KR101756975B1 - Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단을 이용한 타겟 핵산서열의 검출 - Google Patents

Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단을 이용한 타겟 핵산서열의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명은 타겟 핵산서열 존재에 의존적인 주형으로서 임의적인 서열을 갖는 상기 CTO 상에 연장가닥이 생성되는 방식으로 실시되고, 결국 프로브로서 상기 SO가 상기 연장가닥과 혼성화되어 시그널을 제공한다. 본 발명은 PTO 혼성화 및 절단, CTO 혼성화 및 연장, 및 SO 혼성화 및 절단을 포함하는 일련의 반응을 이용하며, 이로 인해 본 발명의 특이성이 높이 향상된다.

Description

ＰＴＯ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단을 이용한 타겟 핵산서열의 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage}
본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
DNA 혼성화(hybridization)는 분자 생물학의 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 구성, 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성제의 존재에 의해 영향을 받는다.
DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산서열 결정에 매우 유용한 도구가 될 것이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다. 그러나, 혼성화에만 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브와 비-타겟 서열간의 비-특이적인 혼성화로 인한 위양성 결과가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아 있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소적 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예컨대, TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산서열에 혼성화된 표지 프로브는 업스트림 프라이머-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 발생을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합-의존적 절단(polymerization-dependent cleavage) 및 중합-독립적 절단(polymerization-independent cleavage). 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 발생되어야 한다. 연장반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하도록 하여 표지가 방출된다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은, 그의 5’-말단 부위에 타겟 서열과 혼성화 되지 않는 5’-테일 구역을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일 구역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 방출되는 몇몇 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 주형에 대해 비-상보적인 5’부위 및 주형에 대해 상보적인 3’부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 주형에 혼성화 되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 주형에 혼성화 되는 절단 구조가 예시되어 있다. 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변형 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 주형에 비-상보적인 5’부위가 방출된다. 그 후 방출된 5’부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap)부위가 방출되고, 방출된 5’플랩부위는 크기 분석 또는 상호작용적 이중 표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성되는 것을 개시하고 있다. 이 방법에서, 첫 번째 절단구조로부터 방출된 플랩은, 핵산 합성 의존적인 방식으로 두 번째 절단구조를 절단하여 두 번째 절단구조로부터 플랩을 방출시키며, 방출된 플랩들을 검출한다. 미국 특허 제7,309,573호는 핵산 합성에 의해 생성된 방출된 플랩의 생성, 방출된 플랩의 연장, 플랩 연장 동안 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 생성된 시그널 검출을 포함하는 방법을 개시하고 있다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하더라도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 5’부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 단편은 캡처 프로브에 혼성화 되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단된/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 혼성화 되지 않는 것이 필수적이다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정화되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질에서의 혼성화의 효율성을 낮게 하고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따라서, 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, 혼성화 뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction)과 같은 효소적 반응에 의하여 액상 및 고상에서 타겟 서열, 보다 바람직하게는 복수의 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 더욱이, 당업계에서 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않는 신규한 타겟 검출 방법이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허 및 문헌들의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면 타겟 검출은 프로브의 혼성화 뿐 만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction) 및 연장과 같은 효소적 반응과 연장-의존적 혼성화 및 절단 반응을 이용하여 달성되며, 타겟 특이성, 과정의 편의성 및 멀티플렉스 검출 가능성을 개선시킨다.
따라서, 본 발명의 목적은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 타겟 핵산 서열을 검출하는 신규한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 PCE-SC 어세이는 다음에서 보다 상세히 설명될 수 있다:
I. PCE-SC 어세이에 의한 타겟 핵산 서열 검출
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→ 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며;
(e) 상기 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide: SO)를 혼성화시켜 연장가닥/SO 혼성화물을 생성시키는 단계로서; 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며;
(f) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme)를 이용하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단하여 상기 SO의 절단된 단편을 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 단계 (f)에서 상기 절단 반응의 발생을 검출하는 단계로서; 상기 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정하여 실시하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면 타겟 검출은 프로브의 혼성화뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction) 및 연장과 같은 효소적 반응 및 연장-의존적 혼성화 및 절단 반응을 이용하여 달성되며, 타겟 특이성, 과정의 편이성 및 멀티플렉스 검출 가능성을 개선시킨다.
본 발명은 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단과 연장 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단 반응을 포함하는 프로브 혼성화에 의해 발생되는 연속적인 이벤트를 이용하며, 따라서, 본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이”로 명명된다.
본 발명의 PCE-SC 어세이를 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 PTO의 혼성화
본 발명에 따르면, 우선 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열”또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)”는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
특정 구현예에서, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridizing)”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 예를 들어, 완전히 상보적인 것을 의미한다.
PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-상보적”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly non-complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 예를 들어, 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위를 언급하면서 사용되는 용어 “비-상보적”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 상기 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적 (perfectly non-complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 예를 들어, 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)”는 (i) 프로브로서의 역할을 하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 타겟 핵산서열과의 혼성화 이후 절단되어 PTO로부터 방출되며 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 반드시 5’→ 3’순서로 위치한다. 도 1에서 PTO를 도시적으로 보여준다.
일 구현예에서, 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되고 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 단계 (a)의 혼성화가 실시된다.
PTO는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 5’-태깅 부위는 CTO의 템플레이팅 부위에 특이적으로 혼성화된 후 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
PTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다. 특정 구현예에서, PTO의 3’-말단은 “블록킹”되어 그의 연장이 방지된다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO는 헤어핀 구조를 가지도록 디자인될 수 있다.
상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 타겟 핵산서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건하에서 그들 사이에 안정한 이중-가닥이 형성되지 않음을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과의 혼성화에 관여하지 않는 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 단일 가닥을 형성한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이도 PTO를 절단한다. 반면에, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어“이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO로부터 이격되어 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
선택적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드, 또는 1-3 뉴클레오타이드 길이이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위 중에서 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시한다. 다운스트림 프라이머는 PTO에 혼성화되는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시키며, 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 사용하는 경우, 상기 프라이머들의 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 사용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이도를 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO 절단으로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨다. 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단이 발생되는 데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우, 그의 3’-타겟팅 부위는 혼성화에 관여하나 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일-가닥을 형성한다(참조: 도 2). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
본 발명은 PTO의 절단반응을 위하여 다수의 종래 기술을 이용할 수 있으며, 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
종합하면, 단계 (b)의 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의하여 PTO의 절단이 시작되는 위치는 PTO 및 타겟 핵산서열 간의 이중가닥이 시작되는 지점 또는 그 시작 지점으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
따라서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 언급하면서 사용되는 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO 단편”으로 표현된다.
일 구현예에 따르면, PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대하여 내성을 갖는 하나의 블록커를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 초기 절단 위치 및/또는 연속적 절단을 조절하는데 이용된다.
일 구현예에 따르면, PTO는 블록커(blocker)로서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대하여 내성을 갖는 최소 1 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖는다.
예를 들어, PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 사이의 정션 위치(junction site)에서 절단을 유도하기 위하여, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 블록커로 블록킹될 수 있다.
블록커 부위에 포함되는 블록커의 개수는 제한되지 않으며, 1-10, 2-10, 3-8 또는 3-6 블록커를 포함한다. 프로브에 존재하는 블록커는 연속적 또는 불연속적인 방식으로 존재할 수 있으며, 적합하게는 연속적인 방식이다. 블록커로서의 뉴클레오타이드, 즉 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카보하이드레이트 변형을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 5’→ 3’엑소뉴클레아제에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형이다.
일 구현예에 따르면, 블록커로서 뉴클레오타이드는 LNA(locked nulceic acid)를 포함한다.
본 명세서에서 PTO의 5’-태깅 부위의 일부, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO 또는 CTO를 언급하면서 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 적합하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 적합하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에 적합한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 특정 구현예에서, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소이다.
선택적으로, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이한 효소이다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
PTO로부터 방출된 단편은 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)와 혼성화 된다.
CTO는 3’→5’방향으로 (i) PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
CTO는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 한다. 프라이머로서의 역할을 하는 상기 단편은 CTO에 혼성화되고, 연장되어 이합체를 형성한다.
템플레이팅 부위가 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 서열을 갖는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이팅 부위가 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, PTO의 5’-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
한편, PTO의 절단 위치를 예상함으로써 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5’-태깅 부위를 갖는 단편은 캡처링 부위와 혼성화 될 수 있으며 이후 연장된다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 될 수 있으며, 상기 단편의 3’-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3’-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인함으로써 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다.
일 구현예에서, 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 위치에 따라 선택될 수 있다. 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드 또는 1-3 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 단편과의 혼성화에 포함되지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, CTO가 상기 단편과 안정되게 혼성화 되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 구성을 포함하여 설명한다.
CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인 할 수 있다.
