KR20240058112A - 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출 - Google Patents
합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 민감도로 타겟 서열을 검출할 수 있다.
Description
본 개시는 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 검출 방법이 널리 사용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로서, 헤어핀 구조를 갖는 이중표지된 프로브를 이용한 Molecular beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체 및 수용체로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호)이 있다. 또한, 이중표지된 프로브와 DNA 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
대안적인 방법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재 시 형성되는 이합체를 이용한 실시간 검출 방법이 제안되어왔다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법(WO 2012/096523), PCEC(PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage) 방법(WO 2012/134195), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-SC(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage) 방법(WO 2013/157821), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818), PCE-IH(PTO Cleavage and Extension-dependent Immobilized Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2015/008985) 및 PTOCE-E(PTO Cleavage and Extension-dependent extension) 방법(WO 2019/0666461).
또 다른 방법으로, 멜팅 커브 분석과 조합된 이중 퀀칭 분석(dual quenching assay)을 이용한 실시간 검출 방법이 제안되었다 (WO 2016/101959).
전술한 이합체를 이용한 실시간 검출 방법 및/또는 이중 퀀칭 분석을 이용한 실시간 검출 방법은 태그 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프로브 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(PTO) 등)를 이용한다. 상기 태그 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 단편(예컨대, PTO 단편)을 방출한다. 이어서, 상기 방법은 상기 단편과 상기 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(CTO), 캡처링 앤드 퀀칭 올리고뉴클레오타이드(CQO) 등) 간의 혼성화를 이용한다. 상기 방법은 단편 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드의 서열을 타겟 핵산 서열의 고려없이 인위적으로 자유롭게 설계할 수 있는 장점이 있다.
하지만, 상기 단편은 태그 올리고뉴클레오타이드의 일부로서, 타겟 핵산 검출 방법에 사용되는 다른 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 상대적으로 길이가 짧으므로 특정 반응 조건에서 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드와 낮은 혼성화 효율을 나타낼 가능성이 있다. 또한, 상기 단편은 타겟 핵산 서열뿐만 아니라 비타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않도록 설계됨에도 불구하고, 예기치 않게 샘플 내에 존재하는 미지의 비타겟 핵산 서열과 혼성화될 수도 있다. 이러한 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 낮은 혼성화 효율은 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 감소로 이어질 수 있고, 단편과 비타겟 핵산 서열 간의 혼성화 역시 단편을 소모시키거나 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 방해하여 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 감소를 야기할 수 있다.
따라서, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키기 위해, 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 및/또는 특이성을 개선할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 태그 올리고뉴클레오타이드 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 타겟 핵산 검출 방법에 있어서, 신호 검출을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 민감도로 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있게 해준다.
따라서, 본 개시의 목적은 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 다른 목적은 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 개시의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 개시의 일 양태에 따르면, 본 개시는 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며, 상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고, 상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
(b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
(i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는 (ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
(c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄.
본 발명자들은 태그 올리고뉴클레오타이드 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 타겟 핵산 검출 방법에 있어서, 신호 검출을 개선하고자 예의 연구 노력하였다.
특히, 본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 정확성으로 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있게 해준다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장가닥을 생성하고, 상기 연장가닥이 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 태깅 부위의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO는 프로브이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타낸다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 하기 단계를 포함한다: (c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고; (c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며; (c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 연장 가닥의 존재를 나타낸다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있으며, 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터의 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부는 변성을 포함하여 반복된다.
본 개시의 다른 양태에 따르면, 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공한다:
(a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며, 상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고, 상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
(b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
(c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 개시의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 사용하는 경우, 타겟 의존적 단편과 FHO 간의 혼성화물(이합체) 높은 Tm을 가지며 결합 친화성이 향상된다. 이는 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율을 높여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(b) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 사용하는 경우, 타겟 의존적 단편과 FHO 간의 이합체의 결합 특이성이 향상된다. 이는 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열과 혼성화되는 것을 방지하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(c) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 경우, TO의 태깅 부위의 Tm을 유지하면서 길이를 축소시킬 수 있다. 길이가 축소된 TO의 태깅 부위는 FHO의 캡처링 부위와의 결합 친화성은 유지하면서 비타겟 핵산 서열과 혼성화시 Tm이 크게 낮아져 결합 친화성이 저하되며, 따라서 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열과 혼성화되는 것을 방지하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(d) 종래의 비자연 염기를 포함하지 않는 TO를 이용하는 방법은 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 복수의 타겟 핵산 서열의 다양성에 의해, 복수의 TO의 태깅 부위가 모든 타겟 핵산 서열에 대한 비상보성을 확보하는데 어려움이 있었다. 그러나, 본 개시의 방법은 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 도입함으로써, 모든 타겟 핵산 서열과 무관하게 타겟 핵산 서열에 대한 비상보성을 획득할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 제1 형태의 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 2는 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 제2 형태의 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 3 및 도 4는 실시예 2의 실시간 PCR의 결과를 나타낸다.
도 2는 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 제2 형태의 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 3 및 도 4는 실시예 2의 실시간 PCR의 결과를 나타낸다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 개시의 일 양태에서, 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며,
상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
(b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
(i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는
(ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
(c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄.
본 개시의 구성 요소를 을 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b), (i), (ii) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
본 개시를 각 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a) : 타겟 핵산 서열과 태그 올리고뉴클레오타이드의 반응
본 개시에 따르면, 우선, 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시킨다.
본원에서 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본원에서 사용된 용어 "프로브"는 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 부위 또는 부위들을 포함하는 단일가닥 핵산 분자이다.
본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 타겟 핵산 서열(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다.
특히, 프로브 및 프라이머는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 개시에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도의 길이를 가져야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 용어 "혼성화"는 소정의 혼성화 조건 또는 엄격 조건하에 2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드가 상보적인 뉴클레오타이드 서열 간의 비공유 결합을 통해 이중-가닥을 형성하는 것을 지칭한다.
특히, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드가 다른 올리고뉴클레오타이드에 대한 "혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다"는 표현은 상기 하나의 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부가 다른 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부와의 상호 혼성화에 필요한 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다는 것을 의미한다.
또한, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드 내의 일부 부위와 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 언급할 때, 상기 일부 부위를 개별적인 올리고뉴클레오타이드로 간주하여 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 표현할 수 있다.
혼성화는 2개의 핵산 서열 간에 혼성화가 일어나는 부위(이중-가닥을 형성하는 부위)에서의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 미스매치(mismatch) 염기(예를 들어, 1-4의 미스매치)가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본원에서 사용된 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 및 "완전히 상보적(perfectly complementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로, 완전히 상보적인 것을 의미한다.
반면, 본원에서 사용된 용어 "비-상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 특정 서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)" 및 "완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로, 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함한다.
타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 '태깅 부위'는 '태그 서열', '플랩 서열', 또는 '테일(tail) 서열'등으로도 불린다. 상기 TO의 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 한 임의적으로 서열을 선택할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 TO의 타겟팅 부위의 5'말단, 3'말단 또는 중앙에 위치할 수 있다. 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 TO의 타겟팅 부위의 5'말단에 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 구아닌(G), 시토신(C) 아데닌(A), 티민(T) 및 우라실(U)과 같은 자연적(naturally occurring) 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 하나 이상의 합성 비자연 염기(synthetic unnatural base)를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위(구체적으로, 5'-태깅 부위)의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 위치할 수 있다. 구체적으로, 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내, 4 뉴클레오타이드 이내, 3 뉴클레오타이드 이내, 2 뉴클레오타이드 이내에 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다. 예컨대, 상기 TO의 태깅 부위가 n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 뉴클레오타이드가 이격된 위치는 태깅부위의 5'에서 3' 순서로, n-1 번째 뉴클레오타이드를 가리키며, 5 뉴클레오타이드가 이격된 위치는 n-4 번째 뉴클레오타이드를 가르킨다.
본 발명자들은 상기 TO의 태깅 부위(구체적으로, 5'-태깅 부위)의 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드(즉, n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 태깅 부위 중 5'에서 3' 순서로 n번째 뉴클레오타이드) 위치에 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 단계 (c)에서 검출에 대한 민감도, 특히, 제1 이합체 내의 연장가닥 검출에 대한 민감도가 낮아지는 결과를 얻었다. 이러한 결과는 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기가 존재하는 경우, (i) 뉴클레아제의 절단부위에 위치한 비자연 염기로 인해 절단 효율이 감소되는 현상, (ii) FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 3'-말단 즉, 중합효소의 연장 시작 부위에 위치한 비자연 염기가 중합효소의 연장 반응에 있어서 일반적인 기질로서 수월하게 인식되지 않음으로 인해 연장 효율이 감소되는 현상, (iii) 상기 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치의 합성 비자연 염기가 맞은 편에 위치하는 타겟 핵산 서열 내의 자연 염기에 대하여 자연 염기 간의 반발력 보다 강한 반발력을 나타내어, 타겟팅 부위의 5'-말단까지 3'-태깅 부위와 함께 들려(즉, 타겟 핵산 서열에 혼성화하지 못함) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단위치가 달라지거나 타겟 의존적 단편의 3'말단의 서열이 달라져, FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율이 감소되는 현상에 기인하는 것으로 추측된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 번째 뉴클레오타이드 내지 5 번째 뉴클레오타이드, 2 번째 뉴클레오타이드 내지 4 번째 뉴클레오타이드 또는 2 번째 뉴클레오타이드 내지 3 번째 뉴클레오타이드에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비자연 염기"는 염기쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연적 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비자연 염기"는 모화합물(mother compound)로서 자연적 염기와 상이한 염기쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비자연 염기들 간의 염기쌍은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함할 수 있다. 또한, 비자연 염기들 간의 염기쌍은 특정한 방식으로도 형성된다.
비자연 염기의 특정한 예는 다음 염기들의 염기쌍 조합을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, M/N 및 5FM-5SICS (참조 미국특허 제7,422,850호).
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 합성 비자연 염기를 더 포함할 수 있으며, 구체적인 예로, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 합성 비자연 염기를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 추가적인 합성 비자연 염기는 태깅 부위의 3'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드를 제외한 사이트에 위치한다. 예컨대, 상기 TO의 태깅 부위가 n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 상기 추가적인 합성 비자연 염기는 태깅 부위 중 5'에서 3' 순서로 n번째 뉴클레오타이드에는 위치할 수 없다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기들은 연속적으로 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 20 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 15 뉴클레오타이드, 1 내지 10 뉴클레오타이드, 1 내지 5 뉴클레오타이드, 2 내지 15 뉴클레오타이드, 2 내지 10 뉴클레오타이드 또는 2 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있으며, 보다 구체적인 예로, 1 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드 또는 5 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기는 모두 또는 일부가 동일할 수 있다. 예컨대, 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기 모두가 동일한 비자연 염기일 수 있다. 다른 예로, 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기 중 일부는 동일한 종류의 비자연 염기(예컨대, S)이고 나머지는 다른 종류의 비자연 염기(예컨대, Z)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기는 모두 상이할 수 있다.
TO는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, TO의 길이는 15 내지 150 뉴클레오타이드, 15 내지 100 뉴클레오타이드, 15 내지 80 뉴클레오타이드, 15 내지 60 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 20 내지 150 뉴클레오타이드, 20 내지 100 뉴클레오타이드, 20 내지 80 뉴클레오타이드, 20 내지 60 뉴클레오타이드, 20 내지 50 뉴클레오타이드, 30 내지 150 뉴클레오타이드, 30 내지 100 뉴클레오타이드, 30 내지 80 뉴클레오타이드, 30 내지 60 뉴클레오타이드, 30 내지 50 뉴클레오타이드, 35 내지 100 뉴클레오타이드, 35 내지 80 뉴클레오타이드, 35 내지 60 뉴클레오타이드 또는 35 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. TO의 타겟팅 부위가 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, TO의 타겟팅 부위는 10 내지 100 뉴클레오타이드, 10 내지 80 뉴클레오타이드, 10 내지 50 뉴클레오타이드, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 10 내지 30 뉴클레오타이드, 15 내지 100 뉴클레오타이드, 15 내지 80 뉴클레오타이드, 15 내지 50 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 15 내지 30 뉴클레오타이드, 20 내지 100 뉴클레오타이드, 20 내지 80 뉴클레오타이드, 20 내지 50 뉴클레오타이드, 20 내지 40 뉴클레오타이드 또는 20 내지 30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 태깅 부위는 FHO의 캡처링 부위에 특이적으로 혼성화 및/또는 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드, 5 내지 40 뉴클레오타이드, 5 내지 30 뉴클레오타이드, 5 내지 20 뉴클레오타이드, 5 내지 15 뉴클레오타이드, 10 내지 50 뉴클레오타이드, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 10 내지 30 뉴클레오타이드, 10 내지 20 뉴클레오타이드, 10 내지 15 뉴클레오타이드, 15 내지 50 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 15 내지 30 뉴클레오타이드 또는 15 내지 20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 구체적인 구현예에 있어서, 상기 TO는 프로브일 수 있다.
