: 21). A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). Cinco lâminas do mesmo tipo foram preparadas para a análise de ciclos. A reação de PTOCE foi realizada como a seguir: 15 min desnaturação a 95°C e 0, 5, 10, 20 ou 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 60 s a 50°C. Após a reação do número de ciclos correspondentes, a aquisição de imagem foi realizada através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microarran- jos, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de fundo locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de re- produtividade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[000428] Como mostrado nas Figuras 23A e 23B, a intensidade fluorescente para a sequência de ácido nucleico-alvo foi aumentada dependendo dos números de ciclos (0 ciclo_UFR: 28.078±460,3; 5 ci- clos_UFR: 35.967±555,1; 10 ciclos_UFR: 44.674±186,0; 20 ci- clos_UFR: 65.423±2,1; e 30 ciclos_UFR: 65.426±2,8) na presença de molde. Não havia alteração da intensidade fluorescente dependendo dos números de ciclos na ausência do molde. EXEMPLO 7: Detecção de várias sequências de ácidos nucleicos- alvo através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em ponto final a uma temperatura predeterminada sobre microarranjo
[000429] Foi adicionalmente verificada a detecção de vários-alvos através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em ponto final a uma temperatura predeterminada sobre microarranjo.
[000430] A clivagem de PTO foi realizada em um recipiente separado com processo de PCR e uma alíquota do resultado foi colocada dentro de um microarranjo em que o CTO foi imobilizado. Após a reação de extensão, a presença da dupla-fita estendida foi detectada através da detecção em ponto final a uma temperatura predeterminada.
[000431] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease a 5' foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO.
[000432] A dupla-fita estendida formada durante o ensaio foi planejado para possuir uma marcação isolada. A marcação isolada na dupla- fita estendida foi fornecida por PTO marcado com Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente na extremidade a 5' do PTO. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades a 3'.
[000433] O CTO possui poli(T)5 como um braço ligante e foi imobilizado sobre uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade a 5'. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade a 5' foi imobilizada sobre a lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade a 3'.
[000434] Uma intensidade fluorescente sobre a lâmina de vidro foi medida a uma temperatura predeterminada. A temperatura de detecção foi determinada até a extensão de que a dupla-fita estendida mantém a forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO e CTO não clivado. Os DNA genômicos de Staphylococcus aureus (SA) e Neisseria gonorrhoeae (NG) foram utilizados.
[000435] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO, CTO e marcador utilizadas neste Exemplo são: NG-F 5'- TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3' (SEQ ID NO: 10) NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5'- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 17) NG-CTO-S1 5'- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 18) SA-F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3' (SEQ ID NO: 13) SA-R2 5'-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3' (SEQ ID NO: 22) SA-PTO-2 5'-[Quasar570] AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCG- TGGTCAATCATTCGGTTTACG[espaçador C3]- 3' (SEQ ID NO: 23) SA_CTO-S1 5'- [Ami- noC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCAGCATAGCG TGGTCGGATT [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 24) Marcador 5'-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000436] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.
[000437] A reação de clivagem foi realizada no volume final de 50 μL contendo cada 100 pg DNA genômico de SA e/ou NG, cada 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NOs: 10 e/ou 13), cada 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NOs: 2 e/ou 22), cada 1 pmol de PTO (SEQ ID NOs: 17 e/ou 23) e 25 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 63°C. Os 30 μL da mistura resultante foram aplicados em uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro de NSB sobre a qual os CTOs (SEQ ID NOs: 18 e 24) foram ligados de forma cruzada. A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). A reação de extensão foi permitida por 20 min a 55°C. Então as lâminas foram lavadas em água destilada a 64°C durante 1 min. A aquisição de imagem foi realizada após cada lavagem através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 10 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microarranjos, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de fundo locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutividade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[000438] Como mostrado na Figura 24, o sinal-alvo para SA (UFR: 65.192±198,7) foi detectado na presença de molde de SA. O sinal-alvo para NG (UFR: 65.332±1,4) foi detectado na presença de molde de NG. Ambos os sinais-alvo para SA (UFR: 65.302±0,7) e NG (UFR 65.302±0,7) foram detectados na presença de ambos os moldes.
[000439] Tendo descrito uma modalidade preferida da presente invenção, deve ser entendido que variantes e modificações da mesma que se encaixam dentro do espírito da invenção podem ser tornar evidentes para os peritos nesta arte e o âmbito desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes. GTCGT[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 18) SA-F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3' (SEQ ID NO: 13) SA-R2 5'-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3' (SEQ ID NO: 22) SA-PTO-2 5'-[Quasar570] AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCG- TGGTCAATCATTCGGTTTACG[espaçador C3]- 3' (SEQ ID NO: 23) SA_CTO-S1 5'- [Ami- noC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCAGCATAGCG TGGTCGGATT [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO: 24) Marcador 5'-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de direcionamento a 5' de PTO)
[000440] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.