CTO의 길이는 다양해 질 수 있다. 예를 들어, CTO는 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다. CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화 되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 또한, CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장반응에서 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
PTO로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화 되며, 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 또한, 비절단 PTO가 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되더라도, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO에 혼성화 되지 않아, 연장 이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 혼성화에 대한 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시한다. CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장 서열을 포함하는 연장가닥을 형성하며, 이에 의해 연장 이합체가 형성된다. 반면, CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 PTO는 연장되지 않으며 이에 의해 연장 이합체도 형성되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연장 이합체”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 된 단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 CTO의 템플레이팅 부위를 주형으로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 단편을 언급하면서 사용되는 용어 “연장가닥(extended strand)”은 단편과 이의 연장서열을 포함하는 서열을 의미한다.
본 명세서에서 용어 단편을 언급하면서 사용되는 용어 “연장서열(extended sequence)”은 연장가닥에서 단편을 제외한 새롭게 연장된 서열만을 의미한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus를 포함한다. 특히, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 동일한 효소이다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이머를 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 동일한 효소이다.
단계 (e): 연장가닥과 SO의 혼성화
상기 연장반응에 이어, 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시켜 연장가닥/SO 혼성화물을 생성시킨다.
상기 연장가닥과 혼성화되는 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 최소 하나의 표지를 포함한다.
본 명세서에서 용어 SO를 언급하면서 사용되는 용어 “연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열”은 특정 엄격조건 하에서 상기 연장가닥과 이중가닥을 형성하여 연장가닥과 함께 혼성화물을 형성할 수 있는 서열을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 전체 또는 일부 서열에 상기 연장 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 SO를 언급하면서 사용되는 용어 “연장서열에 혼성화 가능한 서열”은 SO 서열 가운데 상기 연장 서열과 이중가닥을 형성하는데 관여하는 특정 서열을 의미한다.
예를 들어, 상기 SO는 그의 서열 전체적으로 상기 연장 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다. 택일적으로, 상기 단계 (e)에서 상기 SO가 상기 연장가닥과 이중가닥을 형성할 수 있는 한, 상기 SO의 한 부위는 상기 연장 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있고(즉, 상기 부위는 상기 연장서열에 혼성화 가능한 서열이다), 다른 부위는 상기 PTO 단편에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
특히, 상기 SO는 그의 서열 전체적으로 상기 연장서열에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
상기 연장가닥에서 상기 PTO 단편에 해당하는 부위에만 상보적인 서열을 포함하는 SO가 사용되는 경우, 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 그의 혼성화에 의해 제공되고, 비절단 PTO의 5’-태깅 부위와 SO의 혼성화물은 절단되어 비-타겟 시그널을 생성할 수 있다. 그러나, 상기 SO가 상기 연장 반응에서 새롭게 합성된 상기 연장 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함하도록 디자인되는 경우, 비-타겟 시그널을 배제시킬 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO의 적어도 한 위치가 상기 SO/연장가닥 혼성화물에서 새롭게 합성된 상기 연장 서열에 혼성화될 때에만 제공되도록 디자인될 수 있다. 위의 경우에서, 상기 SO가 비절단 PTO에 혼성화되는 경우, 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 제공되지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 SO의 서열은 비절단 PTO와 혼성화물을 형성하지 않도록 선택된다. 예를 들어, 상기 SO 및 비절단 PTO의 상기 5’-태깅 부위 사이의 상보성은 90%, 70%, 50%, 30% 또는 20% 이하일 수 있고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물 형성에 대한 혼성화 조건에 의존적으로 달라질 수 있다.
SO의 길이는 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 5-10 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
SO는 헤어핀 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있다. 택일적으로, 블록킹되지 않은 3’-OH기를 가지는 SO는 연장될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 SO는 그의 5’-방향으로 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 갖는 5’-태깅 부위를 포함하는 5’-말단이 태깅된 SO(5’-tagged SO)이다. 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 갖는 상기 부위(5’-태깅 부위)는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 단계 (e)의 혼성화는 상기 SO의 업스트림에 위치한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에 실시된다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 SO의 업스트림에서 상기 연장가닥과 혼성화된다. 다른 일 구현예에서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
상기 연장가닥 및 상기 SO 간의 혼성화는 5’뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 제한효소와 같은 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성시킨다. 상기 SO 상에서 상기 절단 위치는 상기 연장가닥/SO 혼성화물이 형성될 때에만 생성된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 5’뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성시킨다. 상기 SO 상에서 상기 절단 위치는 상기 연장가닥/SO 혼성화물이 형성될 때에만 생성되며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 5’뉴클레아제에 의해 5’→3’방향으로 절단된다.
일 구현예에서, 상기 SO는 RNA 서열을 포함하고, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA-RNA 혼성화 이합체 및 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성시킨다.
일 구현예에서, 상기 SO는 상기 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하고, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 상기 제한 효소에 대한 절단 위치를 생성시킨다.
특정 구현예에서, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA 이합체, RNA 이합체 또는 DNA-RNA 혼성화 이합체를 절단할 수 있는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성시킨다.
상기 PTO 단편의 상기 연장가닥 및/또는 상기 SO는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치가 원하는 유형으로 도입되도록 디자인될 수 있다.
DNA 이합체 상에서 작용하는 뉴클레오절단 효소(예컨대, 5’뉴클레아제 및 제한효소)에 대한 절단 위치를 생성하도록 하는 경우, 각각 DNA 분자로 구성된 상기 PTO 단편의 연장가닥 및 상기 SO가 사용된다. DNA 분자로 구성된 상기 PTO 단편의 연장가닥은 DNA 분자로 구성된 상기 SO와 혼성화되어 DNA 이합체 상에서 작용하는 뉴클레오절단 효소(예컨대, 5’뉴클레아제 및 제한효소)에 대한 절단 위치를 생성한다.
본 발명에서 제한효소를 사용하는 경우, 상기 PTO 단편의 연장가닥 및 상기 SO는 상기 제한효소에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 상기 제한효소에 대한 절단 위치를 갖는 상기 연장가닥/SO 혼성화물은 상기 제한효소에 의해 절단되어, 절단된 단편을 생성하며, 이는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
DNA-RNA 혼성화 이합체 상에서 작용하는 뉴클레오절단 효소(예컨대, RNase H)에 대한 절단 위치를 생성하도록 하는 경우, 특히 DNA 분자로 구성된 상기 PTO 단편의 연장가닥 및 RNA 분자로 구성된 상기 SO가 사용된다. 일 구현예에서, 상기 SO는 1-10 리보뉴클레오타이드를 포함한다.
DNA 분자로 구성된 상기 PTO 단편의 연장가닥은 RNA 분자로 구성된 상기 SO와 혼성화되어 DNA-RNA 혼성화 이합체 상에서 작용하는 뉴클레오절단 효소(예컨대, RNase H)에 대한 절단 위치를 생성한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 단계 (d) 및 (e) 사이에 변성단계를 추가적으로 포함한다.
상기 연장가닥 및 상기 CTO 간 연장 이합체의 생성은 상기 SO 및 상기 연장가닥 사이의 낮은 혼성화 효율의 원인이 될 수 있다. 본 발명에서 상기 연장가닥 양의 증가는 상기 연장가닥 및 상기 SO 간의 혼성화 뿐 만 아니라 연속적인 절단 반응의 발생 가능성을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 양은 상기 CTO의 양보다 많고(예컨대, 1.0 이상의 CTO에 대한 PTO의 몰 비율), 상기 단계 (a)-(f)는 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 반복된다. 이러한 경우, 상기 연장가닥의 수는 증가하는 반면, 상기 CTO의 수는 일정하다. 따라서, 상기 CTO와 혼성화되지 않은 자유 연장가닥은 상기 연장가닥 및 상기 CTO 간에 연장 이합체를 형성하도록 하는 조건하에서도 존재할 수 있다. 상기 SO는 상기 CTO에 의한 방해없이 상기 자유 연장가닥과 효과적으로 혼성화될 수 있다.
상기 SO는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 반응의 발생(즉, 타겟 핵산서열의 존재)을 나타내는 시그널을 제공할 수 있는 최소 하나의 표지로 표지된다.
단계 (f): 연장가닥/SO 혼성화물의 절단
상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 뉴클레오절단 효소를 사용하여 절단되어 상기 SO의 절단된 단편을 생성한다. 본 명세서에서 상기 단계 (b)의 절단 반응은 제1절단 반응이라 부르며, 상기 단계 (f)의 절단 반응은 제2절단 반응이라 부른다.
상기 단계 (e)의 혼성화에 의해 생성된 상기 연장가닥/SO 혼성화물에 뉴클레오절단 효소에 대한 작용 위치가 생성되기 때문에 상기 제2절단 반응이 일어날 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 절단된 단편은 단일 가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 상기 절단은 최소 2개의 단편을 생성할 수 있다. 예를 들어, 제한효소에 의한 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 절단은 이중가닥 상태의 두 개의 절단된 단편을 생성하고, 상기 이중가닥 단편은 반응 조건에 따라 단일가닥 형태로 해리될 수 있다. 5’뉴클레아제를 이용한 절단 반응에서 단일가닥 단편이 생성될 수 있다.