일 구현예에 있어서, TO의 3'-말단은 3'-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다.
일 구현예에 있어서, TO의 3'-말단은 "블록킹"되어 그의 연장이 방지될 수 있다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3'-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함한다. 구체적인 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 반응은 상기 타겟 핵산 서열에 상기 TO를 혼성화 시킨 다음, 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 상기 TO를 절단하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함한다. 특히, 타겟 핵산 서열과 TO의 혼성화는 TO의 타겟팅 부위가 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소를 이용하여 실시되거나 또는 별도의 뉴클레아제를 이용하여 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 뉴클레아제는 자연 발생, 비변형 또는 변형된 뉴클레아제 일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO는 TO의 절단을 위한 조건 하에서, 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 절단되어 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TO의 절단을 위한 조건"은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO의 절단이 발생되는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, TO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
TO가 타겟 핵산 서열에 혼성화 되는 경우, TO의 타겟팅 부위는 혼성화에 포함되나, TO의 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않고 단일-가닥을 형성한다. 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 절단할 수 있다. 예컨대, 상기 효소의 예는 5'-뉴클레아제 및 3'-뉴클레아제, 특히 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소일 수 있다. 예컨대, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 구체적으로, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 구체적으로, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 개시는 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5'플랩-특이적 뉴클레아제(5'flap-specific nuclease)일 수 있다. 예컨대, FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시될 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 TO에 비해 5' 방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시에서 사용되는 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO를 기준으로 업스트림에 위치하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 타겟 핵산 서열이 이중 가닥인 경우, 이중 가닥 중 한 가닥에 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 TO가 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림에 TO가 위치한다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO가 혼성화된 타겟 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 타겟 핵산 서열에 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 혼성화시키는 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 그의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함할 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 TO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (i) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ii) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 TO의 절단반응을 유도하는 데 충분할 정도로 TO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이 TO를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 TO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 TO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 TO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 TO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 TO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 TO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 함께 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어 "근접(adjacent)"은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 타겟팅 부위로부터 1 내지 30 뉴클레오타이드, 1 내지 20 뉴클레오타이드 또는 1 내지 15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 함께 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "이격(distant)"은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브일 수 있다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다. 특히, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 업스트림 프라이머인 경우, 이는 정방향(forward) 프라이머로도 지칭될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장-의존적 방식으로 상기 TO의 절단이 유도되는 경우, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 및 연장하여 그의 연장가닥을 생성하는 반응을 포함할 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장가닥은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 그의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출할 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장 가닥을 생성하는 반응은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 실시될 수 있다.
TO 및 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 TO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 선택적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 예컨대, 겹치는 서열은 1 내지 10 뉴클레오타이드 길이이며, 구체적으로 1 내지 5 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로 1 내지 3 뉴클레오타이드이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 상기 TO의 절단 반응에서 3'-타겟팅 부위는 5'-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3'-타겟팅 부위의 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO의 절단을 유도하여 TO의 태깅 부위 또는 TO의 태깅 부위의 일부를 포함하는 타겟 의존적 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 개시에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
TO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
일 구현예에 있어서, TO의 절단 위치는 태깅 부위의 위치, 예컨대, 타겟팅 부의의 5'-, 3'- 또는 중앙에 위치하는지에 따라 다양해질 수 있다. 예컨대, 상기 TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 TO의 혼성화 부위(3'-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5'-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 5'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 또 다른 예로, 상기 TO가 5'-타겟팅 부위 및 3'-태깅 부위를 포함하는 경우, 절단 위치는 (i) TO의 혼성화 부위(5'-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(3'-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site), (ii) TO의 태깅 부위의 5'-말단으로부터 5'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치(즉, TO의 5'-타겟팅 부위의 3'-말단 일부에 위치) 및/또는 (iii) TO의 3'-태깅 부위의 5'-말단으로부터 3'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시할 수 있다. 상기 다운스트림 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머로도 지칭될 수 있다. 다운스트림 프라이머는 업스트림 프라이머 및 TO가 혼성화되는 타겟 핵산 가닥에 상보적인 다른 핵산 가닥에 혼성화된다. 특히, 다운스트림 프라이머는 TO가 혼성화된 타겟 핵산 가닥의 부위에 상보적인 다른 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다. 다운스트림 프라이머는 TO가 혼성화될 수 있는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성시켜 본 발명의 검출 민감도를 향상시킨다.
일 구현예에 있어서, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 서로 상이한 효소일 수 있다.
상기 TO의 절단 반응에 의해 방출된 타겟 의존적 단편은 상기 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함한다.
본 명세서에서 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단을 언급하면서 사용하는 용어 "TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편"은 (i) 태깅 부위, (ii) 태깅 부위의 일부, (iii) 5'- 태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부 및 (iv) 5'-타겟팅 부위의 3'-말단 및 3'-태깅 부위를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 TO의 태깅 부위의 일부, 타겟팅 부위의 일부 및 FHO의 캡처링 부위의 일부와 같이, TO 또는 FHO를 언급하면서 사용되는 용어 "일부(part)"는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10 또는 1 내지 5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 구체적인 예로, 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드일 수 있다.
단계 (b) : 이합체의 형성
이어서, 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 TO로부터 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편은 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)와 반응하여 이합체를 형성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함한다.
본 개시에서 사용되는 비자연 염기쌍은 비자연 염기들 간에 형성된 염기쌍을 의미한다. 구체적으로, 본 개시에서 사용되는 비자연 염기쌍은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing) 과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 합성 비자연 염기들 간에 형성된 비자연 염기쌍을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 본 개시에서 사용되는 상기 합성 비자연 염기들 간에 형성된 비자연 염기쌍은 자연 염기들 간에 형성된 자연 염기쌍 보다 결합 친화성이 높으며(Zunyi Yang, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 34, No. 21, 2006), 이로 인해, 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하는 타겟 의존적 단편과 상기 제2 합성 비자연 염기를 포함하는 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO 간의 결합 친화성이 증가한다. 소정의 혼성화 조건하에서, 상기 합성 비자연 염기는 이에 상보적인 합성 비자연 염기와 비자연 염기쌍을 형성할 수 있다. 또한, 왓슨-크릭 쌍 규칙을 따르지 않는 비자연 염기쌍을 포함할 수 있다. 예컨대, 자연 염기쌍과는 상이한 결합 방법(예컨대, 비-수소 결합 등)에 의해 자연 염기쌍과는 다른 결합 친화성을 나타내는 것을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
일반적으로, 왓슨-크릭 쌍 규칙(Watson-Crick pairing rules)은 (i) 크기 상보성(크기가 큰 퓨린과 크기가 작은 피리미딘 쌍) 및 (ii) 수소 결합 상보성(수소 결합 공여체와 수소 결합 수용체의 쌍)의 두 가지 상보성 규칙을 따른다 (US 10,865,431).
본원에서 사용되는 표현 "비자연 염기쌍은 왓슨-크릭 염기쌍과는 다른 결합 친화성을 나타낸다"는 것은 G-C 및 A-T(U)와 같은 자연적 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과 비교하여, 상기 비자연 염기쌍 간의 수소 결합의 수, 수소 결합의 세기 등이 상이하여, 자연 염기쌍의 결합 친화성과는 상이한 결합 친화성을 나타내는 것을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 G-C 및 A-T(U)와 같은 자연적 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 합성 비자연 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍을 포함한다.
상기 비자연 염기쌍의 예로는 US 5,432,272, US 5,965,364 US 6,001,983, US 6,037,120, US 6,140,496, US 6,627,456 및 US 6,617,106에서 제시한 8가지 유형의 비자연 염기로부터 형성되는 4가지 유형의 상호 독점적 쌍(mutually exclusive pair)을 포함할 수 있다. 상기 8가지 유형의 비자연 염기는 헤테로사이클 고리 시스템 및 수소 결합 패턴에 따라 구분되어지며, pyAAD(S), pyDDA(Z), pyADD(V), pyDAD(K), puDDA(B), puAAD(P), puDAA(J) 및 puADA(X)를 포함한다. 여기서, py는 피리미딘 유사(pyrimidine-like) 헤테로사이클 고리 시스템(heterocyclic ring system), pu는 퓨린 유사(purine-like) 헤테로사이클 고리 시스템, D는 수소 결합 공여체(hydrogen bond dornor) 그룹, A는 수소 결합 수용체(hydrogen bond acceptor) 그룹을 의미한다. 예컨대, 자연 염기쌍의 예인 C-G의 경우, pyDAA-puADD 쌍으로 표기할 수 있다. 상기 4가지 유형의 상호 독점적 쌍은 pyAAD-puDDA(S-B) 쌍, pyDDA-puAAD(Z-P) 쌍, pyADD-puDAA(V-J) 쌍 및 pyDAD-puADA(K-X) 쌍을 포함한다. 상기 8가지 유형의 비자연 염기는 각 유형별 헤테로사이클 고리 시스템(피리미딘 유사 또는 퓨린 유사)의 여부 및 수소 결합 공여체 그룹 및 수용체 그룹 여부를 만족하는 한 다양한 구조를 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 S-B 쌍의 대표적인 예는 isoC-isoG가 있으며, isoC는 이소시토신(isocytosine) 또는 데옥시이소시토신(dexoyisocytosine)을 지칭하며, pyAAD 의 구조를 가진다. isoG는 이소구아노신(isoguanosine) 또는 데옥시이소구아노신(deoxyisoguanosine)을 지칭하며, puDDA 의 구조를 가진다. isoC-isoG 염기쌍에 관한 상세한 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌[C. Y. Switzer, et al., Biochemistry, vol. 32, no. 39, pp. 10489-10496, 1993; J. A. Piccirilli et al., Nature, vol. 343, no. 6253, pp. 33-37, 1990; M. J. Moser et al., Clinical Chemistry, vol. 49, no. 3, pp. 407-414, 2003; Johnson SC et al., Nucleic Acids Res 2004, 32(6): 1937-1941]에서 확인될 수 있다.
Z-P의 대표적인 예로서, Z는 6-amino-5-nitro-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone일 수 있으며, P는 2-amino-8-(2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one일 수 있다. Z-P 염기쌍은 복제당 99.8%의 비자연 염기쌍 선택성을 나타내며, Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR에서 증폭당 자연 염기 맞은편에 0.2%의 오혼입(misincorporation)을 나타낸다(Yang et al., 2007, 2011; Robert W. Molt. Jr. et al., Nucleic Acids Res.. 2017, 45(7): 3643-3653).
V-J의 대표적인 예로서, V는 6-aminopyrazin-2-one ring, J는 2'-deoxy-5-aza7-deazaisoguanosine일 수 있으며, K-X의 대표적인 예로서, K는 2,4-diaminopyrimidine, X는 2'-deoxyxanthosine일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 수소 결합을 기반으로 하는 왓슨-크릭 염기쌍과는 다른, 비-수소 결합을 기반으로 하는 비자연 염기쌍도 포함할 수 있다. 예컨대, hydrophobic and shape complementary interaction에 기반한 비자연 염기쌍(예컨대, Q-Pa, Ds-Pa, Ds-Pn, Dss-Pn) 및 hydrophobic and packing interaction에 기반한 비자연 염기쌍(예컨대, 5SICS-MMO2, 5SICS-5FM, 5SICS-NaM)을 포함할 수 있다. 이에 관한 상세한 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌[Filip Wojciechowski et al., Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5669-5679]에서 확인될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 Pa는 pyrrole-2-carbaldehyde 을 지칭하고, Ds는 7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine을 지칭하며, Q는 9-methyl-1-H-imidzo[(4,5-b)]pyridine, Pn은 2-nitropyrrole, Dss는 7-(2,2-bithien-5-yl)-imidazo[4,5-b]pyridine, Px는 2-nitro-4-propynylpyrrole, MMO2는 2-methoxy 4-methyl benzene, 5SICS는 5-Sulfo-isocarbostyril, 5FM은 5-fluoro-4-methyl-2-methoxybenzene, NaM는 2-methoxy naphthalene을 각각 지칭한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기일 수 있다.