[000441] A reação de clivagem foi realizada no volume final de 50 μL contendo cada 100 pg DNA genômico de SA e/ou NG, cada 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NOs: 10 e/ou 13), cada 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NOs: 2 e/ou 22), cada 1 pmol de PTO (SEQ ID NOs: 17 e/ou 23) e 25 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 63°C. Os 30 μL da mistura resultante foram aplicados em uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro de NSB sobre a qual os CTOs (SEQ ID NOs: 18 e 24) foram ligados de forma cruzada. A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). A reação de extensão foi permiti- da por 20 min a 55°C. Então as lâminas foram lavadas em água destilada a 64°C durante 1 min. A aquisição de imagem foi realizada após cada lavagem através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon Ge- nePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 10 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microarranjos, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de fundo locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutividade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[000442] Como mostrado na Figura 24, o sinal-alvo para SA (UFR: 65.192±198,7) foi detectado na presença de molde de SA. O sinal-alvo para NG (UFR: 65.332±1,4) foi detectado na presença de molde de NG. Ambos os sinais-alvo para SA (UFR: 65.302±0,7) e NG (UFR 65.302±0,7) foram detectados na presença de ambos os moldes.
[000443] Tendo descrito uma modalidade preferida da presente invenção, deve ser entendido que variantes e modificações da mesma que se encaixam dentro do espírito da invenção podem ser tornar evidentes para os peritos nesta arte e o âmbito desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes.

Claims (16)

1. Método para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão com PTO), caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) hibridizar a sequência de ácido nucleico alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o oligonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo; o PTO compreendendo (i) uma porção de direcionamento 3' que compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de marcação 5' que compreende uma sequência de nu- cleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico alvo; em que a porção de direcionamento 3' é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5' não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; o oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO; (b) colocar em contato o resultado da etapa (a) com uma enzima que possui uma atividade de nuclease 5' sob condições para a clivagem do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz a clivagem do PTO pela enzima que possui a atividade de nuclease 5' tal que a clivagem libere um fragmento que compreende a porção de marcação 5' ou uma parte da porção de marcação 5' do PTO; (c) hibridizar o fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Molde); em que o CTO compreende em uma direção 3' para 5' (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5' ou uma parte da porção de marcação 5' do PTO e (ii) uma porção de molde que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de marcação 5' e à porção de direcionamento 3' do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) realizar uma reação de extensão utilizando o resultado da e-tapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente de molde; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e uma dúplice estendida é formada; em que a dúplice estendida possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; (e) fundir a dúplice estendida ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal alvo indicativo da presença da dúplice estendida; em que o sinal alvo é fornecido por (i) pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) uma marcação incorporada dentro da dúplice estendida durante a reação de extensão, (iii) uma marcação incorporada dentro da dúplice estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) uma marcação de intercalação; e (f) detectar a dúplice estendida através da medição do sinal alvo; em que a presença da dúplice estendida indica a presença da sequência de ácido nucleico alvo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a presença da dúplice estendida é detectada através da análise de fusão.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fusão da etapa (e) é seguida pela hibridização para fornecer o sinal alvo indicativo da presença da dúplice estendida.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal alvo é fornecido por pelo menos uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o fragmento ou o CTO possui uma marcação dual interativa que compreende uma molécula de emissão e uma molécula de extinção; em que a fusão da dúplice estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o fragmento possui uma de uma marcação dual interativa que compreende uma molécula de emissão e uma molécula de extinção e o CTO possui a outra da marcação dual interativa; em que a fusão da dúplice estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente das marcações duais interativas para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o fragmento ou o CTO possui uma única marcação e a fusão da dúplice estendido na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da única marcação para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal-alvo é fornecido através de uma única marcação incorporada dentro da dúplice estendida durante a reação de extensão; em que a única marcação incorporada está ligada a um nucle- otídeo incorporado durante a reação de extensão; em que a fusão da dúplice estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da única marcação para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal-alvo é fornecido por uma marcação incorporada dentro da dúplice estendida durante a reação de extensão e uma marcação ligada ao fragmento e/ou ao CTO, e a marcação incorporada está ligada a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que as duas marcações são uma marcação dual interativa de uma molécula de emissão e uma molécula de extinção; em que a fusão da dúplice estendida na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente da marcação dual interativa para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo a montante possui uma sequência parcialmente sobreposta com a porção de direcionamento 3' do PTO.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a repetição das etapas (a)-(b), (a)- (d) ou (a)-(f) com desnaturação entre os ciclos de repetição.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é realizado para detectar pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos-alvos; em que o oligonucleotídeo a montante compreende pelo menos dois tipos de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos dos PTOs e o CTO compreende pelo menos um tipo dos CTOs.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico-alvo compreende uma variação de nucleotídeo.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CTO é imobilizado através de sua extremidade 5' ou sua extremidade 3' sobre um substrato sólido.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que é realizado na presença de
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