상기 제2절단 반응에 사용되는 뉴클레오절단 효소는 당업계에 알려진 어떠한 효소도 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 제2절단 반응에 사용되는 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제, 제한효소 및 리보뉴클레아제를 포함하고, 특히 열안정성 5’뉴클레아제, 제한효소 및 리보뉴클레아제를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 제2절단 반응에 사용되는 뉴클레오절단 효소는 이합체 분자 상에서 특이적으로 작용하는 뉴클레오절단 효소를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 상기 5’뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성하며, 그로 인해 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 5’→3’방향으로 5’뉴클레아제에 의해 절단된다. 특히, 상기 5’뉴클레아제는 주형-의존적 DNA 중합효소 또는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 FEN 뉴클레아제이다.
뉴클레오절단 효소 중, 상기 5’뉴클레아제는 5’→3’방향으로 DNA 이합체를 절단한다. 특정 구현예에서, 상기 5’뉴클레아제는 5’→3’엑소뉴클레아제 활성, 5’→3’엔도뉴클레아제 활성 또는 이 둘의 활성을 갖는다. 도 2 및 도 5에서 나타난 바와 같이, 상기 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO의 절단에 의해 생성된 PTO 단편은 상기 CTO와 혼성화되고, 그 다음 연장되어 연장가닥을 생성하며, 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화되어 상기 연장가닥/SO 혼성화물을 생성한다. 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 5’-말단 부위는 5’뉴클레아제에 의해 절단되어 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 절단된 단편을 생성한다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소는 5’→3’엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 일부 중합효소에서는 5’→3’엔도뉴클레아제 활성도 갖는다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소는 상기 단계 (b)에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드-의존적 절단 반응을 유도할 수 있다(참조: USP 5,210,015). 또한, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 절단 반응을 유도할 수 있다(참조: lawyer 등, Genome Res. 1993, 2:275-287 and WO 2008/011004).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 5’뉴클레아제는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소이고, 특히 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 열안정성 DNA 중합효소는 상기 단계 (b)에서의 설명을 참조하여 상세히 설명될 수 있다. 바람직하게는, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단을 위한 5’뉴클레아제는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 (b)의 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 상기 단계 (f)의 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소이다.
특정 구현예에서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소는 상기 단계 (b)의 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 절단 반응 뿐 만 아니라 상기 단계 (e)의 상기 연장가닥/SO 혼성화물을 절단하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 절단 반응을 유도할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소에 의한 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단은 상기 연장가닥/SO 혼성화물에 존재하는 표지의 위치 또는 표지의 연결 종류에 의해 영향받을 수 있다. 특히, 표지가 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 5’-말단에 연결된 경우, 상기 표지가 특히 탄소-스페이서를 통해 상기 SO의 5’-말단에 포스페이트 그룹에 연결된다면 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존적 DNA 중합효소에 의한 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단은 더욱 효과적일 수 있다. 상기 표지가 상기 SO의 5’-말단 염기에 연결되거나 상기 탄소-스페이서가 사용되지 않을 경우, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단은 발생하지 않을 수 있다.
뉴클레오절단 효소 가운데 상기 절단 효소는 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성에 의해 생성되는 제한효소에 대한 절단 위치를 절단한다. 상기 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO 절단에 의해 생성된 상기 PTO 단편은 상기 CTO(상기 제한효소에 의해 인식되는 서열을 포함하는)와 혼성화된 다음, 연장되어 상기 PTO 단편의 연장 서열에 상기 제한 효소의 인식 서열이 도입되고, 상기 제한효소에 의해 인식되는 서열을 포함하는 상기 SO는 상기 PTO 단편의 연장가닥과 혼성화되어 상기 제한효소에 대한 절단 위치를 생성한다. 상기 제한효소는 상기 연장가닥/SO 혼성화물을 엔도뉴클레오절단 방식(endonucleolytically)으로 절단하여 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 상기 절단된 단편을 생성한다.
일 구현예에 따르면, 상기 제한효소는 이합체의 특정 서열을 특이적으로 인식하여 절단하는 제한효소이고, 특히 열안정성 제한효소이다. 당업계에 공지된 다양한 제한효소가 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 리보뉴클레아제이고, 상기 SO는 RNA 서열을 포함하며, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA-RNA 이합체를 형성시켜 상기 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성한다. 상기 리보뉴클레아제에 대한 상기 절단 위치는 상기 단계 (f)에서 리보뉴클레아제에 의해 절단되어 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 절단된 단편을 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 리보뉴클레아제는 RNase H 또는 Exo Ⅲ이다.
RNase H는 DNA-RNA 혼성화 이합체의 RNA 부위를 절단할 수 있는 엔도리보뉴클레아제 중 하나이다. RNase H가 사용될 경우, 상기 SO는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되는 PTO의 절단에 의해 생성된 상기 PTO 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 다음 연장되고, 상기 SO는 상기 PTO 단편의 연장가닥과 혼성화된다. 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO에서 상기 RNA 분자는 엔도뉴클레오절단 방식으로 절단되어, 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 절단된 단편을 형성한다.
Exo Ⅲ는 RNase 활성을 갖는 것으로 보고되고 있다(Mol CD, 등, Nature 374(6520):381386(1995)). Exo Ⅲ가 사용될 경우, 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 절단된 단편은 RNase H와 같은 방식으로 형성된다.
상기 SO가 RNA 분자를 포함하는 경우, 상기 SO는 RNA 분자를 전체 또는 부분적으로 포함한다.
상기 단계 (f)는 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재 하에서 실시될 수 있다. 이러한 경우, 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
특정 구현예에서, 상기 단계 (f)는 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에 실시된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 단계 (f)는 상기 SO의 업스트림에 위치하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재하에 실시되며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥에 의존적인 5’뉴클레아제의 뉴클레오절단 활성에 의해 절단된다.
특정 구현예에서, 상기 뉴클레오절단 효소는 열안정성 뉴클레오절단 효소이다.
도 2 및 도 6은 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 부재 하에서 실시되는 본 발명의 특정 구현예를 도식적으로 나타내며, 도 3-5는 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되는 본 발명의 특정 구현예를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 주형-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의한 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 절단은 상기 주형-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의한 업스트림 올리고뉴클레오타이드-의존적 절단 보다 낮은 절단 효율을 가질 수 있다.
상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 세부 내용은 단계 (a)에서 상기 PTO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오티드의 내용을 참조하여 기술될 수 있다.
일 구현예에서, 리보뉴클레아제 또는 제한효소가 뉴클레오절단 효소로 사용될 경우, 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드(특히, 업스트림 프라이머)가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 5’뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 중합효소는 단지 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 SO는 5’-방향으로 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다. 이러한 경우, 상기 SO는 5’→3’방향으로 (i) 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위 및 (ⅱ) 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 3’-혼성화 부위를 포함한다.
상기 SO의 5’-태깅 부위가 상기 CTO(예컨대, CTO의 캡처링 부위)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 5’뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 제한효소에 의한 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 상기 SO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고, 상기 SO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO와 혼성화되어 연장될 수 있다. 따라서, 연장가닥은 추가적으로 생성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 뉴클레오절단 효소(특히, 제한효소)에 의한 상기 연장가닥의 생성 및 절단은 별도의 용기에서 실시된다.
단계 (g): 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 검출
상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 반응에 이어, 상기 타겟 핵산서열의 존재를 분석하기 위해 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단반응 발생을 검출한다.
일 구현예에 따르면, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 반응 발생의 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 실시한다.
본 발명에서 채택된 시그널링 시스템은 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단과 시그널 생성이 직접적으로 연관되도록 한 것에 특징이 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용된 시그널링 시스템은 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 시 시그널을 변화시킨다. 타겟 핵산서열이 존재하고, PTO가 절단되는 경우에만 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단이 발생하기 때문에 본 발명은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 요구에 따라 본 발명은 실시간 방식으로 실시할 수 있다.
시그널 발생과 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단을 직접적으로 연관시키기 위하여, 본 발명은 상기 SO에 연결된 최소 하나의 표지를 이용하여 시그널을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하는 상기 표지 시스템은 상호이중적 표지 또는 단일 표지이다.
(i) 상호작용적 이중 표지
상호작용적 표지 시스템은 공여체 분자 및 수용체 분자 사이에 에너지가 비-방사능적(non-radioacively)으로 전달되는 시그널 발생 시스템이다. 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 설명될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 발생되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중 표지 시스템)에 의하여 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO의 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 검출한다.
특정 구현예에서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 생성 전에 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 위치에 위치한다.
본 발명에서 상기 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 이용된다.