일 구현에에 있어서, 제1 합성 비자연 염기는 사용하고자하는 비자연 염기쌍을 구성하는 2개의 비자연 염기 중에서 비자연 염기쌍에 대한 선택성(selectivity of an unnatural base pairing)을 고려하여, 2개의 비자연 염기 중 어느 하나를 제1 합성 비자연 염기로 선택할 수 있다. 구체적으로, 비자연 염기쌍 중 염기쌍에 대한 선택성이 높은 염기(즉, 상보적인 비자연 염기 이외의 자연 염기를 포함한 다른 염기와 염기쌍을 형성하는 빈도가 낮은 염기)를 제1 합성 비자연 염기로 사용하고, 나머지 염기를 제2 합성 비자연 염기로 사용할 수 있다. 예컨대, S-B 염기쌍 중 상대적으로 선택성이 높은 S(예컨대, iso-C)를 제1 합성 비자연 염기로 사용하고, 상대적으로 낮은 선택성을 가지는 B(예컨대, iso-G)를 제2 합성 비자연 염기로 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 S-B 염기쌍을 포함할 수 있다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 S를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 S의 맞은편에 S의 상보적인 염기인 B를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 B를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 B의 맞은편에 S를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 Z-P 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Z를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Z의 맞은편에 Z의 상보적인 염기인 P를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 P를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 P의 맞은편에 Z를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 V-J 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 V를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 V의 맞은편에 V의 상보적인 염기인 J를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 J를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 J의 맞은편에 V를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 K-X 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 K를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 K의 맞은편에 K의 상보적인 염기인 X를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 X를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 X의 맞은편에 K를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 Ds-Px 염기쌍을 포함한다.
Ds-Px 염기쌍은 제3 염기쌍으로서 PCR 증폭에서 높은 효율 및 선택성을 나타낸다(Michiko Kimoto et al., Journal of Nucleic Acids, Vol. 2012). Ds-Px 염기쌍의 선택성은 엑소뉴클레아제-능숙 Deep Vent DNA 중합효소에 의해, 99.77%-99.92%인 것으로 보고되었다(Rie Yamashige et al., Nucleic Acids Research,, 2011, 40(6):2793-2806).
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Ds를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Ds의 맞은편에 Px를 포함한다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Px를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Px의 맞은편에 Ds를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 5SICS-MMO2 염기쌍을 포함한다.
5SICS-MMO2 염기쌍은 OneTaq (Taq 및 엑소뉴클레아제-능숙 Deep Vent DNA 중합효소의 혼합물)을 사용한 PCR에서 99.9% 선택성을 나타낸다(Malyshev et al., 2009, 2012). 5SICS-MMO2 염기쌍의 오혼입 비율은 염기당 복제당 0.01-0.1%이다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 5SICS를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 5SICS의 맞은편에 MMO2를 포함한다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 MMO2를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 MMO2의 맞은편에 5SICS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응은 상기 타겟 의존적 단편을 상기FHO의 캡처링 부위에 혼성화시키는 반응을 포함한다.
상기 타겟 의존적 단편과 FHO의 캡처링 부위의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 특히, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및/또는 제2 합성 비자연 염기가 자연적 염기와는 염기쌍을 형성하지 않고, 제1 합성 비자연 염기와 제2 합성 비자연 염기 간의 염기쌍을 형성하는 조건 하에서 실시될 수 있다.
상기 비자연 염기쌍을 구성하는 제1 합성 비자연 염기는 제2 합성 비자연 염기와만 혼성화되므로, 상기 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍의 도입은 타겟 의존적 단편의 FHO에 대한 결합 특이성을 증가시키고 타겟 의존적 단편이 FHO 이외의 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 가능성을 낮춘다. 이는 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시킬 수 있고 검출 민감도를 증가시킬 수 있다.
또한, 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위에 포함되어 있는 비자연 염기쌍은 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물의 멜팅 온도를 상승시키며, 즉 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 결합 친화성을 향상시킨다.
따라서, 비자연 염기쌍을 포함하는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물은 상기 비자연 염기쌍을 포함하지 않는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물과 비교하여 더 높은 멜팅 온도 및 결합 친화성을 갖는다.
상기 비자연 염기쌍을 포함하는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 증가된 결합 친화성은 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율을 높이고 이는 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가 및 검출 민감도의 증가로 이어질 수 있다.
한편, 상기 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍의 도입은 TO의 태깅 부위의 Tm을 유지하면서 길이를 축소시킬 수 있다. 즉, 제1 합성 비자연 염기를 포함하는 TO의 태깅 부위는 합성 비자연 염기를 포함하지 않는 종래의 TO의 태깅 부위보다 더 짧은 길이를 가질 수 있다.
상기 길이가 축소된 TO의 태깅 부위와 비타겟 핵산 서열과의 혼성화 효율은 길이가 긴 TO의 태깅 부위와 비타겟 핵산 서열과의 혼성화 효율에 비해 미스매치로 인한 영향을 더 많이 받으므로, 길이가 긴 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 확률보다 길이가 짧은 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 확률이 더 낮다. 따라서, 길이가 짧은 TO의 태깅 부위를 사용하는 것은 비타겟과의 혼성화를 방지할 수 있고, 이는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가로 이어질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 연장 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화 및 연장반응을 통하여 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체를 형성할 수 있다. 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 TO는 연장되지 않고, 따라서 연장가닥을 형성하지 않는다.
상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위를 주형으로 하여 주형-의존적 핵산 중합효소의 활성에 의해 연장될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있다.
상기 타겟 의존적 단편의 연장반응과 관련하여 사용된 용어 "연장서열", "연장가닥" 및 "제1 이합체"는 다음의 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 용어 "연장서열(extended sequence)"은 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편으로부터 연장반응을 통해 새롭게 연장된 서열을 지칭한다. 또한, 상기 연장서열은 하기 설명할 연장가닥에서 타겟 의존적 단편을 제외한 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "연장가닥(extended strand)"은 상기 타겟 의존적 단편과 상기 연장서열을 포괄하는 서열을 지칭한다. 또한, 상기 연장가닥은 하기 설명할 제1 이합체에서 제1 형태의 FHO를 제외한 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "제1 이합체"는 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화물 또는 이합체(서열간의 상보성을 통함)를 의미한다. 다시 말하면, 제1 이합체는 타겟 의존적 단편 및 연장서열로 구성된 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 이합체를 의미한다.
단계 (b)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, Escherichia coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 특히, 주형-의존적 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus를 포함한다. 보다 구체적으로, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
일 구현예에 있어서, 주형-의존적 핵산 중합효소는 역전사효소를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)에서 상기 TO가 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 제2 형태의 FHO 간의 혼성화에 의해 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 TO의 태깅 부위와 제2 형태의 FHO가 먼저 혼성화되어 이중-가닥 형태를 형성하고, 이어서 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단반응을 통해 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 제2 형태의 FHO는 TO의 태깅 부위의 말단에 연결되어 있는 형태일 수 있다. 예컨대, 하나의 올리고뉴클레오타이드가 TO의 태깅 부위 및 제2 형태의 FHO를 포함할 수 있다. 이러한 경우, TO의 태깅 부위 및 제2 형태의 FHO 간의 혼성화는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
상기 용어 '헤어핀'은 이중-가닥의 '스템(stem)' 영역 및 단일 가닥의 '루프(loop)' 영역을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 구조를 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "제2 이합체"는 상기 타겟 의존적 단편과 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위 간의 혼성화물 또는 이합체(서열간의 상보성을 통함)를 의미한다. 비절단된 TO의 태깅부위와 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위 간의 혼성화물 또는 이합체는 제2 이합체에 포함되지 않는다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 뉴클레아제 활성을 갖는 효소(특히, 5'뉴클레아제 활성을 갖는 효소), 상기 단계 (a)의 업스트림 프라이머를 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (b)의 타겟 의존적 단편을 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소는 전부 상이할 수 있거나, 일부 동일하거나, 전부 동일할 수 있다.
단계 (c) : 제1 이합체에서의 연장 가닥 또는 제2 이합체 존재의 검출
마지막으로, 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출한다. 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출함으로써 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널"은 백그라운드 시그널의 강도 또는 타겟 핵산의 부재시에 제공될 수 있는 시그널의 강도를 초과하는 강도를 갖는 시그널을 의미하거나, 제공된 시그널의 강도로부터 백그라운드 시그널의 강도 또는 타겟 핵산 서열의 부재시에 제공될 수 있는 시그널의 강도를 차감한 후의 강도를 갖는 시그널을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 나타낼 수 있는 모든 시그널을 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸), 표지로부터의 시그널의 변화(시그널 증가 또는 감소), 멜팅 커브, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 단계 (c)는 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널 또는 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 검출함으로써 달성될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 표지로부터 시그널을 제공할 수 있다. 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 상기 이합체는 제1 이합체 또는 제2 이합체 뿐만 아니라, 이들의 존재에 의존적으로 형성된 제3 이합체를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 제공은 표지로부터 "시그널 발생 또는 소멸" 및 "시그널 증가 또는 감소"를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이합체(duplex)"는 결합된 형태의 이합체(duplex in associated form) 및 해리된 형태의 이합체(duplex in dissociated form)를 포괄하는 의미로 사용될 수 있다. 즉, 부분적 또는 전체적으로 서로 상보적인 서열을 포함하고 있어 혼성화 조건하에서 서로 혼성화되어 이합체(혼성화물) 구조를 가질 수 있는 두 개의 단일-가닥 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 예컨대, 상기 이합체는 온도에 따라, 결합된 형태의 이합체로 존재하거나, 해리된 형태의 이합체로 존재하거나, 또는 일부는 결합된 형태의 이합체로 존재하고 나머지는 해리된 형태의 이합체로 존재할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 결합(association) 또는 해리(dissociation)에 의존적인 방식으로 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 예컨대, 결합된 형태의 이합체는 시그널을 소광(또는 발광)시키고, 해리된 형태의 이합체는 시그널을 발광(또는 소광)시켜, 결합된 상태와 해리된 상태에서 상이한 시그널을 제공할 수 있는 이합체를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다.
용어 "결합(association) 또는 해리(dissociation)"는 용어 "혼성화 또는 변성"과 동일한 의미를 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 상기 절단되는 이합체는 제1 이합체 또는 제2 이합체 뿐만 아니라, 이들의 존재에 의존적으로 형성된 제3 이합체를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 표지는 단일 표지 및/또는 상호작용적 표지일 수 있다.
상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 개시에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 기술될 수 있다. 상호작용적 이중표지는 접촉-매개된 퀀칭에 기초하여 검출가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore 등., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson 등., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 본 개시에서, 상기 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자들(예컨대, 염료들)간의 상호작용에 의한 시그널 변화를 유도하는 모든 경우들을 포함한다.
상호작용적-이중표지로서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다. 구체적으로, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
본 개시에 적용되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되고 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
상기 표지는 종래의 방법을 통해 TO 및/또는 FHO에 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지는 탄소원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 TO 및/또는 FHO에 연결된다.
일 구현예에 있어서, 상기 상호작용적 표지는 최소 하나의 리포터 분자 및 최소 하나의 퀀처 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 하나의 리포터 분자 및 하나의 퀀처 분자를 포함하거나 또는 하나의 리포터 분자 및 두 개의 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 표지일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단일 표지는 그 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 상기 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 구체적으로, 상기 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 개시에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 구체적으로, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지된 뉴클레오타이드 잔기는 5'-말단 또는 3'-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치하는 것이 바람직하다.
본 개시에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
특히, 상기 방법이 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며, 단일 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 강도의 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정 형광 표지를 요구하지는 않는다. 고상 기질에서 제공되는 타겟 시그널이 측정된다.
고상 기질 상에 고정된 FHO를 이용하는 경우, 화학 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 이용할 수 있다.
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 제1 이합체 또는 제2 이합체의 형성과 관련된 시그널을 측정하는 것이다.
일 구현예에 있어서, 제1 이합체 또는 제2 이합체는 표지를 가지며 이에 의해 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체는 시그널을 제공한다.
상기 단계 (c)에서의 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체 존재의 검출은 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 제1 이합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서 상기 제1 이합체에서의 상기 연장가닥의 존재의 검출은, 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 구체적으로, (i) 미리 정해진 온도에서 제1 이합체로부터의 시그널을 측정하거나, 또는 (ii) 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 제1 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 실시될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멜팅 분석(melting analysis)"은 이합체의 멜팅에 의해 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 두 가지 상이한 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석, 및 멜팅 피크 분석을 포함한다. 구체적으로, 멜팅 분석은 멜팅 커브 분석이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "멜팅 후 혼성화 분석"은 이합체를 멜팅한 후 혼성화에 의해 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 얻는 방법을 의미한다. 예컨대, 멜팅 후 혼성화 분석은 혼성화 커브 분석일 수 있다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188:45(1997); Kochinsky 및 Mirzabekov, Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같은 종래의 기술들에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 아웃풋 시그널, 예를 들면 형광이 플롯팅되고, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅될 것이다.