상기 상호작용적 표지 시스템이 이용될 경우, 상기 단계 (e)에서 생성되는 절단 위치는 5’뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
본 발명에서 상호작용적 이중표지의 원리는 도 2 내지 5에서 도식적으로 보여준다. 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO로부터 PTO 단편이 방출된 다음, CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고 연장되어 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성한다. 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화되고, 뉴클레오절단 효소에 의해 절단된다. 이 때, 상기 SO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 분리되고, 퀀처 분자에 의한 퀀칭이 방지되어 시그널 변화(예컨대, 리포터 분자로부터 시그널 증가)가 유도되며, 최종적으로 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 SO 상에서 이중 표지는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 시, 언퀀칭(unquenching)이 발생하는 위치에 위치될 수 있다. 연속적인 절단 반응에 의해 상기 SO 상에서 상기 리포터 및 퀀처를 서로 분리하는 것은 퀀칭을 완전히 경감시킬 수 있다. 그 후, 상기 표지된 단편으로부터 시그널을 측정하여 상기 절단 반응의 발생을 검출한다.
상기 타겟 핵산서열의 부재 시, 상기 PTO는 절단되지 않고, 상기 절단되지 않은 PTO는 연장되지 않지만 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된다. 이러한 경우, 상기 비-혼성화 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 인접하여 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭할 수 있도록 한다.
상기 타겟 핵산서열은 상술한 원리에 따라 검출될 수 있다.
상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성 전에 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 위치에 위치한다. 특정 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상기 SO의 길이에 따라 서로 인접하여 위치하거나, 랜덤 코일 및 헤어핀 구조와 같은 SO의 형태적 구조의 형성에 의해 서로 인접하여 위치한다.
상기 뉴클레오절단 효소(예컨대, 5’뉴클레아제)는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 5’-말단 부위를 절단하여 상기 리포터 분자를 방출할 수 있으며, 그로 인해 상기 리포터 분자로부터 시그널 변화를 유도한다. 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재 결정을 위한 형광 시그널을 측정함으로써 검출할 수 있다.
상기 퀀처 분자가 형광일 경우, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 상기 형광 퀀처로부터 시그널을 측정함으로써 검출할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 상기 SO의 5’-말단에 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 상기 SO의 5’-말단에 연결되어 있고, 다른 하나는 3’-말단에 연결되어 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3’-말단 또는 그의 3’-말단으로부터 1-10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
예를 들어, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있으며, 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 5-80 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상호작용적 이중 표지는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성에 앞서 퀀칭 현상을 유지하기에 충분한 위치에 위치하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단에 따라 언퀀칭을 유도한다.
상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 동안 실시간 시그널 생성을 고려할 때, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 60 뉴클레오타이드 이내, 30 뉴클레오타이드 이내, 25 뉴클레오타이드 이내, 20 뉴클레오타이드 이내, 15 뉴클레오타이드 이내 또는 10 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드, 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 5 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드 또는 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
또한, 표지(예컨대, 리포터 분자)를 갖는 절단된 단편이 생성되기 때문에, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 보다 유연하거나 편리한 조건(예컨대, 고엄격 조건 또는 고상 기질 상에서 세척 후 조건) 하에서 상기 절단된 단편에 연결된 표지로부터 시그널을 직접적으로 검출함으로써 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 고정화된 SO에 연결된 상호작용적 이중 표지 중 하나는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 후에 고상 기질 상에 남는다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질상에 고정화된 상기 SO가 상호작용적 이중 표지를 갖고, 5’뉴클레아제가 뉴클레오절단 효소로 사용되는 경우, 상기 혼성화물로부터 SO 단편을 해리하는 적당한 조건을 부여하거나 상기 SO의 내부 뉴클레오타이드에 5’뉴클레아제 활성에 대하여 내성(예컨대, 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성 또는 그의 염기 상에 표지를 갖는 뉴클레오타이드에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드)을 부여함으로써, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 후 상기 상호작용적 이중 표지 중 하나는 고상 기질 상에 확실히 남아 있을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성에 대한 내성은 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 부여되며, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카르보하이드레이트 변형을 포함하며, 특히, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스터 연결, 아릴 포스포트리에스터 연결, 알킬, 포르포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
상기 SO가 상기 연장가닥에 비-상보적인 5’-태깅 부위를 포함하는 경우, 리포터 또는 퀀처 분자는 상기 절단 위치를 고려하여 상기 5’-태깅 부위에 위치할 수 있다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자(또는 다크 퀀처 분자)가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
SO에 적용되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 색소(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 색소(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
상기 표지는 종래의 방법의 통해 SO에 연결될 수 있다. 예를 들어, 탄소원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 SO에 연결된다.
(ii) 단일 표지
또한 본 발명은 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 연장가닥/SO 혼성화물의 발생에 대한 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
상기 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
단일 표지가 올리고뉴클레오타이드에 연결되어 있는지 아니면 올리고뉴클레오타이드로부터 방출되는지에 의존적으로 또는 단일 표지가 온전한(intact) 올리고뉴클레오타이드에 연결되어 있는지 아니면 상기 올리고뉴클레오타이드의 단편에 연결되어 있는지에 의존적으로 상이한 시그널을 나타내는 단일 표지가 존재한다. 이러한 단일 표지가 사용되는 경우, 본 발명은 액상에서도 연장가닥/SO 혼성화물의 절단과 동시에 발생되는 시그널링 시스템을 제공할 수 있다. 예를 들어, 형광 테르븀 킬레이트는 그것이 올리고뉴클레오타이드에 연결되어 있는지 아니면 올리고뉴클레오타이드로부터 방출되는지에 의존적으로 상이한 시그널을 제공한다(Nurmi 등, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28 No.8 e28). 다른 예를 들면, 상기 단일 표지가 평면 편광에 의한 여기를 통해 분극화된 형광을 방출하는 색소인 경우, 상기 단일 표지를 포함하는 절단된 단편은 FP(fluorescence polarization) 방법을 통해 검출할 수 있다. 방출된 형광의 분극화 정도는 표지에 연결된 분자의 운동에 의해 영향을 받는다. 일반적으로 운동이 빠르면 분극화 정도는 낮아진다(Latif 등, Genome Research, 11:436-440, 2001).
특정 구현예에서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단에 의존적으로 상이한 시그널을 발생시킬 수 있는 단일 표지는 형광 테르븀 킬레이트 또는 분극화된 형광을 방출하는 색소이다.
상기 SO의 절단으로 생성된 단편이 단일 표지를 포함하도록 시그널링 시스템이 디자인된 경우, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 상기 표지된 단편을 이용함으로써 효과적으로 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 전기영동 상에서 표지된 단편을 검출함으로써 편리하게 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 SO는 단일 표지를 가지고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출한다. 이러한 경우, 상기 SO의 절단에 앞서 상기 단일 표지로부터 발생한 시그널은 상기 SO의 절단 후 상기 단일 표지로부터 발생한 시그널과 상이하고, 상기 시그널의 차이는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생을 검출할 수 있도록 한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5’-말단 또는 3’-말단에 연결된다.
본 발명에서 단일 표지를 사용하는 경우, 본 발명은 고정화된 SO를 사용하여 고상에서 효율적으로 실시된다. 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통해 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키고, 상기 단편은 고상 기질 상에서 방출되며, 그로 인해 시그널 변화가 상기 고상 기질 상에서 발생하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생을 검출한다.
상기 SO가 그의 3’-말단을 통해 상기 고상 기질 상에 고정화되는 경우, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5’-말단에 연결되며, 상기 단계 (e)에서 생성되는 상기 절단 위치는 5’-뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
도 6에서 도식화한 바와 같이, 상기 PTO 단편의 연장가닥은 그의 3’-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된 SO와 혼성화되어 5’ 뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성시킨다. 상기 5’뉴클레아제는 상기 절단 위치를 공격함으로써 상기 연장가닥/SO 혼성화물을 절단하고, 상기 SO의 5’-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 고정화된 SO를 포함하는 스팟은 형광의 감소 또는 소멸을 보이는 것이 관찰된다. 타겟 핵산서열이 없을 경우, 고정화된 SO를 포함하는 스팟에서 형광의 감소 또는 소멸은 관찰되지 않는다.
특히, 본 발명이 단일 표지를 사용하여 고상에서 실시되는 경우, 일반적인 형광표지를 사용할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결되어 있는지 아니면 올리고뉴클레오타이드로부터 방출되는지에 의존적으로, 또는 온전한 올리고뉴클레오타이드에 연결되는지 아니면 상기 올리고뉴클레오타이드의 단편에 연결되는지에 의존적으로 상이한 강도를 갖는 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정 형광 표지를 필요로 하지 않는다. 고상에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물 절단 발생에 의존적으로 차이를 나타내는 시그널은 고상에서 단일 표지의 잔류를 검출함으로써 분석할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에서 단일 표지의 활용성(workability)은 고상에서 두드러진다.
상술한 바와 같이, 시그널의 존재 여부 또는 시그널 변화(시그널 강도의 증가 또는 감소)는 상기 제2절단 반응과 동시발생적인 방식으로 상기 단일 표지에 의해 제공되어 타겟 핵산서열의 존재를 검출한다.