형광 vs. 온도의 1차 도함수(derivative)의 플롯, 즉, 형광 vs. 온도(dF/dT vs. T) 또는 (-dF/dT vs. T)에서 변화율 플롯은 멜팅 피크를 제공한다.
상기 검출 방법을 하기에 개략적으로 설명하기로 한다.
미리 정해진 온도에서 제1 이합체의 검출
일 구현예에 있어서, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 미리 정해진 온도에서 측정함으로써 실시된다.
일 예로서, 연장가닥의 존재는 제1 이합체의 이중 가닥을 유지(즉, 상기 제1 이합체가 결합된 형태의 이합체로 존재)하기에 충분한 미리 정해진 온도에서 제1 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 검출된다.
제1 이합체는 그 자체가 제1 이합체의 형성과 비-형성을 구별할 수 있는 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널은 제1 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 미리 정해진 온도에서 검출되고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재가 결정된다.
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 제1 이합체 형성과 관련된 시그널을 측정하는 것이다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 표지를 가지며 이에 의해 상기 제1 이합체는 시그널을 제공한다.
제1 이합체로부터 나오는 시그널의 기본적인 작동 원리는 다음과 같다: (i) 타겟 의존적 단편의 연장은 표지로부터의 시그널 변화를 유도하여 시그널을 제공하며; 또는 (ii) 타겟 의존적 단편 및 제1 형태의 FHO의 혼성화는 표지로부터의 시그널 변화를 유도하여 시그널을 제공하고, 상기 혼성화 후 연장에 의해 형성된 제1 이합체는 시그널을 유지한다.
예를 들어, 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하는 경우, 본 개시는 보다 효과적인 방식으로 다수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 고정화된 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 이후 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성하는 경우 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 따라서, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 상기 연장 단계에서 제공된다.
특정 구현예에서, TO의 태깅 부위(및 타겟 의존적 단편)는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO는 절단되어, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는 태깅 부위를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된다. 상기 혼성화에 의하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 시그널은 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화 단계에서 제공되고, 제1 이합체는 시그널을 유지한다.
TO의 태깅 부위(및 타겟 의존적 단편)가 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체도 제1 이합체의 퀀처 분자처럼 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 이러한 경우, 상기 미리 정해진 온도(즉, 시그널을 검출하는 온도)는 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 일부 또는 모두가 해리된 형태의 이합체로 존재하게 하고 상기 제1 이합체는 일부 또는 모두가 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도 범위에서 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 모두 해리된 형태의 이합체로 존재하게 하고, 상기 제1 이합체는 일부 또는 모두가 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도에서 시그널을 검출할 수 있다. 이러한 경우, 상기 검출된 시그널은 제1 이합체로부터 제공되는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이다. 다른 예로, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 중 일부는 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하고, 상기 제1 이합체는 모두 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도에서 시그널을 검출할 수 있다. 이러한 경우, 상기 검출된 시그널은 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이다. 구체적으로, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양은 제1 이합체가 형성됨에 따라 감소하며, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널 또한 감소하고, 이러한 시그널의 변화(즉, 시그널의 감소)는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널을 검출하는 온도는 이합체의 Tm 값을 고려하여 추가 결정된다.
일 구현예에 따르면, 미리 정해진 온도는 이합체의 Tm 값(두 가지 유형의 이합체가 생성되는 경우, 상기 두 유형 중에서 높은 Tm 값)에서 10℃ 뺀 온도보다 높고, 구체적으로 이합체의 Tm 값에서 5℃ 뺀 온도보다 높으며, 보다 구체적으로 이합체의 Tm 값보다 높은 온도이고, 보다 더 구체적으로 이합체의 Tm 값에서 5℃ 더한 온도보다 높다.
멜팅 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의한 제1 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 멜팅 분석에 의해 측정하거나 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 측정함으로서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은 멜팅 분석을 통해 실시되며, 멜팅분석에서 제1 이합체는 일정 범위의 온도에서 멜팅되어 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은 멜팅 후 혼성화 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은, 제1 이합체가 멜팅되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 혼성화되어 연장가닥의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 혼성화 분석을 통해 실시한다.
전술한 미리 정해진 온도에서 제1 이합체의 검출 및 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의한 제1 이합체의 검출은 다음과 같은 다양한 분석 방법에 따라 실시될 수 있다: A. 제1 이합체의 검출; B. 제1 이합체의 절단의 검출; C. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; D. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출; E. 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; F. 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; 및 G. 제3 형태의 FHO를 사용한 제3 이합체의 검출.
상기 분석 방법을 하기에 상세히 설명한다.
A. 제1 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 직접 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PTOCE 분석을 기반으로 실시될 수 있다(참조 WO 2012/096523).
본 개시의 TO, 제1 형태의 FHO, 타겟 의존적 단편 및 제1 이합체는 전술한 PTOCE, PCEC, PCE-SH, PCE-SC, PCE-NH, PCE-IH 및 PTOCE-E와 같은 PTOCE 기반의 방법에서의 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드), CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드), PTO 단편(즉, PTO의 태깅 부위) 및 연장이합체에 각각 대응될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출 될 수 있다.
PTOCE 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2012/096523호를 참조한다.
상기 PTOCE 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지
일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공된다.
상기 표지는 상호작용적 이중표지 및 단일 표지를 포함한다.
(i-1) 상호작용적 이중표지
일 구현예에 있어서, 제1 이합체의 존재(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 제공되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의해 제공된다.
구현예 1 (가닥 내 상호작용적-이중표지)
상호작용적 이중표지 시스템의 구현예 1에서, 타겟 의존적 단편 또는 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자의 위치에 따라, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상호작용적 이중표지 시스템의 구현예 1은 가닥 내 상호작용적-이중표지로 명명된다.
구현예 1-1 (제1 형태의 FHO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-1에 따르면, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 1-1에 따르면, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성시에, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에, 리포터 분자 및 퀀처 분자 간의 구조적 간격에 변화가 야기되어 시그널(구체적으로, 시그널 발생)이 제공된다:
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는데 반해; 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화된 상기 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적(conformationally)으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널(즉, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널)이 제공된다. 나아가, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공되고; 상기 멜팅 후에 다시 혼성화하는 경우 리포터 분자 및 퀀처 분자가 다시 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 근접한다"는 것은 올리고뉴클레오타이드(예컨대, TO, 타겟 의존적 단편 또는 FHO 등)의 형태적 구조, 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 서로 근접하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격된다"는 것은 이중 가닥의 형성시 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 이합체, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 적어도 하나는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 5'-말단 및 3'-말단에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 위치하거나 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 제1 형태의 FHO의 3'-말단에 위치하거나 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 80 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최대 60 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 30 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 25 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 15 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
리포터 분자 및 퀀처 분자의 제1 형태의 FHO 상에서의 위치에 따라 시그널이 생성되는(시그널 변화가 초래되는) 시점이 달라질 수 있다.
일 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치하고 이중 가닥의 형성시 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 리포터 분자와 퀀처 분자가 이격되어 있는 경우, 상기 단계 (b)에서 제1 이합체의 형성은 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
다른 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치하고 이중 가닥의 형성시 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 리포터 분자와 퀀처 분자가 이격되어 있는 경우, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다.
상기 구현예 1-1에서, 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위가 상호작용적 이중표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 1-2 (TO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화시 시그널이 제공되며, 제1 이합체의 형성시 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널이 유지된다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, TO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는데 반해; 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 상기 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화 또는 멜팅에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단에 위치하거나 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 타겟 의존적 단편의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 50 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최대 40 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 30 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 20 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 15 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다.
상기 구현예 1-2에서, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 2 (가닥간 상호작용적-이중표지)
구현예 2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 제1 형태의 FHO는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 퀀처 분자를 갖고 제1 형태의 FHO가 리포터 분자를 갖는 경우, 상기 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되기 전에는 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자가 퀀칭되지 않는 반면, 상기 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 타겟 의존적 단편에 연결된 퀀처 분자에 의하여 제1 형태의 FHO에 연결된 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되어 시그널(구체적으로, 시그널 소멸)을 제공한다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널(구체적으로, 시그널 발생)이 제공된다.
제1 이합체에서 퀀처 분자에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 타겟 의존적 단편 및 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 상기 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO가 혼성화시에 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는 것을 용이하게 하기 위해, 퀀처 분자와 리포터 분자는 서로 근접하여 위치하는 것이 유리하다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 5'-말단 또는 5'-말단 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단 또는 3'-말단 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단에 위치하거나 또는 그의 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
구현예 2에서, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널(구체적으로, 시그널 소멸)이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
사용되는 표지들의 종류 및 특징은 상술한 본 발명에 적용 가능한 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(i-2) 단일 표지
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
구현예 1 (FHO 상의 단일 표지)
구현예 1에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예에서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성시에, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에 단일 형광 표지로부터 형광 강도가 증가하게 되고, 이에 의해 시그널(구체적으로, 시그널 변화)이 제공된다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, 단일 가닥 상태의 제1 형태의 FHO 상의 단일 표지는 낮은 시그널을 제공하는데 반해; 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 이중 가닥 상태의 제1 이합체 상의 단일 표지는 증가된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다. 나아가, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 단일 가닥 상태의 연장가닥 상의 단일 표지는 감소된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공되고; 상기 멜팅 후에 다시 혼성화하는 경우 이중 가닥 상태의 제1 이합체 상의 단일 표지는 증가된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 위치한다.
단일 표지의 제1 형태의 FHO 상에서의 위치에 따라 시그널이 제공(시그널 변화가 초래)되는 시점이 달라질 수 있다.
일 예로서, 단일 표지가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치하는 경우, 제1 이합체의 형성이 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
다른 예로서, 단일 표지가 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치하는 경우, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화가 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다.
구현예 1에서, 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위가 단일 표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 2 (TO 상의 단일 표지)
구현예 2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화시 시그널이 제공되며, 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, TO 상의 단일 표지(즉, 타겟 의존적 단편 상의 단일 표지)가 낮은 강도의 시그널을 제공하는데 반해; 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 상기 타겟 의존적 단편 상의 단일 표지가 증가된 강도의 시그널을 제공한다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 증가된 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 단일 표지는 낮은 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널(구체적으로, 시그널의 변화)이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제4 형태의 FHO 간의 혼성화, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
구현예 2에서, 타겟 의존적 단편이 단일 표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 제1 이합체에 삽입된 표지
본 개시는 제1 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하기 위하여, 단계 (b)에서의 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
비록 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO가 표지를 갖지 않아도, 단계 (b)에서의 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하여 성공적으로 제1 이합체를 표지시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 연장반응은 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 실시되며, 이에 의해 상기 제1 이합체 내에 단일 표지가 삽입되고 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편은 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 단일 형광 표지로 표지된 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장되어 제1 이합체를 형성한다. 제1 이합체로부터의 형광 시그널은 제1 형태의 FHO가 고정화된 고상 기질의 스팟 상에서 검출할 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널의 변화가 제1 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 합성 비자연 염기(non-natural base)를 가지며, 제1 형태의 FHO는 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는(즉, 상기 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는) 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 구체적으로, 상기 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 어떠한 사이트에도 위치한다.
예를 들어, 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 형태의 FHO에 타겟 의존적 단편이 혼성화된다. 단일 형광 표지로 표지된 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 제1 이합체를 형성한다. 연장반응에서, 상기 단일 형광 표지로 표지된 특정 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 형태의 FHO 상의 이의 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다.
일 구현예에 있어서, 상기 연장 반응 동안 제1 이합체에 삽입되는 표지로 표지된 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 표지된 합성 비자연 염기 및 이의 상보적인 합성 비자연 염기는 비자연 염기쌍을 이룰 수 있으며, 예컨대, S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 또는 NaM-5SICS 염기쌍일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 연장반응 동안 생성되는 비자연 염기쌍은 상기 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기 간의 비자연 염기쌍과 동일하거나 상이할 수 있다.
제1 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 고정화된 제1 형태의 FHO가 있는 고상 기질의 스팟 상에서 검출될 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널의 변화가 제1 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제1 이합체의 존재를 나타낸다.
연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 비절단 TO는 제1 형태의 FHO에 혼성화하여 연장되지 않기 때문에, 표지는 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 내에 포함되지 않는다. 따라서, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 시그널을 제공하지 않는다.
사용되는 단일 표지의 종류 및 특징은 본 명세서에서 상술한 "타겟 의존적 단편 및/또는 FHO에 연결된 표지"를 이용하는 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(iii) 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장 반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지
본 개시는 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 표지 및 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지의 조합을 이용하는 표지 시스템을 이용할 수 있다.
상기 연장 반응 동안 제1 이합체 내에 삽입되는 표지는 단계 (b)에서 상기 제1 형태의 FHO에 상기 타겟 의존적 단편이 혼성화되어 연장되는 연장 반응 동안 연장서열에 삽입되는 표지일 수 있다.
일 구현예에서, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장서열에 표지가 삽입되고; 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
특히, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 합성 비자연 염기를 가지며, 제1 형태의 FHO는 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 구현예에서, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 합성 비자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 상보적 합성 비자연 염기 및 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장서열에 표지가 삽입되고; 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
제1 형태의 FHO 상의 표지 사이트 및 삽입되는 표지의 삽입 사이트는, 제1 이합체의 형성 및 멜팅 단계에서 상기 2개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
특히, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 리포터 또는 퀀처 분자 및 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
상기 단계 (b)에서 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 상기 제1 형태의 FHO 내의 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시된다. 상기 단계 (b)에서 제1 이합체의 상기 2개의 합성 비자연 염기는 염기쌍을 형성하고 퀀처 분자에 의한 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하여 시그널의 변화를 유도하며, 이에 의해 시그널이 제공된다. 택일적으로, 타겟 의존적 단편은 리포터 또는 퀀처 분자를 가지며, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 상기 단계 (b)에서 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 상기 제1 형태의 FHO 내의 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시된다. 상기 단계 (b)의 제1 이합체의 상기 2개의 합성 비자연 염기는 염기쌍을 형성하고 퀀칭에 의한 리포터 분자로부터의 시그널 변화를 유도하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
또 다른 예로서, 리포터 또는 퀀처 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편이 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, isodC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 형태의 FHO에 혼성화된다. 퀀처 또는 리포터 분자로 표지된 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에 연장이 실시되어, 제1 이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭된다. 연장반응에서, 상기 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드는 상기 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, isodC)를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다.
상기 단계 (b)에서 제1 이합체가 형성되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공되며; 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다.
연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입되는 표지를 이용하는 경우, 상기 표지는 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 내에 삽입되지 않는데, 이는, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 연장되지 않기 때문이다. 따라서, 상기 이합체는 시그널을 제공하지 않는다.
(iv) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 개시는 제1 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다. 시료 내 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 제공할 수 있기 때문에, 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
일 구현예에서, 시그널은 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공되며, 상기 단계 (b)에서 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 인터컬레이팅 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는, SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™ 43, SYTO™ 44, SYTO™ 45, SYTOX™ Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™ 1, TO-PRO™ 1, SYTO™ 11, SYTO™ 13, SYTO™ 15, SYTO™ 16, SYTO™ 20, SYTO™ 23, TOTO™-3, YOYO™ 3, GelStar™ 및 thiazole orange를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 제공한다.
본 구현예는 멜팅 분석을 이용하는 다른 구현예들에도 적용할 수 있다.
예를 들어, 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 타겟 의존적 단편이 혼성화된다. 인터컬레이팅 염료(예컨대, SYBR™ Green)의 존재 하에 연장을 실시하여 인터컬레이팅 염료를 포함하는 제1 이합체를 생성한다. 고정화된 제1 형태의 FHO가 있는 고상 기질의 스팟 상의 제1 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 인터컬레이팅 형광 염료를 이용하여 검출될 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 인터컬레이팅 형광 염료가 방출되어 스팟 상에서 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제1 이합체의 존재를 나타낸다.
인터컬레이팅 표지를 이용하는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
B. 제1 이합체의 절단의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 이용여 실시될 수 있다. 예컨대, PCEC 분석에 기초하여 실시할 수 있다(참조 WO 2012/134195).
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 최소 하나의 표지를 포함한다. 상기 표지는 상기 제1 이합체의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공한다. 예컨대, 상기 PCEC 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 최소 하나의 표지를 포함하고, 상기 제1 이합체는 (i) 절단 효소에 의하여 절단되는 절단위치를 포함하여 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하거나, 또는 (ii) 5'-3' 엑소 뉴클레아제에 의해 상기 제1 이합체 중 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 순차적 절단(sequential cleavage)에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 있어서, 상기 표지가 제1 이합체의 절단에 의해 시그널 변화를 유도하는 한, 상기 표지는 제1 이합체의 어떠한 위치에도 결합할 수 있다.
PCEC 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2012/134195호를 참조한다.
상기 PCEC 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 단일 표지
본 개시는 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제1 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
단일 표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체의 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제1 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제1 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제1 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, TO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제1 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제1 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제1 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 제1 이합체의 절단에 따라 상이한 시그널을 제공하는 단일 표지는 형광성 테르비움 킬레이트 또는 편광된 형광을 방출하는 단일 표지이다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 제1 형태의 FHO에 연결되어 있고, 특히 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위, 보다 특히 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 5'-말단이다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 TO에 연결되어 있고, 특히 TO의 태깅 부위이다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 단일 표지를 가지도록 단일 표지가 TO 상에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 본 개시에서 단일 표지를 이용하는 경우, 본 개시는 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하여 고상에서 실시할 수 있다. 본 개시에서 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시하는 경우, TO 또는 제1 형태의 FHO에 결합된 단일 표지는 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
보다 특히, 제1 형태의 FHO는 그의 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, TO는 단일 표지를 가지며, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
제1 형태의 FHO가 3'-말단을 통하여 고정화되어 있고 단일 표지를 이용하는 경우, 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있고, 핵산 절단효소의 절단 위치는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제의 절단 위치일 수 있다.
한 가지 예로서, 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되면 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제가 절단위치를 절단함으로써 제1 이합체가 절단(구체적으로, 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 순차적 절단) 되어 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 형광 리포터 분자가 방출된다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
택일적으로, 제1 형태의 FHO는 그의 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, TO는 단일 표지를 가지며, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
추가의 예로서, 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 제한효소에 의하여 인식되는 서열을 포함)에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성이 되면 제한효소의 절단 위치가 생성된다. 제한효소는 제1 이합체를 절단하여 제1 형태의 FHO의 3'-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
추가의 예로서, 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 RNA 분자를 포함)에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되면 RNase H의 절단 위치가 생성된다. RNase H는 제1 이합체를 절단하여 제1 형태의 FHO의 3'-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 제1 형태의 FHO가 고정화되고 단일 표지를 이용하는 경우, 단일 표지는 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합되고, 제한효소 또는 리보뉴클레아제와 같은 핵산 절단효소의 절단 위치가 생성되는 것이 바람직하다.
고상 반응에 이용되는 단일 표지는 특정한 특징이 요구되지 않는다. 고상 반응을 위해서는, 어떠한 단일 표지도 이용될 수 있다. 이는, 제1 이합체의 절단 이후 고상 기질 상의 단일 표지의 존재 여부에 의하여 제1 이합체의 절단 발생에 따른 시그널의 차이가 유도될 수 있기 때문이다.
단일 표지는 종래 방법들을 이용하여 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합될 수 있다. 구체적으로, 표지는 최소 3개의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(spacer)(예를 들어, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 매개로 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합된다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO에 결합되는 단일 표지는 5'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다. 택일적으로, 제1 형태의 FHO에 결합되는 단일 표지는 3'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
특정 구현예에 따르면, TO에 결합되는 단일 표지는 5'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
(ii) 상호작용적 이중표지
본 개시는 상호작용적 이중표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제1 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
상호작용적 이중표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 제1 형태의 FHO에 결합된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산 절단효소에 의하여 절단되는 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치하고, 제1 이합체가 형성되기 이전에는 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 제1 이합체의 절단은 리포터 분자와 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 제1 이합체의 절단의 발생은 표지로부터의 시그널을 측정하여 검출된다.
본 개시의 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 유용하다.
상호작용적 표지 시스템을 이용하는 경우, 구체적으로는, 제1 이합체에서 생성되는 절단 위치는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제의 절단 위치일 수 있다.
일 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다.
제1 이합체가 형성되기 전에, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하기에 적합한 위치에 위치한다.
특히, 상기 두 개의 표지가 제1 형태의 FHO 상의 거리에 따라 근접하게 있거나 또는 랜덤 코일 (coli) 및 헤어핀 구조와 같은 입체적 구조(conformational structure) 를 형성하여 3차원적인 방식으로 근접하게 있는 경우, 퀀칭이 발생한다.
5' → 3' 엑소뉴클레아제는 제1 이합체의 5'-말단을 절단(구체적으로, 순차적 절단)하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
퀀처 분자가 형광성인 경우, 퀀처 분자로부터의 시그널을 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.
다른 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 제한효소의 절단 위치가 생성된다. 제한효소의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다. 제한효소가 절단 위치를 절단함으로써 제1 이합체를 절단하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널의 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
다른 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 RNA 분자를 포함)에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 RNase의 절단 위치가 생성된다. RNase의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다. RNase가 절단 위치를 절단함으로써 제1 이합체를 절단하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널의 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있으며, 특히 제1 형태의 FHO의 5'-말단이다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에, 다른 하나는 3'-말단에 결합되어 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합된 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치해 있다. 예를 들어, 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 이격된 위치에 위치할 수 있고, 리포터 분자는 퀀처 분자로부터 5 내지 50 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 상호작용적 이중표지 간의 퀀칭 상태가 유지되고, 제1 이합체의 절단에 의하여 표지가 방출되는 경우에는, 상호작용적 이중표지 간의 언퀀칭 상태가 되는 적합한 위치에 위치한다.
제1 이합체의 절단 동안의 실시간 시그널 제공을 고려하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최대 25 뉴클레오타이드만큼 서로 이격된 위치에 위치하며, 구체적으로, 최대 20 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 15 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 10 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드만큼 서로 이격된 위치에 위치하며, 구체적으로, 최소 4 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 5 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드이다.
제1 이합체가 형성되는 경우, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하도록 할 수 있다. 제1 이합체의 절단은 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 완전히 분리시켜, 언퀀칭되면서 초래되는 시그널의 변화를 보다 크게 할 수 있다.
또한, 표지(예를 들어, 리포터 분자)를 갖는 절단 단편이 생성되므로, 보다 유연하거나 편리한 조건(예를 들어, 고-엄격 조건 또는 고상에서 세척 후 조건)하에서, 절단 단편에 결합된 표지로부터의 시그널을 직접 검출하여 제1 이합체의 절단 발생을 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 고정화된 제1 형태의 FHO에 결합된 상호작용적 이중표지 중 하나는, 제1 이합체의 절단 후 고상 기질 상에 잔류한다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO가 상호작용적 이중표지를 갖고 핵산 절단효소로서 5' → 3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 경우, 제1 이합체로부터 제1 형태의 FHO의 단편이 분리되기에 적합한 조건을 부여하거나 또는 제1 형태의 FHO의 내부 뉴클레오타이드에 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 부여함으로써, 제1 이합체의 절단 후 상호작용적 이중표지 중 하나가 고상 기질 상에 확실하게 잔류하도록 할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 5' → 3' 엑소뉴클레아제에 활성에 대한 내성은 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 갖는 백본이 있는 뉴클레오타이드에 의하여 부여되며, 다양한 포스포로티오에이트 연결(linkage), 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2'-카보하이드레이트 변형을 포함하고, 보다 구체적으로, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2'-O-아미노프로필 변형, 2'-O-알킬 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4'-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
본 개시에 이용될 수 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTOCE 분석에서 설명한 것을 참조한다.
(iii) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명에서는 인터컬레이팅 표지(intercalating label)를 이용하여 제1 이합체의 절단반응과 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 제공을 연계시킬 수 있다.
시료 내 존재하는 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 제공할 수 있기 때문에, 고정화된 제1 이합체를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
일 구현예에 따르면, 제1 이합체는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, 인터컬레이팅 염료가 표지로 이용되며, 제1 이합체 절단은 인터컬레이팅 염료를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 제1 이합체의 절단 반응은 제한효소 또는 RNase를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화되지 않은 절단 단편은 고상 기질로부터 해리된다.
본 개시에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
C. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-SH 분석에 기초하여 실시할 수 있다(참조 WO 2013/115442).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-SH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 SO에 연결된 표지, (ii) 상기 SO에 연결된 표지 및 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지의 조합, (iii) 상기 SO에 연결된 표지 및 단계 (b)의 연장반응 동안 연장가닥에 삽입된 표지의 조합, 또는 (iv) 상기 SO에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 표지(intercalating label)의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-SH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2013/115442를 참조한다.
상기 PCE-SH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) SO에 결합된 단일 표지
본 개시는 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, SO는 단일 표지가 결합되어 있고 상기 SO와 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
단일 표지의 종류 및 특징에 대해서는 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상의 단일 표지는 5'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 15 뉴클레오타이드, 1 내지 10 뉴클레오타이드 또는 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 구체적으로, SO의 중앙 부위에 위치한다.