본 발명에서 유용한 단일 형광 표지의 예들은 상술한 바와 같이 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
상기 단일 표지는 종래의 방법에 의해 상기 SO에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 단일 표지는 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 SO에 연결된다.
특정 구현예에서, 상기 SO의 단일 표지는 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 택일적으로, 상기 단일 표지는 상기 SO의 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
상기 프라이머, PTO, CTO 및 SO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, 상기 프라이머, PTO, CTO 및 SO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. 상기 PTO 및 CTO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기”는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 상기 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 혼성화 되는 CTO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3’-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 다양한 위치에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5’-태깅 부위를 갖는 PTO를 복수의 타겟 핵산서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 서로 다른 PTO 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 CTO에 유용하게 사용된다. CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 CTO 또는 최소한의 타입의 CTO를 사용하도록 한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 반복 사이클(repeating cycle) 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(g)의 모두 또는 일부를 반복적으로 실시하는 것을 추가적으로 포함한다. 이러한 반복에 의해 타겟 핵산서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭시킬 수 있다. 상기 변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리옥살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 공지된 기술을 통해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도범위에서 열처리하여 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(b), (a)-(d), (a)-(e), (a)-(f) 또는 (a)-(g)는 변성과정을 포함하여 반복될 수 있다.
상기 단계 (a)-(f)의 반복이 상기 SO의 단편 생성에 대한 일 예인 것은 당업자에게 명확하다. 예를 들어, 본 발명은 단계 (a)-(b)를 반복하고 단계 (c)-(f)를 실시하여 상기 SO의 단편을 생성한 다음, 상기 SO 단편 검출을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(g)는 하나의 반응용기에서 실시되거나 상기 단계 (a)-(g)의 일부는 별도의 반응용기에서 실시된다. 예를 들어, 상기 단계 (a)-(b), (c)-(d) 또는 (e)-(f)는 하나의 반응용기 또는 별도의 반응용기에서 실시될 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위와 타겟 핵산서열 간의 혼성화가 PTO 단편 및 CTO 간의 혼성화보다 더 엄격한 조건하에서 실시될 수 있도록 PTO 및 CTO의 서열 및 반응 조건이 결정되는 경우, 상기 단계 (a)-(b)는 상기 단계 (c)-(g)의 수행없이 반복될 수 있다. 상기 단계 (a)-(b)의 반복 후, 단계 (c)-(g)를 실시할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(b)는 변성과정을 포함하여 반복될 수 있다.
특정 단계의 반복, 반복과정에서 변성의 개재, 특정 단계(들)의 분리 실시 및 검출 시점이 폭넓게 변화될 수 있다는 것은 당업자에게 명확하다.
일 구현예에 따르면, 상기 반복이 상기 PTO에 대한 업스트림 프라이머를 사용하여 변성과정과 함께 실시되는 경우, 상기 반복은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되며, 특히 PCR에 따라 실시된다. 상기 PTO에 대한 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 사용은 타겟 핵산서열을 증폭시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 반복이 상기 PTO에 대한 업스트림 프로브를 사용하여 변성과정과 함께 실시되는 경우, 상기 반복은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시된다.
본 발명에서는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다. 상기 타겟 핵산서열은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
검출 및/또는 증폭될 수 있는 상기 타겟 핵산서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
본 발명에 의하여 검출되는 타겟 핵산서열은 다양한 핵산서열, 예컨대, 지놈 내 서열, 인위적으로 분리되거나 단편화된 서열 및 합성 서열(예를 들어, cDNA 서열 및 바코드 서열)을 포함한다. 예컨대, 타겟 핵산서열은 Immuno-PCR (IPCR)을 위한 핵산 마커 서열을 포함한다. IPCR은 PCR과 함께 핵산 마커 서열 및 항체 간의 콘쥬게이트를 사용하며, 이는 단백질을 포함한 다양한 종류의 타겟들을 검출하는 데 널리 적용된다(Sano 등, Science 258 pp:120-122(1992), 미국 특허 제5,665,539호, Niemeyer 등, Trends in Biotechnology 23 pp:208-216(2005), 미국 출원 공개번호 제2005/0239108호 및 Ye 등, Journal of Environmental Science 22 pp:796-800(2010)).
또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 바람직하게는 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 상기 사용된 용어 ‘뉴클레오타이드 변이’는 핵산서열의 특정 위치에 있는 어떠한 변이도 포함한다. 즉, 용어 ‘뉴클레오타이드 변이’는 야생형 및 핵산서열의 특정 위치에 있는 어떠한 돌연변이형도 포함한다.
타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 발명에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 매칭 템플레이트(matching template)로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 미스매칭 템플레이트(mismatching template)로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟핵산서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3’-말단은 매칭 템플레이트에 어닐링되고 연장되어 PTO 절단을 유도한다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3’-말단이 미스매칭 템플레이트에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치 되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 템플레이트에 혼성화 되더라도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3’-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 타겟 시그널이 발생되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 템플레이트에 혼성화된 후 절단된다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO에 혼성화 되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, PTO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 템플레이트에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 이러한 경우, 바람직하게는 PTO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 인위적 미스매치 뉴클레오타이드의 사용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 가능성을 향상시킨다.
택일적으로, 본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 선택성을 위해 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 갖는 PTO를 사용한다. 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 뉴클레오타이드 변이 검출을 위하여 타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이에 위치하고, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열에서 뉴클레오타이드 변이에 대해 상보적인 서열을 갖는다.
상기 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 매치 템플레이트)과 혼성화되면, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 매치 템플레이트와 이중 가닥을 형성한다. 반면, 상기 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 미스매치 템플레이트)과 혼성화되면, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 미스매치 템플레이트와 이중 가닥을 형성하지 않는다.
본 명세서에서 PTO와 관련하여 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이 구별 사이트”는 타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 상보적인 서열을 의미한다.
이와 같이 관심있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 구별되는 혼성화 패턴은 PTO의 초기 절단 위치에서의 차이를 제공하며, 이에 의해 2 종의 PTO 단편이 생성되어 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다는 것은 주목할 만하다.
관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 하에서 제1단편은 PTO 및 매칭 템플레이트 혼성화물의 절단에 의해 생성되고, 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 부재 하에서 제2단편은 PTO 및 미스매칭 템플레이트 혼성화물의 절단에 의해 생성된다. 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 제2단편이 제1단편과 다르도록 만든다.
단일 뉴클레오타이드 변이 검출에 대한 일 구현예에서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열에서 단일 뉴클레오타이드 변이에 대해 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매치 템플레이트와 혼성화된 PTO의 절단은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 대해 3’-방향으로 인접한 위치에서 유도될 수 있으며, 예를 들어, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서 그렇다. 상기 PTO 단편의 3’-말단은 상기 단일 뉴클레오타이드 변이에 대해 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 상기 PTO 단편은 상기 뉴클레오타이드 변이에 대응되는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 CTO와 혼성화되고, 연장되어 연장이합체를 생성하며, 타겟 시그널을 제공한다. 동일한 상기 PTO가 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고 매치 템플레이트와 동일한 서열을 갖는 미스매치 템플레이트와 혼성화하면, 상기 PTO의 절단은 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 3’-방향으로 2개 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생할 수 있다. 상기 PTO 단편의 3’-말단은 상기 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에도 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드와 혼성화되는 상기 CTO의 위치가 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인되는 경우, 상기 PTO 단편의 3’-말단은 상기 CTO와 혼성화되지 않으며, 그 결과 조절된 조건에서 상기 PTO 단편은 연장되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열을 갖는 상기 PTO의 절단 위치는 매치 템플레이트 또는 미스매치 템플레이트와의 혼성화에 의존적으로 달라지며, 혼성화 이벤트로부터 방출된 상기 PTO 단편은 바람직하게는 그의 3’-말단 일부, 더욱 바람직하게는 그의 3’-말단에 다른 서열을 가진다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO 단편의 3’-말단 일부의 차이를 고려한 CTO 뉴클레오타이드 서열의 선택은 미스매치 템플레이트로부터 매치 템플레이트를 구별할 수 있도록 한다.
일 구현예에 따르면, 둘 중 어느 PTO 단편의 생성도 CTO 상에서 연장 반응에 의해 뚜렷하게 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, CTO가 상기 제2단편의 상기 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않아서, 상기 제2단편의 연장이 방지되도록 CTO의 서열을 선택한다.
본 발명에서 설명한 바와 같이, 상기 제1단편의 연장은 상기 연장 이합체의 절단 발생에 의해 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1-10 뉴클레오타이드(더욱 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드) 이격된 위치 이내에 위치한 비-염기 쌍 모이어티(non-base pairing moiety)를 포함한다.
PTO가 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 뉴클레오타이드 서열과 이중 가닥을 형성하는 것을 방지한다.