(ii) SO 가닥내(intrastrand) 상호작용적 이중표지
가닥내 상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있고, 상기 SO와 연장가닥 사이의 혼성화는 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상기 SO가 혼성화되기 전에는 상기 SO 상의 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 서로 근접하게 되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 상기 SO가 혼성화되면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여, 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화를 초래한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 SO의 5'-말단(또는 3'-말단) 및 3'-말단(또는 5'-말단)에 위치한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태 (conformation)에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 구체적으로, 60 뉴클레오타이드 이내, 보다 구체적으로, 30 뉴클레오타이드 이내, 보다 더 구체적으로, 25 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드, 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
(iii) 가닥 간(interstrand) 상호작용적 이중표지
가닥 간 상호작용적 이중표지를 사용하는 구현예에서, 연장가닥은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 가지며, SO는 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖는다.
가닥 간 상호작용적 이중표지를 사용하는 구현예는 다음의 세 가지 방식에 따라 실시될 수 있다:
첫 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 포함하며, 상기 연장가닥은 상기 타겟 의존적 단편에서 유래된 표지를 포함하고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
SO에 결합되는 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고, 타겟 의존적 단편에 결합된 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다.
TO의 절단위치를 고려하여 TO 상의 표지의 위치를 결정함으로써, 타겟 의존적 단편 상에 표지가 존재하게 할 수 있다.
SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치(예컨대, TO의 태깅부위)에도 결합할 수 있다. 타겟 의존적 단편과의 혼성화에서 타겟 의존적 단편에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5'-말단)에도 결합할 수 있다.
두 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 합성 비자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 상보적 합성 비자연 염기 및 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 연장가닥에 삽입되는 표지는 연장가닥의 어떠한 위치(예컨대, 연장가닥의 3'-말단)에도 결합할 수 있다. 연장가닥과의 혼성화에서 연장가닥에 삽입된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5'-말단)에도 결합할 수 있다.
세 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 단계 (b)의 연장반응은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지
두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지의 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 각각 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며, 상기 두 개의 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
구체적으로, 상기 두 개의 SO 중 최소한 하나의 SO는 단계 (b)의 연장반응에서 새롭게 생성된 연장서열과 혼성화되는 부위를 포함한다.
두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지의 원리는 다음과 같다: 두 개의 SO는 상기 연장가닥과 혼성화된다. 혼성화에서 두 개의 SO는 서로 근접하여 연장가닥과 혼성화되기 때문에, 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 인접하여 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 퀀칭(quenching)하도록 하여 결과적으로 상호작용적 이중표지로부터 시그널의 변화(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가)를 초래한다. 한편, 타겟 핵산 서열이 없는 경우, 연장가닥이 생성되지 않기 때문에 두 개의 SO는 혼성화되지 않는다. 혼성화되지 않은 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 리포터 분자로부터 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥에 혼성화되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 두 개의 SO는 연장가닥의 어떠한 위치에도 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 SO는 바로 인접하거나, 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 두 개의 SO가 연장가닥에 인접하여 혼성화되는 경우, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 두 개의 SO의 어떠한 위치에도 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나의 SO의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 결합되고, 다른 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 퀀처 분자 또는 리포터 분자가 결합될 수 있다.
D. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 상기 제1 이합체에서의 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-SC 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2013/157821).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-SC 분석에서, 상기 SO 및 연장가닥 간의 이합체는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 제한효소에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하고, 상기 SO 및 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단은 상기 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지로부터 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
PCE-SC 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2013/157821을 참조한다.
상기 PCE-SC 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 상호작용적 이중표지
상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에서 기재된 내용을 참고한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 제공되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의하여 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 핵산절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체에서 상기 SO의 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 검출한다.
특정 구현예에서, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 생성 전에 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 위치에 위치한다.
본 개시에서 상기 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 이용된다.
상기 상호작용적 표지 시스템이 이용될 경우, 생성되는 절단 위치는 5' 뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
상기 핵산절단 효소(예컨대, 5' 뉴클레아제)는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO의 5'-말단 부위를 절단하여 상기 리포터 분자를 방출할 수 있으며, 그로 인해 상기 리포터 분자로부터 시그널 변화를 유도한다. 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생은 상기 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 형광 시그널을 측정함으로써 검출할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결되어 있고, 다른 하나는 3'-말단에 연결되어 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3'-말단 또는 그의 3'-말단으로부터 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
예를 들어, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있으며, 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 5 내지 80 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상호작용적 이중표지는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 형성에 앞서 퀀칭 현상을 유지하기에 충분한 위치에 위치하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단에 따라 언퀀칭을 유도한다.
상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 동안 실시간 시그널 생성을 고려할 때, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 60 뉴클레오타이드 이내, 30 뉴클레오타이드 이내, 25 뉴클레오타이드 이내, 20 뉴클레오타이드 이내, 15 뉴클레오타이드 이내 또는 10 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드, 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 5 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드 또는 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
또한, 표지(예컨대, 리포터 분자)를 갖는 절단된 단편이 생성되기 때문에, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생은 보다 유연하거나 편리한 조건(예컨대, 고엄격 조건 또는 고상 기질 상에서 세척 후 조건) 하에서 상기 절단된 단편에 연결된 표지로부터 시그널을 직접적으로 검출함으로써 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 고정화된 SO에 연결된 상호작용적 이중표지 중 하나는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 후에 고상 기질 상에 남는다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질상에 고정화된 상기 SO가 상호작용적 이중표지를 갖고, 5' 뉴클레아제가 핵산절단 효소로 사용되는 경우, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체로부터 SO 단편을 해리하는 적당한 조건을 부여하거나 상기 SO의 내부 뉴클레오타이드에 5' 뉴클레아제 활성에 대하여 내성(예컨대, 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성 또는 그의 염기 상에 표지를 갖는 뉴클레오타이드에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드)을 부여함으로써, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 후 상기 상호작용적 이중표지 중 하나는 고상 기질 상에 확실히 남아 있을 수 있다.
상기 SO가 상기 연장가닥에 비-상보적인 5'-태깅 부위를 포함하는 경우, 리포터 또는 퀀처 분자는 상기 절단 위치를 고려하여 상기 5'-태깅 부위에 위치할 수 있다.
(ii) 단일 표지
또한 본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥과 SO 간의 이합체의 발생에 대한 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
단일 표지의 구체적인 종류 및 특징은 PTOCE 분석에 기재된 내용을 참조한다.
일 구현예에서, 상기 SO는 단일 표지를 가지고, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출한다. 이 경우, 상기 SO의 절단에 앞서 상기 단일 표지로부터 제공된 시그널은 상기 SO의 절단 후 상기 단일 표지로부터 제공된 시그널과 상이하고, 상기 시그널의 차이는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생을 검출할 수 있도록 한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된다.
본 개시에서 단일 표지를 사용하는 경우, 본 개시는 고정화된 SO를 사용하여 고상에서 효율적으로 실시된다. 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키고, 상기 단편은 고상 기질 상에서 방출되며, 그로 인해 시그널 변화가 상기 고상 기질 상에서 제공되어 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생을 검출한다.
상기 SO가 그의 3'-말단을 통해 상기 고상 기질 상에 고정화되는 경우, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단에 연결되며, 생성되는 상기 절단 위치는 5'-뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
특정 구현예에서, 상기 SO의 단일 표지는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 택일적으로, 상기 단일 표지는 상기 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
E. 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-NH 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2014/104818).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 대한 혼성화 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타낸다.
상기 PCE-NH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 표지의 조합, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공될 수 있다.
PCE-NH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2014/104818을 참조한다.
상기 PCE-NH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 단일 표지
본 개시는 단일 표지가 있는 HO를 제1 형태의 FHO에 혼성화시킴으로써 또는 HO를 단일 표지가 있는 제1 형태의 FHO에 혼성화시킴으로써, 연장가닥의 부존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
(ii) HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 검출가능한 시그널은 HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지에 의해 제공된다.
구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화된다. 이후, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지로 표지된 HO가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 혼성화된다. 그리고 나서, 상기 타겟 의존적 단편이 연장되고, 상기 연장은 상기 HO의 절단을 유도하여 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 분리시키고, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다.
이와 같은 구현예에서, 뉴클레오타이드에 연결된 상호작용적 이중표지가 서로 상대적으로 근접하는 경우, HO 절단 전과 절단 후 사이의 시그널 변화를 시그널 검출을 위해 이용할 수 있다.
뉴클레오타이드에 연결된 상호작용적 이중 표지가 서로 상대적으로 거리가 먼 경우, HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화는 상호작용적 이중표지의 구조적 이격을 유도하여 HO가 절단되지 않는 경우에도 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널의 변화를 제공한다. 이러한 경우, HO의 절단된 단편으로부터의 시그널은 HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화를 방지할 수 있는 보다 높은 온도(예컨대, 95℃)에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 양 말단에 각각 위치한다.
(iii) HO 및 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 하나는 HO에 연결되고 다른 하나는 제1 형태의 FHO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지에 의해 검출가능한 시그널이 제공된다.
특정 구현예에서, HO가 제1 형태의 FHO에 혼성화되는 경우 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭되도록, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 HO 및 제1 형태의 FHO 상에 위치한다. 타겟 의존적 단편의 연장에 의해 유도된 HO의 절단은 제1 형태의 FHO로부터 HO를 방출시키고 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 이격시켜, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하게 하며, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, HO와 제1 형태의 FHO간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
일 구현예에 따르면, 상기 HO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 HO의 3'-말단에 연결되고 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 2개의 HO를 사용한 상호작용적-이중표지와 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 개시의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 상호작용적-이중표지는 2개의 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 표지의 종류 및 위치는 상기 SO의 설명을 참고하여 설명될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 인터컬레이팅 염료를 사용한 FRET과 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 개시의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, FRET 표지는 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
F. 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-IH 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2015/008985).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-IH 분석에서, 상기 검출가능한 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지, (ii) 상기 단계 (b)의 연장반응 동안 상기 연장가닥에 삽입되는 표지, 또는 (iii) 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지 및 상기 단계 (b)의 연장반응 동안 상기 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-IH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO WO 2015/008985를 참조한다.
상기 PCE-IH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 타겟 의존적 단편에 결합된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 이용함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥의 존재에 대한 시그널을 제공할 수 있다. 단일 표지로 표지된 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 제1 형태의 FHO 상에서 연장되어 연장가닥을 생성하며, 상기 단일 표지는 상기 연장가닥에 포함된다. 이어, 상기 연장가닥이 고상 기질에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한 후, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
상기 방법에서 사용될 수 있는 단일 표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참고한다.
일 구현예에 따르면, TO로부터 방출된 타겟 의존적 단편이 단일 표지를 포함하도록 하는 한, 상기 TO 상의 단일 표지는 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 TO 상의 단일 표지는 태깅 부위의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있으며, 예컨대 태깅 부위의 5'-말단에 위치할 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 연장가닥에 삽입되는 표지
일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 표지는 연장가닥에 삽입되는 표지이고, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (b)의 연장 반응은 표지 및 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 상보적 합성 비자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입된다. 이어, 상기 연장가닥이 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공하며, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
(iii) 타겟 의존적 단편의 단일 표지 및 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합
일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 표지는 타겟 의존적 단편에 결합된 단일 표지 및 연장 반응 동안 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합이고, 상기 단일 표지 및 상기 삽입된 표지는 수용자(acceptor) 및 공여자(donor)의 쌍을 포함하는 상호작용적 이중표지이다.
일 예로서, 형광 단일 표지(공여자)로 표지된 태깅 부위를 포함하는 TO는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 상기 형광 단일 표지(공여자)를 포함하는 타겟 의존적 단편은 템플레이팅 부위에 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dC)를 포함하는 제1 형태의 FHO에 혼성화되며, 수용자로 표지된 상기 합성 비자연 염기에 대한 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)가 타겟 의존적 단편의 연장 반응 동안 iso-dC의 반대쪽에 삽입되어 연장가닥에 수용자가 도입되며, 이에 의해 연장가닥 상에 상호작용적 이중표지가 형성된다. 이어, 상기 연장가닥은 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되고, 공여자에 대한 여기 광(excitation light)을 이용하여 조사시켜 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이를 유발하며, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 인터컬레이팅 염료
일 구현예에 따르면, 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시하며, 연장가닥에 포함된 표지는 상기 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 받는 수용자이고, 상기 연장가닥 및 IO 간의 이합체에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널은 상기 수용자로 전이되며, 상기 수용자는 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 형광 표지(수용자)로 표지된 태깅 부위를 포함하는 TO가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 형광 표지(수용자)를 포함하는 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고, 연장되어 연장가닥을 형성한다. 이어, 상기 연장가닥은 공여자로서의 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 상기 혼성화물 내로 인터컬레이팅 염료가 삽입된다. 공여자에 대한 여기 광을 이용하여 조사 후, 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이가 유발되고, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고체 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
택일적으로, 연장가닥에 포함되는 표지의 사용 없이, 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시될 수 있으며, 연장가닥 및 IO 간의 이합체에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 검출하여, 타겟 핵산 서열의 존재를 분석한다.
G. 제3 형태의 FHO를 사용한 제3 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 추가적인 제3 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PTOCE-E(PTO cleavage and extension-dependent extension) 분석에 따라 실시될 수 있다(참조 WO 2019/0666461)
본 개시의 제3 형태의 FHO 및 제3 이합체는 전술한 PTOCE-E 방법에서의 제2 CTO, 제2 연장이합체에 각각 대응될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 단계 (c) 대신에 하기 단계를 수행한다:
(c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며;
(c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
상기 PTOCE-E 분석은 A. 제3 이합체의 검출; B. 제3 이합체의 절단의 검출; C. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; D. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출; E. 제3 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; 및 제2 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출과 같은 다양한 분석 방법에 따라 실시될 수 있다.
PTOCE-E 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2019/0666461를 참조한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 제2 합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서의 제2 이합체 존재의 검출은 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체 존재의 검출은, 멜팅 분석과 조합된 이중 퀀칭 분석(WO 2016/101959)을 이용하여 실시할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있다. 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다. 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제2 이합체의 시그널은 멜팅 분석에 의해 측정하거나 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 측정함으로써, 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재의 검출은 혼성화 후 멜팅 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 제2 이합체의 검출은, 제2 이합체가 형성되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 멜팅되어 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 멜팅 분석을 통해 실시한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재의 검출은 멜팅 후 혼성화 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 제2 이합체의 검출은, 제2 이합체가 멜팅되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 혼성화되어 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 혼성화 분석을 통해 실시한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO에 연결된 리포터 분자는 상기 타겟 의존적 단편과 함께 방출될 수 있는 위치에 연결될 수 있으며, 상기 TO에 연결된 제1 퀀처 분자는 단계 (a)에서 TO가 절단되기 전에는 TO에 연결된 리포터 분자에 근접하여 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭시키되, 단계 (a)에서 TO가 절단된 이후에는 상기 타겟 의존적 단편과 함께 방출되지 않는 위치에 연결될 수 있다. 예컨대, 리포터 분자는 상기 TO의 태깅 부위에 연결되고, 제1 퀀처 분자는 상기 TO의 타겟팅 부위에 연결될 수 있다. 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 상기 제2 형태의 FHO가 제2 이합체를 형성한 경우, 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭시킬 수 있는 위치에 연결될 수 있다.
본 개시의 방법에 사용된 TO 및 FHO(제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO), 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, TO 및 FHO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. TO 및 FHO 및 제3 형태의 FHO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2'-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 "유니버설 염기"는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, 일 구현예에서, TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 상기 TO는 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 절단 위치는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 위치할 수 있다. 타겟 의존적 단편이 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 혼성화되는 FHO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, TO가 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 FHO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, TO가 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, FHO의 캡처링 부위의 5'-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3'-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부의 다양한 위치에서 TO의 절단이 일어나는 경우, FHO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5'-태깅 부위를 갖는 TO를 복수의 타겟 핵산 서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 서로 다른 타겟 의존적 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 FHO에 유용하게 사용된다. FHO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산 서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 FHO 또는 최소한의 타입의 FHO를 사용하도록 한다.
일 구현예에 따르면, 본 개시의 방법은 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부를 변성을 포함하여 반복적으로 추가 실시하는 것을 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산 서열 및/또는 시그널을 증폭시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 개시의 방법은 상기 단계 (c) 후에 단계 (b)에서의 이합체(제1 이합체 또는 제2 이합체)를 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 제1 이합체에서의 연장가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 한 번 더 검출한다.
변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 공지된 기술을 통해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도범위에서 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 변성의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
상기 반복 과정에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프라이머가 사용되는 경우, 본 개시의 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하며, 구체적으로, PCR 방법에 의하여 실시한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(c)는 하나의 반응용기에서 실시하거나 또는 상기 단계 (a)-(c) 중 일부는 별도의 반응용기에서 실시된다.
본 개시는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산 서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
본 개시에서 검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산 서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
또한, 본 개시는 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 구체적으로, 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 단편은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 개시에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 DNA 분자의 특정 위치에서의 어떠한 변이를 포함한다. 즉, 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 DNA 분자의 특정 위치에서의 야생형 및 그것의 어떠한 변이형을 포함한다.
타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 개시에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 매칭 주형(matching template)으로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 미스매칭 주형(mismatching template)으로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3'-말단은 매칭 주형에 어닐링되고 연장되어 TO 절단을 유도한다. 결과물로서 타겟 의존적 단편은 FHO에 혼성화되어 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3'-말단이 미스매칭 주형에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 주형에 혼성화되더라도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3'-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 시그널이 제공되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 TO의 혼성화에 의존적인 TO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 TO는 매칭 주형에 혼성화된 후 절단된다. 결과물로서 타겟 의존적 단편은 FHO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, TO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 주형에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 이러한 경우, 구체적으로 TO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 TO의 타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
택일적으로, 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치하고, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부는 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것이 바람직하다.
단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 일 구현예에서, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단은 타겟 핵산 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매칭 주형에 혼성화된 TO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단에 3'-방향으로 바로 근접(immediately adjacent)한 한 위치에서 유도될 수 있다. 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 타겟 의존적 단편은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체를 형성하여, 타겟 시그널을 제공한다.
만일, 동일한 TO가, 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고는 매칭 주형에 대하여 동일한 서열을 갖는 미스매칭 주형에 혼성화된다면, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단으로부터 3'-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에서 TO의 절단이 발생될 수 있다. 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화되는 제1 형태의 FHO의 위치가, 상기 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드에 대하여 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인된 경우, 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 제1 형태의 FHO에 혼성화되지 않으며, 조절된 조건에서 결국 연장가닥이 생성되지 않는다. 만일 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성하여도, 상기 이합체는, TO 및 미스매칭 주형 간의 혼성화에 의한 이합체와는 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 가지는 TO의 절단 위치는, 매칭 주형 또는 미스매칭 주형과의 혼성화에 의존적으로 달라지며, 이에 의해 상기 두 혼성화 이벤트로부터 방출되는 타겟 의존적 단편들은 상이한 서열을 가지며, 구체적으로 그의 3'-말단 일부, 보다 바람직하게는 그의 3'-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편의 3'-말단 일부의 차이를 고려한 제1 형태의 FHO의 뉴클레오타이드 서열의 선택으로 매칭 주형과 미스매칭 주형을 구별할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 개시에 이용되는 타겟 핵산 서열은 전-증폭된 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 개시의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 상당히 높게 증가시킨다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
본 개시의 장점은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출(멀티플렉스)할 수 있다는 것이다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시된다(보다 구체적으로, 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시되고(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종), TO는 최소 2종의 TO를 포함하고(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종), TO는 최소 1종의 FHO를 포함한다(구체적으로 최소 2종, 보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 5종). 선택적으로, SO, HO 및/또는 IO가 사용되는 경우, 상기 SO, HO 및/또는 IO는 최소 2종(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종)을 포함할 수 있다. 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널을 제공한다.
최소 2개의 TO의 태깅 부위(예컨대, 5'-태깅 부위 또는 3'-태깅 부위)는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 개시가 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 실시되는 경우, TO의 태깅 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다.
더욱이, 한 종류의 FHO(구체적으로, 제1 형태의 FHO)를 다수의 타겟 핵산 서열의 검출에 이용할 수 있다. 예를 들면, 태깅 부위에 동일한 서열을 갖는 TO들을 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 이용하는 경우, 한 종류의 FHO를 이용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체(제1 이합체 또는 제2 이합체)는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 시그널은 서로 상이한 종류의 표지로부터 제공된다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2 종의 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공된다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공되며; 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상이한 종류의 표지"는 검출가능한 시그널이 상이한 특징을 갖는 표지를 의미한다. 예를 들면, 형광 리포터 표지로서의 FAM 및 TAMRA를 상이한 종류의 표지로써 고려되는데 이는 이들의 여기(excitation) 및 방출 파장이 서로 상이하기 때문이다.
멜팅 커브 분석에 의하여 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출하기 위해 본 개시를 실시하여 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체가 서로 상이한 Tm 값을 갖는 경우, 한 종류의 표지(예컨대, FAM)를 이용하더라도 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
고상에 고정화된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 검출
본 개시의 두드러진 이점은 마이크로어레이와 같은 고상에서도 타겟 핵산 서열의 검출이 효과적이라는 것이다.
일 구현에에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, FHO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 반응을 위해, FHO는 5'-말단 또는 3'-말단(구체적으로, 3'-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적(구체적으로, 간접적)으로 고정화된다. 또한, 상기 FHO는 공유 또는 비-공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 고정화된 FHO가 고상 기질 상에 간접적으로 고정화되는 경우, 적당한 링커가 이용된다. 본 개시에서 사용되는 링커는 고상 기질 표면 상에 프로브를 고정화하는데 이용하는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로써 FHO 고정화에 이용될 수 있다. 또한, 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일이 링커로 이용될 수 있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 개시에서 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 개시의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산 서열과의 혼성화, 절단, 연장, 혼성화, 연장, 형광 검출(또는 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시의 형광 검출)은 마이크로어레이에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 상기 FHO는 혼성화 가능한 어레이 요소(hybridizable array element)의 역할을 한다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노 튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 개시의 다수의 고정화된 FHO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 두 개 또는 그 이상의 어드레서블 부위에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술을 통해 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 FHO가 조립(fabricate)될 수 있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 고상 기질의 표면상에 고정화된 FHO는 상호작용적 이중표지를 포함한다.
본 개시에서 타겟 의존적 단편은 타겟 핵산과 혼성화된 TO의 절단에 의해 생성되며, 이는 제1 형태의 FHO 상에 혼성화 및 연장반응을 통해 연장 가닥을 생성하고 제1 이합체를 생성하거나 제2 형태의 FHO 상에 혼성화되어 제2 이합체를 생성한다.
일 구현예에서, 본 개시가 제1 형태의 FHO를 이용하는 경우, 연장가닥의 수를 증가시키기 위해서, 추가적인 TO를 이용한 추가적인 5' 뉴클레아제 절단 반응에 의하여 제1 형태의 FHO 상에서 연장 가능한 추가적인 단편을 제공할 수 있다. 상기 추가적인 TO를 사용하여 추가적인 단편을 생성하는 방식은 다양할 수 있다.
일 구현예에서, 추가적인 TO는 (i) 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 상보적인 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. 상기 구현예에서, 상기 추가적인 TO는 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되는 타겟 의존적 단편의 다운스트림에 위치한다. 상기 타겟 의존적 단편은 연장되면서 추가적인 TO를 절단시키고, 상기 절단은 추가적인 타겟 의존적 단편을 생성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용한다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시는 SO(Signaling Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 HO(Hybridizing Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 HO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시는 고상 기질 상에 고정된 IO를 사용하고 제1 형태의 FHO는 고상 기질에 직접 고정화되지 않고 상기 IO를 통해 고정화될 수 있다. 이 경우, 제1 형태의 FHO는 상기 IO에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 추가적으로 포함한다. 상기 구현예에서, IO-혼성화 부위는 제1 형태의 FHO의 3'- 또는 5'-말단에 위치할 수 있다. 또한, 상기 IO-혼성화 부위가 상기 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 위치하는 경우, 상기 제1 형태의 FHO는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 IO-혼성화 부위 사이에 타겟 의존적 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 IO-혼성화 부위를 추가적으로 포함하는 제1 형태의 FHO를 사용하는 구현예의 세부사항은 본원에 참고로 포함된 국제공개 제WO 2015/057008호를 참조한다.
특히, 본 발명이 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 상기 단일 표지는 특정한 특징이 요구되지 않는다. 고상 반응을 위해서는, 어떠한 단일 표지도 이용될 수 있다.
본 개시의 다른 양태에 있어서, 본 개시는 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공한다:
(a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3’-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
(b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
(c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소.
본 개시의 "타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물"은 상기 설명된 본 개시의 첫 번째 양태인 "타겟 핵산 서열을 검출하는 방법"을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기이다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소이다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소이다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO는 프로브이다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 상술한 본 개시의 모든 조성물은 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 개시의 조성물은 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 조성물은 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 개시의 조성물은 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 : 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
본 개시에 따른 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법이 종래 자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법 대비 우수한 민감도 및 특이도를 나타내는지 확인하였다.