비-염기 쌍 모이어티(예컨대, 인위적인 미스매치 뉴클레오타이드)의 이용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 능력을 향상시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열에 PTO가 혼성화되는 경우, 비-염기 쌍 모이어티는 5’-말단 일부가 타겟 핵산서열과 이중가닥을 형성하는 것을 억제하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 상기 PTO 및 매치 템플레이트 혼성화물의 초기 절단 위치 및 상기 PTO 및 미스매치 템플레이트 혼성화물의 초기 절단 위치 간의 거리를 확대시킨다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티 서열의 도입은 초기 절단 위치를 조절할 수 있으며, 특히, 상기 PTO 및 미스매치 템플레이트 혼성화물의 초기 절단 위치를 조절할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 다운스트림에 위치한다.
비-염기 쌍 모이어티는 타겟 핵산서열 간에 염기 쌍을 형성하지 않는 어떠한 모이어티도 포함한다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 (ⅰ) 인위적인 미스매치 염기, 염기 쌍을 할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 염기 또는 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, (ⅱ) 염기 쌍을 형성 할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 뉴클레오타이드 또는 (ⅲ) 비-염기 쌍 형성 화합물이다(non-base pairing chemical compound).
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티는 알킬렌 기, 리보퓨라노실 나프탈렌, 데옥시 리보퓨라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결 및 아릴 포스포로아미데이트 연결을 포함한다. 종래 카본 스페이서 또한 비-염기 쌍 모이어티로 이용된다. 비-염기 쌍 모이어티로서의 유니버설 염기는 PTO의 절단 위치를 조정하는데 유용하다.
디옥시이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5’-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함하는 염기 쌍은 자연 염기들 간의 결합력 보다 낮은 결합력을 가지며, 유니버설 염기는 특정 혼성화 조건하에서 비-염기 쌍 모이어티로서 이용될 수 있다.
5’-말단 일부에 도입된 비-염기 쌍 모이어티는 바람직하게는 1-10개의 모이어티, 보다 바람직하게는 1-5개의 모이어티, 보다 더 바람직하게는 1-2개의 모이어티를 갖는다. 5’-말단 일부의 다수의 비-염기 쌍 모이어티는 연속적 또는 불연속적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 2-5개의 연속적인 모이어티를 갖는다.
바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 비-염기 쌍 형성 화합물이다.
일 구현예에 따르면, PTO의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 및 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드(보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 5 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1 뉴클레오타이드) 이격된 위치 이내에 위치한다.
일 구현예에 따르면, PTO는 블록커(blocker)로서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대하여 내성을 갖는 최소 1 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 초기 절단 위치를 조절하거나 하나의 위치 또는 위치들에서 절단을 방지하기 위해 위치한다.
뉴클레오타이드 변이의 검출 효율을 개선시키기 위해 본 발명은 PCR 클램핑 방법으로 실시될 수 있다. PNA를 사용하는 대표적인 PCR 클램핑 방법은 Henrik 등, Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993) 및 Luo 등, Nucleic Acid Research Vol. 34, No 2 e12 (2006)에 개시되어 있다. 예를 들어, PNA를 사용하는 PCR 클램핑 기술은 mutant type 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열은 증폭하지만 wild type 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열은 증폭하지 않는다. PCR 클램핑에 이어 PTOCE 어세이를 실시하면 뉴클레오타이드 변이를 보다 효과적으로 검출할 수 있다. 특히, PCR 클램핑 기술은 특이적-타입 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열만을 증폭하도록 하기 때문에 PCR 클램핑 기술과 본 발명의 방법을 결합하면 더욱 효과적인 방식으로 마이너리티-변이체(minority-variant)를 검출할 수 있다.
5’-말단 부위에 뉴클레오타이드 변이 구별 부위를 갖는 프로브가 미스매치 템플레이트와 혼성화되는 경우, 이의 5’-말단 부위는 특정 조건 하에서 단일 가닥을 형성할 수 있다. 상기 프로브는 PTO에 해당될 수 있다. 상기 시그널은 본 발명의 PTO 어세이에 의해 생성될 수 있다. 이러한 접근은 프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열의 검출에 유용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 타겟 핵산서열은 전-증폭된 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 상당히 높게 증가시킨다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 PTO에 대한 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
최소 2 종의 타겟 핵산서열이 동시에 검출(멀티플렉스)된다는 점에서 본 발명의 이점이 더욱 두드러진다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시되고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2 종(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, PTO는 최소 2 종(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 PTO를 포함하고, CTO는 최소 2 종(보다 바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 CTO를 포함하며, SO는 최소 2 종(바람직하게는 최소 3 종, 보다 더 바람직하게는 최소 5 종)의 SO를 포함한다.
특정 구현예에서, 최소 2종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 이에 대응하는 최소 2종의 시그널이 제공된다.
최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 상기 방법에서 상기 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 SO에 대한 최소 2종의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 PTO에 대한 최소 2종의 다운스트림 프라이머를 사용하여 실시된다.
본 발명은 액상 또는 고상에서 실시될 수 있다.
고상에 고정화된 SO를 이용한 타겟 검출
일 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되며 SO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다(참조: 도 6). 고상에서는, 고상 기질 상에서 제공되는 타겟 시그널을 측정한다.
고상 반응을 위하여, SO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단(바람직하게는, 3’-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적으로(바람직하게는 간접적) 고정화된다. 또한, SO는 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 고정화된 SO가 고상 기질 표면에 간접적으로 고정화 되는 경우, 적합한 링커를 이용한다. 본 발명에서 유용한 링커는 고상 기질 표면 상의 프로브 고정화에 이용되는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로써 SO 고정화에 이용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용될 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명의 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업계에 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 CTO는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다수의 고정화된 SO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 복수의 어드레서블 부위에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 CTO가 조립(fabricate)될 수 있다.
고상에서 실시하는 본 발명은, 고정화된 SO 상의 표지는 물리적으로 이격되어 있기 때문에 한 종류의 표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 따라서, 고상에서 본 발명에 의하여 검출가능한 타겟 핵산서열의 수는 제한되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 3’-말단 또는 5’-말단을 통하여 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키고, 상기 단편은 고상 기질 상에서 방출되며, 그로 인해 시그널 변화가 상기 고상 기질 상에서 발생하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생을 검출한다.
공초점 검출 장비(confocal detection devices)를 사용하는 경우, 상기 고상 기질 상에서의 시그널은 액상에서 현탁되는 표지의 영향없이 검출할 수 있다.
상기 고정화된 SO를 사용하는 본 발명은 혼성화, 절단 반응 및 증폭을 위해 단일 반응 용기에서 실시할 수 있으며, 실시간 방식으로 타겟 증폭에 의한 시그널 변화를 제공할 수 있다. 택일적으로, 상기 고정화된 SO의 절단 반응이 개별 용기에서 실시되는 경우, 고상에서 시간-의존적 시그널 변화는 실시간 방식으로 검출할 수 있다.
타겟 핵산서열의 증폭을 수반하는 일 구현예
본 발명은 타겟 핵산서열을 합성할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 타겟 핵산서열의 증폭을 동시에 함께 수행하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 각각은 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 그의 3’-말단이 블록킹되어 연장이 방지되며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 상기 5’-태깅 부위 또는 상기 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하여 연장이합체를 형성하며;
(e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 형성시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며;
(f) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme)를 이용하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단하여 상기 SO의 절단된 단편을 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 단계 (f)에서 절단 반응의 발생을 검출하는 단계로서; 상기 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정하여 실시하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예는 상기 상술된 본 발명의 단계들을 실시하기 때문에, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(g)를 모두 또는 일부 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 반응 반복은 타겟 핵산서열의 증폭을 동반한다. 특히, 상기 증폭은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2 종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 실시된다.
Ⅱ. 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 PCE-SC 어세이에 의한 타겟 핵산 검출
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하여 연장이합체를 형성하며;
(e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 형성시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며;
(f) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme)를 이용하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단하여 상기 SO의 절단된 단편을 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 단계 (f)에서 절단 반응의 발생을 검출하는 단계로서; 상기 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정하여 실시하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않는다는 것을 제외하고 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCE-SC 어세이와 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
흥미롭게도, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 본 발명의 방법은 실제로 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고도 PCE-SC 어세이를 통해 타겟 시그널을 제공한다.
본 발명의 방법을 위해 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 종래 효소가 사용될 수 있다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소 가운데 몇몇 효소는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는다(에컨대, Taq DNA 중합효소).
타겟 핵산서열의 증폭 및 PTO의 절단 효율을 고려할 때, 본 발명의 PCE-SC 어세이는 바람직하게는 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시한다.