단계 (c)의 이합체의 검출은 PTOCE 분석(WO 2012/096523)을 이용하여 실시하였으며, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 연장, TO의 절단 및 타겟 의존적 단편의 연장을 위해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
1. 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드의 준비
타겟 핵산은 Enterococcus faecalis(EF)의 유전자를 사용하였다. 타겟 핵산 서열은 하기와 같다 :
타겟 핵산 서열 :
5'-CCACAAGTACCATTCGTGCCAGTTTTAAGAAGTGACTGGAAAGGAAATCCAAAAGAAGTCTTTGAAAAATGTGAAGGTTCTTTAATTTATCCGGTCTTTGTTAAACCTGCCAATATGGGTTCTAGTGTCGGAATTAGCAAAGCGGAAAATCGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGAAGAAGCTTTCCGTTATGATGCCCGAGCAATTGTTGAACA-3'
(서열번호: 1)
상기 Enterococcus faecalis(EF) 유전자의 타겟 핵산 서열(서열번호: 1)을 벡터 plDTSMART-AMP(GenBank: MN689784.1)에 삽입하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이어서, 2.0×104 copies/㎕ 농도의 플라스미드 DNA를 TE 버퍼를 이용하여 10배씩 연속 희석하여 총 4가지 농도(농도 1: 2.0×104 copies/㎕, 농도 2: 2.0×103 copies/㎕, 농도 3: 2.0×102 copies/㎕, 및 농도 4: 2.0×101 copies/㎕ )의 플라스미드 DNA 주형을 준비하였다.
TO는 3'-타겟팅 부위가 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 및 5'-태깅 부위가 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 제1 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기를 갖도록 디자인하였다. 상기 TO의 5’-태깅 부위에 포함되는 합성 비자연 염기의 개수 및 위치는 다양하게 디자인하였으며, 제1 합성 비자연 염기는 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 위치하도록 디자인하였다. 상기 5'-태깅 부위에 포함되는 합성 비자연 염기로는 2-amino-8-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one(이하, P)을 이용하였다.
타겟 의존적 단편과 혼성화되는 FHO는 캡처링 부위가 상기 TO로부터 방출된 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 템플레이팅 부위가 상기 TO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인하였다.
상기 타겟 의존적 단편은 상기 TO의 5'-태깅 부위로부터 유래된 합성 비자연 염기를 포함하며, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편 내의 합성 비자연 염기(즉, 제1 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기)의 맞은 편에 이와 혼성화하는 합성 비자연 염기(즉, 제2 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기), 6-amino-5-nitro-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone(이하, Z)를 포함하도록 디자인되었다. 또한, FHO의 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)를 표지하였다.
상기 TO 및 FHO는 DNA 중합효소에 의한 연장을 막기 위해 3'-말단을 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다.
본 실시예에서 사용된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO의 서열은 하기 [표 1] 과 같다. TO 및 FHO 뒤의 숫자 "X-Y.Y"는 상기 TO의 태깅 부위에 포함된 합성 비자연 염기의 개수 및 위치를 의미한다. 구체적으로, X는 합성 비자연 염기의 개수를 나타내고, Y는 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터의 위치를 나타낸다. 예컨대, TO 1-1은 1개의 합성 비자연 염기를 포함하며, 3'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드 위치에 상기 합성 비자연 염기가 포함되어 있는 것을 의미한다. FHO 1-1은 상기 TO 1-1이 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 혼성화하는 FHO를 의미한다. 또 다른 예로, TO 3-3.7.9 는 3개의 합성 비자연 염기를 포함하며, 3'-말단으로부터 3 번째, 7번째, 9번째 뉴클레오타이드 위치에 상기 3개의 합성 비자연 염기가 포함되어 있는 것을 의미한다. FHO 3-3.7.9는 상기 TO 3-3.7.9가 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 혼성화하는 FHO를 의미한다.
| 서열 번호 |
올리고명 | 서열 (5' to 3') |
| 2 | 정방향 프라이머 | CCACAAGTACCATTCGTGCC |
| 3 | 역방향 프라이머 | TGTTCAACAATTGCTCGRGC |
| 4 | TO 1-1 | CGCATTCTCGT P CGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 5 | FHO 1-1 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGZACGAGAATGCG |
| 6 | TO 1-2 | CGCATTCTCG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 7 | FHO 1-2 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGAGAATGCG |
| 8 | TO 2-2.7 | CGCAT P CTCG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 9 | FHO 2-2.7 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGAGZATGCG |
| 10 | TO 2-3.8 | CGCA P TCTC P TACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 11 | FHO 2-3.8 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTAZGAGAZTGCG |
| 12 | TO 3-2.5.9 | CGC P TTC P CG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 13 | FHO 3-2.5.9 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGZGAAZGCG |
| 14 | TO 3-3.7.9 | CGC P T P CTC P TACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 15 | FHO 3-3.7.9 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTAZGAGZAZGCG |
| 16 | TO 자연염기 | CGCATTCTCGTACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA |
| 17 | FHO 자연염기 | [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTACGAGAATGCG |
(밑줄 친 문자는 TO의 5’-태깅 부위를 가리키며, 볼드체 문자는 합성 비자연 염기를 가리킨다.)
2. 실시간 PCR
먼저, 24개의 튜브를 준비하고, 각 튜브에 (i) 상기 실시예 1-1에서 준비한 플라스미드 DNA 주형(농도 1 내지 농도 4) 5 ㎕, (ii) 정방향 프라이머(서열번호: 2) 및 역방향 프라이머 (서열번호: 3) 각각 5 pmole, (iii) 비자연 염기쌍(P-Z)을 포함하는 TO (서열번호: 4, 6, 8, 10, 12 또는 14) 및 FHO (서열번호: 5, 7, 9, 11, 13 또는 제 15) 각각 4 pmole 및 (iv) EM 1(Cat No.SD10245Z, Seegene, Inc.) 5 ㎕를 포함하여 최종 20 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 반응 혼합물은 (i) 총 4가지 농도의 플라스미드 DNA 및 (iii) 총 6 종류의 TO 및 FHO 쌍의 조합을 통해 24 종류의 반응 혼합물이 준비되었으며, 상기 반응 혼합물을 이용하여 실시간 PCR 반응을 실시하였다.
상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다. 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 10 초 과정을 45 회 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클 마다 60℃에서 측정하였다. Ct 값은 Auto calculated single threshold에 의해 계산되었으며, 모든 실험은 2회씩 반복 실험하여 평균 Ct값을 얻었다.
상기 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO 대신 자연 염기쌍을 포함하는 TO(서열번호: 16) 및 FHO(서열번호: 17)를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 비교 대조군 반응도 함께 실시하였다.
상기 플라스미드 DNA 주형 대신 증류수 5 ㎕를 넣은 반응 혼합물을 이용하여 상기와 동일한 조건으로 음성 대조군 반응도 함께 실시하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 2번째 내지 5번째 뉴클레오타이드 이내에 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 자연 염기만을 포함하는 TO보다 더 낮은 농도의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 동일 농도의 타겟 해산 서열을 검출할 경우, 3.2 내지 7.2 만큼의 Ct가 당겨지는 효과를 확인하였다. 이러한 결과는 TO의 3’-말단으로부터 2번째 내지 5번째 뉴클레오타이드 이내에 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 민감도 및 특이도가 향상된 것을 의미한다.
반면, TO의 3'-말단으로부터 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 자연 염기를 포함하는 TO보다 낮은 민감도 및 Ct 값이 밀리는 결과를 얻었다.
이러한 결과는 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기가 존재하는 경우, (i) 뉴클레아제의 절단부위에 위치한 비자연 염기로 의해 절단 효율이 감소되는 현상, (ii) FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 3'-말단 즉, 중합효소의 연장 시작 부위에 위치한 비자연 염기가 중합효소의 연장 반응에 있어서 일반적인 기질로서 수월하게 인식되지 않음으로 인해 연장 효율이 감소되는 현상, (iii) 상기 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치의 합성 비자연 염기가 맞은 편에 위치하는 타겟 핵산 서열 내의 자연 염기에 대하여 자연 염기 간의 반발력 보다 강한 반발력을 나타내어, 타겟팅 부위의 5'-말단까지 3'-태깅 부위와 함께 들려(즉, 타겟 핵산 서열에 혼성화하지 못함) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단위치가 달라지거나 타겟 의존적 단편의 3'말단의 서열이 달라져, FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율이 감소되는 현상에 기인하는 것으로 추측된다.
한편, 음성 대조군 반응에서는 어떠한 시그널도 확인 되지 않는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (44)
- 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며,
상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
(b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
(i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는
(ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
(c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄. - 제 1 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장가닥을 생성하고, 상기 연장가닥이 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 태깅 부위의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 TO는 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며;
(c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 연장 가닥의 존재를 나타낸다. - 제 1 항에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있으며, 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높은 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부는 변성을 포함하여 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물:
(a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
(b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
(c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소. - 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 30 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 34 항에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5’방향으로 업스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 41 항에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 TO는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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Family Cites Families (38)
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|---|---|---|---|---|
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4351760A (en) | 1979-09-07 | 1982-09-28 | Syva Company | Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US6140496A (en) | 1990-10-09 | 2000-10-31 | Benner; Steven Albert | Precursors for deoxyribonucleotides containing non-standard nucleosides |
| US6037120A (en) | 1995-10-12 | 2000-03-14 | Benner; Steven Albert | Recognition of oligonucleotides containing non-standard base pairs |
| US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
| US5965364A (en) | 1990-10-09 | 1999-10-12 | Benner; Steven Albert | Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives |
| DK51092D0 (da) | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
| US5994069A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
| US5541311A (en) | 1992-12-07 | 1996-07-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase |
| EP0730662A4 (en) | 1993-09-10 | 1999-11-24 | Genevue Inc | OPTICAL DETECTION OF THE POSITION OF OLIGONUCLEOTIDES ON LARGE DNA MOLECULES |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| EP1033411B1 (en) | 1996-06-04 | 2006-02-22 | University of Utah Research Foundation | Fluorescent donor-acceptor pair |
| US6117635A (en) | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| EP0963997B1 (en) | 1996-11-18 | 2003-02-19 | Takeshi Imanishi | Novel nucleotide analogues |
| JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
| US6194149B1 (en) | 1998-03-03 | 2001-02-27 | Third Wave Technologies, Inc. | Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides |
| DE69829760T3 (de) | 1997-09-12 | 2016-04-14 | Exiqon A/S | Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| WO2000079009A2 (en) | 1999-06-22 | 2000-12-28 | Invitrogen Corporation | Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
| US7381532B2 (en) | 1999-10-29 | 2008-06-03 | Stratagene California | Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction |
| ATE334228T1 (de) | 2000-03-29 | 2006-08-15 | Lgc Ltd | Hybridisierungsprobe und methode zum schnellen nachweis und zur schnellen unterscheidung von sequenzen |
| US7422850B2 (en) | 2000-05-19 | 2008-09-09 | Eragen Biosciences, Inc. | Materials and methods for detection of nucleic acids |
| US7514212B2 (en) * | 2003-01-17 | 2009-04-07 | Eragen Biosciences, Inc. | Nucleic acid amplification using non-standard bases |
| WO2008083261A1 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Applera Corporation | Systems and methods for detecting nucleic acids |
| US10865431B1 (en) | 2008-06-17 | 2020-12-15 | Steven A Benner | Polymerase incorporation of non-standard nucleotides |
| US9845492B2 (en) | 2009-12-21 | 2017-12-19 | Seegene, Inc. | TSG primer target detection |
| MX352460B (es) | 2011-01-11 | 2017-11-24 | Seegene Inc | Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto. |
| JP5852222B2 (ja) | 2011-03-29 | 2016-02-03 | シージーン アイエヌシー | Ｐｔｏ切断及び延長−依存的切断によるターゲット核酸配列の検出 |
| KR20130101952A (ko) * | 2012-02-02 | 2013-09-16 | 주식회사 씨젠 | Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 |
| EP2839031B1 (en) | 2012-04-19 | 2017-03-29 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide cleavage |
| KR101760267B1 (ko) | 2012-12-27 | 2017-07-24 | 주식회사 씨젠 | Pto 절단 및 연장-의존적 비-혼성화 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 |
| WO2015008985A1 (en) | 2013-07-15 | 2015-01-22 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization |
| KR102265313B1 (ko) * | 2013-08-09 | 2021-06-15 | 루미넥스 코포레이션 | 핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브 |
| US11447814B2 (en) | 2013-10-18 | 2022-09-20 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequence on solid phase by PTO cleavage and extension using HCTO assay |
| CN107109492B (zh) | 2014-12-22 | 2021-02-26 | 阿纳帕生物技术股份公司 | 用于靶核酸多重检测的双重猝灭测定 |
| KR20170142128A (ko) * | 2016-06-16 | 2017-12-27 | 주식회사 씨젠 | Cto 세트를 사용한 pto 절단 및 연장 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 |
| WO2019066461A2 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Seegene, Inc. | DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO |
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