타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열과 혼성화 되지 않으며;
(b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림에 위치하며, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→ 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하여 연장이합체를 형성하며;
(d) 최소 하나의 표지를 갖는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide: SO); 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 생성하며; 및
(e) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme); 상기 뉴클레오절단 효소는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 상기 연장서열에 혼성화 가능한 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 5’뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성시키며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 5’→ 3’방향으로 5’뉴클레아제에 의해 절단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 키트는 SO의 업스트림에 위치한 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥에 의존적인 5’뉴클레아제의 뉴클레오절단 활성에 의해 절단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 리보뉴클레아제이고, 상기 SO는 RNA 서열을 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA-RNA 혼성화 이합체를 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 리보뉴클레아제에 의해 절단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 제한 효소이고, 상기 SO는 상기 제한 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO는 상기 제한 효소에 의해 절단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA 이합체, RNA 이합체 또는 DNA-RNA 혼성화 이합체를 절단할 수 있는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 5’뉴클레아제는 5’뉴클레아제 활성 또는 FEN 뉴클레아제를 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지고, 상기 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자를 서로 분리시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 단일 표지를 가지고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 상기 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 형광 표지이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 5’-방향으로 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO에 연결된 최소 하나의 표지는 상기 SO의 5’-태깅 부위에 연결된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PTO, CTO 및/또는 SO는 그의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO의 절단을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 3’-말단 또는 5’-말단을 통해 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 키트는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위해 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예를 들어, PCR 반응)을 실시하는데 요구되는 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 양성 및 음성 대조군 반응을 실시하는데 필요한 시약들을 포함할 수 있다. 주어진 반응에서 사용되는 시약의 최적 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 키트는 일반적으로 상술한 성분들이 별도의 포장 또는 구획에 포함되도록 적용된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 타겟 핵산서열과 혼성화 하여 타겟 시그널을 제공하는 프로브를 사용하지 않는다. 본 발명은 타겟 핵산서열 존재에 의존적인 주형으로서 임의적인 서열을 갖는 상기 CTO 상에 연장가닥이 생성되는 방식으로 실시되고, 결국 프로브로서 상기 SO가 상기 연장가닥과 혼성화되고 절단되어 시그널을 제공한다. 본 발명은 PTO 혼성화 및 절단, CTO 혼성화 및 연장, 및 SO 혼성화 및 절단을 포함하는 일련의 반응을 이용하며, 이로 인해 본 발명의 특이성이 높이 향상된다.
(b) SO의 서열은 타겟 핵산서열의 고려 없이 선택될 수 있다. 따라서, 관심있는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성할 수 있다. 그에 따라, 본 발명은 5’뉴클레아제, RNase 및 제한효소와 같은 뉴클레오절단 효소에 의한 프로브 절단을 이용하는 종래의 타겟 검출 기술을 채택하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
(c) SO의 서열은 타겟 핵산서열에 관계없이 선택되기 때문에 시그널 생성에 대한 조건은 타겟 핵산서열에 대한 고려 없이 편리하게 조절될 수 있다. 이러한 특징들은 다중 타겟 검출에서 현저한 장점을 제공하며, 이는 멀티플렉스에 대한 반응 조건이 더 이상 곤란한 문제가 되지 않고 위양성 시그널의 발생을 막기 때문이다.
(d) 본 발명은 연장가닥/SO 혼성화물의 절단에 의해 제공되는 시그널을 측정하기 때문에 상기 연장가닥 및 SO 사이의 혼성화 유지를 위한 조건 하에서 시그널을 측정할 필요가 없다. 표지된 단편을 생성함으로써, 어떠한 온도조건에서도 상기 단편의 표지로부터 발생한 시그널을 검출할 수 있다. 그에 따라, 본 발명은 다양한 검출 조건 하에서 실시될 수 있다(예컨대, 광범위한 온도).
(e) 타겟 핵산서열과 직접적으로 혼성화하는 프로브를 이용하는 종래 기술에서 프로브는 상보적인 서열과 경쟁적인 방식으로 타겟 핵산서열에 결합한다. 반면, 본 발명은 이러한 경쟁적인 혼성화를 피할 수 있다. 본 발명에서는 템플레이트인 CTO를 이용하여 연장가닥만을 증폭시킬 수 있으므로 보다 더 효율적인 프로브 혼성화가 가능하고, 결국 효과적으로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 얻을 수 있다.
(f) PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 SO의 서열은 타겟 핵산서열을 고려하지 않고 선택될 수 있다. 이는 PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 SO에 대한 서열 pool을 미리 디자인할 수 있도록 한다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열을 고려하여 제조하여야 하나, CTO 및 SO의 경우는 타겟 핵산서열의 정보 또는 고려 없이 기성 방식(ready-made)으로 제조할 수 있다.
도 1은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에서 이용되는 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide), CTO(Captureing and Templating Oligonucleotide) 및 SO(Signaling Oligonucleotide)의 도식적 구조를 보여준다. PTO, CTO 및 SO의 3’-말단은 연장되는 것을 막기 위해 블로킹될 수 있다.
도 2는 PCE-SC 어세이의 일 구현예를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하며, 5’-뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 절단 효소에 의해 절단된다.
도 3은 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프로브를 사용하는 PCE-SC 어세이의 다른 일 구현예를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하며, 업스트림 프로브-의존적 5’-뉴클레아제 활성에 의해 절단된다.
도 4는 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프라이머를 사용하는 PCE-SC 어세이의 또 다른 일 구현예를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하며, 업스트림 프라이머-의존적 5’-뉴클레아제 활성에 의해 절단된다.
도 5는 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프라이머를 사용하는 PCE-SC 어세이의 또 다른 일 구현예를 도식적으로 보여준다. 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 SO는 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다.
도 6은 고상에서의 PCE-SC 어세이의 추가적인 구현예를 도식적으로 보여준다. 단일 표지로 표지된 SO는 그의 3’-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된다. SO는 5’-뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 절단 효소에 의해 절단된다.
도 7은 PO에 대한 업스트림 프라이머를 사용하는 PCE-SC 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae 유전자를 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하며, 5’-뉴클레아제에 의해 절단된다.
도 8은 PO에 대한 업스트림 프라이머 및 SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCE-SC 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae 유전자를 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 9는 PTO에 대한 업스트림 프라이머를 사용하지 않고 PCE-SC 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae 유전자를 검출한 결과이다. SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 10은 PTO에 대한 업스트림 및 다운스트림 프라이머 쌍을 사용하는 PCE-SC 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae 유전자를 검출한 결과이다. SO에 대한 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage; PCE-SC) 어세이의 평가
신규한 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage; PCE-SC) 어세이를 이용하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단, PTO 단편의 연장 및 SO의 절단을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않았고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG) 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 주형으로 이용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 표지 분자(FAM)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)를 포함한다.
도 2는 본 실시예에서 이용된 PCE-SC 어세이를 도식적으로 보여준다.
본 실시예에서 사용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO, CTO 및 SO 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGA
GCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GTCGTACCGAGATGCGCTTCTGATTCGTGCGCTGGATACCCTGACGATATCCAGCCAAG
CCGTCGTGCTGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO 5’-[FAM]TGCGCTGGATACCCTGACGATATCC[BHQ-1]-3’ (SEQ ID NO: 5)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 0.5 pmole, SO(SEQ ID NO: 5) 5 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.6 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 30 회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 변성 단계(95℃)에서 수행하였다.
변성 온도(95℃)에서의 검출은 검출된 시그널이 SO 절단에 의해 발생된 표지 단편으로부터 제공되도록 한다.
도 7에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 주형이 존재할 경우 검출되었다. 주형, PTO, CTO 또는 SO가 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
실시예 2: 업스트림 올리고뉴클레오타이드-의존적 SO 절단을 이용한 PCE-SC 어세이의 평가
본 발명자들은 SO의 업스트림에 위치한 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide; UO)를 이용하는 PCE-SC 어세이를 통해 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 추가적으로 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단, PTO 단편의 연장, UO의 연장 및 SO의 절단을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. NG 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 주형으로 사용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(FAM)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)를 포함한다. UO는 SO의 업스트림에 위치하며, UO의 연장 생성물은 Taq DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 SO의 절단을 유도한다.
도 4는 본 실시예에서 이용된 PCE-SC 어세이를 도식적으로 보여준다.
본 실시예에서 사용된 합성 주형, 업스트림 프라이머, PTO, CTO, SO 및 UO 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGA
GCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GTCGTACCGAGATGCGCTTCTGATTCGTGCGCTGGATACCCTGACGATATCCAGCCAAG
CCGTCGTGCTGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO 5’-[FAM]TGCGCTGGATACCCTGACGATATCC[BHQ-1]-3’ (SEQ ID NO: 5)
UO 5’-TACCGAGATGCGCTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 6)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 0.5 pmole, SO(SEQ ID NO: 5) 5 pmole, UO(SEQ ID NO:6) 3 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.6 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 30 회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 변성 단계(95℃)에서 수행하였다. 변성 온도(95℃)에서의 검출은 검출된 시그널이 SO 절단에 의해 발생된 표지 단편으로부터 제공되도록 한다.
도 8에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 주형이 존재할 경우 검출되었다. 주형이 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
실시예 3: PTO의 업스트림 프라이머-독립적 절단을 이용한 PCE-SC 어세이의 평가
본 발명자들은 PTO의 업스트림에 위치한 업스트림 프라이머를 사용하지 않는 PCE-SC 어세이를 통해 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 추가적으로 평가하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 PTO의 절단, PTO 단편의 연장, UO의 연장 및 SO의 절단을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. NG 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 주형으로 사용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(FAM)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)를 포함한다. 본 실시예에서 PTO는 상기 PTO의 업스트림에 위치한 업스트림 프라이머의 관여 없이 Taq DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 절단된다. UO는 SO의 업스트림에 위치하며, UO의 연장 생성물은 Taq DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 SO의 절단을 유도한다.
본 실시예에서 사용된 합성 주형, PTO, CTO, SO 및 UO 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGA
GCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GTCGTACCGAGATGCGCTTCTGATTCGTGCGCTGGATACCCTGACGATATCCAGCCAAG
CCGTCGTGCTGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO 5’-[FAM]TGCGCTGGATACCCTGACGATATCC[BHQ-1]-3’ (SEQ ID NO: 5)
UO 5’-TACCGAGATGCGCTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 6)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG 유전자에 대한 합성 주형(SEQ ID NO: 1) 2 pmole, PTO(SEQ ID NO: 3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 0.5 pmole, SO(SEQ ID NO: 5) 5 pmole, UO(SEQ ID NO:6) 3 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.6 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 30 회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 변성 단계(95℃)에서 수행하였다. 변성 온도(95℃)에서의 검출은 검출된 시그널이 SO 절단에 의해 발생된 표지 단편으로부터 제공되도록 한다.
도 9에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 주형이 존재할 경우 검출되었다. 주형이 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
실시예 4: PCE-SC 어세이를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명자들은 PCE-SC 어세이를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는지를 추가적으로 평가하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단, PTO 단편의 연장, UO의 연장 및 SO의 절단을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. NG 유전자의 지노믹 DNA를 타겟 주형으로 사용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(FAM)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)를 포함한다. UO는 SO의 업스트림에 위치하며, UO의 연장 생성물은 Taq DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 SO의 절단을 유도한다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO, SO 및 UO 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 7)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GTCGTACCGAGATGCGCTTCTGATTCGTGCGCTGGATACCCTGACGATATCCAGCCAAG
CCGTCGTGCTGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO 5’-[FAM]TGCGCTGGATACCCTGACGATATCC[BHQ-1]-3’ (SEQ ID NO: 5)
UO 5’-TACCGAGATGCGCTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 6)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NG의 지노믹 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2) 10 pmole, 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 7) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO:3) 5 pmole, CTO(SEQ ID NO: 4) 0.5 pmole, SO(SEQ ID NO: 5) 5 pmole, UO(SEQ ID NO:6) 3 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.6 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 40 회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 변성 단계(95℃)에서 수행하였다. 변성 온도(95℃)에서의 검출은 검출된 시그널이 SO 절단에 의해 발생된 표지 단편으로부터 제공되도록 한다.
도 10에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 주형이 존재할 경우 검출되었다. 주형이 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEEGENE, INC. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE BY PTO CLEAVAGE AND EXTENSION-DEPENDENT SIGNALING OLIGONUCLEOTIDE CLEAVAGE <130> PI140010 <150> KR 10-2012-0040864 <151> 2012-04-19 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-T <400> 1 aaatatgcga aacacgccaa tgaggggcat gatgctttct ttttgttctt gctcggcaga 60 gcgagtgata ccgatccatt gaaaaa 86 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-R <400> 2 caatggatcg gtatcactcg c 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO <400> 3 acgacggctt ggctgcccct cattggcgtg tttcg 35 <210> 4 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO <400> 4 gtcgtaccga gatgcgcttc tgattcgtgc gctggatacc ctgacgatat ccagccaagc 60 cgtcgtgctg t 71 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-SO <400> 5 tgcgctggat accctgacga tatcc 25 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UO <400> 6 taccgagatg cgcttctg 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-F <400> 7 tacgcctgct actttcacgc t 21

Claims (51)

  1. 다음의 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’→ 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
    (e) 상기 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide: SO)를 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 형성시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며;
    (f) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme)를 이용하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단하여 상기 SO의 절단된 단편을 생성시키는 단계; 및
    (g) 상기 단계 (f)에서 상기 절단 반응의 발생을 검출하는 단계로서; 상기 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정하여 실시하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 상기 연장 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 5’뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 5’뉴클레아제에 의해 5’→ 3’방향으로 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 단계 (f)는 상기 SO의 업스트림에 위치한 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 연장가닥에 의존적인 상기 5’뉴클레아제의 뉴클레오절단 활성에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 리보뉴클레아제이고, 상기 SO는 RNA 서열을 포함하며, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA-RNA 혼성화물 이합체를 생성하고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 리보뉴클레아제에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 제한 효소이고, 상기 SO는 상기 제한 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하며, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 상기 제한 효소에 대한 절단 위치를 생성하고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 제한 효소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)에서 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA 이합체, RNA 이합체 또는 DNA-RNA 혼성화물 이합체를 절단할 수 있는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (f)에서 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 5’뉴클레아제는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 뉴클레오절단 효소에 대한 상기 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO의 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 단일 표지를 갖고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO절단의 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 단일 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 그의 5’-방향으로 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단은 상기 SO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위 일부를 포함하는 단편을 방출하며, 상기 SO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO와의 혼성화 및 연장이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO, 상기 CTO, 상기 SO, 상기 PTO 및 상기 CTO, 상기 PTO 및 상기 SO, 상기 CTO 및 상기 SO, 또는 상기 PTO, 상기 CTO 및 상기 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통해 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 CTO의 캡처링 부위는 그의 5’-말단 부위에 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 1-10 개의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 그의 3’-말단 또는 5’-말단을 통해 고상 기질 표면에 고정화되어 있고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하고, 상기 단편은 상기 고상 기질 상에서 방출되며, 상기 고상 기질 상에서 시그널 변화가 발생하여 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단의 발생을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (d)와 (e) 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(g) 전체 또는 일부를 변성을 포함하여 반복적으로 추가 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(g)는 하나의 반응용기에서 실시하거나 또는 상기 단계 (a)-(g) 중 일부는 별도의 반응용기에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시되며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)에서 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 다음의 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC) 어세이에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머는 각각 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있으며;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 프라이머 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’→ 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하여 연장이합체를 형성하며;
    (e) 상기 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide: SO)를 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 형성시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며;
    (f) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme)를 이용하여 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단하여 상기 SO의 절단된 단편을 생성시키는 단계; 및
    (g) 상기 단계 (f)에서 절단 반응의 발생을 검출하는 단계로서; 상기 검출은 상기 SO에 연결된 표지로부터 제공되는 시그널을 측정하여 실시하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(g) 전체 또는 일부를 변성을 포함하여 반복적으로 추가 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 다음을 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage: PCE-SC)에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트:
    (a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않으며;
    (b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림에 위치하며, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→ 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하여 연장이합체를 형성하며;
    (d) 최소 하나의 표지를 갖는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide: SO); 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 연장가닥/SO 혼성화물을 생성하며; 및
    (e) 뉴클레오절단 효소(nucleolytic enzyme); 상기 뉴클레오절단 효소는 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO를 절단한다.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 상기 연장 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 5’뉴클레아제에 대한 절단 위치를 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 5’뉴클레아제에 의해 5’→ 3’방향으로 절단되는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 키트는 상기 SO의 업스트림에 위치한 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥에 의존적인 상기 5’뉴클레아제의 뉴클레오절단 활성에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 리보뉴클레아제이고, 상기 SO는 RNA 서열을 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA-RNA 혼성화물 이합체를 생성하고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 리보뉴클레아제에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 제한 효소이고, 상기 SO는 상기 제한 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO는 상기 제한 효소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 31 항에 있어서, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 형성은 DNA 이합체, RNA 이합체 또는 DNA-RNA 혼성화물 이합체를 절단할 수 있는 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치를 생성하는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오절단 효소는 5’뉴클레아제이고, 상기 5’뉴클레아제는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 뉴클레오절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 단일 표지를 갖고, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 연장가닥/SO 혼성화물의 상기 SO 절단의 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 단일 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 그의 5’-방향으로 상기 연장가닥에 비-상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 SO에 연결된 최소 하나의 표지는 상기 SO의 5’-태깅 부위에 연결되는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제 31 항에 있어서, 상기 PTO, 상기 CTO, 상기 SO, 상기 PTO 및 상기 CTO, 상기 PTO 및 상기 SO, 상기 CTO 및 상기 SO, 또는 상기 PTO, 상기 CTO 및 상기 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제 31 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
  47. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 상기 타겟 핵산 서열과 혼성화된 상기 PTO를 절단하기 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 그의 3’-말단 또는 5’-말단을 통해 고상 기질 표면에 고정화되어 있고, 상기 SO는 단일 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  49. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 사용되고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하고, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  50. 제 31 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 키트는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위해 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  51. 제 31 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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